lOMoARcPSD|28603807 Tema 1 - metodologia del cultivo in vitro CULTIVOS CELULARES (Universidad Pablo de Olavide) Studocu no está patrocinado ni avalado por ningún colegio o universidad. Descargado por Andres aguilar ([email protected]) lOMoARcPSD|28603807 TEMA 1: METODOLOGÍA DEL CULTIVO IN VITRO Cultivo in vitro: algunos conceptos Es un conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento y/o crecimiento de células o tejidos de plantas (explanto) en un medio nutritivo y en condiciones ambientales controladas. El explanto es la parte de la planta que se toma para comenzar el cultivo in vitro. Existen tres conceptos básicos que fundamentan el cultivo in vitro de células y tejidos vegetales: Totipotencialidad celular: capacidad de casi todas las células vegetales, sin importar el grado de diferenciación, para regenerar tejidos y órganos de nuevo, por tanto, de regenerar una planta completa. Esto sucede bajo ciertas circunstancias: control de parámetros (temperatura, fotoperiodo) y presencia de cierta concentración de algunas hormonas. Esta es la teoría de la totipotencialidad, enunciada por Haberlandt a principios del siglo XX. Desdiferenciación/Rediferenciación: las células vegetales, por muy especializadas que estén, pueden desdiferenciarse y convertirse en células meristemáticas y podrá dar cualquier tipo celular. El siguiente paso involucrado en la regeneración de una planta es la rediferenciación de las células previamente desdiferenciadas, para el que entrarán en un nuevo programa de diferenciación. Balance de reguladores del crecimiento vegetal: es importante el balance hormonal, sobre todo, el de auxina y citoquinina (para la morfogénesis). Estos procesos depende del número de hormonas, su cantidad y el tipo que sean. El crecimiento y desarrollo in vitro de una planta está determinado por diversos factores Naturaleza del explanto. Algunos son mejores que otros, ya que no todos se comportan igual, sean de una misma planta (hoja, raíz…) o de diferentes plantas. Medio de cultivo. Contienen el agua, la fuente de energía, las sales inorgánicas y las hormonas necesarias para el crecimiento celular. Todo ello dependerá del tipo de explanto y las necesidades que tenga. Reguladores del crecimiento Factores físicos. Afectan al desarrollo y son: luz, temperatura, pH, O2 o CO2. La metodología de cultivo se ha puesto a punto de forma empírica. Explanto Célula, tejido u órgano de una planta usado para comenzar el cultivo in vitro. Se pueden utilizar muchos tipos de explantos: meristemos apicales del tallo y raíz, hojas, yemas axilares, zonas internodales, raíces… 1 Descargado por Andres aguilar ([email protected]) lOMoARcPSD|28603807 1. Medio de cultivo Comprende la composición química y las propiedades físicas. 1.1. Composición química Factores que influyen en la elección del tipo de medio de cultivo Existen muchos tipos de medios de cultivo, los cuales son comercializables. Aunque a veces hay que partir de cero por las necesidades del explanto a cultivar. Hay que tener en cuenta: Especie cultivada. Algunas especies son más sensibles a altas concentraciones de nutrientes o sales o tienen altos requerimientos de fitohormonas. Edad del explanto. Los tejidos juveniles, generalmente, regeneran las raíces más rápidamente que los tejidos adultos y además no precisan de un aporte exógeno de auxinas. Tipo de órgano o estructura a cultivar. Las raíces requieren tiamina (vitamina). Composición química del medio de cultivo Hay tres tipos de componentes esenciales: agua, nutrientes y agente gelificante. Agua. > 95%. Tiene que ser lo más pura posible, normalmente se usa agua desionizada a través de filtros mediante un sistema de purificación por cartuchos 2 Descargado por Andres aguilar ([email protected]) lOMoARcPSD|28603807 (agua filtrada). Está en desuso el agua destilada, que se consigue a través de la evaporación y condensación de agua. Compuestos orgánicos. o Fuente de carbono. Las plantas son autótrofas y no necesitarían de una fuente de carbono. Pero los medios de cultivo tienen que llevarla porque los explantos suelen ser heterótrofos, al menos en los primeros estadíos del desarrollo. Para regenerar la planta completa se necesita un aporte de carbono. La más usada es la sacarosa (dímero de fructosa y glucosa), porque se mueve bien por lo tejidos y es una molécula no reductora. Se pone en una concentración del 2-4 % (de 20 a 40 g/L). Otras fuentes de carbono son: fructosa, glucosa, maltosa o rafinosa. o Vitaminas. Se ponen en el rango fisiológico: 0.2-1.0 mg/L. Son: - Vitamina B1 o tiamina. Metabolismo de carbohidratos y biosíntesis de aminoácidos. - Vitamina C. Antioxidante. - Inositol o mio-inositol, se considera una vitamina B. En su forma fosforilada forma parte de las membranas. - Ácido nicotínico (B3) y piridoxina (B6). o Aminoácidos, como tirosina, glicina… Van muy bien en algunos procesos de morfogénesis. o Poliaminas. Son aminas cuaternarias que sintetizan las plantas y están relacionadas con procesos de desarrollo. o Carbón activo. Retiene partículas orgánicas y microorganismos. También neutraliza los fenoles que se liberan como consecuencia del daño mecánico que puede sufrir el explanto. o Antibióticos/fungicidas. Evitan el crecimiento de microorganismos no deseados, pero también pueden afectar negativamente al crecimiento vegetal. Sustancias inorgánicas. Son nutritivas y pueden ser tanto micronutrientes como macronutrientes. Se comercializan algunos tipos de medios. Mezcla de sustancias orgánicas poco definidas. Son complementos orgánicos cuya composición química exacta se desconoce, pero aportan sustancias beneficiosas al medio. Se utilizan si el medio estándar no produce el crecimiento deseado. o Leche de coco. Fuente de hormonas, como la kinetina. o Zumo de tomate. Antioxidantes. o Hidroxilado de caseína, peptona y triptona. Fuente de vitaminas y aminoácidos. o Extracto de levaduras. Alto contenido en vitaminas B. Reguladores del crecimiento (hormonas). Los grupos básicos de reguladores del crecimiento son: auxinas, citoquininas, giberelinas, ácido abcísico y etileno. Especialmente los dos primeros. 3 Descargado por Andres aguilar ([email protected]) lOMoARcPSD|28603807 La relación auxina/citoquinina (IAA/CK) determina el crecimiento y morfogénesis: o Alta IAA y alta CK IAA/CK intermedio formación de callo. o Baja IAA o alta CK IAA/CK bajo formación de brotes, yemas o vástagos. o Alta IAA o baja CK IAA/CK alto formación de raíces. Algunas generalidades que poseen las hormonas vegetales son: o Actúan a bajas concentraciones. Se usan a concentraciones de 0.001-10 µM (orden micromolar). o Interactúan unos con otros, es decir, los resultados están determinados por las concentraciones relativas entre las diferentes fitohormonas. o Los reguladores endógenos del crecimiento están presentes en la planta durante todo su ciclo de vida pero su concentración fluctúa. Su concentración relativa varía en función del estado fisiológico de la planta y en cada uno de los órganos de ésta. o Están involucrados en numerosos procesos fisiológicos, como procesos de desarrollo y diferenciación. o Algunas pueden ser autoclavadas, especialmente las sintéticas, como 2,4D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) o BA (6-benzilaminopurina). Pero la mayoría de las hormonas naturales son termolábiles y se degradan con el calor y, por tanto, tienen que ser esterilizadas con filtros, como IAA (ácido indolacético, precursor de la forma activa de la auxina), kinetina, zeatina… Sistemas de soporte. o Agentes solidificantes. Cuando es para protoplastos no se necesita gelificación y crecen en medio líquido. Aunque también se pueden cultivar en medio sólido. Cuando hay que usar un agente gelificante, tenemos: - Agar. Polisacárido de alto peso molecular obtenido de algas. Solidifica a una temperatura entorno a los 45ºC y se funde entorno a los 65ºC. Tiene un alto contenido de impurezas inorgánicas y orgánicas, por lo que es barato. Va bien para solidificar el medio. - Agarosa. Es una fracción purificada con menos impurezas del agar, por lo tanto es más puro. Tiene un menor punto de fusión y gelificación que le agar, no necesita tanta temperatura. Es más caro que el agar y se suele utilizar en el cultivo de protoplastos (células vegetales sin pared celular), porque son muy sensibles. - Gellam Gum (Gelrite y Phytagel). Polisacárido obtenido de bacterias. Tiene una alta pureza, por lo que es muy caro. Se debe controlar muy bien la concentración de cationes divalentes (Ca2+) del medio para su solidificación, ya que si la concentración de cationes es baja, no gelificará. 4 Descargado por Andres aguilar ([email protected]) lOMoARcPSD|28603807 o Soportes mecánicos. Están en desuso. Mantienen el explanto sobre la superficie del medio líquido. Pueden ser: papel de filtro, lana de vidrio, planchas de poliuretano… Composición de medios de cultivo comúnmente usados Existen muchos tipos de medios de cultivo, pero el más famoso es el MS (Murashige y Skoog). Los medios varían en lo bien que van para los distintos tipos de cultivo in vitro. Efecto de la composición del medio, del genotipo y del agente gelificante en la regeneración de tallos a partir de cultivos de hojas de melocotonero Izqierda: % regeneración de tallos a partir de explantos de hoja. Las distintas barras son los tipos de medios, los cuales se diferencian en las concentraciones de hormonas (relación IAA/CK). Dependiendo de la variedad (genotipo), el % de regeneración cambia mucho y dependiendo de la composición del medio, mirando en un solo genotipo, varía el % de regeneración. Derecha: % regeneración usando tres tipos de agentes gelificantes distintos (agar, agarosa, Gellam Gum) con la misma concentración. Esto variará la retención de agua en el medio, ya que cada agente gelificante tiene una capacidad de retención de agua distinta. A más concentración del agente, más retención de agua en el medio. A menos concentración del agente, menor retención de agua en el medio, por lo que habrá más agua en el tejido, que provocará hiperhidricidad y la vitrificación del tejido. 1.2. Propiedades físicas Consistencia La consistencia del medio de cultivo puede ser: semisólida o líquida. 5 Descargado por Andres aguilar ([email protected]) lOMoARcPSD|28603807 El metabolismo de los tejidos puede modificarse dependiendo de las características del medio de cultivo (líquido o semisólido). En el caso de un medio sólido, la concentración y la calidad del agar pueden tener importantes efectos en el desarrollo del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento lento…). El cultivo en medio líquido resulta imprescindible en: cultivo de protoplastos y en cultivo de suspensiones celulares. El resto de los cultivos se realizan en sólido o semisólido. Intercambio gaseoso El intercambio gaseoso es fundamental para el desarrollo. Los recipientes de cultivo se tapan con un film o tapón de polietileno para posibilitar el intercambio de gases, los cuales permiten la entrada de gases, pero no de microorganismos. La organogénesis puede verse modificada si el intercambio de gases se ve dificultado: La inducción de yemas a partir de callos de tabaco se reduce si no hay suficiente oxígeno. La acumulación de etileno puede inhibir la regeneración de brotes. pH Es muy importante ajustar el pH, ya que dicho pH del medio afecta: Solidificación de agentes gelificantes. No gelificarán o no lo harán bien a pH ácidos. Reguladores del crecimiento y vitaminas. Se degradarán a pH ácido. Solubilidad de algunos componentes del medio. A pH básico el fosfato o el hierro no estarán en su forma soluble. Absorción de determinados nutrientes. El pH básico (baja concentración de protones) desfavorece la absorción de nitrato y sulfato en la célula vegetal. La entrada de nitrato se produce gracias a una ATPasa que saca H+ y a un cotransporte posterior de H+ y nitrato al interior celular. pH del citoplasma El pH se ajusta cuando se ha terminado con el medio de cultivo. Se mide el pH del medio, el cual tiene que estar en un pH óptimo de 5.5-6.0. si no está dentro de ese óptimo, tendremos que arreglarlo: Por encima de 6: se usa un ácido. Por debajo de 5.5: se usa una base, como la potasa. Cuando el pH del medio ya esté dentro del óptimo se usa un tampón para que el pH del medio no varíe tras el ajuste, como fosfato, TRIS… 6 Descargado por Andres aguilar ([email protected]) lOMoARcPSD|28603807 2. Esterilización En el medio de cultivo, a parte de nuestro explanto, también podrán crecer microorganismos, como bacterias y hongos. Las fuentes de infección en cultivos in vitro son: Material vegetal. Medio de cultivo. Puede estar infectada el agua, lo que se añade al agua… Aire. Puede tener microorganismos o esporas. Hay que trabajar en cabinas de flujo laminar. Investigador. Hay que lavarse las manos y ponerse guantes, así como usar mascarilla. Hay una serie de técnicas de esterilización para el material vegetal y el medio de cultivo: Destrucción física. Calor seco (estufas), calor húmedo (autoclave) o irradiando con rayos UV o gamma. Eliminación física. Filtración. Destrucción química. Compuestos desinfectantes (alcohol, hipoclorito…) o antibióticos. 2.1. Destrucción física Calor húmedo: autoclave El calor húmedo es el proceso más usado a través del autoclave, en su interior se consiguen unas condiciones de 120 ºC durante 20 minutos a una presión de 1 atmósfera. La fuente de calor la da una resistencia que se calienta, la cual está separada del resto del calderín por una bandeja porosa. El calderín tiene una válvula de escape (de seguridad), que controla la presión, ya que si aumentase mucho la presión, haría que bajase. Las ventajas del autoclave son: Se utiliza para esterilizar el medio y el material de cultivo, como pinzas, escarpelos o recipientes. Esto es cuando sean de metal o de plástico autoclavable, que soportan altas temperaturas y presiones. 7 Descargado por Andres aguilar ([email protected]) lOMoARcPSD|28603807 Los instrumentos se autoclavan envueltos en papel de aluminio y se tienen que sacar del papel en la cabina de flujo laminar, sino se contaminarían. Cuando se autoclava un medio, se hace en un bote, cuya tapa hay que dejar cerrada pero suelta de rosca, porque si no estallaría. Velocidad y simplicidad. Destrucción de microorganismos y sus esporas. No adsorción de líquidos. La adsorción es el líquido se mantiene “pegado”, por lo que no hay pérdidas de líquido. Las desventajas del autoclave son: Cambios de pH. Que esto suceda es raro. Precipitación de sales. Esto ocurre cuando los tiempos de exposición en el autoclave son largos, como ocurre con el material quirúrgico. Despolimerización del agar. Esto ocurre cuando los tiempos de exposición en el autoclave son largos. Descomposición de sustancias termolábiles. Las hormonas vegetales naturales y las vitaminas son sensibles al calor. Se destruirían a 120 ºC, por lo que hay que autoclavar el medio antes de añadírselas y luego adicionarlas de forma estéril. Calor seco: hornos o estufas Las condiciones de trabajo en hornos y estufas serán de 160 ºC durante 2-3 horas. Las ventajas son: Se utiliza para esterilizar material de cultivo. Destrucción de microorganismos y sus esporas. Las desventajas son: Tiempos largos de trabajo (2-3 horas). No se puede utilizar para medios de cultivo. Porque una temperatura tan alta durante tanto tiempo provoca la despolimerización de la sacarosa del medio. Irradiación: luz UV o gamma Se usan radiaciones altamente energéticas para esterilizar. Las ventajas son: Esterilización de material de plástico que no resiste altas temperaturas, es decir, que no es autoclavable. Destrucción de microorganismos y sus esporas. Las desventajas son: 8 Descargado por Andres aguilar ([email protected]) lOMoARcPSD|28603807 Tiempos muy largos, de más de 6-8 horas. Muy caro, ya que las lámparas de luz UV o gamma valen mucho dinero, aunque tienen una vida útil larga. 2.2. Eliminación física Filtración Se utiliza en sustancias termolábiles, como las hormonas o vitaminas. Esas sustancias se ponen en una campana y se hacen pasar por un filtro de 0.22 µm. Las ventajas son: Esterilización de sustancias termolábiles. Las desventajas son: Adsorción de sustancias al filtro. Pérdida de volumen. Aunque es muy poco. Algunas partículas víricas pueden pasar a través de los poros del filtro. Esto es raro que suceda. 2.3. Destrucción química Se utilizan agentes químicos para esterilizar el material vegetal de partida (explanto). Se eliminan los microorganismos de la superficie externa del explanto son: Etanol. Es uno de los más usados. Para el material vegetal se diluye en agua al 70% y para los instrumentos se usa puro. En el material vegetal no se usa el etanol puro porque se evapora rápidamente, deshidrata y hace que en las capas exteriores de las membranas se forme una barrera física que evita que entre, protegiéndose así los protoplastos. Por lo tanto se diluye al 70% para que no se deseque tanto la pared celular y pueda entrar en la célula vegetal y en los protoplastos. Para los instrumentos, se introducen en un bote de etanol y puro y, al sacarlo, se flamea en la llama. Hipoclorito de sodio (lejía). Está al 1%, mientras que la lejía comercial está al 10%. El tiempo de exposición varía dependiendo de la concentración, cuanta más concentración, menor tiempo de exposición. Es el método más usado junto con el etanol. Hipoclorito cálcico. Penetra lentamente en los tejidos. Más lentamente que la lejía. Peróxido de hidrógeno. Al 3-10% durante varios minutos. Cloruro de mercurio. Es muy tóxico, se encuentra al 0.01-0.05%. Dependiendo del tipo de tejido, las concentraciones y los tiempos de exposición de los agentes químicos variarán. 9 Descargado por Andres aguilar ([email protected]) lOMoARcPSD|28603807 Todas estas sustancias son citotóxicas y pueden dañar los tejidos, por lo que habrá que disminuir su concentración o el tiempo de exposición a los agentes químicos esterilizantes. Normalmente la concentración de etanol no varía del 70%, porque tanto por encima como por debajo de ella pierde eficiencia. Cuando hay microorganismos en el interior del tejido, existen dos soluciones distintas: Cultivo de meristemos. Cuando una planta está infectada, es difícil que el virus o la bacteria lleguen a los meristemos apicales. Esto se explica mediante dos hipótesis: o A los meristemos apicales no llegan los haces vasculares, los cuales son la forma más rápida de infección. Mientras que pasar célula a célula es más lenta. o Los meristemos son zonas de mucha división y con una alta concentración de auxinas, lo cual evita la llegada del microorganismos infector. La adición de antibióticos a los medios de cultivo. Aunque esto puede matar al cultivo. 2.4. Cabinas de flujo laminar: “esterilización del aire” Gracias a las cabinas de flujo laminar se consiguen ambientes estériles o asépticos. La cabina consiste en un habitáculo con una turbina, que toma aire del exterior y lo pasa por un prefiltro, que retiene partículas grandes. Luego, el aire prefiltrado pasará por filtros HEPA, que retienen las partículas eficientemente y saldrá el aire estéril. Dentro de la cabina se crean presiones positivas mayores que las del exterior, lo que promueve el flujo de aire de la turbina hacia dentro del habitáculo. 10 Descargado por Andres aguilar ([email protected]) lOMoARcPSD|28603807 3. Condiciones físicas Las condiciones físicas hay que controlarlas y dependen del cultivo. Es muy importante conocer los factores, los cuales son: luz, temperatura, humedad relativa, oxígeno y dióxido de carbono. 3.1. Luz La luz es la fuente de energía para la fotosíntesis, aunque también puede ser un estímulo para el crecimiento y el desarrollo, debido a la fotomorfogénesis, ya que existen fotorreceptores (citocromos, criptocromos…) que perciben la luz como una señal y no como una energía. Hay tres aspectos de la luz que son importantes para llevar a cabo los cultivos in vitro: La cantidad de luz o la irradiancia. Es la cantidad de luz que incide sobre la superficie y se mide en µmol/m2s o en W/m2. Normalmente los cultivos se desarrollan a irradiancias muy bajas, aunque depende del cultivo. Las necesidades de luz de los cultivos in vitro son inferiores a las irradiancias que necesitan los cultivos in vivo debido a: o Presencia de carbohidratos en el medio de cultivo. o Cultivos in vitro se comportan solo parcialmente de forma autótrofa. Ejemplo: cambiando las irradiancias y la temperatura, cambia el ratio de regeneración de un cultivo. En este caso, una alta irradiancia provoca un aumento de la organogénesis en callos friables de una especie de planta. La calidad de la luz. Existen tres tipos distintos de lámparas, que cambiarán la zona del espectro en la que trabajan. o Lámparas incandescentes. Producen la luz por fenómenos de incandescencia del filamento calentado por el paso de la corriente eléctrica. Buena parte del espectro se halla en la zona del rojo/rojo lejano. Producen gran cantidad de calor y consumen mucha electricidad. o Lámparas fluorescentes. Producen la luz por fenómenos de fluorescencia del gas sometido a un arco voltaico. El espectro de la luz producida es rico en la zona del azul. Existen fluorescentes especiales con un espectro rico en la zona azul y roja. Consumen menos electricidad. o Lámparas de vapor de mercurio y sodio. Producen la luz por efecto del paso de la corriente eléctrica a través de gases calientes de mercurio (azul y verde) y sodio (naranja). Son altamente eficientes en el consumo de electricidad. Ejemplo: efecto de distintos tipos de luz (blanca, azul, roja y roja lejana) y oscuridad en la organogénesis. Cuanto más energética sea la luz, mayor crecimiento. El fotoperiodo. Es la alternancia de ciclos de luz-oscuridad, es decir, las horas de luz frente a las de oscuridad. 11 Descargado por Andres aguilar ([email protected]) lOMoARcPSD|28603807 Ejemplo: dependiendo de las horas de luz que tenga el fotoperiodo, variará el número de tallos adventicios (tallos que brotan del cultivo). 3.2. Temperatura Es un factor fundamental. La temperatura de incubación suele ser la fisiológica y oscila entre 15-30 ºC. Dependerá del cultivo y del tipo de explanto. Ejemplo: efecto de la temperatura en el crecimiento del callo en una variedad de Papaver. Normalmente, cuanto más se acerque la temperatura de cultivo a la fisiológica, más crecerá el cultivo. 3.3. Humedad relativa La humedad relativa es la cantidad de vapor de agua contenido en la atmósfera. No es un problema en los cultivos in vitro porque el medio ya tiene una humedad controlada. 3.4. Oxígeno En el cultivo in vitro se necesita una buena aireación, ya que se necesita para la respiración mitocondrial. En los cultivos líquidos, se emplea agitación para que el oxígeno se difunda correctamente. Como tiene que penetrar en el cultivo, el recipiente tiene que estar tapado con un material poroso que permita el intercambio gaseoso (oxígeno y dióxido de carbono), pero que no deje pasar a los microorganismos. 3.5. Dióxido de carbono No es limitante ya que los medios contienen carbohidratos. El dióxido de carbono no es importante hasta que la planta no tenga hojas, que es cuando empezará a realizar la fotosíntesis. 4. Cámaras de cultivo Las cámaras de cultivo tienen una serie de características: Control del ambiente físico. Es un habitáculo en el que se controla el ambiente físico: temperatura, iluminación, fotoperiodo y humedad relativa. Temperatura. Se emplean sistemas de refrigeración-calefacción, en los que se usan aires acondicionados y resistencias para controlar la temperatura. La temperatura se detecta y controla a través de sondas. Iluminación. Se emplea una mezcla de fluorescentes y bombillas. Fotoperiodo. Se conecta un programador (reloj) conectado a un circuito de iluminación (luz). Humedad relativa (HR). Se pulveriza agua a presión a través de una válvula (pulverizador de agua). 12 Descargado por Andres aguilar ([email protected]) lOMoARcPSD|28603807 5. Organización del laboratorio El laboratorio se organiza en una serie de áreas: Área de preparación de medios de cultivo. Provisto de agua de calidad, balanzas, frigoríficos, congeladores, pH-metros… Autoclave grande Habitación adecuada para almacenar los medios. Normalmente se encuentra a una temperatura de 2-6 ºC. Habitación de transferencia. Donde se preparan los cultivos y se transfieren los explantos. Cuenta con cabinas de flujo laminar, salida de gas, microscopios, pinzas, escarpelos… Cámara de cultivo. Tiene unas condiciones controladas de luz, temperatura, humedad. Cuenta con incubadores y agitadores orbitales. 13 Descargado por Andres aguilar ([email protected])