Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Introducción
La amplificación (aumento del número de copias) de un fragmento determinado de ADN
puede llevarse a cabo mediante métodos como la inserción de la secuencia en una célula
bacteriana, que al multiplicarse repetidamente dará como resultado millones de copias de ese
fragmento. Kary Mullis desarrolló en 1983 una técnica mucho más eficiente denominada
PCR (Polymerase Chain Reaction), capaz de generar en pocas horas billones de copias de
una secuencia a partir de una pequeña cantidad de ADN.
La PCR es una reacción bioquímica in vitro en la que un par de primers (también conocidos
como iniciadores o cebadores) flanquean a la región a amplificar, se unen a las cadenas
sencillas del ADN para elongar el resto de la secuencia objetivo con la ayuda de la Taq
polimerasa. Cada ciclo de la reacción involucra tres pasos principales: desnaturación de
dobles cadenas de ADN, anillaje de primers y elongación. En el primer paso, la temperatura
es elevada, a aproximadamente 94°C, para permitir la separación completa de la doble hebra
de ADN. En el segundo paso, se disminuye la temperatura dependiendo de la temperatura
melting de los primers, aprox. entre 50-68°C, donde las hebras de ADN se asocian con los
primers específicos de la región de interés. Cada primer anilla específica y separadamente en
el extremo 3’ de la secuencia deseada, un solo primer anilla por cadena sencilla de ADN.
Durante el tercer paso, la Taq polimerasa (extraída de la bacteria termofílica Thermus
aquaticus), a 72°C, se vale del primer para sintetizar la cadena complementaria a la secuencia
deseada, dando como resultado dos moléculas que contienen una copia del fragmento de
interés y una secuencia flanqueante a esta región.
A medida que el número de ciclos aumenta, la cantidad de copias que contienen únicamente
el fragmento esperado se eleva exponencialmente permitiendo obtener un alto número de
copias de la secuencia deseada a partir de una mezcla de ADNs.
Esta técnica se ha empleado en métodos que buscan identificar la presencia de una
secuencia específica, como una mutación determinada en el genoma de un paciente o la
presencia de un agente patógeno en una muestra de cualquier origen, esto gracias a la
capacidad de la PCR para aislar una secuencia de una mezcla compleja de moléculas.
En esta práctica, trabajaremos con el ADN extraído previamente y realizaremos la
amplificación de la región del gen alpha-actin-3 humano. Este gen es de importancia en el
rendimiento deportivo ya que se han asociado diferentes polimorfismos con un mejor
desempeño en diferentes ejercicios. Por ejemplo, el gen wildtype, que tiene una arginina (R)
en la posición 557, se ha reportado como un gen indicador de mejor desempeño en
actividades que requieren de contracciones enérgicas como el sprinting y el levantamiento de
pesas. Por otro lado, el polimorfismo R557X, en el cual se cambia la arginina por un codón de
parada, se ha reportado como un posible indicador de mejor desempeño en actividades de
resistencia.
Objetivos.
1. Comprender el fundamento de la Reacción en Cadena de la Polimerasa.
2. Amplificar un fragmento de ADN del gen alpha-actin-3 de humano y visualizar el producto
de amplificación en un gel de agarosa.
3. Entender y adquirir habilidad en la programación y uso del termociclador.
Materiales y Métodos.
1. Realizar la mezcla “Master Mix” de los reactivos en un tubo eppendorf (como lo indica la
Tabla 1).
Reactivo
Agua PCR
Buffer
MgCl2
dNTPs
Primer F
Primer R
Primer F
interno
Primer R
interno
Taq
ADN
Conc.
Inicial
10x
50mM
10mM
10µM
10µM
10µM
Conc.
Final
1x
1.25mM
0.2mM
0.5µM
0.5µM
0.125µM
Volumen (sin
ADN, 22µL)
14.80 µL
2.5µL
0.75µL
0.5µL
1.25µL
1.25µL
0.3125µL
MasterMix para 4
reacciones
59.2 µL
10µL
3µL
2µL
5µL
5µL
1.25µL
10µM
0.25µM
0.625µL
2.5µL
5U
-
2.5U
-
3µL
0.4µL
-
2. Mezclar la reacción de PCR por pipeteo, muy suavemente y sin generar burbujas
3. Agregar 22µl de la mezcla “Master Mix” a 3 tubos eppendorf. Agregar a 2 de los tubos, 3µl del
ADN extraído la clase pasada.
4. Realizar un control negativo de la reacción, agregando 3μl de agua ultrapura al tubo restante
(en lugar de ADN).
5. Llevar al termociclador para correr la reacción bajo el perfil térmico elegido.
Ciclo elegido:
N. Ciclos
Temperatura
Tiempo
1X
94°C
3 min
94°C
30 segundos
68°C
30 segundos
72°C
90 segundos
1X
72°C
10 min
1X
4°C
∞
35X
