REACTIVIDAD CRUZADA DE LAS PROTEÍNAS DE Mycobacterium smegmatis CON SUEROS POSITIVOS A TUBERCULOSIS BOVINA M.C. Quevedo Rocha Gilberto Docente-Investigador del Centro de Bachillerato Tecnológico Agropecuario Núm. 261 de Villa Juárez, Navolato, Sinaloa Quevedo Rocha Gilberto1 [email protected], Gaxiola Camacho Soila Maribel2 [email protected], Castro Del Campo Nohemí2 [email protected], Cárdenas Contreras Miguel Antonio1 [email protected], Rodríguez Gaxiola Miguel Ángel2 [email protected],, Barraza Tizoc Claudia Leonor1 [email protected], Cepeda Quintero Higinio1 [email protected] Enríquez Verdugo Idalia2*. [email protected] del Doctorado en Ciencias Agropecuarias, Colegio de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Autónoma de Sinaloa. 2PITC Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de Sinaloa. 3Docente Investigador Centro de Bachillerato Tecnológico Agropecuario (CBTA) 261. *Autor de correspondencia: Enríquez Verdugo Idalia. Blvd. San Ángel 3886, Mercado de Abastos, San Benito, 80260. 6677181650. Culiacán de Rosales, Sinaloa, México. 1Estudiante Noviembre del 2022 1 INTRODUCCIÓN GENERALIDADES • Bacteria aerobia. • Sobrevive en un ambiente hostil dentro de los macrófagos. • Se transmite por vía aérea. • Basta inhalar una pequeña cantidad de bacilos para contraer la infección. Mycobacterium tuberculosis • Fácil adaptación al medio intracelular de los macrófagos. • Pasa décadas en el hospedero, antes de expresarse. • Enfermedad aguda o reemergente. • Es una de las principales causas de muerte entre las enfermedades infecciosas. (Mehrotra et al., 2014; Álvarez et al., 2009; OMS, 2017) 2 La tuberculosis es una enfermedades infecciosas que causan grave daño a la salud pública. 10 millones de personas enfermaron y 1.6 murieron por esta causa. Además, un millón de niños enfermaron de los cuales 230 000 murieron (OMS, 2019). 3 Tuberculosis bovina: Enfermedad infectocontagiosa causada por Mycobacterium bovis. Es transmisible al hombre (enfermedad zoonótica), a través del consumo de productos lácteos contaminados, no pasteurizados o por el contacto con animales infectados (SENASICA, 2019). Hay disminución en la producción tanto de leche como en producción de carne, de igual forma, debido a la presencia de lesiones causadas por esta enfermedad, el decomiso de carne por pieza o en canal (SENASICA, 2019). 5 Manifestaciones Clínicas en Bovinos Principales síntomas. Debilidad progresiva. Pérdida de apetito. Pérdida de peso. Fiebre fluctuante. Tos seca intermitente y dolorosa. Aceleración de la respiración (taquipneas), dificultad de respirar (disnea). Sonidos anormales en la auscultación y percusión. Diarrea. Como se transmite? La vía respiratoria. Otra vía de infección es la vía digestiva. Los animales ingieren saliva u otras secreciones del animal infectado (comederos o bebederos infectados) algo muy importante es que un solo animal enfermo puede transmitir la enfermedad a muchos otros antes de manifestar los primeros signos clínicos. (SENASICA, 2019) 6 Homología M. smegmatis: Saprófita excepcionalmente causa daños en el cuerpo humano. Comparte con Mt mas de 2000 genes homólogos mas de un 90%. Proteína esat-6. 3 a 5 µm de longitud Ácido-alcohol resistentes Forman colonias visibles en un medio sólido a partir de un inóculo diluido en un período de 5-7 días. Crecimiento rápido. Tinción de Ziehl-Neelsen. M. tuberculosis: Patógena. 2-3 um de longitud y diámetro de .3 a .6 µm Lípido componen el 60% de la pared celular. Crecimiento lento 2 a 6 sem. No fotocromógena. Ácido-alcohol resistentes Resistentes a los ácidos, álcalis y desinfectantes. Resisten la desecación y la congelación. Luz ultravioleta y el calor (>65º C durante 30 min) las inactiva. Proteína ESAT 6. Tinción de Ziehl-Neelsen. M. bovis: Tamaño promedio de 0,2-0,7 micras de ancho por 1-10 micras de largo. Sus células no presentan una cápsula protectora ni producen esporas. Más del 60% de la membrana compuesta por lípidos. Genoma similar al de M. tuberculosis. Comparte con Mt mas de 2000 genes homólogos mas de un 90%. Ácido-alcohol resistentes. Forman colonias visibles en medio sólido a partir de un inóculo diluido en un período de 5-7 días. Crecimiento rápido Tinción de Ziehl-Neelsen. 6 (Urribarren, 2016; Aznar, 2016; OMS, 2017) 7 Tb depende de ciertos minerales para crecer la Tb incrementa su patogenicidad, los genes que codifican la proteína ESAT6, están presentes en el genoma de M. tuberculosis, H37RV, M. bovis, M. leprae, M. avium y en la cepa avirulenta de M. smegmatis y esta requiere de ciertas condiciones de cultivo durante su crecimiento (Pang et al., 2013). Existen diferencias muy marcadas donde se han probado que los cambios conformacionales dependientes del pH de MtbESAT-6 y MsESAT-6, en condiciones de pH ácido, MtbESAT-6 experimenta un cambio conformacional significativo, mientras que MsESAT-6 muestra poco cambio conformacional en respuesta a la acidificación (De león et al., 2012). 8 ANTECEDENTES DIRECTOS Autor Mycobacteria Lugar Resultado Reyrat y Kahn, 2001 M tuberculosis y M smegmatis USA Actividad metabólica similar Rifat et al., 2009 M smegmatis USA Secreción de Proteínas patógenas Ganguly et al., 2007 M tuberculosis Australia Expresión de proteínas ESAT6, CFP10 López et al., 2016 M smegmatis México, Sinaloa Expresa el mensajero esat-6. 9 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA La TBB enfermedad infecto contagiosa del ganado vacuno causada Mycobacterium bovis (M. bovis), de categoría III y de notificación obligatoria por su alto contagio hacia los humanos (OIE, 2012). Afecta los pulmones (TBC pulmonar), otras partes del cuerpo, por ejemplo, ganglios linfáticos, riñones, huesos, articulaciones, etc. Además, puede afectar a personas de cualquier edad, de igual manera a los animales sin embargo las de mayor riesgo son aquellas que están inmunosuprimidas. A nivel mundial se encuentra dentro de las enfermedades bacterianas causantes del 90% de las defunciones en el mundo según la Organización Mundial de la Salud. Los mecanismos de patogenicidad del complejo Mycobacterium tuberculosis se relacionan con su capacidad de sobrevivir en un ambiente hostil dentro de los macrófagos. Al estar atrapadas en el interior de las células del hospedero M. tuberculosis debe responder a las condiciones de carencia de nutrientes. ¿Cuál es la reactividad cruzada de las proteínas de Mycobacterium smegmatis bajo condiciones de limitación con fosforo en sueros de Tuberculosis9 Bovina? 10 80 y 90 de muertos al año registrados por defunción de esta enfermedad (OMS, 2015) JUSTIFICACIÓN 40 millones de dólares por desechos, 17% Producción de leche, 15% ganancia de peso y la tasa de conversión alimenticia y fertilidad en un 6%, se afecta la movilización del ganado causando efecto en la economía por alrededor de los 450 millones de dólares anuales (SENASICA, 2019) • 775 CASOS BOVINOS Y 775 SACRIFICADO (OIE, 2017) 2600 - 2700 muertos por Tb Enfermedad degenerativa silenciosa. Afecta a animales enfermos y sanos. Los signos aparecen hasta que el animal infectado presenta su estado terminal con lesiones tuberculosas en pulmones, ganglios linfáticos y otras partes del cuerpo de acuerdo a la vía de contagio. Afecta principalmente a los hatos ganaderos con explotación Intensiva. Puede ser confundida con otras enfermedades frecuentes causando cuantiosas pérdidas económicas en producción de leche y carne. (Pulgar, 2010). 11 Situación actual de Tuberculosis Bovina Al 17 de enero de 2019 se ha reconocido el 85.77% del territorio nacional en fase de erradicación (Prevalencia menor al 0.5%). SENASICA 2019 11 HIPÓTESIS La limitación de fósforo en el medio de cultivo genera cambios en M. smegmatis que provocan la expresión antigénica con los sueros de bovinos positivos a tuberculosis. 12 OBJETIVOS Objetivo General • Determinar los grupos de proteínas antigénicas de M. smegmatis que presentan reactividad cruzada bajo condiciones de limitaciones con fósforo con sueros de bovino positivos a tuberculosis. Objetivos Específicos: • Expresar proteínas de M. smegmatis bajo restricción de fósforo. • Obtener proteínas de sobrenadante y totales de M. smegmatis restringidas en fósforo. • Detectar proteínas antigénicas de M. smegmatis con sueros de bovinos positivos a tuberculosis. 13 MATERIAL Y MÉTODOS Tipo de estudio: observacional: descriptivo • El presente trabajo se realiza en el Laboratorio de Parasitología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de Sinaloa. La cepa de M. smegmatis que se utiliza es la mc2 155 MEDIOS DE CULTIVO Tinción de Zi ehl-Neelsen Tinción de ZiehlNeelsen Tinción de ZiehlNeelsen Cultivo de M. smegmatis en 7h9 Sólido Cultivo de M. smegmatis en 7H9 Líquido HDB CON P Y -P 16 OBTENCIÓN DE PROTEÍNAS SOBRENADANTE Y TOTALES Las proteínas totales centrifugación a 4000 rpm/10 min Se precipitaron en alcohol absoluto 1:1, por 24 h a -70°C. Posteriormente se centrifugó a 20000 rpm 90 min a 4º C Proteínas totales por sonicación. Sonicado se centrifugó a 12000 rpm por 30 min 15 Cuantificación de proteína (calibración con BSA) La absorbancia en un espectrofotómetro, a 630 nm. La concentración por método de Bradford (1976), y curva de calibración con BSA. 16 CURVA PATRÓN 17 INMUNODOT (dot-blot) Goteo 1,2 Y 3 µg de muestra de proteínas de sobrenadante y precipitado de M. smegmatis en membranas de nitrocelulosa Incubación por 2 h con a peroxidasa Bloqueo de membranas con leche descremada incubación por 2 h a 37°C incubación por 24 h a 37°C con sueros de bovinos positivos a tuberculosis Revelado con diaminobencidina y sol. NICO 20 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Las proteínas del sobrenadante de M. smegmatis expresadas en limitación de fósforo que son reconocidas por sueros de bovinos positivos a tuberculosis como se presenta en las siguientes membranas donde claramente se observa la reacción cruzada de las proteinas de Mycobacterium smegmatis Fig. 1 Fig. 2 Fig. 3 23 CONCLUSIONES Contamos con un complejo de proteínas en sobrenadante de los cultivos de M. smegmatis que reaccionan antigénicamente, lo cual es esencial para el diagnóstico de Tuberculosis bovina. 24 25 Diciembre del 2019 • • • • • • • • • LITERATURA CITADA Andersen AB, Ljungqvist L, Olsen M. 1990 Evidence that protein antigen b of Mycobacterium tuberculosis is involved in phosphate metabolism. Journal of general microbiology.;136(3):477-80. Epub 1990/03/01. 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