nuevo manual micro 2023

ACUERDO DE CONVIVIENCIA
1. Promover el respeto y tolerancia de la libertad de pensamiento y expresión.
2. Los alumnos y el maestro deberán estar puntuales a la hora de comenzar clase.
(10min tolerancia)
3. Sólo se permitirá trabajar en el laboratorio cuando se encuentre su asesor.
4. Llevar a todas las clases el cuadernillo de trabajo.
5. Trabajar con bata blanca de algodón y zapatos serrados. Mujeres con el cabello
recogido.
6. Cuando se trabaje con microorganismos debe emplearse guantes de látex y cubre
bocas.
7. Se deberán preparar con anticipación si se requiere algún material o equipo de
seguridad en el laboratorio.
8. Las superficies de trabajo deben ser descontaminadas antes y después de una
sesión de trabajo e inmediatamente después de algún derrame de material
contaminante.
9. Deberán lavarse las manos después de manipular cultivos bacterianos, así como al
salir del laboratorio.
10. Todos los medios de cultivo inoculados con microorganismos deberán ser
esterilizados antes de ser desechados.
11. Los materiales que estén en contacto con microorganismos deberán ser
esterilizados por métodos físicos (con calor húmedo) o químicos (por ejemplo, con
cloro) antes de ser lavados o desechados en los lugares designados por el asesor.
12. No se permite pipetear ningún líquido con la boca.
13. Está prohibido ingerir alimentos o bebidas dentro del laboratorio.
14. Deberá mantener limpia y ordenada el área de trabajo y el laboratorio.
15. Tomar fotografías únicamente cuando la profesora lo indique.
16. Deberán tomar en cuenta los tiempos y ajustarse a ellos para la entrega de las
evidencias de trabajos. Pasado el tiempo, se obtendrá la mitad de la calificación,
suponiendo que la actividad esté correcta.
17. En trabajos duplicados o copiados la calificación será 0.
18. Si se sorprende al alumno con un cigarro electrónico se reportará con el
prefecto y tendrá “0” en todo el parcial.
19. El material quebrado se deberá reponer en especie o con el valor del equipo o
material dañado.
1
Módulo 2 / Submódulo 3
Emplea técnicas de identificacion de microorganismos
Proposito del submodulo
El propósito del módulo Emplea Técnicas de Identificacion de Microorganismos es
que el alumno conozca los aspectos básicos de la microbiología, los aspectos
morfológicos de las bacterias, las condiciones adecuadas para su desarrollo y las
pruebas bioquímicas que nos permiten la identificación de bacterias de importancia
sanitaria, médica e industrial. Además de la forma y los fundamentos para preparar
diferentes medios de cultivo, su aplicación dentro de la bacteriología y los métodos
esterilización, asepsia y control microbiológico.
Este manual tiene el objetivo de ser una guía teórica y metodológica para la realización
de actividades y prácticas de laboratorio que permitan al alumno conocer la
importancia de preparar y utilizar adecuadamente un medio de cultivo, las técnicas
correctas de siembra y los factores para su óptimo desarrollo; así como conocer las
técnicas empleadas para aislar microorganismos de fuentes naturales o de muestras
clínicas, o evidenciar su capacidad de patogenicidad y virulencia.
Competencias profesionales
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Aplica técnicas de esterilización y desinfección
Aplica técnicas de aislamiento de microorganismos
Aplica técnicas de identificación de microorganismos
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TEMARIO
CAPITULO I. LA MICROBIOLOGÍA Y SU OBJETO DE ESTUDIO
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Introducción a la Microbiología
Ramas de la Microbiología
Historia de la Microbiología
CAPITULO II. FUNDAMENTOS DE MICROSCOPIA
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Tipos de microscopios
Partes del microscopio
CAPITULO III. ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCIÓN
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Métodos físicos
Métodos químicos
Métodos mecánicos.
CAPITULO IV. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
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Clasificación de los medios de cultivo
Preparación de medios de cultivo
CAPITULO V. CÉLULA PROCARIOTA
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Organelos y función
Membrana celular
Reproducción bacteriana
Influencia del medio ambiente
CAPITULO VI MÉTODO DE SIEMBRA Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS
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Cultivo en medios solidos
Cultivo en medios líquidos
Factores de crecimiento bacteriano
CAPITULO VII. MORFOLOGÍA MACROSCÓPICA Y MICROSCÓPICA
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Observación en cultivos líquidos
Morfología colonial y microscópica
Preparación de muestras para microscopía óptica
Tinciones
3
CAPITULO VIII IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA
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Metabolismo microbiano
Pruebas bioquímicas
Algoritmo de identificación
CAPITULO IX PRÁCTICAS DE LABORATORIO
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•
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Practica 1. Microscopia
Practica 2. Preparación de medios de cultivo y esterilización de material
Practica 3. Siembra, aislamiento e identificación macroscópica
Practica 4. Morfología microscópica y tinción gram
Practica 5. Identificación bioquímica
CAPITULO X LECCIONES CONSTRUYE-T
•
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9.1 Hacer el bien sin mirar a quién
10.1 ¿Apreciar a todos?
12.1 Pensar en grande y decidirnos a actuar
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Competencia a desarrollar: Aplica técnicas de esterilización y desinfección
Actividades
Porcentajes
10%
• Ramas de la microbiología
5%
• Descubrimientos de científicos
5%
• Cuestionario de Louis Pasteur
10%
• Cuadro comparativo sobre los
Métodos de Esterilización
10%
• Cuadro sinóptico sobre la NOM087-ECOL-1994
10%
• Practica 1
15%
• Practica 2
30%
• Examen
5%
• Lección 9.1
5
Actividad de iniciación
Descifra el mensaje que Louis Pasteur compartió en 1892 a la humanidad y comenta
de forma grupal tus reflexiones ante estas palabras
“N$ $S D*J*ªS C$RR$M+*R +$R %N *SC*+TªCªSM$ *ST*Rª- Y D*+RªM*NT*; N$ $S D*S&L*T*ªS &NT* -&
TRªST*Z& D* Cª*RT&S H$R&S Q%* +&S&N S$BR* -&S N&Cª$N*S. VªVªD *N -& S*R*N& +&Z D* -$S
-&B$R&T$Rª$S Y D* -&S BªB-ª$T*C&S. +R*G%NT&$S +RªM*R$: ¿Q%* H* H*CH$ +$R ªNSTR%ªRM*? Y
D*S+%*S, & M*DªD& Q%* V&Y&ªS +R$GR*S&ND$: ¿Q%* H* H*CH$ +$R Mª +&TRª&? H&ST& Q%*
--*G%* *- Dª& *N Q%* +$D&ªS T*N*R -& ªNTªM& S&TªSF&CCªÓN D* +*NS&R *N Q%* H&B*ªS
C$NTRªB%ªD$ D* &-G%N& M&N*R& &- +R$GR*S$ Y *- Bª*N*ST&R D* -& H%M&NªD&D”
-$%ªS +&ST*%R 1892
Louis Pasteur 1892
El lenguaje es la capacidad que tiene el ser humano para expresarse y comunicarse, a
través de diversos sistemas de signos: orales, escritos o gestuales.
6
INTRODUCCIÓN
La Microbiología, es una ciencia relativamente nueva con respecto a otras ramas de la
Biología. Aunque se pueden encontrar raíces más profundas, la ciencia de la
microbiología no se desarrolló realmente hasta el siglo XIX. El estudio de los
microorganismos se inició a partir de que Antonie van Leeuwenhoek en 1670 diseñó
el microscopio y observó por primera vez a las bacterias mientras analizaba infusiones
de pimienta, y que a partir de los estudios de Luis Pasteur en 1876, se logró el mayor
desarrollo y reconocimiento de los microorganismos como protagonistas de una gran
diversidad de procesos.
Aunque durante mucho tiempo estos organismos causaron graves problemas de
enfermedades en plantas, animales y humanos también es cierto que desde la
antigüedad algunas especies microbianas han sido utilizadas en procesos de
producción de alimentos fermentados como quesos, vino, pan y cerveza, entre otros y
actualmente se ha reconocido su importancia en diversas áreas de investigación
básica, en la industria alimentaria, ambiental y farmacéutica.
El objetivo general del submódulo de Técnicas de Identificación de Microorganismos
es que el estudiante se inicie en el conocimiento de la biología básica de los
microorganismos (beneficiosas y perjudiciales), en sus características morfológicas,
fisiológicas, nutricionales y genéticas, proporcionando un panorama global de la
importancia de los mismos en la vida del hombre y en las modificaciones que ocurren
en la naturaleza en base a sus actividades como saprófitos, parásitos o simbiontes.
Asimismo, se pretende que el estudiante adquiera las habilidades necesarias para su
manipulación en el laboratorio.
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CAPITULO I.-LA MICROBIOLGIA Y SU OBJETO DE ESTUDIO
La Biología es una ciencia que tiene por objeto el estudio de todos los seres vivos.
Debido a su campo de estudio tan extenso, fue dividida en varias ramas para mejorar
su área de comprensión. De esta forma, cada rama de la biología se especializa en un
tema en específico.
La microbiología es una de estas ramas y estudia a todos los organismos que son
demasiado pequeños y no pueden ser percibidos a simple vista; a los cuales se les
denomina microorganismos.
Los microorganismos tienen una extensa distribución taxonómica, incluyen algunos
protozoos, algas, hongos, bacterias y virus. Fueron los primeros habitantes de la tierra
y siguen siendo las formas de vida predominantes. Miremos donde miremos, habrá
millones de microorganismos. Son los seres vivos mejor adaptados a cualquier
ambiente y conforme avanzan nuestros conocimientos en biología, química, medicina,
genética, ecología, etc. más nos damos cuenta de la enorme relevancia que tienen en
todo aquello que nos rodea.
¿Por qué es importante el estudio de la microbiología?
La microbiología es considerada una de las disciplinas más importantes en biología,
ya que permite identificar y clasificar a microorganismos causantes de enfermedades,
descubrir curas o tratamientos de diversas patologías y ubicar algunos microbios con
fines industriales.
Los microorganismos se encuentran prácticamente en todos los rincones del planeta,
beneficiando o perjudicando nuestras vidas, la de las plantas y los animales. Estos seres
vivos se encuentran constantemente reciclando nutrientes claves, como el carbono o
el nitrógeno, así como degradando materia orgánica y contribuyendo a la
configuración de nuestro día a día. Así pues, los microorganismos juegan un papel
fundamental en el mundo de diferentes maneras.
Primeramente, los microbios mantienen el planeta sano, ya que aseguran un continuo
reciclaje de los minerales y nutrientes y, desempeñan a la vez, un papel crucial para el
mantenimiento de la atmósfera oxigenada. Por otro lado, los microbios son vitales para
la agricultura y los suelos que albergan cultivos y ganado. También, contribuyen a
mantener los brotes de ciertas enfermedades infecciosas bajo control. En cuanto a la
farmacología, los microbios se utilizan en numerosos productos de gran utilidad,
desde antibióticos hasta solventes o conservantes. Finalmente, la microbiología se ha
convertido en una herramienta indispensable para la biotecnología y también para la
ingeniería genética en las últimas décadas.
• Aspectos beneficiosos:
✓ Todas las culturas desarrollaron de modo empírico multitud de bebibas y
alimentos derivados de fermentaciones microbianas: vino, cerveza, pan,
verduras fermentadas, etc.
8
✓ Producción de multitud de productos industriales: alcoholes, ácidos orgánicos,
antibióticos, enzimas, polímeros, etc.
✓ La ingeniería genética empezó con los microorganismos, que siguen
desempeñando un papel fundamental en la nueva generación de
medicamentos recombinantes y de terapias novedosas
• Aspecto perjudicial:
✓ Las enfermedades microbianas han sido causa de grandes males a nuestra
especie. Baste recordar que la peste (muerte negra) causó a mediados del siglo
XIV la muerte de la tercera parte de la población europea, y ya en la primera
mitad del siglo XV llegó a afectar a más del 75%.
✓ Desde la época del descubrimiento de América, las exploraciones han
conllevado el intenso trasiego de agentes patógenos de un lugar a otro. La
desaparición de buena parte de la población indígena se debió en buena parte
a no tener defensas frente a la viruela europea, pero a su vez los descubridores
importaron la sífilis a Europa.
✓ No hace falta resaltar el papel que ha tenido la microbiología médica, desde la
época de Pasteur y Koch, en la lucha contra las enfermedades infecciosas
(antisepsia, desinfección, esterilización, quimioterapia). Y aunque ahora
tengamos nuevos ret os (SIDA, fiebres hemorrágicas, etc.), no cabe duda de que
la Microbiología está contribuyendo a no perder esta permanente batalla contra
los gérmenes patógenos.
✓ Aparte de todas estas actividades de los microorganismos sobre los humanos,
hay que tener en cuenta que existen gérmenes que afectan a animales, plantas,
instalaciones industriales, que afectan a alimentos, etc., representando otras
tantas áreas de atención para la Microbiología
Como el impacto de esta ciencia en nuestras vidas es tan amplio, la microbiología fue
dividida en varias ramas las cuales revisaremos a continuación.
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Actividad 1
Investiga que estudia cada rama de la microbiología y anéxalo en la siguiente tabla.
Rama de la
microbiología
¿Qué estudia?
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"No hay campo del batallar humano, sea en la industria o en la agricultura, o en
la preparación de alimentos, o en problemas de ropas, o en la conservación de la
salud humana o animal y en el combate de enfermedades, donde el microbio no
juegue un papel importante y a menudo dominante." S.A. Waksman (1942)
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HISTORIA DE LA MICROBIOLOGÍA
Se sabe que los microorganismos tuvieron su aparición en la tierra hace
aproximadamente 4000 millones de años. Sin embargo, la microbiología es una
ciencia relativamente joven, pues con la invención del microscopio hace 300 años se
observó por primera vez a estos diminutos seres. Tuvieron que pasar 100 años más
para reconocer su importancia en el equilibrio del planeta.
La existencia de los microorganismos no se conoció hasta la invención del
microscopio, siendo el holandés Anton Van Leeuwenhoek quien realizó las primeras
observaciones de los microorganismos y los describió en detalle en 1684, a los cuales
denominó animáculos. Sin embargo, estas observaciones no condujeron a ninguna
investigación acerca de las posibles actividades de los microorganismos, ni como
agentes de fermentaciones ni de enfermedades infecciosas ya que el desarrollo de la
química y de la medicina era demasiado primitivo.
Louis Pasteur (1822-1895)
Químico y biólogo francés. Padre de la Microbiología. Logró explicar la acción
general de los microorganismos.
1855-1860 Hace diversas investigaciones sobre las fermentaciones (láctica,
alcohólica, butírica).
1859-1862 Hace estudios para lograr argumentos en contra de la teoría de la
generación espontánea.
1877-1881 Desarrolla una vacuna contra el carbunco.
1880 Hace investigaciones sobre el cólera aviar y descubre la inmunización con
cultivos atenuados.
12
1884 Vacuna contra la rabia.
Controversia de la Generación Espontánea
De acuerdo con la doctrina Aristotélica de la Generación Espontánea, las formas más
pequeñas de vida animal se originaron espontáneamente de materia inanimada o de
materia orgánica en descomposición. La aparición de bacterias y protozoarios en
infusiones de carne o de heno se ofrecía como prueba de esta teoría.
Entre los que contrarrestaron esta doctrina tenemos:
Francisco Redi (1626-1697) demostró que la generación espontánea no era
aplicable a animales, comprobando que los gusanos no se desarrollaban
espontáneamente de la carne putrefacta, sino que las moscas depositaban sus huevos
sobre ésta.
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Lazzaro Spallanzani (1729-1799) demostró que calentando las infusiones bajo
condiciones controladas se previene la aparición de vida microscópica.
Schroeder y von Dusch (1850) introdujeron el uso del tapón de algodón, que se usa
todavía para impedir la entrada de microorganismos del aire a fiolas y tubos.
Pasteur demostró que el medio hervido podía permanecer libre de microorganismos
en balones de cuello de cisne, abiertos al aire a través de un tubo sinuoso horizontal,
en el que las partículas de polvo se sedimentan cuando el aire entra al recipiente.
J. Tyndall y F.Cohn (1877) independientemente demostraron la existencia de
cuerpos bacterianos resistentes al calor (esporas).
Teoría Microbiana de las enfermedades
G. Fracastorus (1483-1553) sugirió que las enfermedades podían deberse a
organismos invisibles transmitidos de una persona a otra.
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Berkeley (1845) demostró que un moho era el causante del tizón de la papa de
Irlanda.
I. Semmelweis (1850) y J. Líster (1867) Aportaron cierta evidencia de la importancia
de los microorganismos como causante de enfermedades.
R. Koch (1843-1910) Médico alemán. Descubrió el agente causal del carbunco, el
bacilo causante de la tuberculosis, y el vibrión causante del cólera. Con sus notables
trabajos sentó las bases de la teoría microbiana de las enfermedades.
Postulados de Koch
Son una secuencia definida de pasos experimentales mediante los cuales se
demuestra la relación causal entre un microorganismo y una determinada enfermedad.
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Actividad 2
Con base en las tablas anteriores; realiza una investigación a fondo sobre 3 de los
descubrimientos que más te hayan llamado la atención. No olvides colocar el nombre
del científico y el año en el que se realizó la investigación.
NOMBRE DEL
CIENTIFICO
AÑO DE
APORTACIÓN
DECUBRIMIENTO
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Actividad 3
Realiza una investigación en donde des respuesta a los siguientes cuestionamientos
sobre el padre de la microbiología
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CAPÍTULO II. FUNDAMENTOS DE MICROSCOPIA
La microbiología es el estudio de los microorganismos y sus actividades, su forma,
estructura, reproducción, fisiología, metabolismo e identificación, cómo están
distribuidos en la naturaleza, sus relaciones con otros seres, los efectos benéficos o
perjudiciales que ejercen sobre los humanos y las alteraciones físicas y químicas que
provocan en su medio.
La microbiología tuvo comienzo cuando el hombre aprendió a pulir piezas de vidrio y
a combinarlas para lograr ampliaciones lo bastante grandes para poder ver los
microbios. Anthony van Leeuwenhoek fue el primero en comunicar sus observaciones
con descripciones y dibujos precisos, Leeuwenhoek observó entre otras cosas,
bacterias y protozoarios en el agua de lluvia, en infusiones diversas y en su sarro dental.
Leeuwenhoek registró cuidadosamente sus observaciones en una serie de cartas
dirigidas a la British Royay Society, sus cartas fueron leídas con interés por científicos
británicos, pero es claro que la importancia y trascendencia de sus descubrimientos no
fue debidamente valorada.
El estudio microscópico de los microorganismos proporciona datos fundamentales
para su identificación, determinar su forma, tamaño, reacción a diferentes colorantes y
estructuras celulares; orienta al microbiólogo cuando trata de aislar microorganismos
y permite establecer características como la pureza, presencia de contaminantes,
variedad o edad de una población, entre otras cosas. Por ello, el microscopio es uno
de los instrumentos de mayor importancia en bacteriología, su descubrimiento y
desarrollo fueron los acontecimientos más importantes en el florecimiento de la
microbiología.
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LOS MICROOSCOPIOS DE LEEUWENHOKE
Estos microscopios tenían
poco
parecido
a
los
microscopios
que
hoy
conocemos. La lente, casi
esférica, estaba montada
entre dos pequeñas placas
metálicas. La muestra se
colocaba en la punta un alfiler
romo, unido a la placa
posterior y se enfocaba
manipulando los tornillos y
variaban la posición del alfiler
con respecto a la lente.
Durante esta operación, el
observador
mantenía
el
instrumento con su otra cara muy próxima al ojo, y miraba al soslayo a través de la lente.
No era posible cambiar el aumento. A pesar de la sencillez de su construcción, los
microscopios de LEEUWENHOKE eran capaces de proporcionar imágenes claras con
aumentos que oscilaban, dependiendo de la distancia focal de la lente, desde unas 50
hasta 300 veces.
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TIPOS DE MICROOSCOPIOS
La existencia del mundo microbiano se desconocía hasta
la invención de los microscopios, los cuales fueron creados
a principios del siglo 17 y abrieron al mundo el estudio de
los muy pequeños.
EL microscopio es un instrumento óptico que aumenta la
imagen de los objetos. La lupa puede considerarse como
el microscopio más simple y fue usada inicialmente por
algunos investigadores para adquirir los primeros
conocimientos del mundo microscópico. El microscopio,
al aumentar la imagen de los objetos, nos permite analizar
la estructura, forma y tamaño de diferente tipo de
muestras.
Los microscopios primitivos eran de dos clases; los
primeros eran microscopios simples, con una sola lente,
de distancia focal muy pequeña y en consecuencia,
incapaces de gran aumento.
Los segundos microscopios fueron los compuestos, que
poseían un sistema de dos lentes, un ocular y un objetivo,
lo cual beneficio a obtener un mayor aumento.
Todos nuestros microscopios contemporáneos son del tipo compuesto.
MICROSCOPIO ÓPTICO DE CAMPO CLARO
En la microscopia de campo claro, el campo microscópico o área observada está
brillantemente iluminada y los objetos en estudio aparecen más oscuros en el fondo.
Un microscopio óptico de fondo claro consiste en un armazón de metal que contiene
tres sistemas principales que son:
1. SISTEMA MECÁNICO.
Consta de los siguientes elementos: Base, brazo y cuerpo del tubo, los cuales sirven
para mantener en posición todos los componentes del microscopio.
Tubo intercambiable del microscopio, el cual se encuentra insertado en la parte
superior del cuerpo del tubo. Soporta el ocular y permite alinearlo con el objetivo
seleccionado para una observación.
Platina, en ella se coloca la preparación o portaobjetos de estudio. La platina está
equipada con pinzas para sujetar la preparación y dos tornillos para desplazarla, lo
cual facilita la localización del objeto y la revisión de la preparación.
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Revólver, es el disco que soporta a los objetivos y que se gira para colocar el objetivo
requerido bajo el tubo.
Tornillo macrométrico o de enfoque rápido, permite desplazar el tubo del
microscopio acercando el objetivo a la preparación, lo cual permite localizar la imagen
y lograra un enfoque aproximado.
Tornillo micrométrico o de enfoque fino, éste puede desplazar el tubo en forma más
lenta, lo cual permite hacer movimientos finos que se requieren para obtener un
enfoque exacto y preciso.
2. SISTEMA DE ILUMINACIÓN.
El cual consta a su vez de los siguientes elementos:
Interruptor. Fuente de luz, la cual es una lámpara que se encuentra colocada debajo
del objeto y emite la luz que pasa por el condensador, para después iluminar la
preparación. Para regular la intensidad de la luz algunos microscopios tienen integrado
a la lámpara un diafragma, el cual se abre o se cierra de acuerdo a la cantidad de luz
que se desee; en otros únicamente se regula el voltaje.
Condensador, está interpuesto entre la luz y la muestra. El condensador reciba la luz
de la lámpara, rectifica los rayos de luz y los concentra o enfoca en un cono de luz sobre
el campo donde se sitúa la muestra, de tal manera que los rayos, después de atravesar
la preparación, penetran a la lente del objetivo con el menor ángulo posible. Para ello,
el condensador se baja o se sube hasta alcanzar una posición que origine un foco
preciso.
Diafragma, controla el diámetro del círculo de luz que sale del sistema condensador.
Su propósito no es controlar la intensidad de luz que llega al objeto, sino asegurar que
la que sale del condensador llene exactamente la lente del objetivo; si el diafragma es
demasiado grande, parte de la luz pasará alrededor del objeto y originará brillo,
reduciendo la claridad de la imagen.
3. SISTEMA ÓPTICO:
Consta de los siguientes elementos:
Objetivos, son las lentes que amplifican la imagen del campo microscópico y por lo
tanto, del objeto en estudio. La mayoría de los microscopios tienen tres objetivos que
proporcionan diferentes aumentos, el coeficiente de aumento está indicado para cada
lente objetivo por un número grabado en su tubo, por ejemplo, 10X, que indica que
su poder de aumento es de 10 veces o 10diámetros.
Los objetivos más comunes son: 5X o lupa; objetivo 10X o seco débil, la cual abarca
un campo microscópico con una superficie mayor y se utiliza para localizar los objetos
de interés y para seleccionar el espécimen a observar; objetivo 40X o seco fuerte, el
cual permite la visualización detallada de microorganismos grandes, como algas,
protozoarios y hongos; y el objetivo de 100X o de inmersión, que se utiliza para
observar bacterias o microorganismos eucariotes pequeños.
Ocular, esta lente amplifica aún más la imagen procedente del objetivo y permite que
el ojo la perciba. El ocular se encuentra insertado en el tubo intercambiable. Los
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coeficientes de aumento de los oculares y de los objetivos permiten calcular el
aumento total o capacidad amplificadora de un microscopio, que es igual al producto
de los coeficientes de aumento del ocular y del objetivo que se utilizan; por ejemplo:
en un microscopio con un ocular de 10X y los objetivos de 10X, 40X y 100X, la imagen
se amplifica 100, 400 y 1000 veces respectivamente
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MICROSCOPIO
ULTRAVIOLETA
ÓPTICO
DE
LUZ
El microscopio de luz ultravioleta permite un
mayor poder de resolución con útiles y mayores
ampliaciones que las obtenidas con el
microscopio de luz ordinario, ya que la luz
ultravioleta tiene una longitud de onda más
corta (180-400 nm frente a 400-700 nm) que la
luz visible, su aplicación principal es la
diferenciación de componentes celulares sobre
la base de una mayor o menor facultad de
absorber la luz ultravioleta.
MICROSCOPIO ÓPTICO DE FLUORESCENCIA
Algunas sustancias químicas absorben la energía
de las ondas ultravioletas y la emiten como ondas
visibles de mayor longitud. Así, un material
aparece con un color a la luz ordinaria y con otro
del todo distinto con luz ultravioleta, a estos
materiales se les llama fluorescentes y al
fenómeno fluorescencia. Los microorganismos
que se tiñen con un colorante fluorescente
aparecen como objetos luminosos cuando se
observan al microscopio con luz ultravioleta. Los
colorantes fluorescentes tienen varias aplicaciones
en microbiología, entre ellas, una de las más notables ha sido detectar las reacciones
inmunológicas, es decir, reacciones de anticuerpos con antígenos.
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
El microscopio electrónico utiliza ondas de
electrones y campos magnéticos para
producir la imagen, se utiliza principalmente
para el examen de virus y de la ultraestructura
de las células microbianas. La resolución
superior de la microscopia electrónica se
debe al hecho de que los electrones tienen
una longitud de onda mucho más corta que
los fotones de la luz blanca.
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CAPÍTULO III. ESTERILIZACIÓN y DESINFECCION
Los microorganismos se encuentran en la naturaleza, como todos los seres vivos,
inmersos en un medio ambiente. El estado fisiológico y capacidad de desarrollo
microbiano dependen de la actividad metabólica, dirigida por numerosas enzimas y
proteínas celulares codificadas por el material genético, y por otra parte,
condicionados por el medio ambiente. Los microorganismos se encuentran bajo la
influencia de factores físicos y químicos, los cuales ejercen en su crecimiento y
desarrollo un efecto decisivo, favorable o desfavorable. En la práctica
médicoquirúrgica de las enfermedades transmisibles, en el trabajo del laboratorio
microbiológico y en la higiene y saneamiento de locales, personas, animales y
alimentos se destaca el rol de todo procedimiento, técnica o producto que suprima o
disminuya la viabilidad de los microorganismos patógenos.
Los principios que rigen los mecanismos de acción de los agentes físicos, químicos o
mecánicos son herramientas utilizadas en el control del crecimiento microbiano y
sirven de base a las prácticas de esterilización, desinfección, antisepsia y sanitización.
28
La destrucción o inhibición del crecimiento microbiano por parte de un agente
antimicrobiano es afectada por diversos factores:
Para microorganismos, el único criterio válido de muerte es la pérdida irreversible de
la capacidad para reproducirse. El mecanismo de los procesos de “muerte” difiere de
acuerdo al método empleado, alcanzando el mismo efecto: proteínas o
macromoléculas esenciales de la célula son inactivadas interfiriendo con el ciclo
metabólico celular y bloqueando su capacidad de desarrollo y reproducción.
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ESTERILIZACIÓN
Dentro del concepto de esterilización, se analizarán cuáles son los diferentes métodos
de esterilización que se pueden aplicar y cuáles son sus utilidades prácticas. Existen
diferentes métodos:
TEMPERATURA
El calor es el agente letal más ampliamente utilizado en la esterilización. Su acción
esterilizante depende de su naturaleza, intensidad y tiempo de aplicación; del grado
de humedad y del pH del medio y de la susceptibilidad diferencial a la temperatura,
de cada microorganismo en particular.
Calor húmedo
El calor húmedo requiere menos tiempo como agente esterilizante con respecto al
calor seco debido a que el agua es un buen conductor del calor, de esta manera el
calor penetra mejor y se distribuye más uniformemente.
La esterilización confiable con calor húmedo requiere temperaturas superiores a la de
la ebullición del agua. Estas temperaturas elevadas se alcanzan con más frecuencia
mediante vapor de agua saturado a presión y su aplicación requiere de un aparato
llamado AUTOCLAVE
30
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Calor seco
El calor seco requiere mayor duración e intensidad, con respecto al calor húmedo,
cuando es empleado como agente esterilizante, porque la conducción del calor es
menor en el aire que en el vapor. Además, en ausencia de agua, la estructura nativa de
una proteína está estabilizada por puentes hidrógeno y enlaces disulfuro. En este
estado, la resistencia al calor de las células bacterianas y de las endosporas en estado
de desecación es mayor. El calor seco destruye los microorganismos por oxidación de
sus constituyentes intracelulares.
Entre los métodos descriptos y para poder aprovechar el poder esterilizante del aire
caliente es necesario el empleo de ciertos aparatos conocidos con el nombre de
ESTUFAS.
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Una estufa de esterilización consta de una cabina metálica de doble pared, con
resistencia eléctrica; un termostato, un termómetro y estantes para colocar el material
a esterilizar. El aire caliente circula por el espacio existente entre la doble pared
transmitiendo el calor a los objetos que se encuentran en los estantes de la estufa.
Generalmente, el tiempo y la temperatura del tratamiento para lograr una correcta
esterilización es: 180 – 160º C durante 1 h – 1 ½ h, respectivamente. Los tiempos y la
temperatura pueden variar según las condiciones de trabajo, tales como cantidad y
calidad del material.
RADIACIONES
Se puede definir radiación como la propagación de energía por el espacio. Los
principales tipos de radiaciones que pueden tener efectos sobre los seres vivos son:
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A medida que disminuye la longitud de onda, aumenta la energía de la radiación y
causa alteraciones (ruptura, ionización) de las macromoléculas celulares (ADN y
proteínas).
Los efectos de las radiaciones ionizantes son letales, tanto directos como indirectos,
así como mutagénicos. Los efectos letales directos se logran a altas dosis de radiación,
mientras que los letales indirectos y mutagénicos se consiguen a menores dosis.
MÉTODOS MECÁNICOS
Filtración
La filtración se usa para remover los microorganismos de soluciones termolábiles que
obviamente no pueden ser esterilizadas por calor. Los compuestos sensibles al calor
tales como: suero de animales, soluciones de enzimas, algunas vitaminas y antibióticos,
son filtrados antes de ser adicionados a un medio de cultivo. En la filtración se usan
membranas capaces de retener microorganismos por el pequeño tamaño de los poros
del filtro y en parte por la adsorción a las paredes del poro debido a la carga eléctrica
del mismo y de los microorganismos.
En la práctica se utilizan principalmente dos tipos de filtros:
Filtros de membrana: son discos de acetato de celulosa (discos Millipore), nitrato de
celulosa, policarbonato, poliéster o polipropileno con poros de tamaño uniforme que
varían de 0,05 a 1 m. En la actualidad los de mayor utilidad son los de poros 0,45 m
(clarificantes) y 0,2 m (esterilizantes), ambos son descartables. La filtración se realiza
por aplicación de presión positiva o negativa. Una vez armado el equipo de filtración
34
(Figura 3.2.A), se envuelve en papel metalizado y papel blanco y se esteriliza en
autoclave a 3/4 atm, durante 30 min. Se debe procurar el enfriamiento del filtro antes
de ser retirado del autoclave para evitar su ruptura.
Filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air): están compuestos por pliegues de
acetato de celulosa que retienen las partículas (incluidos los microorganismos) del aire
que sale de la cabina de seguridad biológica (Figura 3.2.B). Son de gran utilidad en
unidades de aislamiento (sala de prematuros, quemados, pacientes bajo tratamiento
inmunosupresor) que requieren de aire purificado.
MÉTODOS QUÍMICOS
Agentes alquilantes
El requisito esencial para un agente químico esterilizante es que sea tóxico para los
microorganismos, así como volátil de manera que pueda ser fácilmente eliminado del
objeto esterilizado luego del tratamiento. Normalmente se usa el formaldehído y el
óxido de etileno, los cuales sustituyen los átomos lábiles de hidrógeno de los grupos
-NH2 (amino) y -OH (oxidrilo), presentes en proteínas y ácidos nucleicos y también de
los grupos -COOH (carboxilo) y -SH (sulfhidrilo) de proteínas por grupos alquilos
(reacción de alquilación).
35
Actividad 4
Realiza la siguiente tabla comparativa sobre los distintos métodos de esterilización
Método
Ebullición
Características
Pasteurización
Autoclave de
vapor
Horno Pasteur
Flameado
36
Por radiación UV
Incineración
Por filtración
Tindalización
Radiación
ionizante
37
Actividad 5
Presta atención a la presentación de power point que te compartirá tu docente sobre
la NOM-087-ECOL-1995, Que establece los requisitos para la separación, envasado,
almacenamiento, recolección, transporte, tratamiento y disposición final de los
residuos peligrosos biológico-infecciosos que se generan en establecimientos que
presten atención médica y realiza un cuadro sinóptico donde incluyas la clasificación
de los RPBI y su correcto manejo.
38
CAPÍTULO IV. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
MEDIO DE CULTIVO
Es un complejo de sustancias que aportan nutrientes en concentraciones óptimas que
permiten un buen desarrollo de los microorganismos.
Diseño de los medios de cultivo
La composición química de las células refleja cuáles son los principales materiales
requeridos para el crecimiento. El agua representa entre el 80 y 90 % del peso total y
es, así, el principal nutriente. La materia sólida de las células contiene hidrógeno y
oxígeno (proveniente del agua), carbono, nitrógeno, fósforo y azufre. Estos seis
elementos se conocen como macronutrientes ya que se requieren en altas
concentraciones (en g/litro) y bajo una forma orgánica o inorgánica, según el
microorganismo. Los elementos como el potasio, magnesio, calcio y hierro, deben
proporcionarse en cantidades de mg/litro e incluirse como sales.
39
Los medios de cultivos se clasifican en:
40
Las posibles fuentes de error en la preparación de medios de cultivo son:
•
•
•
•
•
•
•
•
Selección inadecuada del medio de cultivo o uso inapropiado.
Adición de un volumen incorrecto de agua o utilización de agua corriente con
impurezas.
Adición de menor cantidad de agar al medio, lo cual se manifiesta por la no
solidificación correcta del mismo.
Utilización de balanzas inadecuadas cuyo margen de error altera la
composición del medio.
Distribución errónea del volumen del medio que puede resultar inapropiado
para su utilización.
Disolución insuficiente del agar.
La esterilización a temperaturas elevadas y/o durante períodos de tiempo
largos, puede ocasionar el deterioro de algunos constituyentes.
Los residuos adheridos al vidrio pueden inhibir algunos microorganismos
exigentes particularmente a los virus.
41
Competencia a desarrollar: Aplica técnicas de aislamiento de microorganismos
Actividades
Porcentajes
5%
• Identificación de organelos
celulares
10%
• Tabla de funciones de los
organelos celulares
5%
• Tabla de movimientos de los
fosfolípidos
15%
• Mapa mental de los aspectos
físicos que intervienen en el
crecimiento bacteriano
20%
• Practica 3
40%
• Examen
5%
• Lección 10.1
42
CAPITULO V. CELULA PROCARIOTA
Las células son bioquímica, estructural y
funcionalmente muy complejas; se
clasifican en procariotas y eucariotas.
El término procariota significa “antes del
núcleo”.
Todos los seres vivos están formados de
uno de estos dos tipos de células. Las
células procariontes constan de un
único compartimiento cerrado rodeado
por la membrana plasmática, carecen de
un núcleo definido y tienen una
organización interna bastante sencilla,
comparada con la organización de las
células
eucariontes.
Todos
los
organismos procariontes pertenecen al reino monera.
Las células procariotas son aquellas que no tienen núcleo diferenciado, de manera que
su ADN se encuentra localizado en el citoplasma pero no encerrado en una cubierta
membranosa como ocurre con las células eucariotas. Además contienen membrana
celular, pared celular, citoplasma y ribosomas. Prácticamente todas las células
procariotas son organismos unicelulares.
Aunque las células procariotas no tienen compartimientos rodeados por membrana,
muchas proteínas están localizadas en el interior acuoso o citosol, lo que indica que
presentan una organización interna. Una sola bacteria de Escherichia coli tiene un peso
seco de 25 X 10-14 gramos.
Se estima que 1 - 1,5 kilogramos del peso promedio de un ser humano se debe a las
bacterias, sobre todo a las que forman la flora normal en el intestino grueso.
Se han encontrado células procariontes a 11 kilómetros de profundidad en el océano
y a 65 kilómetros por encima en la atmósfera; como se ve, son bastante adaptables.
Tipos de células procariotas:
Arqueas: Microorganismos unicelulares muy
primitivos. La diferencia a nivel molecular entre
arquea y bacteria es muy elevada, por ello se
clasifican en grupos distintos.
Bacterias: Organismos
evolucionados.
microscópicos
más
43
Actividad 6
Investiga el nombre de cada uno de los organelos de la célula procariota e
identifícalos en la siguiente imagen
44
Actividad 7.
Investiga la función de cada uno de los organelos de la célula procariota
Organelo
Función
Cuerpo de Inclusión
Mesosoma
Ribosoma
Nucleoide
Membrana Plasmática
Pared Celular
Capsula
Flagelo
Fimbria
Pilis
45
MEMBRANA PLASMATICA
La membrana plasmática delimita el territorio de la célula y controla su contenido
químico, es decir, la célula está rodeada por una membrana que representa el límite
entre el medio extracelular y el intracelular; a través de ella se transmiten mensajes que
permiten a las células realizar numerosas funciones.
La membrana plasmática es tan delgada que no se puede percibir con el microscopio
óptico.
Con el microscopio electrónico se visualiza como una línea de alrededor de 8
nanómetros (nm) compuesta de dos capas densas de unos 2.5 nm de espesor,
separadas por una capa más clara de alrededor de 3 nm de ancho.
Las funciones de la membrana plasmática son:
•
•
•
•
Regula el paso de sustancias hacia el interior de la célula y viceversa. Permite el
paso de ciertas sustancias e impide el paso de otras, actuando como barrera
con permeabilidad selectiva.
Es una estructura continua que rodea a la célula. Por un lado, está en contacto
con el citoplasma (medio interno) y por el otro, con el medio extracelular que
representa el medio externo.
Contiene receptores específicos que permiten a la célula interaccionar con
mensajeros químicos y emitir la respuesta adecuada y, por consiguiente,
proporciona el medio apropiado para el funcionamiento de las proteínas de
membrana.
Aísla y protege a la célula del ambiente externo, confiriéndole su individualidad,
al separarla del medio externo
46
¿QUÉ SON LOS FOSFOLÍPIDOS?
Los fosfolípidos son los principales
componentes estructurales de la
membrana plasmática.
Estas moléculas son anfipáticas, esto
significa que poseen un extremo
hidrofílico muy polar (la cabeza) y un
extremo
hidrofóbico
no
polar,
constituido por dos largas cadenas de
ácidos grasos (la cola). Los extremos no
polares, con fobia al agua, forman el interior hidrofóbico de la membrana, mientras
que los extremos muy polares se orientan hacia la superficie donde hay agua, que
también es polar.
Los fosfolípidos se encuentran acomodados en dos capas y se le conoce como doble
capa fosfolipídica o bicapa lipídica la cual es fluida, es decir, tiene características de
líquido por lo que se encuentran en constante movimiento, donde intercambian sus
lugares con las moléculas vecinas.
La membrana plasmática no es una estructura estática; sus componentes tienen
movimiento, lo que le proporciona fluidez.
Actividad 8
Investiga cuales son los 4 tipos de movimientos de los fosfolípidos en la
membrana celular y en que consiste cada uno
Movimiento
¿En qué consiste?
47
REPRODUCCIÓN BACTERIANA
Como la mayoría de los seres vivos, los procariotas pueden reproducirse mediante
métodos asexuales o sistemas parasexuales.
Reproducción asexual.
La reproducción asexual es el
sistema
más
primitivo
de
reproducción, el
primero
en
aparecer en el curso evolutivo y por
lo tanto el más extendido.
Consideramos éste un sistema
asexual pues, a partir de una sola
célula original se originan dos
individuos genéticamente
idénticos entre si, es decir clones. La
ventaja
del
primer
sistema,
reproducción asexual es su rapidez:
si una bacteria está viviendo en un
ambiente adecuado puede dividirse en unos veinte minutos y generar grandes
poblaciones.
El método más habitual es la bipartición o fisión binaria en la que, a partir de una célula
original, resultan dos células hijas aproximadamente iguales en tamaño y con la misma
dotación genética: una copia de la molécula de ADN circular propia de la célula
“madre” en cada una de ellas.
Reproducción sexual.
Las bacterias, en sentido estricto, no poseen
mecanismos de reproducción sexual. No se
forman gametos, ni estos se fusionan en un
zigoto. Sin embargo, si que tienen
mecanismos de intercambio de genes que
conllevan la aparición de bacterias “hijas” con
características diferentes a las originales, lo
que es una de las principales consecuencias
de los procesos sexuales.
48
INCLUENCIA DEL MEDIO AMBIENTE SOBRE LOS MMICROORGANISMOS
El entendimiento de la influencia medioambiental sobre los microorganismos permite
explicar su distribución ecológica y a diseñar métodos para su control y/o destrucción.
No todos los organismos responden igualmente a un factor ambiental determinado.
De hecho, una condición ambiental puede ser dañina para un organismo y beneficiosa
para otro. Los factores físicos que influyen sobre el crecimiento de los microorganismos
son: temperatura, pH, oxígeno, disponibilidad de agua, presión osmótica y
radiaciones.
Temperatura
La temperatura es uno de los factores ambientales más importantes que influyen en la
proliferación y sobrevida de los organismos. Los microorganismos son particularmente
susceptibles debido a que son usualmente unicelulares y “poikilotérmicos”, es decir
que su temperatura varía de acuerdo a la del medioambiente externo. Ciertas bacterias
pueden desarrollarse a temperaturas extremas que impedirían la supervivencia de casi
todos los organismos eucariotas.
La dependencia de la temperatura de un microorganismo se caracteriza por sus
temperaturas cardinales (temperaturas de crecimiento mínima, óptima y máxima). Al
sobrepasar la temperatura máxima se produce la desnaturalización irreversible de las
proteínas estructurales y enzimáticas. Por debajo de la temperatura mínima los
microorganismos detienen su crecimiento pero mantienen su viabilidad. Estas
características del crecimiento tienen importantes aplicaciones prácticas. Las
temperaturas por encima de la máxima son utilizadas para eliminar microorganismos
mediante los procedimientos de esterilización por calor, mientras que la congelación
es usada para la conservación de cultivos, sangre, plasma, alimentos, cepas
bacterianas. La temperatura óptima permite, entre otros factores, la máxima velocidad
de desarrollo microbiano.
De acuerdo a sus temperaturas cardinales, los microorganismos pueden ser
clasificados en cinco categorías. Los límites y las temperaturas máximas que definen a
las bacterias en estos cinco grupos no están bien definidos, dado que existen
variaciones para cada especie en particular.
49
Acidez y alcalinidad (pH)
La concentración de iones positivos juega un rol decisivo en la colonización de
sustratos de diferentes ambientes. La mayoría de los entornos naturales poseen
valores de pH entre 5 y 9, evidentemente el mayor número de poblaciones
microbianas desarrollarán dentro de estos límites. En general, las bacterias desarrollan
a pH neutro (7,2 - 7,6), cuando el pH disminuye por debajo de 5, el crecimiento
bacteriano es progresivamente menor.
Respecto del margen normal de pH a los que crecen los microorganismos, se
clasifican en:
50
El desarrollo de una población microbiana puede ser inhibido por:
− el descenso de pH debido a la producción de ácidos orgánicos a partir de la
fermentación de los azúcares. − el ascenso de pH resultante de la utilización de
componentes aniónicos o la descomposición de proteínas y aminoácidos.
Oxígeno
El comportamiento de cada microorganismo frente al oxígeno está dado por la
presencia o no de una o más enzimas, tales como: catalasa, peroxidasa, superóxido
dismutasa (SOD), encargadas de destruir los derivados tóxicos del oxígeno: peróxido
(H2O2), anión peróxido (O2-2), oxígeno singlete (1O2), radicales libres superóxido
(O2) y radical hidroxilo (OH- ). Esto determina la concentración gaseosa que debe
suministrarse durante el crecimiento microbiano.
Los microorganismos pueden clasificar en:
51
52
Actividad 9
Realiza un mapa mental con los 3 principales factores físicos que influyen sobre el
crecimiento de los microorganismos (Temperatura, acidez y alcalinidad, oxigeno)
53
CAPITULO VI. MÉTODOS DE SIEMBRA Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS.
La técnica más usada en el laboratorio de microbiología es probablemente la
transferencia de microorganismos de un ambiente a otro con el propósito de
cultivarlos. Una vez que el medio de cultivo está debidamente preparado se procede
a inocular la muestra deseada.
Si se desea aislar o separar los diferentes tipos microbianos que se encuentran en una
muestra (agua, materias primas, alimentos, etc.) se pueden utilizar distintas técnicas de
siembra. Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de la muestra
(inóculo) en un medio de cultivo adecuado con el fin de iniciar un cultivo microbiano;
y se realizan diferentes metodologías de acuerdo al fin que se persiga. Luego de
sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el
crecimiento.
Dependiendo del estado físico del medio de cultivo (líquido, sólido o semisólido) la
siembra se puede realizar con: ansa en anillo, ansa en punta, varilla de vidrio (espátula
de Drigalsky), hisopo o pipeta estéril.
El ansa de siembra consta de un filamento de platino, que puede ser recto o en anillo.
Para facilitar el manejo, este filamento está sujeto a un mango aislante.
Antes de poner en contacto el ansa de siembra con los microorganismos. Esta debe
ser esterilizada para evitar contaminaciones; para ello se la incinera a la llama del
mechero Bunsen, hasta que todo el filamento esté incandescente. Se deja enfriar el
ansa cerca de la llama y luego, se la introduce en el recipiente (tubo, placa, frasco
Erlenmeyer, etc.) que contenga el cultivo microbiano o la muestra que se quiere
trasladar.
54
55
CULTIVOS EN MEDIOS SÓLIDOS
Siembra en picadura o punción
Se introduce el ansa en punta con el inóculo en
un tubo conteniendo agar en columna, sin tocar
las paredes del tubo y en forma paralela
asegurándose que el inóculo quede distribuido
a lo largo de toda la punción. Se retira el ansa y
se quema. Esta técnica permite conocer el
comportamiento de los microorganismos frente
al oxígeno y su movilidad
Siembra en estrías
Se toma el material con ansa en anillo y se
siembra en estrías en un tubo que contiene
agar pico de flauta o agar inclinado,
respetando las indicaciones señaladas
anteriormente. Esta técnica constituye un
medio adecuado para el cultivo de
microorganismos aerobios y aerobios
facultativos.
Siembra por agotamiento en estrías
Con el ansa en anillo cargada de material se realiza una serie de estrías paralelas no
superpuestas, sobre una tercera parte de la superficie de la placa de Petri conteniendo
el medio de cultivo. Se esteriliza el ansa y se efectúan una serie de estrías en dirección
perpendicular a la anterior, comenzando en la zona donde termina la última estría. Este
procedimiento se repite varias veces. El esterilizar el ansa de siembra disminuye la
cantidad de microorganismos que se extiende en una superficie determinada. Una vez
inoculadas las placas se incuban en estufa durante 24 – 48 h, a la temperatura
adecuada según el microorganismo a cultivar. Utilizando esta metodología de siembra
se obtienen colonias aisladas en las últimas estrías, separadas unas de otras,
permitiendo a partir de las mismas la obtención de cultivos puros mediante resiembra
en otro medio de cultivo.
56
Siembra con espátula de Drigalsky
Se pipetea un volumen de inóculo (generalmente 0,1 ml) y se deposita sobre la
superficie de la placa de Petri que contiene el medio de cultivo solidificado. Con una
espátula de Drigalsky estéril (previamente embebida en alcohol, flameada y enfriada)
se disemina la muestra por toda la superficie, efectuando movimientos de rotación
hasta su completa absorción. Esta técnica permite sembrar inóculos sobre superficies
grandes, para obtener un crecimiento confluente que nos permite estudiar el efecto
de antimicrobianos (antibióticos,
antisépticos, desinfectantes, etc.).
También se utiliza para realizar
recuento de colonias; para cumplir
con
este
último
objetivo,
previamente se deben realizar
diluciones seriadas de la muestra
57
Siembra en placa vertida
Se lleva un volumen de inóculo (generalmente 1 ml) a un tubo que contiene agar
fundido y se vierte el contenido en una placa de Petri vacía y estéril. Se homogeneiza
el contenido de la placa efectuando movimientos rotatorios en ambas direcciones para
distribuir su contenido y se deja solidificar. Una vez incubada a la temperatura
adecuada, se observarán colonias en profundidad (inmersas en el medio) y en la
superficie. Esta técnica permite el desarrollo de microorganismos aerobios, aerobios
facultativos y microaerófilos.
CULTIVOS EN MEDIOS LÍQUIDOS
Se lleva el material con ansa en anillo o pipeta a un recipiente (frasco Erlenmeyer o
tubo) conteniendo el medio de cultivo líquido. Generalmente este tipo de siembra se
utiliza para aumentar el número de microorganismos.
58
FASES DEL CRECIMIENTO BACTERIANO
El crecimiento bacteriano en un cultivo se da cuatro fases diferentes: fase de
adaptación (A), fase exponencial (B), fase estacionaria (C), y fase de declive (D).3 4
A. Durante la fase de adaptación, las bacterias se adaptan a las condiciones de
crecimiento. Es el período en el que las bacterias individuales están madurando y no
tienen aún la posibilidad de dividirse. Durante la fase de adaptación del ciclo de
crecimiento de las bacterias, se produce la síntesis de ARN, enzimas y otras moléculas.
Así que en esta fase los microorganismos no están latentes.
B. La fase exponencial (a veces llamada fase logarítmica) es un período caracterizado
por la duplicación celular. El número de nuevas bacterias que aparecen por unidad de
tiempo es proporcional a la población actual. Si el crecimiento no se limita, la
duplicación continuará a un ritmo constante, por lo tanto el número de células y la tasa
de crecimiento de la población se duplica con cada período de tiempo consecutivo.
Para este tipo de crecimiento exponencial, representando el logaritmo natural del
número de células frente al tiempo se obtiene una línea recta. La pendiente de esta
línea es la tasa de crecimiento específica del organismo, que es una medida del
número de divisiones por célula y por unidad de tiempo. La tasa real de este
crecimiento (es decir, la pendiente de la recta en la figura) depende de las condiciones
de crecimiento, que afecta a la frecuencia de los eventos de división celular y a la
probabilidad de que ambas células hijas sobrevivan. Bajo condiciones controladas, las
cianobacterias pueden duplicar su población cuatro veces al día.6 El crecimiento
exponencial no puede continuar indefinidamente, sin embargo, porque el medio llega
pronto al agotamiento de nutrientes mientras se acumulan los desechos.
C. Durante la fase estacionaria, la tasa de crecimiento disminuye como consecuencia
del agotamiento de nutrientes y la acumulación de productos tóxicos. Esta fase se
alcanza cuando las bacterias empiezan a
agotar los recursos que están disponibles
para ellas. Esta fase se caracteriza por un
valor constante del número de bacterias a
medida que la tasa de crecimiento de las
bacterias se iguala con la tasa de muerte
bacteriana.
D. En la fase de declive o muerte, las
bacterias se quedan sin nutrientes y
mueren.
59
Competencia a desarrollar: Aplica técnicas de identificación de microorganismos
•
•
•
•
•
•
Actividades
Cuadro comparativo sobre las
pruebas bioquímicas
Tabla de identificación de
microorganismos
Practica 4
Practica 5
Examen
Lección 12.1
Porcentajes
15%
10%
20%
20%
30%
5%
60
CAPITULO VII.MORFOLOGIA MACROSCOPICA Y MICROSCOPICA DE LAS
BACTERIAS
Todos los medios de cultivo, una vez sembrados, se dejan incubar durante un cierto
plazo y a una temperatura conveniente, luego de lo cual es necesario observar y anotar
los cambios sufridos en los distintos medios de cultivo empleados.
OBSERVACIÓN EN MEDIOS DE CULTIVO LÍQUIDOS
1. Enturbiamiento en toda la masa del cultivo.
2. Desarrollo formando grumos que se depositan en el fondo del tubo dejando el
resto del líquido transparente.
3. Desarrollo en la superficie formando un velo o película.
4. Puede observarse aparición de color en el medio de cultivo debido a la síntesis de
pigmentos difusibles.
OBSERVACIÓN EN MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS
Es muy importante el estudio macroscópico de la colonia cuando se cultiva a la
bacteria en la superficie de un medio sólido; de la multiplicación de cada germen se
origina una colonia formando una masa de millones de gérmenes observables a
simple vista.
La morfología de la colonia deriva de cada célula, pero es una característica de la masa
celular. Las características que se observan y se analizan de cada colonia son:
I.
II.
Tamaño: uniforme para cada especie o tipo, las dimensiones varían desde muy
pequeñas o apenas visibles, hasta unos centímetros de diámetro.
Forma: depende del borde y pueden ser: Circular, filamentosa, irregular,
rizoide y puntiforme
61
III.
IV.
V.
VI.
VII.
VIII.
Bordeo margen: El borde puede ser liso, entero, ondulado, lobulado,
filamentoso o rizado
Elevación, pueden ser elevadas, convexas, cónicas, crateriformes. planas,
embonada
Consistencia: blanda, seca o viscosa.
Color: amplia gama de colores
Olor: Algunas cepas desarrollan olores característicos que sirven para orientar
su identificación
Hemolisis: Característica que se observa en medios de cultivo con sangre
donde se forman halos alrededor de la colonia
62
MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA DE LAS BACTERIAS
El tamaño de las bacterias oscila entre las 0.5 y 3 µm, pudiendo llegar en algunos tipos
a 10 µm. Las bacterias de interés médico tienen un tamaño entre 0.4 y 2 µm. Solo son
visibles al microscopio óptico o microscopio electrónico. Para observarlas con el
microscopio óptico se usa el objetivo de inmersión (100X), sumergiendo esta lente en
una gota de aceite (aceite de inmersión) en el preparado a observar. A modo
comparativo, una célula eucariota mide más de 5 µm (un eritrocito tiene un diámetro
de 7µm), mientras que un reovirus mide menos de 0.1µm.
La forma de las bacterias al microscopio está determinada por la rigidez de su pared
celular. Básicamente, se diferencian según su forma en cocos, bacilos, espirilos y
comas.
Las bacterias pueden mantenerse unidas unas con otras después de la división celular,
pero conservando siempre la independencia celular. Podemos encontrar entonces
cocos en cadena, en tétradas o en racimos. Los bacilos pueden ser muy cortos o muy
largos. Sus extremos pueden ser redondeados o rectos; pueden estar aislados, en
cadenas, en filamentos o formando letras chinas. La morfología bacteriana debe ser
observada con el microscopio óptico o el microscopio electrónico.
Cocos: Son de forma redondeados, tienen poca relación con el exterior, viven en
medios ricos en nutrientes, se transmiten por el aire, resistentes y son muy patógenos.
En grupo de a dos son: diplococos, Cuando forman cadenas: estreptococos, En
grupos: estafilococos, masas cúbicas: sarcinas
63
Bacilos: Son alargados, cilíndricos y en forma de bastón, pueden vivir en lugares
pobres en nutrientes como lo son las vías urinarias o el agua. Son menos resistentes
que los cocos y son susceptibles a cambios ambientales. No se transmiten por el aire,
estos se transmiten a través de líquidos o superficies húmedas.
Espirilos: Su forma es de hélice o espiral, su diámetro es tan pequeño que les
permite atravesar las mucosas. Son muy sensibles a los cambios ambientales y su vía
de transmisión es a través de contacto directo o mediante vectores.
Vibrios: Son cortos, curvados, viven en medios viscosos y su vía de transmisión es a
través de contacto directo o mediante vectores.
Cocobacilos. La palabra Cocobacilo se refiere a microorganismos que combinan:
forma de bacilo (bastón), y forma de coco (esférica
64
PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA MICROSCOPIA ÓPTICA
Confección de preparados para observación en fresco: técnica de montaje en
fresco
La forma más simple de examinar microorganismos vivos es suspenderlos en agua u
otro líquido, colocar una gota de esta suspensión en un portaobjetos y encima un
cubreobjetos, utilizando para su observación al microscopio los objetivos secos (10 x
a 40x).
Para evitar la evaporación y el efecto de las corrientes de aire, se puede rodear la
preparación con vaselina, que cierra el espacio exterior entre el portaobjetos y el
cubreobjetos. Cuando la observación es inmediata no es necesario el uso de la
vaselina.
Confección de preparados para coloraciones
En Microbiología todas las tinciones se realizan a partir de suspensiones de
microorganismos extendidas en un portaobjetos (frotis), secadas y fijadas. La fijación
es un procedimiento que permite preservar estructuras celulares, se puede llevar a
cabo con diferentes tratamientos: fijación por calor o fijación química. La fijación por
calor es la más utilizada para la observación de bacterias, preserva la morfología
externa de los microorganismos pero no las estructuras internas. La fijación química
con agentes como etanol, formaldehído y ácido acético entre otros, se utiliza para
preservar las estructuras celulares.
Preparación y coloración de frotis
La forma más común de preparar un frotis es extender una pequeña cantidad de
muestra sobre un portaobjetos limpio y desengrasado, con un ansa en anillo,
previamente esterilizada a la llama del mechero y enfriada. Luego, se seca el extendido
al aire aunque puede acelerarse por calentamiento suave en la cercanía de la llama del
mechero. Una vez seco, el preparado debe fijarse; una forma sencilla y rápida consiste
en fijar por calor, pasando el frotis suavemente sobre la llama del mechero evitando
un recalentamiento excesivo del vidrio. Esto impedirá el arrastre de los
microorganismos por las soluciones de colorantes y lavados durante la coloración.
Coloraciones
Las coloraciones se usan para teñir a las células aumentando así su contraste, de tal
manera, que puedan observarse más fácilmente en el microscopio de campo claro. En
general, consisten en cubrir el frotis seco y fijado con una o más soluciones de
colorantes. Los tiempos, cantidad y tipos de colorantes varían según el tipo de
65
coloración empleada. Finalmente, se lava el portaobjetos con agua, se seca, se coloca
una gota de aceite de inmersión y se observa al microscopio con objetivo de inmersión
de 100x (Figura 2.2)
Para aplicar los colorantes los microbiólogos emplean diferentes clases de tinciones:
Tinción simple
Se utiliza un colorante, generalmente básico, como por ejemplo, azul de metileno,
cristal violeta y fucsina. Todos los microorganismos toman el mismo color, con este tipo
de coloración no se pretende diferenciar microorganismos o estructuras celulares. La
tinción simple nos proporciona exclusivamente información acerca de la forma,
tamaño y tipo de agrupación de los microorganismos. Sin embargo tiene la ventaja de
ser un método muy sencillo y rápido.
66
Tinción diferencial
Se denominan así los procedimientos de coloración que ponen de manifiesto
diferencias entre las células microbianas o entre subestructuras de una misma célula.
Básicamente comprenden el empleo de más de un colorante, mordientes y/o
decolorantes específicos.
Ejemplos: tinción de Gram, tinción de endosporas, etc.
Tinción especializada
Se utiliza para identificar y estudiar determinadas estructuras que pueden estar
presentes en los microorganismos. En las tinciones estructurales se colorea
únicamente una parte de la célula. Se utiliza este tipo de tinciones para poner en
evidencia la presencia de cápsulas, endosporas, flagelos o inclusiones (almidón,
polifosfato, etc.).
67
TINCIONES
COMÚNMENTE
MICROBIOLOGÍA
USADAS
EN
Coloración de azul de metileno (tinción simple,
directa, positiva)
Se cubre el frotis ya fijado con la solución de colorante
durante aproximadamente 5 minutos. Lavar con agua,
secar y observar al microscopio.
Coloración de Gram (tinción diferencial)
La tinción de Gram fue desarrollada por el bacteriólogo
danés Hans Christian Gram en 1884 y es la tinción
diferencial más utilizada de forma rutinaria y prácticamente
la primera prueba a la que se someten las muestras de
cualquier origen antes de su estudio. Proporciona una
información esencial, sobre la forma, tamaño y agrupación
celular. La tinción de Gram divide a las bacterias con pared
del Dominio Bacteria en dos grandes grupos según el tipo
y composición de la pared que presentan: bacterias con
pared de tipo Gram positiva y bacterias con pared de tipo
Gram negativa.
PROCEDIMIENTO
a) Preparar el frotis en la forma ya indicada.
b) Cubrir el frotis ya fijado con cristal violeta y dejar actuar durante 1 min.
c) Lavar con agua corriente, cuidando que no se arrastre la preparación.
D) Cubrir con solución de Lugol (I3K), dejar actuar durante 1 min y lavar con agua.
c) Cubrir con alcohol-acetona, durante 10 s y lavar con agua (3 veces).
d) Cubrir con solución de fucsina básica o safranina (si se usa la fucsina fenicada se
diluye 1/10), dejar actuar 30 s y lavar con agua. Secar y observar al microscopio con el
objetivo de inmersión (100x).
RESULTADOS
Con esta coloración las bacterias se presentan de dos colores distintos, las llamadas
GRAM POSITIVAS, de color azul a violeta, y las llamadas GRAM NEGATIVAS, de color
rosado a rojo (Figura 2.3).
68
FUNDAMENTO TINCIÓN GRAM
Las bacterias reaccionan de modo
distinto frente a la tinción de Gram
porque las diferencias estructurales en
sus paredes determinan la retención o el
escape del complejo cristal violeta/yodo
(lugol). Entre otras diferencias las
bacterias Gram positivas tienen un
peptidoglucano en su pared celular más
grueso que las bacterias Gram negativas.
Por otro lado, las bacterias Gram
positivas presentan un polímero con un gran número de uniones cruzadas dando
como resultando un plano de malla pequeña, mientras que, las bacterias Gram
negativas presentan un polímero con pocos entrecruzamientos que determina una
malla planal de “criba” o tamiz grande. Por lo tanto, al agregar el yodo se forma un
complejo cristal violeta/mordiente con un tamaño molecular mayor al del tamiz del
peptidoglucano de las bacterias Gram positivas y menor al tamiz de las Gram
negativas. En consecuencia, cuando se decolora el preparado con alcohol o alcoholacetona, las células Gram positivas retienen el Microbiología I (2159) 14 complejo
colorante-mordiente y permanecen de color violeta. En cambio, en las células Gram
negativas el alcohol altera la capa externa de lipopolisacárido y el complejo
colorante/mordiente se elimina de la capa delgada de peptidoglucano. Como
consecuencia, las células Gram negativas son incoloras hasta que se agrega el
colorante de contraste rojo (fucsina o safranina), después de lo cual aparecen de color
rosado.
69
CAPITULO VIII.IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS
METABOLISMO MICROBIANO
Ahora que conocemos la estructura de las células bacterianas, podemos estudiar las
actividades que permiten la proliferación de estos microorganismos. Hasta los
procesos vitales de los organismos muy simples incluyen una gran cantidad de
reacciones bioquímicas complejas.
Aunque no la totalidad, la mayoría de los procesos bioquímicos de las bacterias se
observan en los eucariotas y en las células de los organismos pluricelulares, incluido el
hombre. Sin embargo, las reacciones específicas de las células bacterianas les
permiten hacer cosas que el ser humano no puede hacer.
Definimos al metabolismo microbiano como el conjunto de procesos por los cuales
un microorganismo obtiene la energía y los nutrientes (carbono, por ejemplo) que
necesita para vivir y reproducirse. Los microorganismos utilizan numerosos tipos de
estrategias metabólicas distintas y las especies pueden a menudo distinguirse en base
a estas estrategias. Las características metabólicas específicas de un microorganismo
constituyen el principal criterio para determinar su papel ecológico, su
responsabilidad en los ciclos biogeoquímicos y su utilidad en los procesos industriales.
A través del metabolismo, se transforman en el interior de la célula, distintas sustancias
nutritivas que el organismo obtiene del medio. Estas transformaciones se llevan a cabo
por distintas reacciones enzimáticas.
El metabolismo se divide en:
Puede dividirse en dos categorías:
o Rutas generadoras de energía o degradativas (catabolismo)
o Rutas consumidoras de energía o biosintéticas (anabolismo)
La función química esencial del metabolismo productor de energía es la de sintetizar
moléculas orgánicas que poseen un alto nivel de energía potencial en forma de
enlaces
ricos en energía, la que luego es acoplada por medio de reacciones a las vías
anabólicas. Las reacciones catabólicas producen energía como ATP, el cual es utilizado
en las reacciones anabólicas para sintetizar el material celular a partir de nutrientes.
Las principales funciones del metabolismo son:
➢ Formar las subunidades que luego serán utilizadas en la síntesis de
macromoléculas
➢ Proporcionar la energía necesaria para todos aquellos procesos que la requieran
como transporte activo, movilidad, biosíntesis, etc.
70
El metabolismo de las bacterias tiene muchos procesos en común con el metabolismo
de las células eucariotas, pero algunos procesos son exclusivos del metabolismo
bacteriano
Algunas particularidades del metabolismo bacteriano son:
➢ El metabolismo de la bacteria está adaptado para el crecimiento veloz y
transcurre entre 10 y 100 veces más rápido que en las células humanas
➢ La bacteria tiene mayor versatilidad en cuanto al tipo de nutrientes que puede
utilizar para obtener energía
➢ La bacteria tiene una mayor versatilidad en la utilización de oxidantes y no están
limitadas al sólo uso del O2
➢ Existe una gran diversidad de requerimientos nutricionales entre las bacterias
debido a que ellas no poseen todos los caminos biosintéticos
➢ El cuerpo de los procariotas es muy sencillo, lo que le permite sintetizar
macromoléculas por mecanismos menos engorrosos que los que utilizan las
células eucariotas
➢ Algunos procesos biosintéticos son únicos de las bacterias, como los que
conducen a la síntesis de mureína, ácidos teicoicos y lipopolisacárido
71
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Las pruebas bioquímicas permiten determinar las características metabólicas de las
bacterias objeto de identificación. Algunas de estas pruebas son técnicas rápidas, ya
que evalúan la presencia de una enzima preformada y su lectura varía entre unos
segundos hasta unas pocas horas. Otras pruebas requieren para su lectura el
crecimiento del microorganismo con una incubación previa de 18 a 48h; a este grupo
pertenecen la mayoría de las pruebas que detectan componentes metabólicos o
aquellas que determinan la sensibilidad de un microorganismo a una sustancia dada
tras cultivo en medios de identificación que contienen el sustrato a metabolizar.
Los microorganismos se identifican con fines prácticos, como por ejemplo para
determinar un tratamiento adecuado para una infección.
72
Actividad 10
Realiza la siguiente tabla con la cual podrás conocer las generalidades de cada una de
las pruebas bioquímicas, ya sean rápidas o lentas.
Sugerencia de bibliografía:
• https://es.slideshare.net/Marlenpmtz/pruebas-bioqumicas-61067684
• https://corporacionbiologica.info/wp-content/uploads/2020/12/IDENTIF-DEENTEROBACTERIAS.pdf
73
Nombre
de la
prueba
Coagulasa
Método de
siembra o
análisis
Observación de un
resultado negativo
Observación de un
resultado positivo
Reacción que sucede en un
resultado positivo
Catalasa
Oxidasa
Urea
74
Citrato de
Simmons
Sim
Mio
LIA
75
Kligler
Triple
azúcar
Hierro
(TSI)
76
Género o Especie
Escherichia coli
KLIGLER / TSI
Glucosa
Lactosa
Gas
H2S
Sacarosa
Descarboxilación
Desaminación
+
+
-a
V
(V)
V
V
V
+
+
+
(V)
V
+
+
-
+
-b
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
V
V
V
V
+
V
+
V
V
V
-
+
+
+w
+
+
+
+
+
+
+
V
V
-a
V
V
V
V
+
+
+
+
+
+
+
+
V
+
V
V
V
V
V
+
+
+
+
+
+
+
+
(V)
(V)
+
-
+
+
+
+
+
+
+
Shigella sonnei
Sigella spp
Edwarsiella tarda
Salmonella spp.
+
+
Salmonella typhi
Salmonella Arizona
Citrobacter freundii
Citrobacter koseri
Citrobacter amalonaticua
Citrobacter farmeri
Klebsiella pneumonae
Klebsiella oxytoca
Klebsiella aerogenes
Enterobacter cloacae
+
+
+
+
Serratia marcescens
Serratia liquefaciens
Serratia rubidea
Serratia adorifea
Proteus mirabilis
Proteus vulgaris
Proteus penneri
Morganella morganii
Providencia rettgeri
Providencia alcalifaciens
Providencia stuartii
LIA
+
CITRATO
UREA
V
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Vw
Vw
V
V
+
+
Vw
Vw
Vw
Vw
Vw
+
+
+
+
+
V
MIO
SIM
Ornitina
Indol
H2S
Mov.
V
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
V
+
+
-
+
V
+
V
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+w
+
+
+
+
+
+
+
V
V
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
V
+
+
+
+
V
+
+
V
77
Yersinia enterocolitica
Yersinia pseudotuberculosis
Yersinia pestis
+
-
-
+
+
-
+
-
-
-
V
-
+
+
-
+
-
V
-
+
+
-
-37°C / +22°C
-37°C / +22°C
-37°C / +22°C
78
Actividad 11: Analiza los resultados obtenidos en las siguientes pruebas bioquímicas y concluye
de qué bacteria se trata según la tabla.
KLIGLER/TSI
LIA
CITRATO UREA
LACTOSA + DESCARBOXILACIÓN +
+
SACAROSA+ DE LISINA +
GLUCOSA +
GAS +
H2S -
MIO
SIM
DESCARBOXILACIÓN INDOL –
DE ORNITINA –
H2SMOVILIDAD
-
Bacteria presente _________________________________
KLIGLER/TSI
LIA
CITRATO UREA
LACTOSA + DESCARBOXILACIÓN +
SACAROSA+ DE LISINA GLUCOSA +
GAS +
H2S -
MIO
SIM
DESCARBOXILACIÓN INDOL –
DE ORNITINA +
H2SMOVILIDAD
+
Bacteria presente _________________________________
KLIGLER/TSI
LIA
CITRATO
LACTOSA DESCARBOXILACIÓN SACAROSA- DE LISINA GAS H2S -
UREA
-
MIO
SIM
DESCARBOXILACIÓN INDOL –
DE ORNITINA –
H2SMOVILIDAD
-
Bacteria presente _________________________________
KLIGLER/TSI
LIA
CITRATO UREA
LACTOSA + DESCARBOXILACIÓN GLUCOSA + DE LISINA +
SACAROSA+
GAS +
H2S -
MIO
SIM
DESCARBOXILACIÓN INDOL +
DE ORNITINA +
H2SMOVILIDAD
+
Bacteria presente _________________________________
79
80
PRACTICAS A REALIZAR DURANTE EL SEMESTRE
REPORTE
ENTREGADO
Practica No. 1 Microscopía
Practica No. 2 Preparación de medios de cultivo y esterilización de material
Practica No. 3 Siembra, aislamiento en placa y morfología macroscópica
Practica No. 4 Morfología microscópica y Tinción gram
Practica No. 5 Pruebas bioquímicas
Practica Examen (para esta no existe técnica)
Heteroevaluación/Autoevaluación/ Coevaluación
Material Básico para trabajar el laboratorio
Individual
• Bata blanca para laboratorio.
• Guantes de látex de cirujano.
• Guantes de látex para uso doméstico (para lavar material)
• Cubre bocas.
Por equipo
• Un paquete grande de Algodón plisado
• Masking tape aproximadamente de 1cm de ancho
• Marcador permanente de punto fino
• Tijeras que corten tela
Nota: El reporte de practica o actividad diseñada para cada sesión de laboratorio tiene como
fecha de entrega una semana después de haber concluido la práctica de laboratorio.
No se reciben trabajos a destiempo
81
RUBRICA DE EVALUACION REPORTE PRACTICA DE LABORATORIO.
Submódulo: Emplea técnicas de identificación de microorganismos
Titular: Q.B.P Claudia Alejandra Bastardo Márquez
Actividad: PRACTICA DE LABORATORIO
COMPETENCIA GENERICA Y ATRUBUTO:
5. Desarrolla innovaciones y propone soluciones a problemas a partir de métodos establecidos
5.2 Ordena información de acuerdo a categorías, jerarquías y relaciones.
5.3 Identifica los sistemas y reglas o principios medulares que subyacen a una serie de fenómenos.
Exce
INDICADOR
Deficient
lent
Regular
ASPECTOS POR EVALUAR
e
e
El reporte de práctica tiene la portada todos los datos Escuela
Nombre y número de práctica, Materia Maestro Equipo Nombre
de los alumnos en orden alfabético iniciando con apellido
Fecha y hora de entrega sin faltas de ortografía.
Tiene índice con los números de página debidamente
indicados.
Contiene un resumen breve de la temática de la práctica (En
mínimo 10 renglones máximo 15)
Contiene el objetivo bien redactado.
Contiene justificación bien redactada, En mínimo 5 renglones
máximo 10
El marco teórico tiene coherencia y está debidamente
relacionado con la práctica realizada mínimo una cuartilla
máxima dos (No se copió y pego directamente de internet
Contiene la metodología (protocolo), así como los materiales y
reactivos utilizados.
Contiene el apartado de las observaciones bien definido y
redactado correctamente. Con imágenes debidamente
etiquetadas
Contiene el apartado de resultados bien definido (no se
confunde con las observaciones ni las conclusiones).
El apartado de discusión de resultados es correcto, relaciona su
marco teórico con sus resultados y explica de manera clara la
razón de estos, analiza correctamente los datos obtenidos y
logra explicarlos.
Las Conclusiones son individual y está bien redactada y
fundamentada, tiene coherencia y no se confunde con
observaciones ni resultados.
Contiene el apartado de los anexos bien definido y redactado
correctamente. En caso de agregar alguna imagen esta tiene
que estar debidamente etiquetadas
Está incluida la bibliografía. En formato APA
Entrega en PDF realizado en Word con el siguiente formato: •
Portada, libre, • Titulo Negritas, • índice y bibliografías cada uno
en hojas solos • Calibri 12 • Justificado • Interlineado 1.15
Entrego el reporte en tiempo y forma con sus respectivos
instrumentos de evaluación.
TOTAL
Ponderació
n máxima
1, 0.5, 0
1, 0.5, 0
1, 0.5, 0
0.5, 0.25,
0
0.5, 0.25,
0
2, 1, 0
2, 1, 0
2, 1, 0
2, 1, 0
2, 1, 0
1, 0.5, 0
1, 0.5, 0
2, 1, 0
1, 0.5, 0
82
Practica 1
Asignatura
Semestre:
Facilitador:
Microscopia
Emplea técnicas de cuantificación de microorganismos
3º I, 3º J,3º K
Q.B.P Claudia Alejandra Bastardo Márquez
Objetivo:
• Observar al microscopio la disposición de las células animales y vegetales, para identificar sus
semejanzas y diferencias.
• Poner en práctica la manipulación del microscopio
Maquinaria, Equipo o Elementos Necesarios:
✓ Microscopio óptico
✓ Agua destilada
✓ 3 cubreobjetos y 3 portaobjetos
✓ Gotero
✓ 50 ml Agua de rio o arroyo
✓ Cuchillo
✓ Tejido epitelial de la mucosa bucal
✓ Azul de metileno y Lugol
✓ Epidermis de cebolla
✓ Guantes de látex
✓ Abate lenguas
Desarrollo:
Antes de comenzar deberán:
1. Lavarse las manos con agua y jabón, y limpiar su mesa de trabajo con la solución de cloro que se
encuentra previamente preparada
2. Lavar todo el material de vidrio con jabón líquido, enjuagar con abundante agua de la llave y al final
con agua destilada, escurrir el exceso de agua y secarlo papel de estraza.
3. Una vez que tu área de trabajo esté limpia, homogeniza el recipiente donde traes el agua encharcada
con mucho cuidado de no derramar
4. Coloca una gota de agua encharcada en el centro del portaobjetos, agrega una gota de Lugol, coloca el
cubreobjetos. Observa al microscopio con los objetivos de 10x y 40x. Toma fotografías
5. En otro portaobjetos coloca una gota de agua destilada y con un abatelenguas raspa la superficie interna
de la mejilla de uno de tus compañeros y disuelve el contenido en una gota de agua previamente puesta
en el centro del portaobjetos.
6. Agrega una gota de azul de metileno, coloca el cubreobjetos y observa al microscopio con los objetivos
10x y 40x. Toma fotografías
7. En otro portaobjetos coloca un pedazo de epidermis de cebolla, agrega una gota de Lugol, coloca el
cubreobjetos y observa al microscopio con los objetivos 10x y 40x. Toma fotografías.
Cuestionario (anexar en el reporte de prácticas)
1. Describa la técnica correcta para enfocar un frotis bacteriano
2. ¿Qué cuidados se deben tener en el uso y manejo del microscopio?
3. ¿Qué aplicación tienen las preparaciones microscópicas en fresco?
4. Como se calculan la ampliación total de la imagen observada de acuerdo con el tipo de lente utilizado
(objetivo y ocular)
Tipo de Evidencias:
Documento: Presentación de power point
https://www.youtube.com/watch?v=57SZHltgSJc
https://www.youtube.com/watch?v=cAHtTbVP45A&t=13s
83
Practica 2
Asignatura
Semestre:
Facilitador:
➢
➢
➢
✓
✓
✓
✓
✓
✓
✓
✓
✓
✓
✓
Preparación de medios de cultivo y esterilización de material
Emplea técnicas de cuantificación de microorganismos
3º I, 3º J,3º K
Q.B.P Claudia Alejandra Bastardo Márquez
Objetivo:
Comprender el proceso de esterilización como principal agende destructor de microorganismos
Aprender a envolver el material de vidrio que se someterá al proceso de esterilización
Preparar un medio de cultivo solido/ líquido y relacionar la importancia que tiene el llevar a cabo el
proceso de esterilización en autoclave
Maquinaria, Equipo o Elementos Necesarios:
Matraz Erlenmeyer de 250ml
✓ Agua destilada
Piceta
✓ Tijera
Probeta
✓ Guantes de látex
Espátula
✓ Cubre bocas
Guante de asbesto
✓ Encendedor
Caja Petri (por aluno)
✓ Sharpie o marcador permanente
1 Pipeta (por alumno)
✓ Masking tape
Mechero
✓ Medio de cultivo sólido y liquido
Tripie
Lamian de asbesto
1 pliego de papel estraza
Desarrollo:
Antes de comenzar deberán:
1. Lavarse las manos con agua y jabón, y limpiar su mesa de trabajo con la solución de cloro que se
encuentra previamente preparada
Observa el siguiente video. TUTORIAL: ¿CÓMO HACER UN MEDIO DE CULTIVO CORRECTAMENTE?
https://www.youtube.com/watch?v=S4cpDdXtk_I
a) Preparación y esterilización de material de vidrio
2. Lavar el material de vidrio con jabón líquido, enjuagar con abundante agua de la llave y al final
con agua destilada.
3. Escurrir el exceso de agua y colocar los materiales sobre una toalla o papel de estraza, de tal
forma que terminen de secar.
4. Cortar el papel de estraza del tamaño adecuado para lograr envolver la caja petri y la pipeta
5. Envolver la caja petri y la pipeta como su docente se los indique
6. Colocar cinta testigo si es necesario
7. Identificar el material con su nombre, grupo y fecha de preparación. (A las pipetas es importante
colocar el volumen correspondiente)
84
8. Colocar los materiales a un costado de la mesa en lo que terminan todos los equipos
9. Proceder a Esterilizar en autoclave a 121oC y 15 lbs. de presión durante 20 minutos (El docente
explicará el manejo de la autoclave).
b) Preparación, esterilización y vaciado de medios de cultivo
1. Leer cuidadosamente la etiqueta del medio de cultivo deshidratado.
2. Calcular la cantidad necesaria que te indique tú maestro.
3. Pesar la cantidad calculada del medio deshidratado. Esta operación debe ser rápida para evitar que
la humedad del ambiente no afecte el resto del contenido del frasco.
4. Colocar la mitad del volumen de agua destilada en el matraz
5. Agregar el medio de cultivo al matraz, disolver y una vez disuelto completar el volumen de agua
6. Calentar hasta disolución total, para ello agitar repetidamente y evitar que el medio de cultivo hierva
y se derrame, posteriormente tapar el matraz con un tapón algodón que se encuentre previamente
envuelto en gasa, después colocar aluminio y etiquetar.
7. En caso de trabajar con tubos vaciar 6ml y tapar cada uno con algodón y aluminio, etiquetarlos y
esterilizarlos en autoclave a 121oC y 15lbs. de presión durante 20 minutos.
8. Después de la esterilización vaciar en las cajas Petri alrededor de 18 ml
9. Tapar las cajas, etiquetar y dejar solidificar.
10. Meter al refrigerador de forma invertida las cajas
11. No olvides tomar evidencia fotográfica durante toda la practica
Tipo de Evidencias:
Video
85
Practica 3
Asignatura
Semestre:
Facilitador:
Siembra, Aislamiento en placa y morfología macroscópica
Emplea técnicas de cuantificación de microorganismos
3º I, 3º J,3º K
Q.B.P Claudia Alejandra Bastardo Márquez
Objetivo:
➢ Utilizar la técnica de siembra adecuada según la clasificación del medio de cultivo a emplear
➢ Manipular los medios de cultivo en placa para obtener colonias aisladas mediante la técnica de
agotamiento en placa y observar el crecimiento en tubos (medios líquidos)
Maquinaria, Equipo o Elementos Necesarios:
✓ Mechero
✓ Guantes de látex
✓ Asa en aro
✓ Cubre bocas
✓ Medios de cultivo elaborados en la práctica
✓ Encendedor
anterior
✓ Masking tape
✓ Muestra
✓ Marcador permanente de punto fino
Desarrollo:
Antes de comenzar deberán:
1. Lavarse las manos con agua y jabón, y limpiar tu mesa de trabajo
2. Lavar todo el material de vidrio con jabón líquido, enjuagar con abundante agua de la llave, escurrir el
exceso de agua y secarlo papel de estraza.
a) TOMA DE MUESTRA E INOCULACIÓN EN MEDIO LIQUIDO
3. Esterilizar el asa bacteriológica colocándola en un ángulo de 45º en la periferia de la flama del mechero
hasta que tome un color rojo vivo en las tres cuartas partes del filamento del asa.
4. Tomar el tubo de la cepa o la muestra con la mano izquierda y retirar el tapón.
5. Introducir el asa y tomar la muestra
6. Colocar la muestra en el tubo con medio líquido, hacer movimientos circulares, retirar el asa.
7. Tapar el tubo, etiquetar y colocarlo en la incubadora a 35°C, durante de 24 a 48 ± 2 horas.
8. Después de pasado el tiempo de incubación y con el mechero prendido realice sus observaciones
b) SIEMBRA EN PLACA
TÉCNICA DE AISLAMIENTO
9. Tomar la placa Petri con la mano izquierda por la base con los dedos medio a meñique y la tapa con los
dedos pulgar e índice. Abrir la placa cerca del mechero.
10. Descargar en un primer cuadrante masivamente, hasta la mitad de la placa. Tapar la caja.
11. Girar la placa 90º.
12. Estriar el segundo cuadrante hasta la mitad de la caja. (2º cuadrante)
13. Nuevamente esterilizar el asa como se procedió anteriormente y realizar un 3er. Cuadrante (la estría es
más abierta de manera que se obtengan colonias aisladas)
14. Invertir las cajas y colocarlas en dentro de la incubadora a 35°C, durante de 24 a 48 ± 2 horas.
15. Después de pasado el tiempo de incubación y con el mechero prendido realice sus observaciones
C) MORFOLOGÍA MACROSCÓPICA (día 2)
1. Lavarse las manos con agua y jabón, y limpiar tu mesa de trabajo
2. Después de pasado el tiempo de incubación y con el mechero prendido coloque sus cajas petri con
crecimiento en la mesa, sin abrir la caja, observar las características de las colonias
86
Nota: De ser necesario para una mejor observación, abrir en lo zona del mechero la caja petri y observar
las características de las colonias.
3. Seleccionar 3 colonias de preferencia que estén aisladas y realiza la morfología macroscópica de cada
una de ellas
4. Registrar tus resultados en una tabla para registrar las observaciones
5. No olvides tomar evidencia fotográfica durante toda la practica la cual te servirá para tu reporte
MORFOLOGIA
MACROSCOPICA
Tamaño
Forma
Borde
Transparencia
brillo
Color
Textura
Elevación
Consistencia
1
2
3
Cuestionario (anexar en el reporte de prácticas)
1. Mencione porque es importante determinar la morfología colonial bacteriana
2. Cuáles son las semejanzas y diferencias tiene la morfología colonial de una bacteria, una levadura y un
hongo
No olvides tomar evidencia fotográfica durante toda la practica
Tipo de Evidencias:
Documento: REPORTE DE PRACTICA
87
Practica 4
Asignatura
Semestre:
Facilitador:
➢
➢
➢
➢
✓
✓
✓
✓
✓
Morfología microscópica y Tinción de Gram
Emplea técnicas de cuantificación de microorganismos
3º I, 3°J, 3º K
Q.B.P Claudia Alejandra Bastardo Márquez
Objetivo:
Poner en práctica el proceso de tinción Gram
Retomar la correcta manipulación del microscopio
Lograr identificar la forma y el arreglo del microorganismo observado.
Reconocer a las bacterias Gram – y Gram + según su coloración
Maquinaria, Equipo o Elementos Necesarios:
Mechero
✓ Guantes de látex
Asa en aro
✓ Cubre bocas
Medios de cultivo elaborados en la
✓ Encendedor
práctica anterior
✓ Masking tape
Microscopio
✓ Marcador permanente de punto fino
Colorantes para tinción Gram
✓ Muestra
Desarrollo:
Antes de comenzar deberán:
1. Lavarse las manos con agua y jabón, y limpiar tu mesa de trabajo
2. Lavar todo el material de vidrio con jabón líquido, enjuagar con abundante agua de la llave,
escurrir el exceso de agua y secarlo papel de estraza
Preparación de frotis
3. Coloca una gota de solución salina sobre el portaobjetos
4. Con cuidado esterilice el asa de nicromio hasta que se observe al rojo vivo, deje enfriar un
segundo (siempre debe permanecer cerca del mechero)
5. Abrir la caja Petri cerca del mechero y con el asa toque levemente la colonia que eligió, cierre la
caja al finalizar.
6. Colocar el inoculo en la solución salina y homogeniza.
7. Esterilice el asa.
8. Fije su preparación pasándola algunas veces sobre la flama del
mechero, teniendo cuidado de no sobrecalentarla.
Tinción Gram
9. Colocar el portaobjetos sobre las varillas de tinción encima del resumidero
10. Cubrir su frotis con cristal violeta por un minuto.
11. Enjuagar con agua destilada y mucho cuidado de no agregar el agua directamente sobre la
muestra.
12. Agregar yodo Lugol por un minuto.
13. Enjuagar con agua destilada.
14. Agregar alcohol-acetona para decolorar por 15 segundos
15. Enjuagar con agua destilada
16. Contrastar con safranina durante un minuto.
17. Enjuagar con agua destilada y secar con cuidado al ambiente
88
Observación al microscopio
18. Colocar el portaobjetos en la platina del microscopio.
19. Enfocar con el objetivo de 10 x.
20. Buscar un campo donde el “frotis” sea delgado y homogéneo.
21. Enfocar el campo con el objetivo de 40 x.
22. Colocar una pequeña gota de aceite de inmersión y observar con el objetivo de 100 x.
23. Registrar tus resultados en una tabla para registrar las observaciones
24. Limpiar y colocar adecuadamente los objetivos del microscopio al terminar de utilizarlo.
25. No olvides tomar evidencia fotográfica durante toda la practica la cual te servirá para tu reporte
MORFOLOGIA
MICROSCOPICA
Forma
Acomodo
Color (gram + o -)
1
2
Cuestionario (anexar en el reporte de prácticas)
1. ¿Con qué finalidad se fija la muestra de microorganismos en el portaobjetos?
2. ¿Qué importancia tiene teñir las muestras bacterianas?
3. ¿Por qué es necesario emplear aceite de inmersión para la observación de los
microorganismos?
4. De los reactivos que utilizaste para la tinción de Gram, ¿cuál es el que funciona como
colorante primario.
5. ¿Qué pasaría si no se esteriliza el asa antes de tomar la muestra?
Tipo de Evidencias:
Documento: Reporte de practica
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Practica 5
Metabolismo microbiano (pruebas bioquímicas)
Asignatura
Emplea técnicas de cuantificación de microorganismos
Semestre:
3º I, 3°J, 3º K
Facilitador:
Q.B.P Claudia Alejandra Bastardo Márquez
Objetivo:
➢
Realizar pruebas bioquímicas en medios de cultivo para sustratos específicos que permitirán demostrar
actividades metabólicas de bacterias y levaduras.
➢
Interpretar las diversas pruebas bioquímicas considerando los resultados falsos negativos y/o falsos
positivos
Maquinaria, Equipo o Elementos Necesarios:
✓
Asa recta
✓
Guantes de látex
✓
Asa en aro
✓
Cubre bocas
✓
Medios de cultivo con crecimiento bacteriana
✓
Encendedor
elaborados en la práctica anterior
✓
Masking tape
Tubos de ensaye con los diferentes medios de
✓
Marcador permanente de punto fino
cultivo para pruebas bioquímicas
✓
Mechero
✓
Incubadora
✓
Desarrollo:
Antes de comenzar deberán:
1. Lavarse las manos con agua y jabón, y limpiar tu mesa de trabajo
2. Lavar todo el material de vidrio con jabón líquido, enjuagar con abundante agua de la llave, escurrir el
exceso de agua y secarlo papel de estraza.
TOMA DE INÓCULO
3. Prender el mechero y una vez que el área esta estéril colocar las cajas Petri con las colonias y los tubos de
ensaye cerca del mechero
4. Esterilizar el asa bacteriológica colocándola en un ángulo de 45º en la periferia de la flama del mechero hasta
que tome un color rojo vivo en las tres cuartas partes del filamento del asa.
5. Tomar la placa Petri con la mano izquierda por la base con los dedos medio a meñique y la tapa con los
dedos pulgar e índice. Abrir la placa cerca del mechero
6. Tocar con el asa el crecimiento (no debe ser muy denso el inóculo)
7. Tomar el tubo con la mano izquierda y retirar el tapón con los dedos anular y meñique de la mano derecha.
8. Flamear la boquilla del tubo
9. Introducir el asa en el tubo según corresponda
10. Nota: Tipo de inoculación dependiendo de la inclinación del tubo y el agar
12. agar
11. Inoculación
13. Estría en bisel
15. Estría en bisel y
picadura hasta el
fondo
14. Citrato (pico de flauta)
16. Triple azúcar hierro (pico de
flauta)
17. Lisina hierro agar (pico de
flauta)
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18. Agar kliger (pico de flauta)
19. picadura hasta el
fondo
20. MIO
21. SIM
23. Infusión cerebro corazón
22. Agitación
24. RM/VP
25. Caldo Urea
(Si él tuvo tiene pico de flauta se inocularán por picadura hasta el fondo del tubo y por estría simple en la superficie,
26. . Retirar el asa, flamear el tubo y tapar.
27. Colocar los tubos inoculados en una gradilla los cuales están etiquetados debidamente y colocarlas en dentro
de la incubadora a 35°C, durante de 24 a 48 ± 2 horas.
C) LECTURA DE PRUEBAS BIOQUIMICAS
28. Después de pasado el tiempo de incubación y con el mechero prendido sacar los tubos de ensaye de la
incubadora y realice la lectura de los tubos realizando la comparación con los tubos control interprete los
resultados con ayuda de la teoría
29. Finalmente, y utilizando la tabla de pruebas bioquímicas de microrganismos interpretar lo resultados que
obtuviste y concluye de que bacteria se trata
30. No olvides tomar evidencia fotográfica durante toda la practica
Cuestionario (anexar en el reporte de prácticas)
31. ¿Qué importancia tiene la identificación de las bacterias?
No olvides tomar evidencia fotográfica durante toda la practica
Tipo de Evidencias:
Documento: Reporte de practica
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