OPTIMIZACIÓN DE METODOLOGÍA PARA LA DETERMINACIÓN DE DERIVADOS ANFETAMINICOS EN MATRICES BIOLÓGICAS DEL SERVICIO MEDICO LEGAL. POR JAVIERA IGNACIA FREDES FIERRO. Propuesta de Trabajo de Fin de Carrera presentado en la Facultad de Farmacia de la Universidad de Concepción para optar al título profesional de Químico Farmacéutico. Profesor Patrocinante: Claudio Müller Ramírez Departamento de Farmacia Facultad de Farmacia Profesional Guía: QF. Christian Ortega Venegas Laboratorio de Toxicología Servicio Médico Legal Julio,2023 Concepción Introducción Informe sobre el Consumo de Drogas en las Américas de 2019, en Chile: Anfetaminas Utilizadas como: Estimulantes del SNC. Tratamiento de déficit atencional. Narcolepsia. Más consumidas ¿qué son? Cannabis Cocaina Anfetaminas Prevalencia de consumo en estudiantes de enseñansa media (cifras bajas en comparacion a otros paises de la región). Compuestos sintéticos derivados de la feniletilamina que actúan como análogos adrenérgicos en el cerebro, estimulando el SNC mediante la liberación tanto de norepinefrina como de dopamina. Pueden ser altamente adictivas debido a las caracteristicas que les confiere su estructura quimica, produciendo sensacion de euforia y bienestar. Ademas se asocian a efectos secundarios graves, como hipertensión arterial, taquicardia, dolor de cabeza y comportamientos psicóticos, especialmente cuando se consumen en exceso o sin una supervisión médica adecuada. Estructura química y caracteristicas farmacodinamicas. Absorcion por V.O rapida, alcanzando efectos farmacologicos aprox a los 30 min. Peak de concentracion a nivel plasmatico entre 1-3 horas. Absorcion completa lugo de 4-6 horas de su administración. Se distribuyen principalmente en riñores, pulmones, líquido cefalorraquídeo y cerebro (por su liposolubilidad). Se metabolizan a nivel hepático (Citocromo P450) y dan paso a la produccion de para-hidroxianfetamina y fenilacetona. Excrecion principalmente por via renal,tambien por via fecal y pulmonar Grupo amina (-NH2) y fenilo le dan caracteristicas de : liposolubilidad actividad sobre transportadores de monoaminas Variaciones en la estructura molecular principal de la anfetamina le confieren a sus análogos caracteristicas farmacologicas y toxicologicas diferentes. Fig. 1. Estructura química anfetamina y derivados (Extraído de Robledo, P. (2008). Las anfetaminas.) [Robledo, P.,2008]. Importancia medico-legal 1 de cada 2 delitos cometidos en el país están relacionados con el consumo de drogas, incluidas las anfetaminas y otras drogas estimulantes. [Servicio Nacional para la Prevención y Rehabilitación del Consumo de Drogas y Alcohol (Senda). (2021)] ¿Por qué se asocia el consumo de anfetaminas a la ejecución de delitos? Debido a sus efectos en el SNC, los cuales pueden producir cambios en el comportamiento y la personalidad de las personas, como aumentar la agresividad y disminuir la capacidad de juicio, lo que puede llevar a comportamientos sociales y criminales de riesgo. [Nuria, B. y cols. GESTIÓN, ANÁLISIS Y REDACCIÓN Observatorio Español de las Drogas y las Adicciones (OEDA) Delegación del Gobierno para el Plan Nacional sobre Drogas (DGPNSD)] Institución encargada de realizar pruebas toxicologicas en muestras biologicas como orina,sangre y tejidos para determinar la presencia y cantidad de sustancias de abuso en el cuerpo. Herramienta importante en la prevención y el tratamiento del abuso de drogas, debido a que proporciona informacion precisa y confiable sobre el consumo de éstas a las autoridades competentes y a los profesionesl de salud. Dentro de los diferentes análisis realizados en el servicio, tenemos la detencción y cuantificación de anfetaminas. Tabla 1. Anfetaminas detectadas y cuantificadas en el laboratorio de Toxicología del Servicio Médico Legal. Actualmente el analisis de anfetaminas se realiza siguiendo el procedimiento normado de trabajo "Extracción en fase sólida de anfetaminas y sus derivados en matriz sangre. Se realiza en un cromatógrafo de gas acoplado a un espectrómetro de masa, utilizando una columna de 60 metros y derivatizante anhídrido pentafluoropropiónico (PFPA). Con dicha columna se demoran alrededor de 20-25 minutos por muestra, lo que conlleva a análisis más extensos. Problema El uso del derivatizante PFPA resulta en daño del relleno de la columna, provocando así una disminución en su vida útil. Actualmente no se encuentran caracterizadas todas las anfetaminas ni sus derivados, como tampoco las aminas biógenas. Objetivos Objetivo principal: Optimizar metodología para la determinación de derivados anfetamínicos en matrices biológicas. Objetivos específicos: Modificar y evaluar condiciones cromatográficas al utilizar una columna de 30 metros. Perfeccionar condiciones cromatográficas como el sistema de inyección y rampas de temperatura. Caracterizar nuevos derivados anfetamínicos e interferentes. Evaluar utilización de anhídrido trifluoroacético (TFA) como nuevo derivatizante. Calcular algunos parámetros de validación a nuevos derivados anfetamínicos. Metodología En primera instancia se realizará una búsqueda bibliográfica en bases de datos como Cochrane library, Elsevier, SciELO, entre otras. Modificar y evaluar condiciones cromatográficas al utilizar una columna de 30 metros. 1. .Se modificará la columna cromatográfica del equipo desde una de 60 metros a la de 30 metros. 2. Se preparará una solución estándar y un patrón de los diferentes derivados anfetamínicos. 3. Paralelo al punto 2 se sobrecargaran las soluciones en sangre y orina para así también poder evaluar su comportamiento al encontrarse dentro de estas matrices Perfeccionar condiciones cromatográficas como el sistema de inyección y rampas de temperatura. Modificar y evaluar condiciones 1. Mediante la inyección de patrones puros y en matriz se evaluarán distintas cromatográficas al utilizar una columna de 30 condiciones cromatográficas, específicamente la modificación del volumen de metros. inyección de muestra, el sistema de inyección, las rampas de temperatura, y el flujo, los cuales nos van a entregar datos como el porcentaje de recuperación, el tiempo de retención y la eficiencia de la columna. 2. Probar diferentes configuraciones del sistema multimodo de inyección, como Split, Splitless, Spliltess pulsado o PTV y se evaluará la intensidad de las señales analíticas. 3. En el caso de las rampas de temperatura, se comenzará con una primera rampa isoterma de prueba y se evaluarán los resultados obtenidos, luego se irán probando las rampas del método actual, y en función de los resultados se determinará si es necesario modificarlas. Evaluar utilización de anhídrido trifluoroacético (TFA) como nuevo derivatizante. 1. Se preparará un estándar puro que se derivatizará con anhídrido trifluoroacético y se medirá elyporcentaje de recuperación que este nos proporcionará. Modificar evaluar condiciones 2. cromatográficas Se modificarán parámetros tiempo temperatura para así encontrar las condiciones al utilizar unade columna dey 30 óptimas de derivatización TFA. Una vez obtenidos los parámetros óptimos de metros. derivatización con TFA se procederá a comparar su eficacia versus el derivatizante actualmente utilizado (PFPA). Caracterizar nuevos derivados anfetamínicos e interferentes. 1. Se prepararán soluciones patrones de 100ug/mL de efedrina, pseudoefedrina, Fentermina, metformina, 2-feniletilamina, metilfenidato, putrescina, cadaverina, triptamina, espermidina y NBOME, los cuales no se encuentran completamente caracterizados en el laboratorio de toxicología del SML. 2. Se les aplicará el procedimiento normado de trabajo “Extracción en fase sólida de anfetaminas y sus derivados en matriz sangre” bajo las condiciones cromatográficas anteriormente obtenidas con la nueva columna. Calcular algunos parámetros de validación a nuevos derivados anfetamínicos. Se obtendrán algunos parámetros de validación de derivados anfetamínicos, los cuales se evaluarán según guías Modificar y evaluar condiciones de validación, los puntos a medir serán: cromatográficas al utilizar una columna de 30 metros. Selectividad: Se analizarán 6 muestras reales multicomponentes (matriz sangre), las cuales serán sobrecargadas con las diferentes anfetaminas y derivados para así obtener los cromatogramas y con esto poder calcular la resolución. Límite de detección y cuantificación analítica: Para la obtención de éstos, se realizará en análisis 10 veces de un blanco analítico (anfetamina D-11), calculando así la media y la desviación estándar de las señales para luego aplicar la formula correspondiente. Límite de detección y cuantificación del método: Se seguirá los mismos pasos del parámetro anteriormente mencionado, con la diferencia que en este caso se utilizará una muestra real que contenga un valor de entre 2 a 10 veces la concentración del límite de detección obtenido con anterioridad. Linealidad: A partir de la construcción de una curva de calibración con concentraciones conocidas de estándares certificados de anfetaminas, se evaluará la relación entre las Modificar y evaluar condiciones concentraciones y la respuesta cromatográficas al utilizar una columna de 30 analítica para así asegurar que metros. exista una relación lineal. Replicabilidad: En una muestra que contenga concentraciones cercanas al límite de cuantificación del método se realizaran los análisis por triplicado, respetando las variables de mismo equipo, mismo día y analista para luego calcular la desviación estándar y la media de las concentraciones pudiendo calcular de esta forma el coeficiente de variación. Exactitud: Se realizará el análisis de diferentes concentraciones de estándares certificados por triplicado, obteniendo así el promedio de las concentraciones que servirán para calcular el error relativo del método. Repetibilidad: Al igual que en el caso anterior se analizarán las muestras por triplicado, pero en este caso lo que se cambiará será tanto el día del análisis como el analista propiamente tal. Modificar y evaluar condiciones cromatográficas al utilizar una columna de 30 metros. Recuperación: En este caso se medirá por triplicado una muestra real y al mismo tiempo igualmente por triplicado se analizará la misma muestra, pero fortificada con una concentración conocida de estándar. Sensibilidad: La cual estará dada por la pendiente obtenida de la curva de calibración Carta Gantt