Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Introducción La amplificación (aumento del número de copias) de un fragmento determinado de ADN puede llevarse a cabo mediante métodos como la inserción de la secuencia en una célula bacteriana, que al multiplicarse repetidamente dará como resultado millones de copias de ese fragmento. Kary Mullis desarrolló en 1983 una técnica mucho más eficiente denominada PCR (Polymerase Chain Reaction), capaz de generar en pocas horas billones de copias de una secuencia a partir de una pequeña cantidad de ADN. La PCR es una reacción bioquímica in vitro en la que un par de primers (también conocidos como iniciadores o cebadores) flanquean a la región a amplificar, se unen a las cadenas sencillas del ADN para elongar el resto de la secuencia objetivo con la ayuda de la Taq polimerasa. Cada ciclo de la reacción involucra tres pasos principales: desnaturación de dobles cadenas de ADN, anillaje de primers y elongación. En el primer paso, la temperatura es elevada, a aproximadamente 94°C, para permitir la separación completa de la doble hebra de ADN. En el segundo paso, se disminuye la temperatura dependiendo de la temperatura melting de los primers, aprox. entre 50-68°C, donde las hebras de ADN se asocian con los primers específicos de la región de interés. Cada primer anilla específica y separadamente en el extremo 3’ de la secuencia deseada, un solo primer anilla por cadena sencilla de ADN. Durante el tercer paso, la Taq polimerasa (extraída de la bacteria termofílica Thermus aquaticus), a 72°C, se vale del primer para sintetizar la cadena complementaria a la secuencia deseada, dando como resultado dos moléculas que contienen una copia del fragmento de interés y una secuencia flanqueante a esta región. A medida que el número de ciclos aumenta, la cantidad de copias que contienen únicamente el fragmento esperado se eleva exponencialmente permitiendo obtener un alto número de copias de la secuencia deseada a partir de una mezcla de ADNs. Esta técnica se ha empleado en métodos que buscan identificar la presencia de una secuencia específica, como una mutación determinada en el genoma de un paciente o la presencia de un agente patógeno en una muestra de cualquier origen, esto gracias a la capacidad de la PCR para aislar una secuencia de una mezcla compleja de moléculas. En esta práctica, trabajaremos con el ADN extraído previamente y realizaremos la amplificación de la región del gen alpha-actin-3 humano. Este gen es de importancia en el rendimiento deportivo ya que se han asociado diferentes polimorfismos con un mejor desempeño en diferentes ejercicios. Por ejemplo, el gen wildtype, que tiene una arginina (R) en la posición 557, se ha reportado como un gen indicador de mejor desempeño en actividades que requieren de contracciones enérgicas como el sprinting y el levantamiento de pesas. Por otro lado, el polimorfismo R557X, en el cual se cambia la arginina por un codón de parada, se ha reportado como un posible indicador de mejor desempeño en actividades de resistencia. Objetivos. 1. Comprender el fundamento de la Reacción en Cadena de la Polimerasa. 2. Amplificar un fragmento de ADN del gen alpha-actin-3 de humano y visualizar el producto de amplificación en un gel de agarosa. 3. Entender y adquirir habilidad en la programación y uso del termociclador. Materiales y Métodos. 1. Realizar la mezcla “Master Mix” de los reactivos en un tubo eppendorf (como lo indica la Tabla 1). Reactivo Agua PCR Buffer MgCl2 dNTPs Primer F Primer R Primer F interno Primer R interno Taq ADN Conc. Inicial 10x 50mM 10mM 10µM 10µM 10µM Conc. Final 1x 1.25mM 0.2mM 0.5µM 0.5µM 0.125µM Volumen (sin ADN, 22µL) 14.80 µL 2.5µL 0.75µL 0.5µL 1.25µL 1.25µL 0.3125µL MasterMix para 4 reacciones 59.2 µL 10µL 3µL 2µL 5µL 5µL 1.25µL 10µM 0.25µM 0.625µL 2.5µL 5U - 2.5U - 3µL 0.4µL - 2. Mezclar la reacción de PCR por pipeteo, muy suavemente y sin generar burbujas 3. Agregar 22µl de la mezcla “Master Mix” a 3 tubos eppendorf. Agregar a 2 de los tubos, 3µl del ADN extraído la clase pasada. 4. Realizar un control negativo de la reacción, agregando 3μl de agua ultrapura al tubo restante (en lugar de ADN). 5. Llevar al termociclador para correr la reacción bajo el perfil térmico elegido. Ciclo elegido: N. Ciclos Temperatura Tiempo 1X 94°C 3 min 94°C 30 segundos 68°C 30 segundos 72°C 90 segundos 1X 72°C 10 min 1X 4°C ∞ 35X