Transcriptómica: Conceptos Básicos, Aislamiento y Análisis de ARN

TEMA 15. CONCEPTOS BÁSICOS DE TRANSCRIPTÓMICA. AISLAMIENTO Y
ANÁLISIS DE ARN.
15.1. CONCEPTOS BÁSICOS DE TRANSCRIPTÓMICA.
El transcriptoma es el conjunto de todas las moléculas de ARN (también llamadas transcritos)
presentes en una célula o grupo de células en un momento determinado. Engloba tanto al ARN
mensajero (mRNA), que puede traducirse en una proteína, como al ARN no codificante (ncRNA)
mi microARN. Cada tejido o tipo celular posee un transcriptoma único y distinto.
Así, el metatranscriptoma Es el conjunto de transcritos presentes, en un momento dado, en
las celulas de una mezcla de organismos
El transcriptoma de una célula está íntimamente vinculado a otros niveles moleculares como el
genoma o el proteoma mediante el proceso de expresión genética. El ADN se transcribe como ARN
mensajero por medio de la RNA polimerasa II (reconoce una región promotora en un proceso
mediado por factores de transcripción, se une a la cadena molde de DNA y cataliza la unión de
ribonucleotidos en extremo 3’), el cual se traduce como proteína en los ribosomas. el proteoma de
una célula es siempre un subconjunto de su transcriptoma, el cual es a su vez un subconjunto de su
genoma. La expresión de un gen se regula por factores de transcripcion, modificaciones postraduccionales, la metilacion del ADN y otros mecanismos. Como cada secuencia de ARN refleja
la secuencia de ADN de la que fue transcrito, el estudio del transcriptoma permite analizar qué
partes del genoma se están expresando en el material de estudio, y compararlo con otros.
ARN: Molécula formada por un polirribonucleótido de longitud variable que contiene uracilo en
vez de timina. Los más importantes son de 3 tipos: ARN mensajero (ARNm), ARN ribosomal
(ARNr) y ARN transferente (ARNt)
Tipos de ARN:
ARN ribosomal (rARN): 80-85%: Son 3 en procariotas (5S, 23S, 16S) Y 4 en eucariotas (5S,
5’8S, 28S y 18S). Se asocian a los ribosomas y son esenciales para la síntesis proteica mediante la
traducción.
ARN mensajero (mARN): 2-5%: ARN monocatenario que contiene la información codificante
para la síntesis de una proteína. Madura mediante el splicing de sus regiones intrónicas, quedando
solo las regiones exónicas. Se traduce a proteínas en los ribosomas (reconocimiento de secuencai
Shine-Dalgarno). En eucariotas presenta una cola poliA y una región 3’UTR que permite su
silenciamiento por ARN de interferencia.
Gen: contiene exones e intrones. Al transcribirse a ARN
INTRÓN: Secuencia de ADN ubicada entre exones que primero se transcribe en ARN pero
que se elimina del transcrito de ARN final. Los intrones de los grupos I, II y III, presentes en
eucariotas y menos comunmente en procariotas, son ribozimas capaces de catalizar su propio
ayuste (splicing, corte y empalme) aunque la mayoría, en eucariotas, son intrones
espliceosomales (ayustosomales grupo IV, solo eucarióticos, sufren splicing mediante
spliceosoma: 5 ribonucleoproteínas nucleares pequeñas con ARN rico en U que reconoce al
intrón)
Un exón es una región del genoma que finaliza con una molécula de ARNm madura. Algunos
exones son codificantes, es decir que contienen información para producir una proteína, mientras
que otros no son codificantes. La mayoría de los genes tienen múltiples exones intercalados con
intrones.
ARN t: Transfiere el aminoácido correspondiente al codón de ARNm que reconoce mediante el
anticodón a la proteína en síntesis en el ribosoma.
ARN no codificantes:
ARN
de
interferencia:
(silenciamiento de genes)
micro-ARN o mi-ARN: ARN
monocatenario, de una longitud de
entre 21 y 25 nucleótidos, que tiene
la capacidad de regular la expresión
de otros genes mediante la ruta de
ribointerferencia.
Puenden
encontrarse en muchos loci: con
promotores propios, como partes de
intrones de genes y menos común
superpuestos a exones. Durante su
producción por transcripción se
forman regiones que tienen la
capacidad de formar horquillas y
generar un ARN bicatenario
primario largo conocido como primi-ARN.
Posteriormente,
una
enzima nuclear llamada DROSHA
corta las bases de la horquilla,
formando lo que se denomina premicro-ARN (70 nucl).
Los si-ARN (small interference
ARN) provienen generalmente de grandes moléculas de RNA doble cadena, a diferencia de los
miARN que proceden de transcritos en horquilla.
Los ARN de interferencia (miARN y siARN) es transportado desde el núcleo al citoplasma
donde son fragmentados por la enzima DICER, que los corta hasta la longitud final de 20-25
nucleótidos (ss). La hebra antisentido (ss) del ARN de interferencia se une a la enzima Argonauta-2
en el complejo RISC (complejo de inducción de silenciamiento de ARN) donde se unirá al 3’UTR
(3’ UnTranslated Region) del mARN diana provocando su inhibición de expresión (si la
complementariedad es parcial) o el corte y degradación (si la complementariedad el total) .
Otro tipo de ARN de interferencia son los pi-ARN (piwi interacting ARN), que no requieren de
DICER sino solo de una subfamilia de proteínas Argonaute denominadas piwi.
Long non coding RNA (lncRNA): más de 200 nucleótidos que no codifican proteínas. Pueden
factivar o inhibir la expresión de genes a través de diversos mecanismos. No todos son
funcionales
Formas de estudio de la transcriptómica:
Inicialmente se usaban técnicas de bajo rendimiento, Northern blot, mRNAFISH o PCR:
-Northern-blot: se toma la mezcla de ARN y se somete a una electroforesis en gel a fin de
separar los fragmentos de acuerdo con su tamaño. Tras esto, se transfiere el contenido del gel, ya
resuelto, a una membrana cargada positivamente en la que se efectúa la hibridación de una sonda
molecular marcada radiactiva o químicamente.
-Hibridación in situ fluorescente de mRNA (MRNA-FISH): un conjunto de sondas cortas
específicas marcadas se hibrida con el ARN diana de interés. Hibridaciones posteriores generan un
“árbol de hibridación" marcado con fluorescencia que proporciona detección de moléculas de ARN
individuales mediante imágenes o citometría de flujo. No requiere purificación de ARN ni
procesado con enzimas. Permite determinar si un mRNA se expresa en las celulas de secciones de
un tejido previamente congelado
-Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR): sólo permite el
análisis cualitativo o semicuantitativo de la expresión de un gen candidato por análisis.
-RT-qPCR (PCR cuantitativa con transcripción reversa): Varios transcritos puedenn ser
analizados al mismo tiempo. permite medir la cantidad de ARNm en una muestra de manera
cuantitativa. La qPCR es útil para validar los resultados obtenidos por otras técnicas de
transcriptómica, especialmente los microarrays. BUSCAR Microfluidic single cell qPCR.
Pueden aislarse células únicas mediante citometría de flujos y/o tecnología de
microfuidos. De esta forma, se puede analizar qPCR de células únicas
-Microarrays de ADN(basados en hibridación) logró la caracterización de niveles de expresión
de miles de tránscritos simultáneamente. Consiste en la retrotranscripción del ARN a cADN
combinándolo con un marcaje fluorescente (Cy3 o Cy5) y la posterior hibridación a un chip que
contiene múltiples sondas de cADN correspondientes a los genes transcritos que se conocen en ese
organismo. La intensidad de fluorescencia es proporcional al nivel de expresión de cada gen.
Requiere control de calidad con qPCR y no permite estudiar genes desconocidos.
-SAGE (Serial Analysis of Gene Expression): Desarrollada antes de RNA-seq. Se pasa el ARN a
cDNA y se fragmenta con enzimas de restricción a fragmentos de unos 10 nucleótidos. Los
fragmentos se ligan entre sí, quedando flanqueados por secuencias que permiten su amplificación.
Se secuencian mediante secuenciación Sanger y cada los fragmentos de un ARNm concreto
presentarán una concentración proporcional al resto, lo que permite determinar la cantidad y
diversidad de ARNm presente en la muestra.
-ARN-seq (basado en secuencias): secuenciación masiva de todas las moléculas de ARN
presentes en una muestra y, por tanto, del transcriptoma completo. Con esta tecnología es posible
cuantificar de manera absoluta el total de moléculas de ARN con mayor resolución y
reproducibilidad que con los microarrays. RNA-Seq se ha convertido en la técnica más utilizada y
recomendada actualmente debido a su mayor resolución y flexibilidad. Puede detectar tanto genes
conocidos como desconocidos, además de cuantificar su expresión directamente. Comienza con la
conversión de las moléculas de ARN a ADN complementario (cDNA) mediante PCR reversa (RTPCR). (El ARN o en cDNA pueden fragmentarse por métodos químicos o por sonicación en
fragmentos de 200 a 500 bp para su posterior secuenciación mediante NGS). El ADN
complementario es entonces amplificado para formar una biblioteca de ADN (ligación en vector de
clonación?), la cual puede ser secuenciada. El resultado final es una serie de secuencias que pueden
ser alineadas al genoma o transcriptoma y, después, cuantificadas mediante métodos
computacionales. Esto permite saber de qué gen proviene cada secuencia y cuántas secuencias le
corresponden a cada gen. El número de secuencias alineadas a un gen determinado es proporcional
al número de moléculas de ARN provenientes del mismo.
Los datos transcripcionales se almacenan en repositorios, que permiten estudios y comparaciones
de perfiles de expresión de diferentes genes o de isoformas de un gen, dentro de una misma especie
o de varias, en función de las condiciones
15.2. AISLAMIENTO DE ARN.
El ARN es inestable y puede ser degradado por Rnasas, que son altamente ubicuas. Para proteger
el ARN de la degradación es necesario trabajar con máxima precaución, en frío, usando guantes,
puntas de pipeta con filtro y con zonas, equipos y material limpio libre de Rnasas, para lo que
pueden tratarse con DEPC (pirocarbonato de dietilo)
La purificación de ARN requiere cuatro etapas: 1) Disrupción de las células o del tejido; 2)
Inactivación de la actividad de la ribonucleasa (RNasa) endógena; 3) Desnaturalización de los
complejos nucleoproteicos; y 4) Eliminación de ADN y proteínas contaminantes. El paso más
importante es la rápida inactivación de las RNasas endógenas, que se liberan de los orgánulos con
membrana cuando las células se desintegran.
Extracción: liberación del ARN del interior celular mediante lisis
La lisis celular depende del tipo celular y suele combinarse con varias técnicas, que deben
mantener la integridad del ARN:
-Métodos físicos: mecánico (mortero, con N2, bolitas de vidrio). Puede realizarse antes de los
métodos químicos, para separar de estructuras celulares.
-Métodos químicos: Método del Fenol ácido-tiocianato de guanidinio-cloroformo
Inactivación de nucleasas: suele hacerse en el mismo paso que la extracción, para evitarse la
degradación del ARN. Así, los reactivos utilizados para la extracción suelen presentar inhibidores
de Rnasas como hidroxiquinoleina. Se hace a la vez que la degradación de proteínas de la muestra.
Purificación: separación del ARN del resto de los componentes solubles (proteínas, otros ác
nucleicos, lípidos, carbohidratos, sales…):
-Método del fenol-tiocianato de guanidinio (Trizol) y cloroformo: El más utilizado. Se añade el
trizol (fenol-tiocianato de guanidinio) ácido a la muestra, produciendo homogeneización en
solución de lisis. El tiocianato es una sal caotrópica que lisa las células y solubiliza sus
componentes, desnaturalizando proteínas (inactivación rápida de Rnasas) Se añade cloroformo y se
centrifuga, separando en fases:
·Acuosa: ARN (monocatenario: las bases nitrogenadas se quedan con carga positiva aunque
los grupos fosfato pierdan la carga negativa por las condiciones ácidas)
·Interfase: ADN (gracias a las condiciones ácidas, se protona y se bloquea su interacción
·Fase orgánica: fenol-cloroformo (lípidos, proteínas…)
posteriormente el ARN puede: precipitarse con isopropanol y lavarse con etanol 75%, seguido de
resuspensión en H2O tratada con DEPC (pureza media); o terminar de purificarse mediante
columnas de cromatografía de adsorción o de afinidad (pureza alta).
-
Columnas de adsorción (columnas spin): columna de fase estacionaria de sílice, donde se une el
ARN en presencia de alta concentración de sales caotrópicas (isotiocianato de guanidinio) y pH
ácido. Sepuede tratar con DNasa I y los contaminantes se eliminan por lavados con centrifugación.
El ARN se eluye con agua o tampón hiposalino a pH neutro o ligeramente alcalino.
-
Columnas de afinidad: columnas con fragmentos de oligo dT que retienen colas poliA. Permite
tratar con DNasas y eliminarlas en el paso siguiente de lavado, reduciendo la contaminación con
ADN.
-Gránulos magnéticos: recubiertos con polímeros de alta afinidad por los ácidos nucleicos. Unión
al tubo>unión a ARN>retención mediante imán>eliminación sobrenadante>resuspensión y
lavado>elución mediante tampón adecuado. Ejemplo: Dynabeads pueden unirse a oligos dT (oligo
de 18 nucleotidos de timina, en lugar de anticuerpos), con lo que seleccionan específicamente ARN
eucariota.
-
.También pueden purificarse a partir de bandas de geles de electroforesis: Se separan las bandas
de ARN>sevisualiza bajo luz UV y se corta la banda de interés>se solubiliza la agarosa a
60º>purifica en columna de adsorción o de afinidad. Sirve para seleccionar ARNm y evitar ARNr,
aunque se prefieren otros métodos.
El proceso de purificación de ARN depende del tipo de ARN, su tamaño y la técnica a utilizar.
Dado que el ARNm es la especie de interés y representa solo el 3 % de su contenido total, la
muestra de ARN debe tratarse para eliminar el ARNr y el ARNt y los transcritos de ARN
específicos de tejido. Se puede seleccionar ARNm mediante cromatografía de afinidad con con las
colas poli-A o eliminar el ARN ribosomal puede eliminarse mediante kits específicos, como
-riboPOOL consisten en mezclas complejas de sondas de oligonucleótidos biotiniladas en 3′.
Estas sondas están diseñadas para hibridar específicamente con todos los ARN ribosómicos de las
especies diana. Los ARN ribosómicos unidos a las sondas de riboPOOL se eliminan eficazmente de
las muestras mediante bolitas magnéticas conjugadas con estreptavidina. Los riboPOOL funcionan
independientemente de la poliadenilación de ARN y se pueden aplicar para cualquier aplicación
posterior
-RiboMinus™ Eukaryote Kit for RNA-Seq (Life Technologies), que consiste en la separación
del rRNA mediante unas sondas específicas unidas a unas bolas magnéticas.
15.3. ANÁLISIS DE ARN.
Espectrofotómetro (nanodrop) midiendo OD 260/280 nm
ARN (y ADN) tiene pico de absorbancia a 260 nm. La absorbancia es proporcional a la
concentración de ácidos nucleicos. Requiere pequeños volumenes de muestra (1 o 2 microlitros).
Como blanco se usa la solución en la que se resuspende el ARN.
La "unidad A260" se utiliza como medida de cantidad para los ácidos nucleicos. Una unidad
A260 es la cantidad de ácido nucleico contenida en 1 mL y que produce una DO (densidad óptica)
de 1: 1 A260 unidad ssRNA = 40 µg
Es habitual que las muestras de ácidos nucleicos estén contaminadas con otras moléculas (por
ejemplo, proteínas, compuestos orgánicos, etc.). El método permite determinar la pureza de la
muestra utilizando la relación de la absorbancia a 260 y 280 nm (A260/280). Para una muestra de
ARN puro, la A230:260:280 debe ser de alrededor de 1:2:1.
Las proteínas absorben a 280 nm. El Fenol absorbe a 270: puede hacer que se sobreestime la
concentración de ARN. A 230 absorben compuestos orgánicos como tiocianatos.
Absorción en 330 nm debe ser 0
Se puede hacer con Qubit (fluorimetría)
Este método es útil para los casos en los que la concentración es demasiado baja para evaluarla
con precisión con la espectrofotometría y en los casos en los que los contaminantes que absorben a
260 nm hacen imposible una cuantificación precisa.
Qubit es más sensible (desde 10 pg/uL) y específico que la espectrofotometría (no sobreestima).
Se basa en una unión altamente específica de un fluorocromo con los ácidos nucleicos (ADN, ARN)
o proteínas.
La fluorescencia se emite por la interacción con el ARN, siendo proporcional a la concentración
del mismo. La concentración se determina mediante interpolación con una curva estándar de
muestras de concentración conocida. Puede medir la integridad de ARN (con un segundo
fluorocromo que se une a ARN tamaño pequeño)
Electroforesis en gel: carga negativa en los tampones (TAE,TBE) y migran hacia el ánodo (+).
Se separan por tamaño y conformación. Los geles de poliacrilamida se utilizan para ARN pequeño,
aunque también es posible utilizar geles de agarosa con alta concentración.
La muestra se carga en pocillos con tampón de carga (glicerol+ dos colorantes de avance),
flanqueada por pocillos en los que se carga marcador de peso molecular. Se realiza electroforesis y
se detectan los ácidos nucleicos por medio de bromuro de etidio (fluorocromo intercalante), Gel
Red (como bromuro de etidio pero no atraviesa mb), Redsafe, sybr green u otros, visualizando bajo
luz UV
Permite estimar la calidad de forma cualitativa según intesidad. También se puede evaluar la
integridad (bandas únicas o “smear” por degradación por nucleasas).
Se puede ver si el ARN está contaminado con ADN, si no se ha eliminado el ARNr, etc.
Electroforesis en chip (“Bioanalyzer” de Agilent): determinación de calidad y cantidad de una
forma más fiable y rigurosa que los sistemas tradicionales. Microelectroforesis automatizada
mediante el uso de nanocapilares en chips. Minimiza tiempo y cantidad de ARN (o ADN) requerido
(1 µL). Se inyectan pequeños volúmenes de la muestra (1 microlitro) con colorante y tampón de
carga (No es necesaria una tinción posterior con bromuro de etidio). Se puede monitorizar a tiempo
real.
Dos parámetros para el análisis de integridad del RNA: la relación de los ARN ribosomales 28S
y 18S y el RIN (RNA Integrity Number), que permite determinar la integridad de las muestras de
RNA eucariótico total en base a un rango numérico del 1 al 10, siendo 1 el valor para una muestra
de RNA totalmente degradada y 10 el valor obtenido para una muestra intacta. La calidad e
integridad del RNA de partida debe dar un valor de RIN superior a 7 para RNA-seq.