NTC 4516: Detección y Enumeración de Coliformes en Alimentos

NORMA TÉCNICA
COLOMBIANA
NTC
4516
2009-11-18
MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y PRODUCTOS
DE ALIMENTACIÓN ANIMAL.
MÉTODO HORIZONTAL PARA LA DETECCIÓN Y
ENUMERACIÓN DE COLIFORMES TÉCNICA DEL
NÚMERO MÁS PROBABLE
E:
MICROBIOLOGY
MICROBIOLOGY OF FOOD AND ANIMAL FEEDING
STUFFS. HORIZONTAL METHOD FOR THE DETECTION
AND ENUMERATION OF COLIFORMS. MOST PROBABLE
NUMBER TECHNIQUE
CORRESPONDENCIA:
esta norma es idéntica (IDT) con
respecto a su documento de
referencia, la norma ISO 4831-2006.
DESCRIPTORES:
microbiología
microbiología de alimentos; alimentos
para consumo humano; alimentación
animal; método horizontal; detección
de coliformes; método de NMP.
I.C.S.: 07.100.30
Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC)
Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. (571) 6078888 - Fax (571) 2221435
Prohibida su reproducción
Primera actualización
Editada 2009-11-25
PRÓLOGO
El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo
nacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993.
ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el
sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en
los mercados interno y externo.
La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica
está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último
caracterizado por la participación del público en general.
La NTC 4516 (Primera actualización) fue ratificada por el Consejo Directivo de 2009-11-18.
Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.
A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a
través de su participación en el Comité Técnico 25 Microbiología.
ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS S.A.
ALCALDÍA DE BOGOTÁ - ARCHIVO
BOGOTÁ
AVESCO S.A. -KOKORIKOBASIC FARMA S.A.
BIFAR EU
CARULLA VIVERO S.A.
COMPAÑIA NACIONAL DE CHOCOLATES S.A.
ENZIPAN LABORATORIOS S.A.
FILTRACIÓN Y ANÁLISIS LTDA.
GAE LTDA.
INDALPE LTDA.
IVONNE BERNIER LABORATORIO
LABCONTROL E.U.
LABFARVE
LABORATORIOS SFC LTDA.
PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE FLUIDOS
LTDA.
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES - LEMA-
Además de las anteriores, en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de las
siguientes empresas:
ACEGRASAS S.A.
ACUAGYR S.A. E.S.P.
ALGARRA S.A.
ANNAR DIAGNOSTICA IMPORT LTDA.
AQUALAB
AREPAS DOÑA ALEJA
ASBIOQUIM LTDA.
ASEBIOL
ASINAL
ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE CIENCIA
Y TECNOLOGÍA COSMÉTICA -ACCYTECASOCIACIÓN
COLOMBIANA
DE
MICROBIOLOGÍA
BAVARIA S.A.
BECTON DICKINSON DE COLOMBIA
LTDA.
CALIDAD INDUSTRIAL LTDA.
CASA LUKER
CERVECERÍA LEONA S.A.
COLOMBIANA S.A.
CONGELAGRO S.A.
CONSERVAS COLOMBINA S.A. -LA
CONSTANCIACORPOICA -CORPOLABCORPORACIÓN PARA EL AVANCE DE LA
MICROBIOLOGÍA Y LA MICROSCOPIA
MICROS
DUPONT QUALICON
EMPRESA
DE
ACUEDUCTO
Y
ALCANTARILLADO DE BOGOTÁ E.S.P.
FABRICA
DE
ESPECIAS
Y
CONDIMENTOS EL REY S.A.
FRUGAL S.A.
JOHNSONDIVERSEY
KLIK S.A.
LA CAMPIÑA
LABORATORIO A.B.B.A.
LABORATORIO BIOCONTROL LTDA.
LABORATORIO
DE
GENÉTICA
Y
BIOLOGÍA MOLECULAR
LESNIAK EU
MICROBIOLOGOS ASOCIADOS LTDA.
MULTIDIMENSIONALES S.A.
NESTLÉ DE COLOMBIA S.A.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
QUIK LTDA.
ROCHE DIAGNOSTICS
SERVICIOS DE LABORATIO CLINICO LTDA.
UNIVERSIDAD MANUELA BELTRÁN
ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales y otros documentos relacionados.
DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4516 (Primera actualización)
CONTENIDO
Página
INTRODUCCIÓN...........................................................................................................................1
1.
ALCANCE .........................................................................................................................1
2.
REFERENCIAS NORMATIVAS .......................................................................................2
3.
TÉRMINOS Y DEFINICIONES .........................................................................................2
4.
PRINCIPIO.........................................................................................................................3
4.1
DETECCIÓN DE COLIFORMES......................................................................................3
4.2
ENUMERACIÓN MEDIANTE LA TÉCNICA DE NMP.....................................................3
5.
MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES..........................................................................3
5.1
GENERALIDADES............................................................................................................3
5.2
DILUYENTES ....................................................................................................................4
5.3
MEDIO DE ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO: CALDO LAURIL
SULFATO TRIPTOSA ...................................................................................................... 4
5.4
MEDIO DE CONFIRMACIÓN: CALDO LACTOSA BILIS
VERDE BRILLANTE.........................................................................................................4
6.
EQUIPO Y VIDRIERÍA ......................................................................................................5
7.
MUESTREO.......................................................................................................................5
8.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO ..........................................................6
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4516 (Primera actualización)
Página
9.
PROCEDIMIENTO ...........................................................................................................6
9.1
MÉTODO DE DETECCIÓN .............................................................................................6
9.2
MÉTODOS DE ENUMERACIÓN (NMP) ..........................................................................7
10.
CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS ......................................................8
11.
PRECISIÓN .......................................................................................................................8
12.
INFORME DE ENSAYO....................................................................................................8
BIBLIOGRAFÍA...........................................................................................................................13
DOCUMENTO DE REFERENCIA ..............................................................................................14
ANEXOS
ANEXO A (Normativo)
DIAGRAMAS DE FLUJO PARA EL PROCEDIMIENTO ............................................................ 9
ANEXO B (Informativo) ...............................................................................................................12
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4516 (Primera actualización)
MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y PRODUCTOS DE ALIMENTACIÓN ANIMAL.
MÉTODO HORIZONTAL PARA LA DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE COLIFORMES
TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE
INTRODUCCIÓN
Debido a la gran variedad de alimentos y productos de alimentación, este método horizontal
puede no ser adecuado en todo detalle para algunos productos. En este caso, se pueden
utilizar métodos diferentes específicos para tales productos, si es absolutamente necesario por
razones técnicas justificadas. Sin embargo, se debería realizar todo el esfuerzo para aplicar
este método horizontal en la medida de lo posible.
La técnica descrita en esta norma permite realizar un examen microbiológico en una porción de
ensayo más grande permitiendo así la detección de un número más bajo de coliformes por
gramo o mililitro de producto.
Para los propósitos de un método de ensayo factible, la definición de "coliformes" indicada en la
sección 3 y utilizada como base para el procedimiento, no necesariamente es idéntica a las
definiciones correspondientes indicadas en otros textos publicados. Una proporción de las
cepas de los microorganismos descritos en otros textos publicados como "coliformes"
(incluyendo Escherichia coli) no produce suficiente gas para ser detectable mediante la
utilización de un tubo Durham (es decir, las "cepas anaerógenas"). Por lo tanto, el método
descrito en esta norma no detecta a todas las cepas de los microorganismos a los que se hace
referencia en otras publicaciones como "coliformes (presuntivo)" (por ejemplo, algunas cepas
de Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella) (véase referencia [2]).
1.
ALCANCE
Esta norma suministra directrices generales para la detección y la enumeración de coliformes.
Se aplica a:
-
productos destinados para consumo humano y para alimentación de animales, y
-
muestras ambientales en el área de producción y manipulación de alimentos.
La enumeración se realiza mediante el cálculo del número más probable después de la
incubación en un medio líquido a 30 °C ± 1 °C o 36° ± 1 °C.
1 de 14
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4516 (Primera actualización)
NOTA
La temperatura está sujeta al tipo de producto. En el caso de la leche y los productos lácteos, la
temperatura de incubación es de 30 °C ± 1 °C.
Este método de enumeración se aplica cuando se espera que el número que se busca esté en
el rango entre 1 ml y 100 por ml o por gramo de muestra de ensayo.
Una limitación en la aplicabilidad de esta norma está impuesta por la susceptibilidad del
método a un amplio grado de variabilidad. La información suministrada en el numeral 11 brinda
directrices sobre la aplicabilidad del método y sobre la interpretación de los resultados.
2
REFERENCIAS NORMATIVAS
Los siguientes documentos normativos referenciados son indispensables para la aplicación de
este documento normativo. Para referencias fechadas, se aplica únicamente la edición citada.
Para referencias no fechadas, se aplica la última edición del documento normativo referenciado
(incluida cualquier corrección).
NTC 4092, Microbiología de alimentos y productos para alimentación animal. Requisitos
generales y directrices para análisis microbiológicos.
NTC 4491 (todas las partes), Microbiología de alimentos y alimentos para animales –
Preparación de muestras para ensayo, suspensiones iniciales y diluciones decimales para los
análisis microbiológicos. Parte 1. reglas Generales para la preparación de la suspensión inicial
y de diluciones decimales
GTC 78, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. guía para la preparación y
producción de medios de cultivo. guía general para el aseguramiento de la calidad para la
preparación de los medios de cultivo en el laboratorio.
GTC 171, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Guía para la preparación de
medio de cultivo. Guía general para los ensayos de desempeño de medios de cultivo.
ISO FDIS 6887-5:200 9, Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs - Preparation of Test
samples, Initial Suspension and Decimal Dilutions for Microbiological Examination - Part 5:
Specific Rules for the Preparation of Milk and Milk Products.
3.
TÉRMINOS Y DEFINICIONES
Para los propósitos de esta norma, se aplican los siguientes términos y definiciones.
3.1 Coliformes. Bacterias Gram negativas que, a una temperatura especificada (30 °C ± 1 °C o
36 °C ± 1 °C, según producto), produce fermentación de la lactosa con producción de gas, bajo
las condiciones de ensayo que se especifican en esta norma.
3.2 Detección de coliformes. Determinación de la presencia o ausencia de estas bacterias, en
una cantidad particular de producto, cuando se realizan ensayos de acuerdo con el método que
se especifica en esta norma.
3.3 Enumeración de coliformes. Número más probable de coliformes hallados por mililitro o
por gramo de muestra de ensayo, cuando el ensayo se realiza según el método que se
especifica en esta norma.
2
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
4.
PRINCIPIO
4.1
DETECCIÓN DE COLIFORMES
NTC 4516 (Primera actualización)
4.1.1 Un tubo con caldo de enriquecimiento selectivo se inocula con la porción de ensayo y se
incuba a 30 °C ± 1 °C o 36 °C ± 1 °C (según producto) durante 24 h o 48 h.
4.1.2 Un tubo con medio de confirmación se inocula con el contenido del tubo obtenido del
numeral 4.1.1 cuando se ha observado la formación de turbidez o gas o ambos, y se incuba a
30 °C ± 1 °C o 36 °C ± 1 °C (según acuerdo) durante 24 h o 48 h.
4.1.3 La presencia de coliformes se confirma en el caso en que se haya observado la
formación de turbidez y gas después del examen del tubo obtenido del numeral 4.1.2.
4.2
ENUMERACIÓN MEDIANTE LA TÉCNICA DE NMP
4.2.1 Tres tubos con medio de enriquecimiento selectivo líquido con doble concentración se
inoculan con una cantidad específica de la muestra de ensayo, si el producto inicial es líquido,
o con una cantidad específica de una suspensión inicial en el caso de otros productos.
4.2.2 Tres tubos con medio de enriquecimiento selectivo líquido con una concentración
sencilla se inoculan con una cantidad específica de la muestra de ensayo, si el producto inicial
es líquido, o con una cantidad específica de una suspensión inicial en el caso de otros
productos. Después, bajo las mismas condiciones, se inoculan con diluciones decimales de la
muestra de ensayo o de la suspensión inicial tubos adicionales que contengan medio con una
concentración sencilla.
4.2.3 Los tubos que contienen el medio de enriquecimiento selectivo con doble concentración
se incuban a 30°C ± 1 °C o 36 °C ± 1 °C (según acuerdo) durante 24 h, y los tubos que
contienen el medio con concentración sencilla se incuban durante 24 h o 48 h, después de este
periodo estos tubos se examinan para determinar la formación de gas o la turbidez que presume la
detección de la formación de gas.
4.2.4 Una serie de tubos con el medio de confirmación se inoculan con los cultivos
provenientes de los tubos del medio de enriquecimiento selectivo con doble concentración y
con los cultivos de los tubos con medio de enriquecimiento selectivo de concentración sencilla,
en los cuales se ha observado la formación de gas o la turbidez que presume la detección de la
formación de gas.
4.2.5 Los tubos que se obtienen en el numeral 4.2.4 se incuban a 30 °C ± 1 °C o 36 °C
(según acuerdo) durante 24 h o 48 h y se examinan para determinar la formación de gas.
±
1 °C
4.2.6 Se calcula el número más probable de coliformes por mililitro o por gramo de muestra
(es decir, el NMP) a partir de la cantidad de tubos en la serie nueva (véase el numeral 4.2.5)
que muestran formación de gas. Se utiliza una tabla para determinar el número más probable.
5.
MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES
5.1
GENERALIDADES
Véase la NTC 4092 con respecto a la preparación, producción y ensayo de desempeño de los
medios de cultivo.
3
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
5.2
NTC 4516 (Primera actualización)
DILUYENTES
Véase la NTC 4491 (la parte correspondiente), DE 027-08 o la norma internacional específica
para el producto que se está examinando.
5.3
MEDIO DE ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO: CALDO LAURIL SULFATO TRIPTOSA
5.3.1 Composición
a) Medio con doble
concentración
b) Medio con
concentración sencilla
Producto de la digestión enzimática de la leche y
proteínas animales
40 g
20 g
Lactosa (C12H22O11 ·H2O)
10 g
5g
Fosfato hidrógeno de dipotasio (K2HPO4)
5,5 g
2,75 g
Fosfato dihidrógeno de potasio (KH2PO4)
5,5 g
2,75 g
Cloruro de sodio
10 g
5g
Lauril sulfato de sodio
0,2 g
0,1 g
1 000 ml
1 000 ml
Agua
5.3.2 Preparación
Disuelva los diferentes componentes o el medio completo deshidratado en agua mediante
calentamiento, si es necesario.
Ajuste el pH según la NTC 4092, si es necesario, de manera que después de la esterilización
esté en 6,8 ± 0,2 a 20 - 25 °C.
Dispense el medio en cantidades de 10 ml en tubos con dimensiones aproximadas de 16 mm
x 160 mm (véase el numeral 6.4) que contengan tubos Durham (véase el numeral 6.5) en el caso
del medio concentración sencilla, y en tubos con dimensiones aproximadas de 20 mm x 200 mm
(véase el numeral 6.4) [que no contengan tubos Durham (véase el numeral 6.5)] en el caso del
medio con doble concentración.
Esterilice en autoclave ajustado a 121 °C durante 15 min. Los tubos Durham no deben
contener burbujas de aire después de la esterilización.
5.3.3 Ensayo de desempeño para el aseguramiento de la calidad del medio de cultivo
Con respecto a las definiciones de selectividad y productividad, consulte la GTC 171. El ensayo
de desempeño con respecto al caldo lauril sulfato triptosa se encuentra en la GTC 171,
5.4
MEDIO DE CONFIRMACIÓN: CALDO LACTOSA BILIS VERDE BRILLANTE
5.4.1 Composición
Producto de la digestión enzimática de la caseína
10 g
Lactosa (C12H22O11·H20)
10 g
Bilis de buey deshidratado
20 g
4
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4516 (Primera actualización)
Verde brillante
0,013 3 g
Agua
1 000 ml
5.4.2 Preparación
Disuelva los diferentes componentes o el medio completo deshidratado en agua mediante
calentamiento, si es necesario.
Ajuste el pH, según la NTC 4092, si es necesario, de manera que después de la esterilización
esté en 7,2 ± 0,2 a 20 - 25 °C.
Dispense el medio en cantidades de 10 ml en los tubos de ensayo de aproximadamente 16 mm
x 160 mm (véase el numeral 6.4) que contienen los tubos Durham (véase el numeral 6.5).
Esterilice en autoclave ajustado a 121 °C durante 15 min. Los tubos Durham no deben
contener burbujas de aire después de la esterilización.
5.4.3 Ensayo de desempeño para el aseguramiento de la calidad del medio de cultivo
Con respecto a las definiciones de selectividad y productividad, consulte la GTC 171. El ensayo
de desempeño con respecto al caldo lactosa bilis verde brillante se encuentra en la GTC 171.
6.
EQUIPO Y VIDRIERÍA
Equipo común de laboratorio de microbiología (véase la NTC 4092), en particular, el siguiente.
6.1
Equipo para estilización en seco (horno) o para esterilización en húmedo
(autoclave).
Véase la NTC 4092.
6.2
Incubadora, con capacidad de funcionamiento a 30 °C ± 1 °C o 36 °C ± 1 °C.
6.3
Asas, de platino-iridio o níquel-cromo, con diámetro aproximado de 3 mm, o asas
desechables.
6.4
Tubos de ensayo, con dimensiones aproximadas de 16 mm x 160 mm y 20 mm x 200 mm.
6.5
Tubos Durham, con un tamaño adecuado para su uso en los tubos de ensayo con
dimensiones de 16 mm x 160 mm (véase el numeral 6.4).
6.6
Pipetas de descarga total, con capacidad nominal de 1 ml y 10 ml.
6.7
pHmetro, con exactitud de ± 1 unidad de pH a 25 °C.
7.
MUESTREO
El muestreo se debería realizar de acuerdo con la norma internacional específica
correspondiente para el producto en cuestión. Si no existe una norma internacional, se
recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este tema.
5
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
8.
NTC 4516 (Primera actualización)
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO
Prepare la muestra de ensayo de acuerdo con la NTC 4491 (la parte correspondiente), DE 027-08
o la norma internacional específica correspondiente al producto en cuestión. Si no existe norma
internacional específica, se recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre
este tema.
9.
PROCEDIMIENTO (véase el Anexo A)
9.1
MÉTODO DE DETECCIÓN (véase la Figura A.1)
9.1.1 Porción de ensayo y suspensión inicial
Véase la NTC 4491 y el DE 027-08 o la norma internacional específica correspondiente al
producto en cuestión.
9.1.2 Inoculación e incubación
9.1.2.1 Dependiendo del límite de detección que se requiera, se transfieren x ml de la muestra de
ensayo si es líquida, o x ml de la suspensión inicial en el caso de otros productos, a un tubo que
contengan 10 ml del medio de enriquecimiento selectivo de doble concentración [véase el
numeral 5.3.1a)] cuando x esté entre 1 ml y 10 ml, o a un tubo que contengan 10 ml del medio de
enriquecimiento selectivo de concentración sencilla [véase el numera 5.3.1b)] cuando x ≤ 1 ml.
9.1.2.2 Deje los tubos con el medio de doble concentración (véase el numeral 9.1.2.1) en la
incubadora (véase el numeral 6.2) ajustada a 30 °C ± 1 o 36 °C ± 1 °C (según acuerdo) durante
24 h ± 2 h.
9.1.2.3 Deje los tubos con el medio de concentración sencilla (véase el numeral 9.1.2.1) en la
incubadora (véase el numeral 6.2) ajustada a 30 °C ± 1 o 36 °C ± 1 (según acuerdo)
durante 24 h ± 2 h o, si no se ha observado formación de gas o turbidez que presuma la
detección de dicha formación en esta etapa, continúe la incubación por otras 24 h ± 2 h.
9.1.3 Confirmación (véase la Figura A.3)
9.1.3.1 Tomando material de los tubos incubados según el numeral 9.1.2.2, inocule con un asa
(véase el numeral 6.3) un tubo que contenga medio de confirmación (véase el numeral 5.4).
Incube a temperatura de 30 °C ± 1 °C o 36 °C ± 1 °C (según acuerdo) durante 24 h ± 2 h o, si no se
ha observado formación de gas en esta etapa, durante 48 h ± 2 h.
9.1.3.2 Realice el mismo procedimiento descrito en el numeral 9.1.3.1 para los tubos incubados
según el numeral 9.1.2.3 que muestren formación de gas o turbidez que presuma la detección
de la formación de gas, cuando cualquiera de estas características se observe primero (es
decir, después de 24 h ± 2 h o después de 48 h ± 2 h).
9.1.4 Interpretación (véase la Figura A.1)
Un tubo de los suministrados según los numerales 9.1.3.1 o 9.1.3.2 en el cual se observó la
formación de gas después de 24 h ± 2 h o de 48 h ± 2 h se considera un tubo positivo.
6
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
9.2
NTC 4516 (Primera actualización)
MÉTODOS DE ENUMERACIÓN (NMP) (véase la Figura A.2)
9.2.1 Porción de ensayo, suspensión inicial y diluciones
Véase la NTC 4092 (la parte correspondiente), DE 027-08 o la norma internacional específica
correspondiente al producto en cuestión.
Prepare una cantidad suficiente de diluciones para garantizar que todos los tubos
correspondientes a la dilución final produzcan un resultado negativo.
9.2.2 Inoculación e incubación
9.2.2.1 Es común que exista una combinación de tres tubos para cada serie de diluciones. Sin
embargo, para algunos productos o cada vez que se requieran resultados de mayor exactitud,
exactitud o ambos casos, puede ser necesario inocular series que consten de más de tres
tubos (por ejemplo de cinco tubos). En estos casos, para el cálculo del número más probable,
consulte las tablas correspondientes que se incluye en la NTC 4092.
9.2.2.2 Tome tres tubos que contengan medio de enriquecimiento selectivo de doble concentración
[véase el numeral 5.3.1a)]. Utilizando una pipeta estéril (véase el numeral 6.6) transfiera a cada
uno de estos tubos 10 ml de la muestra de ensayo, si es líquida, o 10 ml de la suspensión
inicial en el caso de otros productos.
9.2.2.3 Tome tres tubos que contengan medio de enriquecimiento selectivo de concentración
sencilla [véase el numeral 5.3.1b)]. Utilizando una pipeta estéril (véase el numeral 6.6)
transfiera a cada uno de estos tubos 1 ml de la muestra de ensayo, si es líquida, o 1 ml de la
suspensión inicial en el caso de otros productos.
9.2.2.4 Para cada una de las diluciones adicionales, continúe tal como se describe en el
numeral 9.2.2.3. Utilice una pipeta estéril para cada dilución. Mezcle cuidadosamente el inóculo
y el medio.
9.2.2.5 Deje los tubos con el medio de doble concentración (véase el numeral 9.2.2.2) en la
incubadora (véase el numeral 6.2) ajustada a 30 °C ± 1 °C ó 36 °C ± 1 °C (según acuerdo)
durante 24 h ± 2 h.
9.2.2.6 Deje los tubos con el medio de concentración sencilla (veánse los numerales 9.2.2.3 y
9.2.2.4) en la incubadora (véase el numeral 6.2) ajustada a 30 °C ± 1 °C ó 36 °C ± 1 °C (según
acuerdo) durante 24 h ± 2 h o, si no se ha observado la formación de gas o de turbidez que
presuma la detección de dicha formación en esta etapa, continúe la incubación durante 24 h ±
2 h adicionales.
9.2.3 Confirmación (véase la Figura A.3)
9.2.3.1 Tomando material de los tubos incubados según el numeral 9.1.2.2, inocule con un asa
(véase el numeral 6.3) un tubo que contenga medio de confirmación (véase el numeral 5.4).
Incube a temperatura 30°C ± 1 °C o 36 °C ± 1 °C (según producto) durante 24 h ± 2 h o, si no
se ha observado formación de gas en esta etapa, durante 48 h ± 2 h.
9.2.3.2 Realice el mismo procedimiento descrito en el numeral 9.2.3.1 para los tubos incubados
según el numeral 9.2.2.6 que muestren formación de gas o turbidez que presume la detección
de la formación de gas, cuando se observe cualquiera de estas características (es decir,
después de 24 h ± 2 h o después de 48 h ± 2 h).
7
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4516 (Primera actualización)
9.2.4 Interpretación (véase la Figura A.2)
Para cada dilución, cuente la cantidad total de tubos en los cuales se observó la formación de
gas en el paso del numeral 9.2.3 (tubos positivos) después de 24 h ± 2 h y (si se utiliza) 48 h ±
2 h.
10.
CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
De acuerdo con los resultados de la interpretación (véase el numeral 9.1.4), indique la
presencia o ausencia de coliformes en la porción de ensayo de x g o x ml de producto (véase la
NTC 4092).
Calcule el número más probable a partir del número de tubos positivos en cada dilución (véase
la NTC 4092).
11.
PRECISIÓN
Se reconoce que se pueden presentar amplias variaciones en los resultados con la técnica del
NMP. Por lo tanto, los resultados obtenidos utilizando este método se deberían utilizar con
precaución.
Los límites de confianza se suministran en la NTC 4092.
12.
INFORME DE ENSAYO
El informe de ensayo debe especificar:
-
toda la información necesaria para la identificación completa de la muestra,
-
el método de muestreo utilizado, si se conoce;
-
el método de ensayo utilizado, con referencia a esta norma nacional;
-
el objeto del ensayo y la temperatura de incubación utilizada;
-
todos los detalles operativos que no se especifican en esta norma o se consideran
opcionales, junto con los detalles de todo incidente que haya podido tener influencia en
los resultados;
-
los resultados obtenidos.
8
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4516 (Primera actualización)
ANEXO A
(Normativo)
DIAGRAMAS DE FLUJO PARA EL PROCEDIMIENTO
Suspensión inicial (productos sólidos) o muestras de ensayo (productos líquidos)
D
10 ml
1 ml
1 Tubo con medio de
concentración doble
(9.1.2.1)
1 Tubo con medio de
concentración sencilla
(9.1.2.1)
Proceder de la misma forma
Incubación por 24 h
+/- 2 horas (9.1.2.2)
D+1
Incubación por 24 h +/- 2h
o 48 h +/- 2 h (9.1.2.3)
Inoculación (9.1.3.1)
D+2
Inoculación
(9.1.2.3)
Incubación por 24 h +/- 2h
o 48 h +/- 2 h
(+)
1er caso
D+3
Interpretación
(+)
(9.1.4)
1er caso
(-)
(-)
2docaso
Incubación por 24 h +/- 2h
o 48 h +/- 2 h
2docaso
D+4
(+)
(-)
1er caso
Figura A.1. Método de detección
9
Interpretación
(9.1.4)
2docaso
3er caso
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4516 (Primera actualización)
Suspensión inicial (productos sólidos) o muestras de ensayo (productos líquidos)
10 ml
D
1 ml
3 Tubos con medio de
concentración doble
(9.1.2.2)
3 Tubos con medio de
concentración sencilla
(9.2.2.3)
Proceder de la misma forma
Incubación por 24 h
+/- 2 horas (9.2.2.5)
D+1
Incubación por 24 h +/- 2h
o 48 h +/- 2 h (9.2.2.6)
Inoculación (9.2.3.1)
D+2
Incubación por 24 h +/- 2h
o 48 h +/- 2 h (9.2.3.1)
Inoculación
(9.2.3.2)
(+)
1er caso
D+3
Interpretación
(+)
(9.2.4)
1er caso
(-)
(-)
2docaso
Incubación por 24 h +/- 2h
o 48 h +/- 2 h (9.2.3.2)
2docaso
D+4
(+)
1er caso
(-)
2docaso
Figura A.2. Método de enumeración
10
Interpretación
(9.2.4)
3er caso
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
Antes de la incubación
NTC 4516 (Primera actualización)
Formación
de gas (+)
Después de
la incubación Turbidez No formación
de gas (-)
Asas
(6.3)
Tubo con medio de
doble concentración (5.3a)
Tubos con medio de
concentración sencilla (5.3b)
Figura A.3. Detalles de la etapa de confirmación
11
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4516 (Primera actualización)
ANEXO B
(Informativo)
MEDIOS DE CULTIVO
Otro medios de cultivo indicados para la fase de confirmación aparecen relacionados en la
GTC 125. Guía de referencias de métodos horizontales de análisis microbiológicos para
bebidas, alimentos y alimentos para animales.
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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4516 (Primera actualización)
BIBLIOGRAFÍA
[1]
ISO 4832, Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs. Horizontal Method for the
Enumeration of Coliforms. Colony-Count Technique .
[2]
Edward, P.R. and Ewing, W.H., Identification of Enterobacteriaceae, 3rd edn., Burgess
Publishing Company, Minneapolis, Minnesota, USA, 1972.
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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4516 (Primera actualización)
DOCUMENTO DE REFERENCIA
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Microbiology of Food and
Animal Feeding Stuffs. Horizontal Method for the Detection and Enumeration of Coliforms. Most
Probable Number Technique. Geneva: ISO, 2006, 12 p (ISO 4831:2006 (E)).
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