CHARACTERISTICS AND COMPOSITION OF RNA CODING U7NITS...

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CARACTERÍSTICAS Y COMPOSICIÓN DE LAS UNIDADES DE CODIFICACIÓN DE RNA*.
La traducción de un código de nucleótidos de cuatro letras en un diccionario de aminoácidos de veinte
"palabras" ha sido objeto de muchas especulaciones. Aunque los polímeros de ADN y ARN estaban implicados
de forma inferencial en la determinación de la secuencia de aminoácidos, no se disponía de un sistema de
síntesis de proteínas sin células que dependiera de estos polímeros. Recientemente hemos descrito un sistema de
este tipo que depende de la adición de ARN molde. Este sistema ofrece un ensayo sensible tanto para el ARN
molde natural como para el sintético.
El ácido poliuridílico dirigió la síntesis de la polifenilalanina; así, uno o más residuos de ácido uridílico en la poli
U parecían ser la unidad de codificación correspondiente a la fenilalanina. La fenilalanina unida al ARN soluble
es un intermediario en este proceso. El hallazgo de que los polirribonucleótidos sintéticos de composición
conocida podían utilizarse para dirigir la síntesis de proteínas sin células, sugirió un enfoque experimental
razonable para establecer las características del código genético, un enfoque que ha sido utilizado por nosotros y
por otros.
El propósito de esta comunicación es informar de otros resultados relativos a la influencia de la poli U en la
dirección de la síntesis de la polifenilalanina y los efectos de los copolímeros ordenados aleatoriamente sobre la
incorporación de otros aminoácidos en la proteína. Algunos de estos resultados se han presentado en una
comunicación preliminar.
Métodos y materiales.-Se ha descrito la preparación de extractos enzimáticos estables de E. coli (fracciones S-30
tratadas con ADNasa y preincubadas). Dichos extractos fueron dializados y almacenados bajo nitrógeno líquido
después de la preincubación. Las mezclas de reacción utilizadas para determinar la incorporación de
aminoácidos C14 en la proteína contenían los siguientes componentes 0,1 M de tris(hidroximetil)- aminometano,
pH 7,8; 0,01 M de acetato de magnesio; 0,05 M de KCl; 6 X 10-3 M de mercaptoetanol 1 X 10-3 M de ATP; 5 X
10-3 M de fosfoenolpiruvato de potasio; 20 ,ug/ml de fosfoenolpiruvato quinasa cristalina (California Biochem.
Corp.); 0,8 - 1,6 X 10-4 M de C14-aminoácidos; 2 X 10-4 M de cada uno de los 19 L-aminoácidos menos el C14
-aminoácido; 3 X 10-5 M de cada uno de los GTP, CTP y UTP (excepto cuando se indique); y extractos de E.
coli. El volumen total fue de 0,50 ml, excepto cuando se especifica. Todos los ensayos se realizaron por
duplicado. Se ha informado de las técnicas empleadas en el lavado, el chapado y el recuento de los precipitados
de proteínas. Los análisis de proteínas se realizaron mediante una micromodificación del método de Lowry et al.
Las sales de litio y sodio de los difosfatos de nucleótidos se obtuvieron de Schwarz Biochemical Corp. y Sigma
Chemical Co. respectivamente. Los aminoácidos U-C14 se obtuvieron de Nuclear-Chicago Corp.
La pureza de cada C'4-aminoácido se comprobó mediante electroforesis de alto voltaje seguida de
radioautografía. La C'4-isoleucina estaba contaminada con C'4-leucina; por lo tanto, la C14-isoleucina se
purificó electroforéticamente antes de su uso. La C14-metionina estaba contaminada con C14-metionina
sulfóxido. Todos los demás C'4-aminoácidos se encontraron libres de contaminantes C14. La S3'-cisteína se
redujo antes de su utilización, ya sea por vía electrolítica o con mercaptoetanol. Los aminoácidos radiactivos
utilizados, su fuente y sus respectivas radioactividades específicas son los siguientes UC14_ glicina, U-C'4-Lisoleucina, U-C'4-L-tirosina, U-C'4-L-leucina, U-C'4-L-prolina, Lhistidina- 2(anillo)-C'4, U-C'4-L-fenilalanina,
U-C14-L-treonina, L-metionina (metil-C'4), U-C14-Larginina, y U-C'4-L-lisina obtenidos de Nuclear-Chicago
Corporation, 5.8, 6.2, 5.95, 6.25, 10.5, 3.96, 10.3, 3.9, 6.5, 5.8, 8.3 mC/mM, respectivamente; ácido C'4-Laspártico, ácido C'4-L-glutámico, C14-L-alanina, obtenidos de Volk, 1,04, 1,18, 0,75 mC/mM, respectivamente;
D-L-triptófano- C'4, obtenido de New England Nuclear Corporation, 2.5 mC/mM; S36L-cistina obtenida de los
Laboratorios Abbott, 2,4 mC/mM; U-C14-L-serina obtenida de la Nuclear-Chicago Corporation, 0,2 mC/mM.
Las radioactividades específicas de C'4-fenilalanina, valina y leucina comunicadas por Nuclear-Chicago Corp.
fueron validadas por ensayo. La concentración de aminoácidos se determinó por el método de la ninhidrina.'0
Estos ensayos concordaron bien con los datos reportados comercialmente. En algunos casos, la concentración de
C'4-fenilalanina también se analizó mediante la medición de la absorción del complejo enol-borato del ácido
fenilpirúvico generado enzimáticamente a partir de la fenilalanina por la L-aminoácido oxidasa.
Los polirribonucleótidos se sintetizaron enzimáticamente con la polinucleótido fosforilasa de Micrococcus
lysodeikticus purificada por el método de Singer y Guss. Las mezclas de reacción contenían 0,15 M de
tris(hidroximetil)aminometano, pH 9,0; 0,01 M de MgCl2; 4 X 10-4 M de etilendiaminotetraacetato; 0,06 M de
difosfato de nucleótidos; y la polinucleótido fosforilasa purificada mediante el paso de fraccionamiento con
sulfato de amonio ácido.'2 Se añadieron aproximadamente 1,4 unidades de polinucleótido fosforilasa por ml de
mezcla de reacción. Las mezclas de reacción se incubaron a 370 y la formación de polinucleótidos se siguió
determinando la liberación de fosfatos por el método Fiske-SubbaRow.'3 Después de que la reacción se hubiera
completado en un 20-35%, los polinucleótidos se precipitaron mediante la adición de 3 volúmenes de etanol
absoluto frío más unas gotas de M NaCl y los precipitados se recogieron por centrifugación. Los polinucleótidos
se redisolvieron en H20 y se volvieron a precipitar como antes. El pellet se disolvió en H20 y la solución se
desproteinizó tres veces por el método de Sevag. Las fases acuosas obtenidas tras la desproteinización se
combinaron y se añadió KCl sólido hasta una concentración final de 0,025 M. La solución se dializó contra KCl
0,025 M durante 24 horas y contra H20 durante 48 horas más. A continuación, las soluciones de polinucleótidos
se liofilizaron y se almacenaron a - 150. Algunos polinucleótidos fueron los generosos regalos de los doctores
Leon Heppel, Maxine Singer, Daniel Bradley, David Davies y Robert Steiner.
La relación de bases de cada polinucleótido se determinó por hidrólisis ácida".1 Las bases se separaron por
cromatografía descendente en papel Whatman nº 1 durante 18 horas utilizando isopropanol-concentrado HClH20 (130:33:37).
Los análisis de relación de bases obtenidos por hidrólisis ácida se verificaron en algunos casos mediante la
comparación con los datos de relación de bases obtenidos por hidrólisis alcalina'6 y por la determinación del
fosfato.'7 Se encontró una buena concordancia entre los análisis de relación de bases obtenidos por los tres
métodos.
Resultados: estequiometría: En la Tabla 1 se comparan los mjimoles de C'4-fenilalanina incorporados a la
proteína con los mumoles de residuos de ácido uridílico (pU) en el poli U añadido a una mezcla de reacción. Se
añadieron concentraciones limitadas de poli U y se continuaron las incubaciones hasta que cesó la incorporación
de fenilalanina. Se incorporó aproximadamente 1 momole de C '4-fenilalanina a la proteína por cada 1,5
m/Amole de residuo de ácido uridílico en el poli U. Estos datos representan las proporciones más bajas
obtenidas. Los resultados de muchos experimentos similares demostraron que podían obtenerse relaciones
estequiométricas muy diferentes dependiendo de la enzima y de las preparaciones de poli U utilizadas. En
algunos experimentos se necesitaron más de 50 mjumoles de residuos de ácido uridílico en el poli U para dirigir
la incorporación de 1 mjumol de C14-fenilalanina en la proteína. Cabe señalar que la presencia de trazas de
ARNasa en el sistema, el peso molecular del poli U, etc., son variables que afectan a la incorporación de
fenilalanina. Por estas razones, es probable que se obtengan proporciones menores que las presentadas en la
Tabla 1. Dado que no se sabe si una molécula de poli U dirige la síntesis de una o muchas moléculas de
polifenilalanina, estos datos por sí solos no pueden utilizarse para determinar el número de residuos de ácido
uridílico en una unidad de codificación de fenilalanina (ratio de codificación).
Efecto del peso molecular sobre la actividad de la plantilla de Poly U.-Poly U se separó en fracciones de
diferentes pesos moleculares mediante centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. 8 Se recogieron
dieciséis fracciones y se determinó tanto la absorción a 260 milímetros de cada fracción como su capacidad para
estimular la incorporación de C14-fenilalanina en la proteína (Fig. 1).
FIG. 1.-La relación entre el peso molecular del ácido poliuridílico y su actividad en la estimulación de la C'4-fenilalanina en
la proteína. El ácido poliuridílico se separó en fracciones de diferentes tamaños mediante centrifugación en gradiente de
densidad de sacarosa. Se preparó un gradiente lineal de concentración de sacarosa que iba del 16% en el fondo al 5% en la
parte superior del tubo. Las soluciones de sacarosa (4,4 ml de volumen total) contenían 5 X 10-3 M de imidazol, pH 6,8 y
0,1 M de NaCl. Se colocaron 0,5 mg de ácido poliuridílico en 0,2 ml en la parte superior del tubo, que se centrifugó a
39.000 X g durante 4,0 horas a 3°C en un rotor de cubeta oscilante, tipo SW-39 de Spinco, utilizando una ultracentrífuga
Spinco Modelo L. Se recogieron dieciséis fracciones de 0,29 ml cada una tras perforar el fondo del tubo. Para los ensayos
de incorporación de C'4-fenilalanina se utilizaron alícuotas que contenían 25 mumoles de residuos de ácido uridílico en
ácido poliuridílico. Esta cantidad de ácido poliuridílico era limitante en las condiciones del ensayo. Los componentes de
cada mezcla de reacción se presentan en Métodos y Materiales. El volumen total de cada mezcla de reacción fue de 0,5 ml y
las incubaciones continuaron durante 60 minutos a 370.
Se añadieron cantidades iguales de poli U a cada mezcla de reacción y se continuaron las incubaciones hasta que
las reacciones se detuvieron. La concentración de poli U en las mezclas de reacción limitó la velocidad de las
reacciones. Así, se determinó la actividad total de cada fracción de poli U. Las moléculas de poli U de mayor
peso molecular se distribuyeron hacia el fondo del tubo; las de menor peso molecular se acercaron a la parte
superior del tubo. Se puede observar que las fracciones de poli U de mayor peso molecular eran más activas en
la dirección de la polifenilalanina hacia la proteína que las fracciones de menor peso molecular. Aunque la
actividad biológica del poli U está relacionada con su peso molecular, no se conoce el peso molecular mínimo
del poli U activo como ARN informativo y se están realizando experimentos para responder a esta pregunta.
Cinética de la incorporación de fenilalanina.-En la figura 2 se muestra la velocidad de incorporación de
fenilalanina a la proteína. Se añadieron de 7,5 a 150 momoles de residuo de ácido uridílico (pU) en poli U por
0,5 ml de mezcla de reacción. La incorporación de C14-fenilalanina cesó en los 30 minutos siguientes a la
adición de poli U. Una nueva adición de poli U después de que la incorporación se hubiera detenido dio lugar a
una estimulación adicional de la incorporación. Después de que las reacciones se detuvieran de nuevo, la adición
de más poli U no estimuló apreciablemente la incorporación de C'4-fenilalanina. Cuando las mezclas se
incubaron durante 30 minutos en ausencia de poli U, y en ese momento se añadieron 15 m~imoles de pU, se
observó una incorporación algo mayor de C14-fenilalanina en comparación con la incorporación resultante de la
adición de poli U al inicio de la incubación. Estos experimentos demuestran que, aunque la incorporación de
C'4-fenilalanina se detiene después de 20-30 minutos de incubación, los extractos enzimáticos son totalmente
activos. El hecho de que la incorporación de C14-fenilalanina se detenga después de 30 minutos aunque haya un
gran exceso de poli U (150 mumoles pU) demuestra que el poli U está siendo inactivado. Esta inactivación del
exceso de poli U no parece depender de la síntesis de proteínas.
FIG. 2.-Cinética de la incorporación de C14-L-fenilalanina. (A) Incorporación de C "4-fenilalanina en función del tiempo.
Los componentes de las mezclas de reacción se describen en el apartado Métodos y materiales. En (A) se muestran los
mpmoles de residuos de ácido uridílico (pU) en ácido poliuridílico añadidos a 0,5 ml de mezcla de reacción. Cada punto
representa una mezcla de reacción de 0,5 ml que contiene 2,6 mglo de proteína S-30 preincubada. En (B) se representa la
incorporación total de C14-fenilalanina (cada análisis final de 90_. minutos mostrado en (A)) en función de la concentración
de ácido poliuridílico.
Los datos de la Figura 2 B muestran que la incorporación de fenilalanina es proporcional a la concentración de
poli U en el rango de 10-50 m~imoles de pU en poli U por 0,5 ml de mezcla de reacción. En la parte lineal de la
curva se requirieron unos 6 m~umoles de pU para dirigir la incorporación de 1 mpumole de C'4-fenilalanina. El
efecto de los "homopolinucleótidos" sobre la incorporación de aminoácidos en la proteína se presenta en la Tabla
2. Como se ha informado anteriormente12 , el poli U estimuló específicamente la incorporación de fenilalanina
en la proteína. El poli U también estimuló la incorporación de pequeñas cantidades de C14-leucina y C14-valina
en la proteína.
Los análisis de relación de bases (véase Métodos y Materiales) mostraron que este polímero contenía un 2,5% de
ácido guanílico presente como impureza. Por lo tanto, la pequeña estimulación de la incorporación de leucina y
valina por parte del poli U se debe probablemente a la presencia de ácido guanílico (véase la siguiente sección).
El poli C estimuló la incorporación de prolina.2 Sin embargo, la eficacia del poli C para estimular la
incorporación de prolina varió con diferentes preparaciones de poli C; por ejemplo, muchas preparaciones
estimularon de 5 a 10 veces y tres preparaciones estimularon de 75 a 100 veces. Dado que la eficacia del poli C
en la estimulación de la incorporación de prolina no era totalmente reproducible, se examinó la pureza de varias
preparaciones (véase la sección Métodos y materiales). Estas preparaciones contenían entre un 4 y un 14% de
ácido uridílico. Se analizaron las preparaciones comerciales de CDP y se comprobó que no contenían UDP.
Como se verá en la siguiente sección, el poli UC mezclado al azar estimuló notablemente la incorporación de
prolina, por lo que la actividad observada del poli C puede ser resultado de la presencia de pequeñas cantidades
de U en las preparaciones de polinucleótidos.
El poli A no estimuló la incorporación de ningún aminoácido a la proteína. La adición de concentraciones
menores de poli A también dio resultados similares. El peso molecular del poli A era de aproximadamente
30.000. En cambio, el poli U de peso molecular similar estimuló notablemente la incorporación de fenilalanina.
La ineficacia del poli A para codificar cualquier aminoácido podría deberse a su estructura de doble cadena en
solución o a la posibilidad de que una secuencia de A no especifique ningún aminoácido.
Anteriormente, se descubrió que el ARN ribosomal de levadura preparado por el método de Crestfield et al.,19
estimulaba la incorporación de aminoácidos en este sistema.2 El ARN de levadura se utilizó como control para
demostrar que el sistema era activo con respecto a cada aminoácido. Estos experimentos también demuestran
que la adición de ARN molde natural estimuló la incorporación de todos los aminoácidos, en contraste con la
especificidad mostrada por el poli U.
Dado que el poli G es difícil de preparar enzimáticamente, no estaba disponible para nosotros en cantidades
suficientes para probar con cada aminoácido individual. Sin embargo, cuando se probó el poli G con un
hidrolizado de proteína C14-algal que contenía 16 aminoácidos C14, no estimuló la incorporación de ningún
aminoácido C'4-. Se necesitó un cebador de oligonucleótidos (ácido tetraadenílico) para la síntesis enzimática
del poli G y se obtuvieron principalmente polinucleótidos de bajo peso molecular con una longitud de cadena
media de 15 nucleótidos. Por lo tanto, el hecho de que el poli G no fuera capaz de estimular la incorporación de
aminoácidos debe interpretarse con precaución.
Los efectos de los polinucleótidos ordenados aleatoriamente sobre la incorporación de aminoácidos.- Los datos
de la Tabla 3 demuestran que los polirribonucleótidos ordenados aleatoriamente dirigen la incorporación de
aminoácidos en la proteína de una manera muy específica. Dado que cada preparación de polinucleótidos difiere
en peso molecular, es difícil comparar directamente la incorporación de actividad de un polímero con otro. Por
lo tanto, las cifras de la Tabla 3 representan el porcentaje de cualquier aminoácido incorporado en comparación
con la incorporación de fenilalanina estimulada por el mismo polinucleótido. Los recuentos/minuto de C14-Lfenilalanina incorporada debido a la adición de cada polinucleótido se presentan en la leyenda que acompaña a la
Tabla 3; por lo tanto, las cifras porcentuales de la tabla pueden convertirse fácilmente en recuentos/minuto.
También se indica la relación de bases de cada polinucleótido, determinada experimentalmente. Si un
polinucleótido que contiene dos bases estimula la incorporación de un aminoácido, la inclusión de una tercera
base en el polinucleótido no impide esta estimulación.
Anteriormente se descubrió que el poli UG y el poli UGC dirigían la incorporación de pequeñas cantidades de
metionina y ácido glutámico, respectivamente". Otros experimentos han demostrado que el poli UGA codifica
estos aminoácidos de forma más eficaz; por lo tanto, las unidades de codificación para la metionina y el ácido
glutámico contienen U, G y A. La incorporación de la lisina fue estimulada por la adición de poli UA
(proporción 1/), pero no por poli UA mezclados al azar que contenían proporciones más bajas de A. Por lo tanto,
la unidad de codificación para la lisina probablemente contiene UAA.... La estimulación de la incorporación de
fenilalanina por el poli UA (proporción '/4) fue insignificante, por lo que estos datos no se han expresado en la
Tabla 3 como proporción de incorporación de lisina a fenilalanina.
Se preparó una serie de polinucleótidos que contenían una proporción diferente de U y A. También se
sintetizaron series similares de polinucleótidos que contenían U y C o U y G. Se descubrió que la estimulación
de la incorporación de un aminoácido dado por un polinucleótido variaba con la proporción de bases del
polímero.22 De este modo, se pudieron estimar las cantidades relativas de dos nucleótidos en una unidad de
codificación. Estos datos son demasiado extensos para ser comunicados aquí y serán objeto de una futura
comunicación.
La relación de codificación no se conoce definitivamente. Sin embargo, suponiendo un código de tripletes, la
probabilidad de que un triplete aparezca en un polinucleótido, en relación con UUU, puede calcularse a partir de
los datos de la relación de bases presentados en la Tabla 3. Por ejemplo, si el polinucleótido UG tuviera una
relación de bases de 3U/1G, la probabilidad de obtener la secuencia UUU sería de 3/4 X 3/4 X 1/4 = 9/4. Así
pues, se producirían 3 UUU por 1 UUG y, suponiendo que la frecuencia de UUU fuera del 100%, la frecuencia
de UUG sería del 33%. La frecuencia teórica de cada posible triplete, en relación con UUU, se presenta en la
Tabla 3. La incorporación de aminoácidos coincidió con las predicciones basadas en la teoría de la probabilidad
en la mayoría de los casos. La composición de nucleótidos de las unidades de codificación correspondientes a
cada aminoácido puede derivarse de estos datos y se presenta un resumen en la última columna de la Tabla 3.
Los puntos después de cada "palabra" se utilizan para indicar la posible presencia de residuos de ácido uridílico
adicionales.
Discusión: Dado que las unidades de codificación de la arginina, la alanina y el ácido glutámico contienen cada
una tres nucleótidos diferentes, la proporción mínima de codificación parece ser tres. El poli GC no codifica para
la arginina o la alanina y el poli AG no codifica para el ácido glutámico.22 Posiblemente la proporción de
codificación sea mayor, pero estos datos descartan la posibilidad de códigos singulares y dobles. En este estudio
preliminar asumiremos que cada aminoácido tiene la misma proporción de codificación20 y que en este sistema,
como en los sistemas celulares,2' es improbable un código de tripletes superpuesto.
Es importante determinar si una molécula de poli U dirige la síntesis de una o varias moléculas de
polifenilalanina, es decir, si el poli U funciona de forma estequiométrica o catalítica. Si, por ejemplo, cada
molécula de poli U dirigiera la síntesis de una sola molécula de polifenilalanina y funcionara un código de
sextupleteado no solapado, serían necesarios seis residuos de ácido uridílico en el poli U para mediar la
incorporación de una fenilalanina. En cambio, los datos de la Tabla 1 muestran que se incorporó a la proteína
casi un miumole de fenilalanina por cada mumole de residuo de ácido uridílico en el poli U. Por lo tanto, cada
unidad de codificación de fenilalanina parece funcionar catalíticamente durante un tiempo limitado.
Un código degenerado es aquel en el que dos o más unidades de codificación diferentes pueden dirigir la
incorporación del mismo aminoácido en la proteína. En un código completamente degenerado, cada permutación
de nucleótidos codificaría un aminoácido. En un código parcialmente degenerado, ciertas unidades de
codificación dirigirían la incorporación de aminoácidos, mientras que otras no lo harían. Las unidades de
codificación que no dirigirían los aminoácidos a la proteína se llamarán "palabras sin sentido". Hasta ahora no ha
sido posible determinar directamente si el código contiene unidades sin sentido.
Los datos de la Tabla 2 demuestran que el poli A no dirige la incorporación de ningún aminoácido a la proteína.
Otros polinucleótidos, como el poli AG, tampoco dirigen la incorporación de aminoácidos.22 Estos
experimentos indican que existen palabras sin sentido y, por tanto, excluirían la posibilidad de un código
completamente degenerado. Las regiones sin sentido en el ARN molde pueden ser funcionalmente importantes,
ya que es posible que estas secuencias de nucleótidos sirvan como períodos, es decir, que puedan especificar los
grupos Cor N-terminal en las proteínas.
Los datos de la Tabla 3 demuestran que una unidad de codificación correspondiente a la leucina puede contener
tanto U y C como U y G. Dado que dos palabras que contienen nucleótidos diferentes corresponden a la leucina,
el código está parcialmente degenerado cuando se utilizan polinucleótidos sintéticos para dirigir la incorporación
de aminoácidos.
Mientras que el contenido de U en los virus de ARN no es excesivo, hasta ahora se ha encontrado una
proporción sorprendentemente alta de U en las unidades codificantes (Tabla 3). Esta dicotomía no puede
explicarse en la actualidad. Sin embargo, es probable que se encuentren otras palabras de código degeneradas
que no contengan U. En este estudio sólo se han medido los péptidos insolubles en ácido tricloracético. Dado
que la polifenilalanina se vuelve insoluble cuando se enlazan cuatro o cinco residuos de fenilalanina, un "asa"
insoluble de este tipo puede asegurar la precipitación de un polipéptido que de otro modo sería soluble. Si se
supone un código con mucha degeneración, es posible que las unidades de codificación que contienen U hayan
sido seleccionadas por el método de ensayo. Sin embargo, otras explicaciones son posibles y se están
considerando.
Los datos anteriores demuestran que el código es parcialmente degenerado, que la proporción mínima de
codificación es de tres y que existen unidades de codificación sin sentido. Crick et al., basándose en ingeniosos
experimentos genéticos que emplean la región HI en el fago T4, han llegado a conclusiones similares. 23 Es
importante señalar que esta información, obtenida por medio de enfoques bioquímicos y genéticos, concuerda
completamente entre sí.
El tratamiento del ARN del virus del mosaico del tabaco (TMV) con ácido nitroso produce la desaminación de
los nucleótidos24 y la formación de cepas mutantes del TMV con una morfología de placa alterada.25 La
citidina se convierte en uridina, la adenosina en hipoxantina y la guanosina en xantosina. Los recientes y
sorprendentes trabajos de Wittmann28 en Tubinga y de Tsugita y Fraenkel-Conrat26' 27 en Berkeley han
demostrado que la proteína aislada de tales cepas mutantes es, en muchos casos, diferente de la producida por el
TAMV de tipo salvaje. Se determinaron las secuencias de aminoácidos de las proteínas del TMV de tipo salvaje
y de las mutantes, y se encontró que ciertos aminoácidos eran sustituidos por otros con bastante frecuencia. En la
Tabla 4 se ha hecho una comparación entre las sustituciones de aminoácidos inducidas por el ácido nitroso y las
composiciones de nucleótidos de las unidades de codificación correspondientes. Sólo se han citado las
sustituciones de aminoácidos que se han encontrado más de una vez. De este modo, se reduce la posibilidad de
que una sustitución se produzca espontáneamente y no por desaminación. Sólo se incluyen las sustituciones de
aminoácidos que corresponden a unidades de codificación de ARN con composiciones de nucleótidos
determinadas experimentalmente. Estamos en deuda con los doctores Tsugita y Fraenkel-Conrat por permitirnos
citar algunos de sus datos de sustitución no publicados.
Se han observado sustituciones de serina por fenilalanina, de ácido glutámico por glicina, de prolina por leucina,
de ácido glutámico por valina y de arginina por glicina. La mayoría de las conversiones de nucleótidos
correspondientes a las sustituciones de aminoácidos serían, pues, la conversión de citidina en uridina o de
adenina en guanina.
Como ha predicho Freese,29 una proporción bastante alta de sustituciones de aminoácidos inducidas por el ácido
nitroso debería ser el resultado de la conversión de citidina en uridina en una unidad de codificación. Wittmann
también ha demostrado que el ácido nitroso convertirá la adenina en guanina.28 La desaminación de la
guanosina no tiene efecto mutagénico. La comparación de los datos de sustitución de aminoácidos con las
composiciones de nucleótidos propuestas para las unidades codificadoras que se muestran en la Tabla 4
confirman de forma sorprendente estas predicciones.
Anteriormente hemos demostrado que el ARNs es un intermediario en la síntesis de la polifenilalanina.4 Es
probable que los aminoácidos pierdan su identidad tras unirse al ARNs y que las moléculas de aminoacil-ARN
reconozcan las unidades de codificación del ARN molde mediante el emparejamiento de bases. En el transcurso
de la evolución, pueden producirse mutaciones que afecten a la secuencia de nucleótidos del ARNs o a la
especificidad de las enzimas activadoras de aminoácidos, lo que podría dar lugar a una serie de códigos
relacionados filogenéticamente en lugar de un código universal para todas las especies.
Desde un punto de vista evolutivo, una mutación que diera lugar a un cambio de código en el que un aminoácido
sustituyera a otro en todas las proteínas probablemente sería letal para un sistema celular altamente organizado.
El uso de polinucleótidos sintéticos ofrece una oportunidad única para determinar si el código es universal. Los
datos de la Tabla 4 demuestran que tanto las unidades codificadoras del TMV que dirigen la síntesis de proteínas
en las plantas de tabaco, como las unidades codificadoras que funcionan en E. coli tienen composiciones
nucleotídicas similares. No es improbable que se encuentren pequeños cambios en el código en diferentes
especies; sin embargo, estos datos sugieren fuertemente que al menos parte del código puede ser universal.
Resumen: La actividad del ácido poliuridílico para dirigir la síntesis de polifenilalanina varía en función del peso
molecular del ácido poliuridílico; las cadenas de polinucleótidos más largas son más activas que las más cortas.
Se presentaron pruebas que sugerían que una molécula de ácido poliuridílico podía dirigir la síntesis de varias
moléculas de polifenilalanina. Se utilizaron polinucleótidos mezclados al azar, así como "homopolinucleótidos",
para dirigir la incorporación de aminoácidos libres de células. Mediante esta técnica se determinaron las
composiciones de nucleótidos de las unidades de codificación de ARN correspondientes a 15 aminoácidos. Se
investigaron las características del código, como la degeneración, la existencia de palabras sin sentido, la
proporción mínima de codificación y la universalidad del código. Se encontraron dos unidades de codificación
correspondientes a la leucina, por lo que se demostró que parte del código era degenerado. Algunas secuencias
de nucleótidos de un polinucleótido no codificaban ningún aminoácido, por lo que se sugirió la presencia de
unidades de codificación sin sentido. El número mínimo de nucleótidos por unidades de codificación parece ser
tres. La comparación entre la composición de las unidades de codificación de ARN en E. coli y los datos de
sustitución de aminoácidos en el virus del mosaico del tabaco sugirió que al menos una parte del código podría
ser universal.