Universidad Veracruzana Instituto de Ciencias Básicas Evaluación de la actividad biológica in vitro del puré de cereza como potencial nutracéutico en la gota. Tesis de investigación para obtener el grado de Maestro en Ciencias Alimentarias Presenta: L. en N. Juan Jesús Virgen Gen Directores: Dra. Rosa Isela Guzmán Gerónimo. Dra. Yessica Eduviges Zamudio Cuevas. Xalapa, Veracruz Enero, 2019 DEDICATORIAS Este trabajo está dedicado principalmente a mi familia, ya que han sido y serán para siempre mi más grande inspiración y fortaleza. A mi madre, María Concepción Gen Islas, gracias por ser mi pilar más importante, por todo el apoyo y confianza que me has brindado, por los valores y el conocimiento que has compartido a lo largo de la vida, eres un ejemplo a seguir, una persona que tengo el gusto de llamar mamá. A mi hermano, Mario Alberto Virgen Gen, pilar importante también en mi vida, por impulsarme a ser mejor persona, y por su paciencia cuando me he encontrado en momentos de desesperación y no he sabido cómo actuar. A mi padre, cuyas experiencias me han demostrado que los errores no se deben repetir, y siempre se debe ser mejor ante todo. A mis amigos de la preparatoria, los cuales siempre me han apoyado, y demostrado estar ahí cuando más los necesito, especialmente a Roberto Giovanni Vázquez López y Alejandra Salas Gil. A mis conocidos, ya que me han motivado a ser mejor persona, mediante el aprendizaje adquirido. A la vida, que gracias a pesar de todas las situaciones que he vivido, me ha demostrado que siempre se puede seguir adelante, siempre y cuando te lo propongas, luchando por lo que más quieres. AGRADECIMIENTOS Al Instituto de Ciencias Básicas de la Universidad Veracruzana, y al Instituto Nacional de Rehabilitación “Luis Guillermo Ibarra Ibarra”, por el apoyo brindado para la elaboración de este proyecto, así mismo al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT), ya que gracias a su financiamiento pude desarrollar y elaborar mi estancia durante mi investigación en la Ciudad de México. A la Dra. Rosa Isela Guzmán Gerónimo y la Dra. Yessica Eduviges Zamudio Cuevas, por brindarme su conocimiento y paciencia, para desarrollar y culminar este proyecto, ya que fueron mi fuente de inspiración e iluminación para desenvolverme completamente en el ámbito de investigación. Al Dr. Alberto Gabriel López Reyes, la Dra. Karina Martínez Flores, la Dra. Gabriela Angélica Martínez Nava, el M. Javier Fernández Torres y la Biol. Mónica Guadalupe Santamaria Olmedo, por su conocimiento, y su amistad, durante mi estancia en el Instituto Nacional de Rehabilitación. A la Dra. Maribel Jiménez Fernández por su apoyo y disposición de tiempo como tutora durante mi posgrado. A la Dra. Elia Nora Aquino Bolaños, al Dr. Oscar García Barradas, al Dr. Micloth López Del Castillo Lozano, al Dr. Iñigo Verdalet Guzmán y al Dr. Armando Jesús Martínez Chacón, por su conocimiento y enseñanza durante el periodo de posgrado en Ciencias Alimentarias. A mi comité evaluador conformado por el Dr. Oscar García Barradas, el Dr. Ebner Azuara Nieto, y el Dr. Micloth López Del Castillo Lozano, agradezco enormemente su apoyo brindado. A mis compañeros del posgrado, por esos momentos tan agradables que pasamos juntos, así como por su conocimiento adquirido en sus distintas áreas de investigación y desarrollo académico. El presente trabajo fue presentado como parte de un proyecto de investigación y sus resultados publicados en un capítulo de libro. Congreso de la Liga Panamericana de Asociaciones de Reumatología (PANLAR) llevado acabo del 7-10 de Abril del 2018, en Buenos Aires, Argentina. Congreso Internacional de Ciencias Químicas e Ingeniería (ChemSciE) efectuado del 26-27 de Abril del 2018, en Xalapa, Veracruz. ÍNDICE Resumen IV Summary V 1. Introducción……………………………………………………………………… 1 2. Marco teórico…………………………………………………………………….. 3 2.1 Antecedentes………………………………………………………………....... 3 2.1.1 Clasificación botánica, composición y propiedades biológicas de la cereza…………………………………………………………………………. 3 2.1.2 Radicales libres y estrés oxidante…………………………………………. 5 2.1.3 Inhibición de radicales libres……………………………………………….. 6 2.1.4 Polifenoles totales y antocianinas…………………………………………. 7 2.2 Procesamiento con microondas……………………………………………… 9 2.3 Artritis gotosa…………………………………………………………………... 10 2.3.1 Estrés oxidante y la artritis gotosa………………………………………… 11 2.3.2 Métodos de evaluación de la capacidad antioxidante de un compuesto in vitro e in vivo……………………………………………………………………... 12 3. Planteamiento del problema…………………………………………………… 15 4. Objetivos……………………………………...………………………………….. 16 4.1 Objetivo general……………………………………………………………….. 16 4.2 Objetivos específicos………………………………………………………….. 16 5. Hipótesis…………………………………………………………………………. 16 6. Material y métodos……………………………………………………………… 17 6.1 Materia prima…………………………………………………………………... 17 6.2 Metodología…………………………………………………………………….. 17 6.2.1 Obtención del puré………………………………………………………….. 17 6.2.2 Procesamiento con microondas…………………………………………… 17 6.2.3 Obtención del extracto de cereza………………………………………….. 18 6.2.4 Cuantificación de polifenoles totales………………………………………. 18 6.2.5 Cuantificación de antocianinas monoméricas……………………………. 19 6.2.6 Determinación de actividad antioxidante…………………………………. 20 6.3 Actividad antioxidante del extracto procesado y sin procesar en modelo in vitro……………………………………………………………………………….. 21 6.3.1 Preparación y estandarización de cultivo celular………………………… 21 I 6.3.2 Preparación de cristales de urato monosódico monohidratado………... 21 6.3.3 Viabilidad celular…………………………………………………………….. 21 6.3.4 Estimulación de las células con el extracto y los CUM………………….. 22 6.3.5 Determinación de ERO intracelulares…………………………………….. 23 6.3.6 Determinación de pro-citosina IL-1β………………………………………. 23 6.3.7 Análisis estadístico………………………………………………………….. 24 7. Resultados y discusión…………………………………………………………. 25 7.1 Determinaciones del extracto de puré de cereza………………………….. 25 7.1.1 Polifenoles totales…………………………………………………………… 25 7.1.2 Antocianinas monoméricas………………………………………………… 25 7.1.3 Actividad antioxidante por medio de FRAP………………………………. 26 7.2 Evaluación de la actividad antioxidante in vitro del extracto de cereza 27 7.2.1 Viabilidad celular…………………………………………………………….. 27 7.2.2 Estrés oxidante por CellRox………………………………………………... 30 7.2.3 Actividad del extracto de cereza en interleucina IL-1β………………….. 31 8. Conclusiones…………………………………………………………………….. 35 9. Referencias………………………………………………………………………. 36 10. Apéndice………………………………………………………………………... 40 II ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Cereza dulce (Prunus avium)………………………………………….. 3 Figura 2. Estructura de cianidina-3-O-glucósido……………………………….. 4 Figura 3. Clasificación de polifenoles……………………………………………. 7 Figura 4. Estructura básica de flavonoides……………………………………… 8 Figura 5. Clasificación de flavonoides…………………………………………… 8 Figura 6. Preparación de diluciones……………………………………………… 22 Figura 7. Contenido de polifenoles totales………………………………………. 25 Figura 8. Contenido de antocianinas monoméricas……………………………. 26 Figura 9. Actividad antioxidante por método de FRAP………………………… 27 Figura 10. Viabilidad celular de extracto T0…………………………………….. 28 Figura 11. Viabilidad celular de extracto T60…………………………………… 28 Figura 12. Morfología de THP-1 a 100 µm expuestas a diluciones de extracto T0………………………………………………………………………… 29 Figura 13. Morfología de THP-1 a 100 µm expuestas a diluciones de extracto T60………………………………………………………………………. 29 Figura 14. Estrés oxidante de THP-1 a 24 h como tratamiento simultáneo…… 30 Figura 15. Estrés oxidante de THP-1 a 24H como pre-tratamiento……………. 32 Figura 16. Determinación de IL-1β en tratamiento simultáneo de THP-1 a 24 h………………………………………………………………………..... 33 Figura 17. Determinación de IL-1β en pre-tratamiento THP-1 a 24 h………….. 34 Figura 18. Mecanismo de producción del inflamasoma a nivel celular………... 34 ÍNDICE DE CUADROS Cuadro 1. Contenido nutricional de cereza dulce……………………………… 4 Cuadro 2. Curva de calibración de polifenoles totales………………………… 18 Cuadro 3. Curva estándar de trolox……………………………………………... 20 III RESUMEN La fruta de la cereza es rica en antioxidantes como polifenoles y ha demostrado ser activa contra algunas de las enfermedades más comunes de la actualidad, incluida la gota. Sin embargo, el mecanismo de acción es aún desconocido. El objetivo del estudio fue evaluar el estrés oxidativo en fibroblastos humanos expuestos a cristales de urato monosódico (CUM), que desencadenan un proceso inflamatorio. El puré de cereza se colocó en un horno de microondas con una mesa giratoria con una potencia de 433 W. Los tiempos de tratamiento fueron 0 y 60 s. Los extractos de puré de cereza se obtuvieron por centrifugación. Los fibroblastos humanos se estimularon con cristales de CUM durante 24 h. La viabilidad celular se evaluó mediante tinción con azul de tripano. Se realizaron experimentos tanto preventivos como simultáneos y se analizó el contenido celular de las especies reactivas de oxígeno, así como las citoquinas proinflamatorias (IL1β). Los resultados obtenidos indican que ambos extractos disminuyeron los niveles de ERO y procitosinas. Estos resultados sugirieron la aplicación potencial del puré de cereza como tratamiento terapéutico en un ataque de gota aguda. Palabras Clave: Cereza, Gota, In vitro, Especies Reactivas de Oxígeno, Citocinas Proinflamatorias. IV SUMMARY Cherry fruit is rich in antioxidants as polyphenols and it had shown to be active against some of today's most common diseases, including gout. However the mechanism of action is still unknown. The aim of the study was to evaluate the oxidative stress in human fibroblast exposed to monosodium urate (MSU) crystals, which trigger an inflammatory process. Cherry purée was placed in a microwave oven with a turntable with a power of 433 W. The treatment times were 0 and 60 s. Cherry purée extracts were obtained by centrifugation. Human fibroblastes were stimulated with MSU crystals for 24 h. Cellular viability was evaluated by trypane blue staining. Both preventive and simultaneous experiments were performed and the cellular content of reactive oxygen species as well as pro-inflammatory cytokines (IL-1β) were analyzed. The results obtained indicate that both extracts decreased the levels of ROS and procytosines. These results suggested the potential application of cherry purée as therapeutic treatment in an acute gout attack. Keywords: Cherry, Polyphenols, In Proinflammatory Cytokines. V vitro, Reactive Oxygen Species, 1. INTRODUCCIÓN En la industria alimentaria existe una creciente demanda por productos cuyo consumo además de aportar nutrimentos, contribuyan a la salud de los consumidores. Existen reportes que indican que el consumo de frutas y vegetales está relacionado con una menor incidencia de enfermedades crónico-degenerativas (Oliviero et al., 2017). La cereza es una fruta que se caracteriza por ser una fuente rica de compuestos polifenólicos como las antocianinas, las cuales poseen diversas propiedades biológicas como son capacidad antioxidante, anticancerígena y antiinflamatoria (McCune et al., 2011). Sin embargo, estos compuestos se degradan durante el procesamiento, por lo que resulta de interés explorar la aplicación de tecnologías no convencionales como las microondas, las cuales generan altas temperaturas en cortos períodos de tiempo permitiendo mantener en mayor grado los compuestos bioactivos (Dorantes-Alvarez et al., 2017), teniendo un potencial de aplicación para el desarrollo de productos alimenticios ricos en polifenoles cuya ingesta contribuya a la salud. La prevalencia de gota en el mundo es variable según los países, pero afecta entre el 1-2 % de las personas adultas, los principales factores de riesgo son la hiperuricemia avanzada, la edad, el consumo de alcohol, dietas altas en purinas y la obesidad y, según datos recogidos en Reino Unido, es superior al 7 % en hombres y alcanza casi el 3 % en mujeres mayores de 75 años (Goicoechea et al., 2012). Alrededor del 0.3-0.4 % de la población mexicana padece gota (Kuo et al., 2015). Si esta no se trata adecuadamente puede desarrollar granulomas, comúnmente llamados tofos gotosos, los cuales son un conjunto de células, cristales y tejidos, llegando a causar enrojecimiento, hinchazón, dolor, hasta rigidez en la articulación, principalmente afectando el dedo gordo de los pies. En México, el 15 % de la población adulta padece hiperuricemia, es decir unos 10 millones de personas (Vazquez-Mellado & Torres, 2016); esto debido al exceso de ácido úrico (AU) en la sangre, superando concentraciones de 6.8 mg/dL en hombres y de 6.5 mg/dL en mujeres (Urbina et al., 2017). 1 La hiperuricemia puede cursar con periodo asintomático; sin embargo, una minoría de personas acaba desarrollando gota. La gota es una enfermedad crónica metabólica, comúnmente relacionada con una de las artritis inflamatorias más dolorosas, que puede llegar a ser incapacitante; esto debido a la formación de cristales de urato monosódico (CUM) tanto en articulaciones como en tejidos convexos. Existen escasos informes clínicos y experimentales sobre la utilización de cerezas como tratamiento eficaz, por ello en el presente trabajo se planteó el desarrollo de un puré de cereza procesado con microondas con la finalidad de obtener una mayor concentración de compuestos bioactivos y evaluar en un modelo in vitro expuesto a CUM mimetizando un ataque agudo de gota, el efecto antioxidante del extracto de cereza (EC) empleando una línea celular de monocitos THP-1. Este estudio es importante para identificar los efectos protectores del extracto de puré de cereza procesado, durante el estrés oxidante (EO) provocado por los CUM presentes en un ataque agudo de gota. 2 3 2. MARCO TEÓRICO 2.1 Antecedentes 2.1.1 Clasificación botánica, composición y propiedades biológicas de la cereza El árbol de cerezo pertenece a la familia de las Rosaceae que incluye 95 géneros, entre los cuales se encuentra el género Prunus y se divide en varios subgéneros: Prunus, Amygdalus, Padus y Cerasus. Entre el subgénero Cerasus, el cerezo (Prunus avium L.) es la especie más cultivada, la cual tuvo su origen en Asia, en la región comprendida entre el Mar Negro y el Mar Caspio en el año 1600, siendo introducida y cultivada en América hasta el año 1800 por los colonos ingleses (Lemus et al., 2005). La cereza es la fruta del árbol de cerezo, es una drupa roja no climatérica, globosa que contiene un solo hueso, y es apreciada por los consumidores debido a su sabor agradable (Figura 1). Figura 1. Cereza dulce (Prunus avium). La cereza es un fruto rico en macronutrientes, principalmente en carbohidratos, así como en vitaminas y minerales (Cuadro 1) (McCune et al., 2011). 3 Nutrimento Energía (Kcal) Proteína (g) Grasa (g) Carbohidratos (g) Fibra (g) Índice glicémico Vitamina C (mg) Vitamina A (IU) Potasio (mg) β-Carotenos (µg) Antocianinas totales (mg) Quercetina (mg) Cereza dulce 63 1.06 0.2 16.0 2.1 22 7 64 222 38 80.2 2.64 Cuadro 1. Contenido nutricional de cereza dulce. Entre los compuestos polifenólicos que se encuentran en la cereza se tiene a las antocianinas, como cianidina-3-O-rutinósido, cianidina-3-O-glucósido y peonidina-3-O-rutinósido (Wu et. al., 2004); los ácidos fenólicos principalmente derivados del ácido hidroxicinámico y del ácido p-cumárico; flavanoles y flavonoles como catequina, epicatequina, quercitina-3-O-glucósido, quercetina-3-O-rutinósido y kampferol- 3-O-rutinósido (Mozetic et al., 2005; Jacobek et al., 2007). Sin embargo la biomolécula de mayor importancia es la cianidina-3-O-glucósido ya que posee propiedades biológicas como la actividad antioxidante, antiinflamatoria, analgésica, entre otras (McCune et al., 2011) (Figura 2). Figura 2. Estructura de Cianidina-3-O-Glucósido. Se ha reportado que el consumo de cerezas dulces incrementa la capacidad antioxidante plasmática (Prior et al., 2007) y disminuye el óxido nítrico (ON), 4 actuando como un inhibidor de la inflamación (Kelley et al., 2006). De igual manera, estudios previos realizados en ratas alimentadas con jugo de cerezas amargas reportan un incremento de la actividad de las enzimas superóxido dismutasa (SOD) en hígado y sangre, y glutatión peroxidasa (GPx), cuyas enzimas participan en la triada antioxidante endógena (Šarić et al., 2009). Es por ello, que dicho fruto podría tener un papel de gran importancia en la artropatía gotosa, ya que debido a sus propiedades biológicas podría actuar como un tratamiento preventivo y/o coadyuvante durante ataques agudos de gota. Debido a lo anterior, el desarrollo de productos de cereza resulta de especial interés para la industria de alimentos ante la demanda de los consumidores por alimentos ricos en antioxidantes que inhiban a los radicales libres (RL). Sin embargo, se sabe que las tecnologías tradicionales degradan los compuestos fenólicos, por lo que es de vital importancia explorar la aplicación de tecnologías no convencionales. 2.1.2 Radicales libres y estrés oxidante Los radicales libres son átomos o moléculas que contiene un electrón desapareado en su orbital exterior. En un organismo el metabolismo aerobio produce especies reactivas de oxígeno (ERO), tales como: el anión superóxido (O2), radical hidroxilo (OH-), el oxígeno singlete y el peróxido de hidrógeno (H2O2), las cuales participan en el estallido respiratorio de las células fagocíticas, activadas por el contacto de partículas extrañas (Saavedra et al., 2010). En condiciones normales, el organismo neutraliza los radicales libres con enzimas antioxidantes como la SOD, GPx y Catalasa (CAT), dichas enzimas forman parte de la triada antioxidante, las cuales participan en la producción de compuestos microbicidas cuando hay presencia de agentes extraños en el organismo (Zhang et al., 2016). El mecanismo principal de la SOD es convertir al O2- en H2O2, un radical libre menos dañino, esto debido a que el superóxido es el radical más poderoso y peligroso. Por otro lado, el GPx y la CAT se encargan de eliminar el H2O2, sin 5 embargo los mecanismos son diferentes, la GPx cataliza la reducción del H2O2 evitando su oxidación en radicales de peróxido, mediante un mecanismo antioxidante GPx/GRd (Glutatión reductasa), mientras dicho mecanismo de la CAT es SOD/CAT. Ambos mecanismos no actúan a la par, la CAT actúa en presencia de altas concentraciones de H2O2 y la GPx lo hace a concentraciones bajas, lo que demuestra una correlación inversa en la actividad de ambas enzimas (Prego et al., 1997). Cuando las especies oxidantes superan a los sistemas antioxidantes se presenta un desbalance a favor de la oxidación, generando un estado de estrés oxidante celular, el cual puede provocar daños a células y biomoléculas, como ácidos nucleicos, proteínas, polisacáridos y lípidos. Actualmente se sabe que el estrés oxidante contribuye a procesos inflamatorios induciendo daños a la membrana sinovial y otros tejidos articulares, así mismo provocando disfunción endotelial, considerado este último como el factor de riesgo principal de enfermedades cardiovasculares (Saavedra et al, 2010). 2.1.3 Inhibición de radicales libres Los antioxidantes son biomoléculas que poseen la capacidad de ceder electrones, de tal manera que inhiben el estrés oxidante generado por determinadas situaciones, como la autoxidación de la glucosa, la vía del sorbitol, la glicosilación de proteínas, los productos de glicosilación avanzada, el gasto excesivo de cofactores reducidos; esto aunado a la reducción de las defensas antioxidantes, la capacidad redox de la célula y de la capacidad amortiguadora antioxidante (Salinas et al., 2013), de tal manera, que se reduce la producción de las ERO durante el EO, dichos antioxidantes se encuentran de manera endógena y exógena. Los antioxidantes endógenos son aquellos que se encuentran presentes en el organismo, dentro de los cuales están las enzimas SOD, GPx y CAT (Zhang et al., 2016). Por otro lado, los antioxidantes exógenos son aquellos que provienen de los 6 alimentos dentro de la dieta, estos se encuentran en frutos y vegetales, como el ácido ascórbico, los tocoferoles y carotenos (Coronado-H. et al., 2015). Por ello, el consumo de alimentos ricos en antioxidantes es de vital importancia, ya que intervienen en enfermedades cardiovasculares, artropatías, cáncer, y enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer, ya que dichas enfermedades están asociadas por la producción descontrolada de radicales libres (Oliviero et al., 2017). 2.1.4 Polifenoles totales y antocianinas En la naturaleza existe una amplia variedad de alimentos, cuyos compuestos presentan una estructura molecular caracterizada por la presencia de anillos fenólicos, dichos compuestos son llamados polifenoles. Estos se originan principalmente en las plantas y frutos, y se clasifican de acuerdo a la cantidad de anillos y sustituyentes que poseen, así como al tipo de enlace que presentan. Los principales grupos de polifenoles son: ácidos fenólicos (derivados del ácido hidroxibenzoico o del ácido hidroxicinámico), estilbenos, lignanos y flavonoides (Quiñones et al., 2012) (Figura 3). a) c) b) d) Figura 3. Clasificación de polifenoles. a) Lignanos b) Flavonoides c) Ácidos fenólicos d) Estilbenos. Dentro de los grupos mencionados, los flavonoides son de gran relevancia para nuestro estudio, estos son compuestos de bajo peso molecular que comparten un esqueleto común difenilpirano (C6-C3-C6’), compuesto por dos anillos fenilo (A y B) ligados a través de un anillo C de pirano heterocíclico (Figura 4). 7 Figura 4. Estructura básica de flavonoides. Los flavonoides se encuentran principalmente como glucósidos, pero también pueden aparecer en forma libre, también llamados agliconas. Los glucósidos se pueden encontrar de dos formas: como O-glucósidos con los carbohidratos ligados a través de átomos de oxígeno (enlace hemiacetal), o como C-glucósidos con los carbohidratos ligados a través de enlaces carbono-carbono (Quiñones et al., 2012). Los flavonoides se clasifican de acuerdo al estado de oxidación del anillo heterocíclico C y la posición del anillo B (Figura 5). Figura 5. Clasificación de flavonoides. Dichos grupos se clasifican de la siguiente manera: Flavonoles: Se encuentran principalmente en verduras y las frutas, así mismo el té y el vino son también alimentos ricos en flavonoles. 8 Flavonas: Son los flavonoides menos abundantes en los alimentos. El perejil y apio son la única fuente comestible de flavonas. Flavanonas: Aparecen a altas concentraciones en cítricos y en tomates, se localizan mayoritariamente en las partes sólidas de la fruta. Isoflavonas: Se pueden presentar como agliconas, o a menudo conjugadas con glucosa, pero son termosensibles, la soya y sus derivados son la principal fuente de isoflavonas. Flavanoles: Aparecer como monómeros (catequinas), como dímeros condensados entre sí y como oligómeros (procianidinas), o bién pueden aparecer como polímeros (proantocianidinas) se encuentran principalmente en fresas y arándanos. Antocianinas: Son compuestos termolábiles e hidrosolubles, por ello se requiere de tecnologías que disminuyan su degradación, constituyen uno de los grupos más importantes de pigmentos vegetales. Las antocianidinas están ampliamente distribuidas en la dieta humana. Se pueden encontrar en ciertas variedades de cereales, el vino tinto y en algunos vegetales, pero principalmente se encuentran en los frutos rojos o frutas del bosque. (Castañeda-Sánchez & Guerrero-Beltrán, 2015). 2.2 Procesamiento con microondas La tecnología de microondas se caracteriza principalmente por la aplicación de altas temperaturas en cortos períodos de tiempo, permitiendo mantener en mayor grado la calidad sensorial, y nutrimental de los alimentos; esto debido a la inactivación de enzimas, reducción del volumen del material, expulsión del aire atrapado intracelularmente, disminución de la carga microbiana y eliminación de aromas o sabores indeseables (Montiel, 2008). Una de las aplicaciones del microondas es el escaldado, el cual generalmente se realiza por ebullición o con vapor; sin embargo, diversos reportes indican que los frutos y vegetales escaldados por métodos convencionales presentan una mayor pérdida de nutrimentos y compuestos bioactivos debido a la lixiviación. Recientes investigaciones han sido enfocadas a su aplicación como un pretratamiento en 9 diversos procesos, con la finalidad de mantener o incrementar los compuestos bioactivos en productos como purés, jugos, botanas, entre otros (Dorantes-Alvarez et al., 2017). En purés de manzana variedad red y champion que fueron escaldados con microondas durante 2 min a 80 °C se mantuvo en mayor concentración el contenido de sustancias fenólicas como procianidinas, quercetina, catequina y ácido clorogénico, en comparación con muestras escaldadas en agua durante 4 min a 90 °C, mientras que la actividad antioxidante fue ligeramente superior en las muestras procesadas con microondas (Gerard & Roberts, 2004). La aplicación del escaldado asistido con microondas en diversos procesos de frutos y vegetales ricos en polifenoles podría significar una ventaja desde el punto de vista de salud al minimizar la degradación de estos compuestos. 2.3 Artritis gotosa La artritis gotosa o comúnmente llamada gota, es una enfermedad metabólica que se desarrolla por la sobreproducción de ácido úrico, generándose una cristalización en las articulaciones, como urato monosódico, dichos cristales provocan una reacción inflamatoria aguda, caracterizada por un acumulamiento masivo de leucocitos, de manera que se liberan citoquinas, quimioquinas, ERO y enzimas proteolíticas (Oliviero & Scanu, 2017) provocando enrojecimiento, inflamación y dolor, por lo que es considerada una enfermedad incapacitante (González, 2003). En México 3 % de la población padece dicha enfermedad, afectando principalmente a varones adultos. Cuando la gota cursa un período crónico existe una formación de granulomas, dicha formación se encuentra estructurada por un conjunto de células, CUM y tejidos, formando cúmulos en las articulaciones, los cuales son llamados tofos gotosos (Goicoechea et al., 2012). Esencialmente, los CUM se forman en la superficie del cartílago articular, sobre fibras colágenas del cartílago que han sido alteradas por un proceso de artrosis. Una vez formados los cristales, nuevos cristales encuentran la situación ideal de 10 nucleación y crecimiento sobre ellos, lo que facilita la formación de los tofos, que pueden alcanzar gran tamaño. De acuerdo con Lozano (2004), la gota se puede clasificar en dos tipos; Primaria; Abarca los trastornos hereditarios del metabolismo de las purinas, que cursan con la hiperproducción de ácido úrico. Secundaria; Abarca aquellos casos donde el origen de la hiperuricemia es adquirido, es decir, secundario a otros procesos, puede deberse a la hiperproducción de ácido úrico, bien de origen exógeno (dietas hiperproteícas e hipercalóricas), ingestión excesiva de etanol, entre otros. 2.3.1 Estrés oxidante y la artritis gotosa Debido a la acción oxidante de las ERO sobre los lípidos de la membrana, las proteínas celulares y los ácidos nucleicos (ADN, ARN), el estrés oxidante ha sido asociado al desarrollo de diversas enfermedades como la artritis gotosa. Se sabe que los CUM generan un EO y un estado inflamatorio con la liberación de ERO, como el O2-, H2O2 y del nitrógeno como ON, los cuales inducen daños a la membrana sinovial y otros tejidos articulares (Pineda et al., 2015). Recientemente se demostró que el resveratrol y su precursor la polidatina inhiben la producción de ERO en monocitos expuestos a CUM (Datos no publicados). Se ha reportado que una taza de cerezas consumidas de forma regular, puede reducir el riesgo de un ataque agudo de gota, sin embargo, es necesario corroborar estos hallazgos a través de ensayos clínicos y observacionales, antes de la recomendación de las cerezas como tratamiento complementario para prevenir ataques de gota (Zhang et al., 2012). Existen dos teorías acerca del mecanismo de acción de las cerezas, la primera es que por su contenido de ascorbato, ejerce una actividad biológica sobre los receptores tubulares renales impactando en la filtración de urato, y la segunda está relacionada a su contenido de vitamina C o de antocianinas, las cuales han 11 mostrado propiedades antiinflamatorias al inhibir a la ciclooxigenasa y la modulación de la secreción del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) (Gelber & Solomon, 2012). Se reportó que el jugo concentrado de cerezas inhibe hasta un 60 % la producción de Interleucina-1 beta (IL-1β). Por tal motivo, resulta importante evaluar si los mecanismos de generación del EO son inhibidos por el extracto del puré de cereza (Schlesinger et al., 2012). Este estudio será importante para diseñar un alimento funcional, que sean parte de la dieta de individuos con la enfermedad de la gota. 2.3.2 Métodos de evaluación de la capacidad antioxidante de un compuesto in vitro e in vivo Actualmente se entiende por cultivo celular al conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de las células in vitro, manteniendo al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Los cultivos celulares se utilizan tanto en la investigación básica como en la aplicada. En la investigación aplicada, las técnicas del cultivo celular son utilizadas para áreas como; Virología: Cultivo de virus animales y de plantas, producción de vacunas, etc. Biotecnología: Producción industrial de fármacos en birreactores como interferón, insulina, hormona del crecimiento, etc. Inmunología: Producción de anticuerpos monoclonales, señalización de fenómenos de inflamación, etc. Farmacología: Efecto de diversos fármacos, interacciones con el receptor, fenómenos de resistencia, etc. 12 Ingeniería de tejidos: Producción de tejidos artificiales, injertos o autotrasplantes, desdiferenciación y diferenciación inducida, etc. Toxicología: Citotoxicidad, mutagénesis, carcinogénesis, etc. Los modelos de células en cultivo son empleadas para la evaluación de la eficacia de diversas sustancias, esto debido a que tienen una serie de ventajas frente a otros modelos experimentales, como su menor costo económico, la criopreservación de las líneas celulares y la facilidad de control de las condiciones experimentales. En la investigación enfocada a la validación de alimentos funcionales, los modelos celulares proporcionan información valiosa sobre los mecanismos de acción y la eficacia protectora de sustancias bioactivas presentes en los productos alimenticios. Para ello, las células son incubadas con la sustancia pura o el extracto y posteriormente son expuestas a la acción de una sustancia oxidante. La evaluación del efecto protector proporcionado por la muestra, se realiza mediante el análisis de diversos biomarcadores o bioindicadores del daño causado por el EO (Guerra, 2001). La línea THP-1 es una línea celular de células monocíticas de leucemia humana, que ha sido ampliamente utilizada para estudiar funciones, mecanismos, vías de señalización y el transporte de nutrientes de los monocitos/macrófagos. Forman parte del compartimento inmunológico innato, en el que su principal función es el reconocimiento de patógenos extraños como bacterias, hongos y virus (Chanput et al., 2014). Los monocitos son células circulantes en la sangre, mientras que los macrófagos sólo se pueden encontrar en el sitio de la infección/inflamación (los llamados macrófagos derivados del monocito inflamatorio) o en los nódulos de tejido/linfocitos (los denominados macrófagos residentes en el tejido). 13 Estudios realizados en enfermedades inflamatorias reportan que una vez que fueron expuestas a los lipopolisacáridos (LPS) los monocitos respondieron rápidamente con un cambio en la expresión de genes relacionados con la inflamación en comparación con el forbol 12-miristato-13-acetato (PMA) (IL-1β, IL6, IL-8, IL-10 y TNF-α) (Chanput et al., 2010). Gracias a la capacidad de dicha línea, es posible experimentar la exposición simultánea de las células THP-1 a LPS y compuestos alimentarios, junto con el análisis de expresión génica, permitiendo que sea una herramienta útil in vitro para seleccionar los compuestos de modulación de inflamación y alimentos. 13 14 3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA En la actualidad los consumidores demandan productos y alimentos que brinden beneficios a su salud, en particular para la prevención de enfermedades crónico-degenerativas como la artritis gotosa, enfermedad que afecta al 3 % de la población mexicana, para la cual se requiere de alternativas para su prevención y/o tratamiento. Los alimentos son fuente de nutrientes, vitaminas, minerales y compuestos bioactivos que poseen diversas propiedades biológicas como los polifenoles, los cuales se encuentran en frutos como las cerezas, estás se expenden a nivel nacional en forma cruda o en conservas. Existen reportes que indican que las cerezas pueden reducir el riesgo de la artritis gotosa. Sin embargo, no existen productos elaborados a partir de cereza que representen una alternativa para los pacientes de gota. Con base en lo anterior el presente proyecto de tesis se justifica y plantea la elaboración de un puré de cerezas procesado con microondas con el fin de evaluar el efecto antioxidante in vitro en un modelo de ataque agudo de gota, permitiendo conocer así, el efecto protector ante el daño oxidante presente durante la artritis gotosa. 15 4. OBJETIVOS 4.1 Objetivo general Evaluar la actividad antioxidante y antiinflamatoria in vitro del puré de cereza procesado con microondas en un modelo de monocitos humanos expuestos a cristales de urato monosódico mimetizando un ataque agudo de gota. 4.2 Objetivos específicos Evaluar el contenido de polifenoles totales, antocianinas monoméricas y actividad antioxidante del extracto de cereza con procesamiento del microondas y del extracto de puré de cereza sin tratamiento con microondas. Evaluar el efecto del extracto obtenido del puré de cereza procesado con microondas y sin tratamiento, durante el daño oxidante inducido por los cristales de urato monosódico en cultivos celulares. 5. HIPÓTESIS El procesamiento con microondas del puré de cereza permitirá obtener un extracto con mayor actividad biológica sobre el estrés oxidante inducido por los CUM en un modelo in vitro de ataque agudo de gota. 16 6. MATERIAL Y MÉTODOS 6.1 Materia prima. El fruto de cereza fue adquirido durante los meses de Mayo–Junio del 2017 de la empresa local Grupo la norteñita ubicada en el Km 98.5 de la carretera Chihuahua–Cuauhtémoc S/N, C.P. 31552, de Cd. Cuauhtémoc, Chihuahua, en un estado de maduración comercial. Una vez adquiridos, los frutos se lavaron con una solución de hipoclorito de sodio (NaClO) al 0.1 % durante 2 min, y fueron almacenados bajo congelación (-20 °C) para procedimientos posteriores. 6.2 Metodología 6.2.1 Obtención del puré de cereza. Los frutos fueron molidos con un homogenizador marca Braun por períodos de 5 segundos para después ser procesados por microondas. 6.2.2 Procesamiento con microondas. Se colocaron 50 g del puré de cereza en una caja Petri y calentaron en un horno de microondas marca Panasonic operando a una frecuencia de 2450 MHz con una potencia de salida de 435 W durante periodos de 0 y 60 s (Dorantes-Alvarez et al., 2017). La potencia nominal del horno de microondas se determinó de acuerdo al método descrito previamente por Buffler (1992). Posteriormente, después de salir del microondas se colocaron en un baño de hielo, para realizar un choque térmico por un período de 2 min, esto con la finalidad de alargar la vida útil del puré evitando a su vez, la pérdida de nutrientes, aromas y texturas. Los tratamientos experimentales se elaboraron por triplicado, y se utilizaron para cuantificar los componentes fenólicos obtenidos y su capacidad antioxidante. 17 6.2.3 Obtención del extracto. Se colocaron 40 g del puré previamente sin procesar y procesado con microondas en tubos de centrifuga, posteriormente se centrifugaron a 1,500 rpm, durante 30 min a 4 °C, obteniendo el extracto líquido por medio de decantación, y posteriormente fue almacenado a -20 C en frascos ámbar de 50 mL. Dicho extracto líquido fue empleado para evaluación antioxidante en un modelo in vitro. 6.2.4 Cuantificación de polifenoles totales. La técnica empleada para cuantificar los polifenoles totales del extracto fue mediante el método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteu (Singleton & Rossi, 1965) para el cual se utilizó una curva de calibración de ácido gálico, usando una solución patrón de 12 mg EAG/100 mL (Cuadro 2). La intensidad del color se midió a una absorbancia de 750 nm. Concentración (µg/mL) Solución patrón (mL) Agua destilada (mL) 120 100 80 60 40 20 0 2.000 1.667 1.333 1.000 0.667 0.333 0.000 0.000 0.333 0.667 1.000 1.333 1.667 2.000 Cuadro 2. Curva de calibración de polifenoles totales. De cada extracto se tomaron 200 µL, y se adicionaron 200 µL del reactivo FolinCiocalteu 2 N, posteriormente se agitó en un vortex, y se agregaron 2 mL de la solución de carbonato de sodio 7 %: por último se añadieron 2 mL de agua destilada. Se agitó nuevamente y se dejó reposar por 1 hora a temperatura ambiente. 18 La concentración de las muestras se calculó con base en la curva de calibración (Apéndice 1), y se expresó como mg equivalentes de ácido gálico/100 g de muestra (mg EAG/100 g). 6.2.5 Cuantificación de antocianinas monoméricas. Se determinó el contenido de antocianinas monoméricas por el método de pH diferencial (Giusti y Wrolstad, 2001). Se prepararon las soluciones de pH 1 y pH 4.5. Para el buffer pH 1 (0.025 M) se pesaron 0.186 g de cloruro de potasio (KCl) y se disolvieron en 90 mL de agua destilada, posteriormente se ajustó el pH a 1 con ácido clorhídrico (HCl), una vez ajustado, se aforó a 100 mL. Para el buffer pH 4.5 se pesaron 5.44 g de acetato de sodio y se diluyó en 90 mL de agua destilada, se ajustó el pH mediante HCl, por último se aforó a 100 mL. Se diluyeron 2.5 mL de cada extracto en 25 mL de agua destilada. Posteriormente se tomaron 600 µL por duplicado de cada extracto y se adicionaron a 2.4 mL de buffer pH 1 y a 2.4 mL del buffer pH 4.5. Se dejó en reposo por 7 min a temperatura ambiente. Posteriormente se realizó un barrido en el espectrofotómetro de 420, 505, 510, 515 y 700 nm. La concentración de pigmentos monoméricos se calculó mediante la fórmula para antocianinas monoméricas como sigue: La concentración de antocianinas monoméricas se expresó como mg equivalentes de cianidina-3-glucósido/L (mg EC3G/L). 19 6.2.6 Determinación de actividad antioxidante La actividad antioxidante del extracto se evaluó mediante la técnica FRAP descrita por Benzie y colaboradores (1996) donde se cuantificó la capacidad de captación de radicales libres que tiene el extracto del puré de cereza a través de una reducción de Fe3+ a Fe2+, formando una coloración azul, la intensidad del color se midió a una longitud de onda de 593 nm. Se utilizó una curva de calibración estándar de trolox (Cuadro 3). Concentración (µM) Solución patrón (mL) Metanol 80 % (mL) 0 133 266 400 533 666 800 0.0 0.4 0.6 1.0 1.4 1.6 2.0 2.0 1.6 1.4 1.0 0.6 0.4 0.0 Cuadro 3. Curva estándar de Trolox. El reactivo FRAP se preparó mediante la siguiente mezcla de a), b) y c), en una relación de 100:10:10 (v:v:v) al momento de usarla. Todo el procedimiento debe realizarse protegido de la luz. a) Buffer de acetato de sodio 300 mM a pH 3.6. b) FeCl3 – 6H2O 20 nM c) TPTZ (2,4,6-Tripiridil-s-triazina) 10 mM La concentración de las muestras se calculó con base en la curva de calibración (Apéndice 2), y se expresaron como µM ET/100 g de muestra. 20 6.3 Actividad antioxidante del extracto procesado y sin procesar en modelo in vitro. 6.3.1 Preparación y estandarización de cultivo celular El cultivo de monocitos humanos, se realizó a partir de una línea celular comercial THP-1 (ATCC TIB-202), el medio de cultivo utilizado fue RPMI el cual se complementó con 10 % de suero fetal bovino (SFB) y 1 % de penicilina/estreptomicina (P/S) en una atmósfera controlada de CO2 al 5 % con una humedad del 95 % a 37 °C, hasta alcanzar una confluencia de 80 %, es decir, se mantuvieron en la misma caja de cultivo hasta que sobrepasaron el número máximo de células por mL, tomando 250,000 células por mL, para una caja nueva, aproximadamente cada 7 días. La viabilidad celular fue determinada usando la tinción con azul tripano en cámara de Neubauer. 6.3.2 Preparación de los cristales de urato monosódico monohidratado Los CUM se prepararon siguiendo el procedimiento de Zamudio et. al., 2016. Para la identificación de su forma y birrefringencia se empleó microscopía de luz polarizada. Se pesaron 4 g de ácido úrico (Sigma-Aldrich) y se disolvieron en 800 mL de agua desionizada estéril calentada a 60 °C, ajustada a un de pH 8.9 con NaOH 0.05 N, y se dejaron cristalizar toda la noche a temperatura ambiente. Para recuperar los cristales se centrifugaron a 4400 rpm a 4 °C. Posteriormente los cristales fueron lavados con agua destilada a 4 °C y secados a 60 °C durante 48 h en una estufa con aire en circulación forzada. Por último, los cristales fueron triturados en un mortero y antes de cada experimento se esterilizaron durante 2 h a 180 °C. 6.3.3 Viabilidad celular Se realizó viabilidad celular del EC T0 y T60 con las células, esto para verificar que el extracto por sí solo no actué como un tóxico. Para ello, se hicieron diluciones del extracto, y se colocaron con células THP-1 y medio RPMI complementado en 21 20 cajas de 12 pozos por duplicado. Las diluciones que se realizaron fueron 1:200, 1:400, 1:800 1:1000 y 1:1600 (Figura 6), tomando como control a las células con medio RPMI complementado sin el extracto. Figura 6. Preparación de diluciones. Posteriormente, se almacenaron por 24 h en una incubadora con una atmósfera controlada de 5 % CO2, humedad 95 %, temperatura 37 °C. Una vez almacenadas, se procedió a observar la proliferación mediante un microscopio EVOS. Posteriormente se realizó conteo de azul de tripano por cada muestra, tomando en cuenta las diluciones presentes. Una vez obtenidos los resultados del grupo control, y diluciones 1:200, 1:400, 1:800, 1:1000 y 1:1600 (v:v), se procedió a realizar los análisis estadísticos. Con base en los resultados obtenidos, se procedió a utilizar dichas diluciones para los experimentos posteriores. Cada experimento se realizó por triplicado. 6.3.4 Estimulación de las células con el extracto y con los CUM Se realizaron dos ensayos experimentales, uno como tratamiento coadyuvante, y otro como pre-tratamiento. Para el tratamiento coadyuvante se realizaron experimentos donde los CUM y los extractos de cereza T0 y T60 fueron añadidos al mismo momento del cultivo, tras 24 h se procedió a medir ERO. Para ensayos como pre-tratamiento, se cultivaron las células 24 h antes con los EC T0 y 23 22 T60, posteriormente se añadieron los CUM y se incubaron nuevamente 24 h, por último se procedió a medir ERO. 6.3.5 Determinación de ERO intracelulares La producción de ERO intracelulares se medió con el kit CellROX (Molecular Probes, Life Technologies Cat. C10422), que es una prueba fluorogénica diseñada para medir ERO en células vivas. Primero las células fueron recolectadas de una caja de 96 pozos, colocando cada grupo en tubos eppendorf de 1.5 mL, para ser centrifugadas a 3,600 rpm por 5 min a 4 °C, posteriormente los sobrenadantes fueron colocados en 3 tubos eppendorf de 0.6 mL y almacenados a -20 °C para realizar determinaciones extracelulares. Para preparar el reactivo, se colocaron 4 µL del kit CellROX en 2 mL de medio RPMI al 10 % SFB 1 % PS. Después de tratar las células con el EC, se adicionaron 200 µL del reactivo CellROX previamente elaborado con una concentración final 5 µM a las células e incubó durante 30 min a 37 ºC. Posteriormente se retiró el sobrenadante tras haber centrifugado los tubos a 3,600 rpm por 5 min a 4 °C y se realizaron lavados con una solución buffer de fosfato (PBS) tres veces, esto para eliminar los sobrantes del reactivo y el medio en las células. Tras el último lavado, se resuspendieron los botones celulares con 100 µL de PBS, y se procedió a cuantificarlas por citometría basada en imagen en un equipo “Tali Image Based Cytometer (TIBC)” Invitrogen de Life Technologies. Los resultados se muestran cómo % de células con estrés oxidante. 6.3.6 Determinación de interleucina IL-1β La determinación cuantitativa de IL-1β se realizó por medio un inmunoensayo enzimático de ELISA para sobrenadantes de cultivo celular, para ello se preparó la placa de 96 pocillos, y se colocaron 100 µL del anticuerpo de captura por 24 h a temperatura ambiente, posteriormente al día siguiente se realizaron 4 lavados con PBS Tween. 23 Enseguida se colocó el buffer de bloqueo (300 µL) y se cubrió la placa con papel aluminio, dejando reposar la placa por 1 h a temperatura ambiente. Posteriormente se procedió a realizar 4 lavados con PBS Tween, retirando los excedentes mediante sanitas, una vez seca la placa se colocaron 100 µL de las muestras a analizar, recubriendo nuevamente la placa con papel aluminio y dejando reposar por 2 hrs. Se realizaron nuevamente 4 lavados con PBS Tween, retirando excedentes, colocando finalmente 100 µL del anticuerpo de detección en cada pocillo, cubriendo seguidamente la placa con papel aluminio y dejando a temperatura ambiente por 2 hrs. Nuevamente se hicieron 4 lavados con el PBS Tween como en pasos previos, colocando posteriormente 100 µL de Avidina, y cubriendo la placa con papel aluminio y dejando a temperatura ambiente por 30 min. Finalmente se realizaron los 4 últimos lavados con PBS Tween, retirando los excedentes, y colocando finalmente el anticuerpo MTB para ELISA, y se procedió a leer en un lector de micro placas al minuto, seguida de lecturas cada 5 min, por un periodo de 30 min (1, 5, 10, 15, 20, 25 y 30 min). 6.3.7 Análisis estadístico Se realizó un análisis de varianza de una vía para las pruebas de ERO, con los distintos tratamientos con CUM. Para determinar si existen diferencias estadísticamente significativas de las variables antes mencionadas entre los cultivos se realizará la prueba de ANOVA, así como prueba de Tukey para determinar diferencias significativas entre las medias para valores de P ≤ 0.005. 24 25 7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 7.1 Determinaciones del extracto del puré de cereza 7.1.1 Polifenoles totales Los resultados en cuanto al contenido de polifenoles totales en el extracto de cereza procesado y sin procesar se muestran en la Figura 7. El extracto del puré de cereza procesado T60 tuvo una mayor concentración en polifenoles totales con 1116 mg EAG/L en comparación con T0 con 872 mg EAG/L, es decir mostró un incremento del 28 % en T60 (Figura 7). Con base a estudios previos, el uso de microondas permitió obtener una mayor extracción de compuestos bioactivos, esto es debido a una mayor disrupción de la pared celular (Dorantes-Alvarez et al., 2017) 1200 28% 1000 ( m g E A G /1 0 0 g ) P o life n o le s T o ta le s * 800 600 400 200 0 T0 T 60 Figura 7. Contenido de polifenoles totales. T Estudiante no emparejada. Valores expresados como media ± SEM de 3 experimentos independientes P <0.0001. 7.1.2 Antocianinas monoméricas El extracto T60 obtuvo mayor concentración de antocianinas monoméricas con 48 mg EC3G/L, en comparación a T0 con 29 mg EC3G/L, permitiendo un aumento del 65 % con respecto a T0 (Figura 8). 25 Lo anterior se atribuye a una mayor ruptura en la pared celular (Dorantes- 60 * ( m g E C 3 G /L ) A n to c ia n in a s M o n o m é r ic a s Alvarez et al., 2017). 65% 40 20 0 T0 T 60 Figura 8. Contenido de antocianinas monoméricas. T Estudiante no emparejada. Valores expresados como media ± SEM de 3 experimentos independientes P 0.0085. 7.1.3 Actividad antioxidante por el método de FRAP La actividad antioxidante se midió por método FRAP, el extracto T0 obtuvo 66µM/100g y el T60 112 µM/100g, incrementando hasta un 69 %, lo que sugiere que el extracto procesado T60 posee mayor actividad antioxidante en comparación al extracto sin procesar (Figura 9). Debido al incremento de los compuestos bioactivos, como los polifenoles totales y antocianinas monoméricas en el extracto del puré procesado con microondas, es de esperarse un aumento en la capacidad antioxidante. 26 150 ( µ M o l/1 0 0 g ) FRAP * 69% 100 50 0 T0 T 60 Figura 9. Actividad antioxidante por método de FRAP. T Estudiante no emparejada. Valores expresados como media ± SEM de 3 experimentos independientes P <0.0001. 7.2 Evaluación de la actividad antioxidante in vitro del extracto de cereza 7.2.1 Viabilidad celular Con base en la viabilidad celular de los extractos tanto procesado como sin procesar, T60 y T0 respectivamente, se observó que las diluciones 1:800 y 1:1600 (v:v) fueron las mejores para implementarse en los modelos in vitro, dado que hay menor presencia de toxicidad por parte de los extractos (Figura 10 y 11). Al momento de realizar los experimentos de vialidad celular, se encontró que ambos extractos en las diluciones 1:200 resultaron tóxicos, ya que producían apoptosis celular, sin embargo, en las diluciones 1:800 y 1:1600 (v:v) se encontró un incremento en la confluencia de ambos experimentos, es decir, que hubo un crecimiento celular mayoritario al grupo control. Lo anterior se podría atribuir a un mayor contenido de carbohidratos en los extractos tanto procesados como sin procesar. 27 V ia b ilid a d C e lu la r (N o . d e c é lu la s ) 200 V iv a s M u e rta s 150 100 50 0 C o n t r o l 1 :2 0 0 1 :4 0 0 1 :8 0 0 1 :1 0 0 0 1 :1 6 0 0 V ia b ilid a d C e lu la r (N o . d e c é lu la s ) Figura 10. Viabilidad celular de extracto T0. ANDEVA dos vías. Valores expresados como media ± desviación estándar de 3 experimentos independientes P <0.0001 de interacción y de factor de columna (Post hoc de Tukey’s). 200 V iv a s M u e rta s 150 100 50 0 C o n t r o l 1 :2 0 0 1 :4 0 0 1 :8 0 0 1 :1 0 0 0 1 :1 6 0 0 Figura 11. Viabilidad celular de extracto T60. ANDEVA dos vías. Valores expresados como media ± desviación estándar de 3 experimentos independientes P <0.0001 de interacción y de factor de columna (Post hoc de Tukey’s). Ambos experimentos fueron observados en un microscopio Evos a 100 µm, para conocer la morfología celular de los monocitos, ante la presencia de las diluciones de los extractos sin procesar T0 y procesado T60, respectivamente. (Figura 12 y 13), lo cual corroboró la toxicidad de las muestras en las diluciones 1:1200. 28 Figura 12. Morfología de THP-1 a 100 µm expuestas a diluciones de extracto T0. A) Control. B) Dilución 1:200. C) Dilución 1:400. D) Dilución 1:800. E) Dilución 1:1000. F) Dilución 1:1600. Figura 13. Morfología de THP-1 a 100 µm expuestas a diluciones de extracto T60. A) Control. B) Dilución 1:200. C) Dilución 1:400. D) Dilución 1:800. E) Dilución 1:1000. F) Dilución 1:1600. 29 30 7.2.2 Estrés oxidante por CellRox. Como se puede observar, los CUM incrementaron la producción de ERO en monocitos a las 24 h en comparación con el control (Figura 14). Se puede observar que la producción de ERO disminuyó de forma significativa al administrar los extractos obtenidos del puré sin tratamiento (T0) y con tratamiento con microondas (T60). Es decir, el estrés oxidante de las células con los extractos de cereza T0 y T60 en el experimento simultáneo, es menor en comparación al grupo de los CUM. Es importante mencionar que en tratamiento normal o simultáneo consistió en 40 * & # 30 20 # & 10 T 6 0 1 :1 6 0 0 + C U M T 6 0 1 :8 0 0 + C U M T 0 1 :1 6 0 0 + C U M T 0 1 :8 0 0 + C U M CUM 0 C o n tro l % C é lu la s c o n e s t r é s o x id a n te administrar los extractos al mismo tiempo que se provocaba el ataque agudo. Figura 14. Estrés oxidante de THP-1 a 24 h como tratamiento simultaneo. ANDEVA de una vía. Valores expresados como media ± desviación estándar de 3 experimentos independientes P 0.0206*, P 0.0271 &, P 0.0137# (Post hoc de Tukey’s). Control: monocitos sin exposición a los CUM, CUM: monocitos expuestos a los CUM, T0 1:800+ CUM: monocitos expuestos a los CUM + extracto de puré de cereza sin procesar a una dilución 1:800, T0 1:1600+ CUM: monocitos expuestos a los CUM + extracto de puré de cereza sin procesar a una dilución 1:1600, T60 1:800+ CUM: monocitos expuestos a los CUM + extracto de puré de cereza procesado con microondas 60 s a una dilución 1:800, T60 1:1600+ CUM: monocitos expuestos a los CUM + extracto de puré de cereza procesado con microondas 60 s a una dilución 1:1600. 30 Los resultados obtenidos sugieren la actividad antioxidante del extracto de cereza en un modelo in vitro de estrés oxidante inducido por CUM. Diversos estudios sugieren el potencial de aplicación como terapéutico de polifenoles como el bergamot y la polidatina en el tratamiento de la gota (Lyn y Bochu, 2014; Olivero et al., 2017). Por otro lado, el pretratamiento consistió en administrar los extractos 24 h antes de la inmersión de los CUM, actuando como preventivo antes de un ataque agudo de gota, en el caso del experimento como pretratamiento, en los monocitos que fueron expuestos a CUM y recibieron el pretratamiento con extracto obtenido de cereza sin tratamiento (T0) y con tratamiento con microondas (T60) durante 24 horas, la producción de ERO disminuyó en comparación con los monocitos que fueron expuestos a los CUM (Figura 15). Estudios realizados por Zhang y colaboradores (2012) con el consumo de ½ taza de cerezas 2 días ayuda a la prevención del ataque agudo de gota. Los presentes resultados sugieren la actividad antioxidante del extracto de cereza en un modelo in vitro de estrés oxidante inducido por CUM, y su potencial de aplicación tanto como preventivo y terapéutico en un ataque agudo de gota. 7.2.3 Actividad del extracto de cereza en interleucina IL-1β Dado que la gota es una patología con un fuerte componente tanto oxidante como inflamatorio, se evaluó el efecto del extracto de cereza en la interleucina IL1β. Al evaluar el efecto de los extractos obtenidos de cereza sin (T0) y con tratamiento con microondas (T60) en un tratamiento normal o simultáneo, es decir su administración ante un ataque agudo de gota (Figura 16) se observó una disminución de la interleucina IL-1β en los grupos donde se administró el extracto de cereza en comparación con el grupo correspondiente a los monocitos expuestos a los CUM, lo cual fue estadísticamente significativo, P<0.0001. Diversos estudios indican que en la enfermedad de la gota los cristales de urato monosódico activan el inflamasoma, liberando así interleucina 1β (IL-1β). Lo anterior plantea la 31 32 necesidad del desarrollo de terapias de la gota para ataque agudo que bloqueen la 40 **** *** * 30 20 ** 10 ** ** T 6 0 1 :1 6 0 0 + C U M T 6 0 1 :8 0 0 + C U M T 0 1 :1 6 0 0 + C U M CUM T 0 1 :8 0 0 + C U M 0 C o n tro l % C é lu la s c o n e s t r é s o x id a n te interleucina IL-1. Figura 15. Estrés oxidante de THP-1 a 24 h como pre-tratamiento. ANDEVA una vía. Valores expresados como media ± desviación estándar de 3 experimentos independientes P 0.0219*, P 0.0029**, P 0.0001***, P <0.0001**** (Post hoc de Tukey’s). Control: monocitos sin exposición a los CUM, CUM: monocitos expuestos a los CUM, T0 1:800+ CUM: monocitos expuestos a los CUM + extracto de puré de cereza sin procesar a una dilución 1:800, T0 1:1600+ CUM: monocitos expuestos a los CUM + extracto de puré de cereza sin procesar a una dilución 1:1600, T60 1:800+ CUM: monocitos expuestos a los CUM + extracto de puré de cereza procesado con microondas 60 s a una dilución 1:800, T60 1:1600+ CUM: monocitos expuestos a los CUM + extracto de puré de cereza procesado con microondas 60 s a una dilución 1:1600. 32 & IL -1 ( p g /m L ) 600 * ** # 400 ** # 200 T 6 0 1 :1 6 0 0 + C U M T 6 0 1 :8 0 0 + C U M T 0 1 :1 6 0 0 + C U M T 0 1 :8 0 0 + C U M CUM C o n tro l 0 Figura 16. Determinación de IL-1β en tratamiento simultáneo de THP-1 a 24 h. ANDEVA una vía. Valores expresados como media ± desviación estándar de 3 experimentos independientes P 0.0040 *, P 0.0212#, P <0.0001&, P 0.0008 (Post hoc de Tukey’s). Control: monocitos sin exposición a los CUM, CUM: monocitos expuestos a los CUM, T0 1:800+ CUM: monocitos expuestos a los CUM + extracto de puré de cereza sin procesar a una dilución 1:800, T0 1:1600+ CUM: monocitos expuestos a los CUM + extracto de puré de cereza sin procesar a una dilución 1:1600, T60 1:800+ CUM: monocitos expuestos a los CUM + extracto de puré de cereza procesado con microondas 60 s a una dilución 1:800, T60 1:1600+ CUM: monocitos expuestos a los CUM + extracto de puré de cereza procesado con microondas 60 s a una dilución 1:1600. De igual manera, en el tratamiento preventivo los extractos de puré de cereza sin procesar (T0) y procesado con microondas (T60) también indujeron una reducción de la interleucina IL-1β (Figura 17). De acuerdo a Schlesinger (2012) y Chanput (2010), esto se debe a la inhibición de la producción de la IL-1β durante la fagocitosis del CUM por parte de los monocitos, de tal manera que el extracto de cereza interviene en el mecanismo del inflamasoma (Figura 18). Cuando ocurre dicha inactivación por parte del mecanismo del inflamasoma, este no permite la liberación de mediadores pro-inflamatorios tras la señalización del endotelio, lo cual reduce el reclutamiento de neutrófilos, evitando así la liberación de más citosinas pro-inflamatorias. 33 500 ** * IL -1 ( p g /m L ) 400 300 200 100 T 6 0 1 :1 6 0 0 + C U M T 6 0 1 :8 0 0 + C U M T 0 1 :1 6 0 0 + C U M T 0 1 :8 0 0 + C U M CUM C o n tro l 0 Figura 17. Determinación de IL-1β en pre-tratamiento THP-1 a 24 h. ANDEVA una vía. Valores expresados como media ± desviación estándar de 3 experimentos independientes P 0.0400*, P 0.0249** (Post hoc de Tukey’s). Control: monocitos sin exposición a los CUM, CUM: monocitos expuestos a los CUM, T0 1:800+ CUM: monocitos expuestos a los CUM + extracto de puré de cereza sin procesar a una dilución 1:800, T0 1:1600+ CUM: monocitos expuestos a los CUM + extracto de puré de cereza sin procesar a una dilución 1:1600, T60 1:800+ CUM: monocitos expuestos a los CUM + extracto de puré de cereza procesado con microondas 60 s a una dilución 1:800, T60 1:1600+ CUM: monocitos expuestos a los CUM + extracto de puré de cereza procesado con microondas 60 s a una dilución 1:1600. Figura 18. Mecanismo de producción del inflamasoma a nivel celular. 34 8. CONCLUSIONES El procesamiento por microondas permitió obtener un extracto con mayor concentración de compuestos bioactivos, tales como polifenoles totales, antocianinas monoméricas y su capacidad antioxidante. Los extractos de puré de cereza mostraron potencial de aplicación como pretratamiento y durante un ataque agudo de gota al reducir la producción de ERO e interleucina IL-1β, factores que intervienen durante el estrés oxidante y procesos inflamatorios, sin embargo no se apreció que el extracto procesado sea más efectivo en comparación al extracto sin procesar. La aplicación del extracto procesado por microondas como pre-tratamiento, demostró tener ligeramente una mayor actividad biológica en cuanto a la actividad antiinflamatoria. 35 9. REFERENCÍAS Benzie, I.F. y F.J. Strain. 1996. Ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of antioxidant power: The FRAP assay. Analytic Biochemistry 239: 70-76. Buffler, R. C. 1992. Power measurement test procedures. In: MicrowaVe Cooking and Processing; Engineering Fundamentals for the Food Scientist; AVI Books: New York; pp 157-158. Castañeda-Sánchez, A., & Guerrero-Beltrán, J. 2015. Pigmentos en frutas y hortalizas rojas: Antocianinas. 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