Aislamiento e Identificación de Azotobacter en Suelos Mexicanos

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Aislamiento e identificación de cepas nativas del suelo mexicano del género
Azotobacter
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Carolina Flores
Juan Carlos Contreras-Esquivel
Autonomous University of Coahuila
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M. Humberto Reyes-Valdes
Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro (UAAAN)
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2012 Volumen 4, No. 8
Revista Científica de la Universidad Autónoma de Coahuila
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE CEPAS NATIVAS DEL SUELO
MEXICANO DEL GÉNERO Azotobacter
1
1
Adriana Carolina Flores-Gallegos , Juan Carlos Contreras-Esquivel , Manuel Humberto
2
1
Reyes-Valdés y Raúl Rodríguez-Herrera
1
Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de Coahuila, Boulevard Venustiano Carranza y
José Cárdenas sin número, Col. República Oriente. Saltillo, Coahuila, C.P. 25280, Tels (844) 416 92 13, 415
95 34. *Correo electrónico [email protected]
2
Departamento de Fitomejoramiento, Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, Blvd. Antonio Narro
1923, Buenavista Saltillo, Coahuila, C.P. 25315, Tels (844) 411 02 72, 411 03 02.
RESUMEN
Desde el siglo pasado, los microorganismos diazótrofos han sido objeto no solo de estudio en microbiología de suelos,
sino también en el desarrollo de productos biológicos comerciales especialmente en Cuba, México y Estados Unidos.
Con el fin de aislar y caracterizar bacterias diazótrofas del género Azotobacter, se analizaron muestras de suelos
mexicanos. El aislamiento se realizó empleando medio Ashby-sacarosa libre de nitrógeno. Los aislamientos se
caracterizaron fenotípica y bioquímicamente, logrando identificar bacterias del género Azotobacter. La caracterización
molecular se realizó mediante la amplificación del ADNr 16S utilizando como cepa de referencia a Azotobacter vinelandii
CDBB B-992. El gen 16S fue amplificado mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando los
iniciadores FGPL y FGPS, que además amplifican la región polimórfica de los espacios intergénicos (IGS) 16S-23S. Se
obtuvieron productos de 2000 pb aproximadamente tanto para los aislamientos como para la cepa de referencia.
Posteriormente se obtuvo la secuencia de estos productos y se comparó con la base de datos del GenBank mediante la
herramienta BLAST obteniendo una similitud del 99% para Azotobacter vinelandii. Así se demostró que las técnicas
moleculares en conjunto con las convencionales y la bioinformática son herramientas fundamentales para la
caracterización de bacterias diazótrofas de importancia en agricultura, estudios de biodiversidad, bioprospección y
biotecnología.
Palabras clave: diazótrofos, aislamiento, suelos mexicanos, PCR.
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INTRODUCCIÓN
Actualmente la mayoría de cultivos agrícolas dependen de los fertilizantes químicos sintéticos, los cuales proporcionan
nutrimentos asimilables por las plantas. Sin embargo, su uso prolongado ocasiona contaminación ambiental y daños
ecológicos, además de un incremento en el costo de producción y el impacto negativo en la salud animal y humana. Una
33
alternativa es utilizar biofertilizantes para promover la agricultura orgánica y las tecnologías limpias y seguras. Las
bacterias fijadoras de nitrógeno (diazótrofas) fueron las primeras en producirse comercialmente con fines de
biofertilización. De este grupo, las más utilizadas como biofertilizantes corresponden al género Azotobacter, el cual
comprende siete especies a) A. chroococcum, b) A. vinelandii, c) A. beijerinckii,d) A. paspali, e) A. armeniacus, f) A.
nigricans y g) A. salinestris (Dobereiner y Day, 1975; Tchan y New, 1984; Page y Shivprasad, 1991). Los
microorganismos de este género fijan asimbióticamente nitrógeno y son solubilizadoras de fosfato. Además realizan
procesos de biodegradación de plaguicidas como el endosulfan (Balandreau y col., 1986). En vida libre, fijan al menos 10
mg de N2 por gramo de carbohidrato consumido (Holt, 2000).
Los métodos más utilizados para aislar bacterias del género Azotobacter incluyen el aislamiento en medio libre de
nitrógeno, enriquecimiento en solución de Winogradsky y posterior siembra en medio libre de nitrógeno, y siembra de
gránulos individuales de suelo en medio libre de nitrógeno. Para su identificación preliminar se emplean pruebas
bioquímicas como la fermentación de diferentes azúcares (Holt, 2000).
Sin embargo, las pruebas bioquímicas y morfológicas resultan métodos limitados para la identificación y caracterización
de bacterias diazótrofas a nivel de especie. Debido a esto, se han desarrollado técnicas de huella genética como RFLP
(Restricting Fragment Length Polymorphisms), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), ARDRA
(Amplified
Ribosomal DNA Restriction Analysis) y secuenciación que permiten una identificación y caracterización más precisa.
Adicionalmente, los genes nif y el gen ADNr 16S han sido reportados para la caracterización de diferentes géneros
diazótrofos, ya que son muy conservados y se encuentran en todos los microorganismos fijadores de nitrógeno (Rodicio
y Mendoza, 2004).
En el presente trabajo se logró el aislamiento e identificación fenotípica de cepas nativas del suelo mexicano fijadoras de
nitrógeno, y se identificaron bioquímica y molecularmente a nivel especie empleando técnicas básicas de biología
molecular.
METODOLOGÍA
Aislamiento de las cepas. Se muestrearon cinco suelos de distintas regiones del país en zigzag y a una profundidad de
10-15 cm (Martyniuk y Martyniuk, 2002; Tejera y col., 2005). Las muestras se almacenaron en bolsas de cierre hermético
a temperatura ambiente. El pH de las muestra se verificó de acuerdo al protocolo propuesto por Van Lierop (1981). Para
lograr el aislamiento de cepas fijadoras de nitrógeno, se sembraron gránulos de cada uno de los suelos en agar Ashby
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libre de nitrógeno a una distancia aproximada de 1 cm. Las placas fueron incubadas a 30°C por 7 días (Aquilanti y col.,
2004). Al término de este periodo se procedió a sembrar por agotamiento en placas de agar Azotobacter a partir de las
colonias obtenidas incubando nuevamente a 30°C durante 7 días. Las cepas obtenidas se conservaron en glicerol al
30% (v/v).
Identificación bioquímica. A cada aislamiento se le realizó una caracterización con base en el comportamiento
bioquímico frente a la fermentación de glucosa, manitol y benzoato. También se realizó una prueba de asimilación y
crecimiento en benzoato, fenol y glicerol como fuente de carbono, prueba de la catalasa, prueba de Nessler y
producción de ácido 3-indolacético (Torres-Rubio y col., 2000). Se llevó a incubar a 28±2ºC durante 24 h para después
verificar la acidificación del medio como indicativo de la fermentación de azúcares y benzoato. Finalmente se realizó la
prueba de Nessler para determinar la desnitrificación, la prueba de la catalasa y la prueba de la producción de ácido
indolacético. Todas las pruebas bioquímicas se realizaron por triplicado.
Cepa control. Para la identificación bioquímica y caracterización molecular se utilizó la cepa A. vinelandii como control
positivo. Esta cepa se adquirió de la Colección Nacional Mexicana de Cepas Microbianas del Centro de Investigación y
Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional (CINVESTAV), la cual se encuentra clasificada como CDBB B-992.
Extracción de ADN. Se llevó a cabo la extracción de ADN genómico siguiendo el protocolo propuesto por Maloy (1989).
El procedimiento consistió en realizar la suspensión de una colonia de Azotobacter en 5 ml de caldo nutritivo e incubar
48 h a temperatura ambiente a 150 rpm. Se transfirieron 1.5 ml del cultivo a tubos eppendorf estériles para centrifugar a
13000 rpm por 2 min y se desechó el sobrenadante.
Las células se resuspendieron en 50 µl de buffer TE 1X y las fracciones se reunieron en un solo tubo. Se agregó 1 ml de
TE 1X y se lavó suavemente agitando los tubos; se centrifugó a 13000 rpm por 2 min y se descartó el sobrenadante. Las
células se resuspendieron en 350 µl de TE 1X y se adicionaron 5 µl de lisozima (50 mg/ml) y 2 µl de RNAsa A (10
mg/ml). Se llevó a incubar a 37ºC durante 10 min para posteriormente adicionar 3 µl de proteinasa K (20 µg/ml) y 30 µl
de SDS al 10% (p/v) y se volvió a incubar a 65ºC por 15 minutos hasta observarse una suspensión clara que indicara la
lisis bacteriana. Una vez lisadas las células, se adicionaron 350 µl de la mezcla fenol: cloroformo: alcohol isoamílico
(25:24:1) y se mezcló por inversión 5 veces. El tubo fue centrifugado a 13000 rpm por 7 minutos recuperándose el
sobrenadante en un tubo Eppendorf cuidando de no tomar la fase orgánica ni la interfase. Se adicionaron 350 µl de
cloroformo: alcohol isoamílico (24:1) y se mezcló por inversión 5 veces. Posteriormente se centrifugó a 13000 rpm por 7
min.
El sobrenadante obtenido fue transferido a otro tubo que contenía 1 ml de etanol absoluto frío y se llevó a incubar a
-20ºC durante 1 h. Finalmente se centrifugó a 10000 rpm por 5 min y se dejó secar la pastilla obtenida durante 20 min a
temperatura ambiente para después resuspenderlo en 50 µl de agua destilada estéril para poder determinar su calidad.
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Determinación de la calidad del ADN. Con el fin de conocer la integridad del ADN extraído por distintos métodos se
procedió a realizar una electroforesis en gel de agarosa al 1% p/v en TAE 1X. El ADN se tiñó con bromuro de etidio (0.5
µg/ml). La electroforesis se llevó a cabo en una cámara Thermo EC105® a 60 V por 1 h. Se colocaron en cada pozo 10
µl del ADN y 3 µl de azul de bromofenol. La visualización de los geles se realizó en un transiluminador de luz UV
Spectroline®.
35
Amplificación del ADN ribosomal 16S-IGS. Para lograr la amplificación del gen ADNr 16S se utilizaron los iniciadores
universales FGPL 132`-38 y FGPS 6-63 que amplifican además los IGS (Cuadro 1) (Nour y col., 1994). La amplificación
se llevó a cabo en un volumen de 50 µl que contenía: Buffer 1X, 2 mM MgCl2, 50 µM dNTPs, 0.8 pmol de iniciador FGPL
132`-38 y 0.8 pmol de iniciador FGPS 6-63, 2.5U de Taq DNA Polimerasa recombinante de la marca InvitrogenTM ; el
volumen de ADN se ajustó para alcanzar una concentración de 100 ng (Junior y col., 2004). La reacción de amplificación
(PCR) se llevó a cabo en un termociclador Px2 Thermal Cycler® con un paso inicial de desnaturalización de 94ºC por 5
min; 35 ciclos con un programa de temperatura que consiste en: desnaturalización a 94ºC por 1 min, alineamiento a 54ºC
por 1 min y elongación a 72ºC por 1 min; y un paso final de extensión de 72ºC por 5 min (Quatrini y col., 2001).
Cuadro 1. Secuencia de los iniciadores utilizados para la amplificación del gen 16S.
Iniciador
FGPL 132’-38 Forward
FGPS 6- 63 Reverse
Secuencia
5’-CCGGGTTTCCCCATTCGG-3’
5’-GGAGAGTTAGATCTTGGCTC-3’
Pares de bases
18 pb
20 pb
Para observar los productos de la amplificación del ADNr 16S se corrió una electroforesis en gel de agarosa al 1.0% (p/v)
en TAE 1X teñido bromuro de etidio (0.5 µg/ml). La electroforesis se llevó a cabo en una cámara Thermo EC105® a 60
V por 1 h. Se colocaron en cada pozo 10 µl del ADN y 3 µl de azul de bromofenol. Se utilizó el marcador de peso
molecular de 100 pb (InvitrogenTM). La visualización de los geles se realizó en un transiluminador de luz UV
Spectroline®.
Secuenciación. La secuenciación se realizó en un equipo Perkin Elmer de Applied Biosystems Modelo 3730 por el
método de terminadores fluorescentes (Taq FS Dye Terminator Cycle Sequencing Fluorescence-Based Sequencing).
Las secuencias obtenidas se compararon con la base de datos del GenBank mediante la herramienta BLAST (Basic
Local Aligment Search Tool) de la base de datos del NCBI, optimizando para las secuencias altamente similares. Los
datos obtenidos mediante BLAST se utilizaron para la construcción del árbol filogenético por el método Neighbor-Joining
y un valor de bootstrap de 1000 empleando el modelo de sustitución nucleotídica de dos parámetros de Kimura con
distribución gamma.
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Medición de pH de las muestras de suelo. Se encontraron valores de pH de los suelos muestreados cercanos a la
neutralidad. Para el caso del suelo 4 se obtuvo un valor de 7.56, mientras que para el suelo 2 se registró un valor de
6.48. Estos valores se encuentran en el rango óptimo reportado para el crecimiento de bacterias del género Azotobacter
cuando realizan la fijación del nitrógeno (7.0-7.5) (Balandreau, 1986). Sin embargo, se han reportado especies que
pueden crecer desde pH alrededor de 5.5 tales como A. chroococcum y A. vinelandii (Saribay, 2003).
Identificación morfológica de bacterias diazótrofas aerobias asimbióticas. El aislamiento secundario en medio
Azotobacter permitió obtener un total de 6 aislamientos de bacterias aerobias fijadoras de nitrógeno asimbióticas. Este
medio selectivo permite el aislamiento de bacterias fijadoras de nitrógeno además de que posee microelementos
importantes para la fijación del nitrógeno como el FeSO4. En el total de los aislamientos se evidenciaron dos morfologías
diferentes de colonia. Las colonias en la mayoría de los aislamientos fueron de color crema, medianas, irregulares y
brillantes (C1, C2, C3 y C5) muy similares a las reportadas para el género Azotobacter, sin embargo, se presentaron
aislamientos con colonias pequeñas, traslúcidas y brillantes como en el caso de los cepas 4 y 6 (C4 y C6). Además, se
logró identificar tres morfologías celulares. En algunas cepas se evidenció la formación de quistes, ya que las bacterias
del género Azotobacter cuando provienen del suelo se encuentran en un estado de resistencia a las condiciones
ambientales (Vela, 1974). En un cultivo, estos quistes pueden formarse después de la fase de crecimiento exponencial,
cuando las condiciones son adversas por falta de nutrientes o nutrimentos complejos como el β- hidroxibutirato o bien,
cuando se degradan los PHBs (Hitchins y Sadoff, 1973), así como por la acción de los iones calcio en el medio (Hitchins
y Sadoff, 1970). Por otro lado, estas estructuras de resistencia no son formadas exclusivamente por especies del género
Azotobacter, sino que también son características de especies del género Beijerinckia, aunque para el caso de
Azotobacter los quistes se agrupan en pares. Asimismo, se observaron bacilos gram negativos, grandes y cortos (C3 y
C5) como los reportados para Azotobacter sp. (Holt, 2000). Sin embargo, en algunas cepas se presentaron bacilos gram
negativos cortos y pequeños (C1, C2, C4 y C6) (Cuadro 2).
Identificación bioquímica. La identificación bioquímica se realizó empleando técnicas convencionales para la
identificación del género Azotobacter. Las pruebas empleadas se basaron en la utilización de cuatro azúcares, benzoato
y fenol como fuente de carbono, prueba de la catalasa, prueba de Nessler, hidrólisis de almidón y producción de ácido 3indolacético. Estas pruebas bioquímicas se utilizaron ya que permiten diferenciar el género Azotobacter de otras
bacterias fijadoras de nitrógeno asimbióticas (Tejera y col., 2005). De las cepas aisladas, únicamente dos fueron
positivas para la glucosa (C3 y C5). Por lo tanto estas cepas fueron identificadas como bacterias del género Azotobacter.
Además se tomaron en cuenta las observaciones macro y microscópicas (morfología celular y de la colonia) así como la
pigmentación en medio Ashby-benzoato para la identificación preliminar (Cuadro 3).
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Cuadro 2. Descripción de las colonias aisladas.
Cepa
Suelo
C1
C2
C3
C4
C5
C6
Control
S1
S1
S1
S3
S4
S5
A:
B:
X:
Y:
Z:
Morfología
colonial
B
A
A
B
A
B
A
Morfología
celular
Z
Z
X
Z
Y
Z
X
Pigmentación
Sin pigmentación
Sin pigmentación
Café-claro
Sin pigmentación
Café-claro
Sin pigmentación
Café-claro
37
Colonias color crema, medianas y brillantes
Colonias pequeñas, traslúcidas y brillantes
Quistes
Bacilos gram-negativos grandes
Bacilos gram-negativos pequeños
Cuadro 3. Perfil bioquímico de las cepas aisladas.
Prueba
Glucosa
Sacarosa
Manitol
Glicerol
Benzoato
Indol
Nessler
Catalasa
C1
+
D
D
D
+
+
C2
+
+
+
C3
+
+
+
+
+
+
+
+
C4
+
+
+
+
C5
+
+
+
+
+
+
+
+
C6
+
+
+
+
+
+
Control
+
+
+
+
+
D
+
+
Identificación molecular con base en el ADNr 16S. Una vez obtenido el ADN de alto peso molecular, se procedió a
realizar la amplificación con los iniciadores FGPL y FGPS los cuales han sido utilizados en la amplificación del ADNr 16S
de bacterias diazótrofas (Nour y col., 1994), sin embargo, no son específicos para bacterias del género Azotobacter. Se
obtuvo un fragmento de 2000 pb aproximadamente, correspondiente a el gen 16S y los IGS 16-23S, acorde con lo
reportado por McDonald y Melton (1998) y Farajzadeh (2009) para los aislamientos C3 y C5, así como para la cepa
control.
Secuenciación.
Se obtuvieron secuencias en ambos sentidos, las cuales fueron ensambladas empleando la
herramienta CAP contig del software Bioedit. Una vez obtenida la secuencia, se llevó a cabo la comparación con las
secuencias reportadas en la base de datos del GenBank mediante el programa BLAST 2.2.20 (Basic Local Aligment
Search Tool) (Zhang y col., 2000), obteniendo la máxima identidad con Azotobacter vinelandii en ambos casos. El
análisis filogenético demostró que los aislamientos se encuentran agrupados en el mismo clado que Azotobacter
vinelandii, teniendo como vecino al clado que contiene a A. chrococcum y A. salinestris. Finalmente, se logró observar
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que estas especies de Azotobacter guardan una estrecha relación con Pseudomonas alcaligenes, como lo ha reportado
Fialho y col. (1990) (Figura 2).
M
1
2
3
4
5
38
2072 pb
1500 pb
600 pb
Figura 1. Amplificación del ADNr 16S-IGS de las cepas aisladas 1) Cepa Control; 2) C3; 3) C5; 4 y 5) Control negativo
M) Marcador de peso molecular (100 pb)
Figura 2. Árbol filogenético de los aislamientos C3 C5 construido por el método Neighbor Joining con un valor de
bootstrap de 1000. El valor anotado debajo de la figura indica el número de sustituciones nucleotídicas por residuo.
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CONCLUSIÓN
Los suelos mexicanos evaluados presentaron características que permitieron la recuperación de dos aislamientos
correspondientes a bacterias diazótrofas. Estos aislamientos pudieron ser caracterizados mediante técnicas básicas de
biología molecular y el análisis de las secuencias obtenidas empleando los recursos bioinformáticos. Asimismo, se logró
la ubicación taxonómica y establecimiento de la relación filogenética con bacterias relacionadas. De esta manera, dichos
aislamientos podrían ser empleados en la formulación de un biofertilizante y así promover el uso de tecnologías limpias y
seguras en la agricultura moderna.
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