UNIDAD 1 LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA

UNIDAD 1
LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y
CITOGENÉTICA
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BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA
Unidad 1 Biología Molecular y Citogenética
Contenido
I. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 4
II. LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR ................................................................... 6
1.
EQUIPAMIENTO GENÉRICO ................................................................................... 6
2.
EQUIPAMIENTO ESPECÍFICO PARA BIOLOGÍA MOLECULAR ................................. 8
3.
ESTRUCTURA DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR ............................ 10
4.
CONDICIONES DE TRABAJO Y PREVENCIÓN DE LA CONTAMINACIÓN................ 12
5.
USO EFICIENTE DE LOS RECURSOS ...................................................................... 13
III. LABORATORIO DE CITOGENÉTICA Y CULTIVOS CELULARES ...................................... 14
1.
EQUIPAMIENTO ESPECÍFICO PARA CULTIVOS CELULARES.................................. 14
2.
EQUIPAMIENTO ESPECÍFICO PARA CITOGENÉTICA ............................................. 16
3.
ESTRUCTURA DEL LABORATORIO DE CITOGENÉTICA.......................................... 17
4.
TÉCNICA ASÉPTICA............................................................................................... 17
IV. SEGURIDAD EN EL LABORATORIO ............................................................................ 18
1.
SEGURIDAD QUÍMICA .......................................................................................... 19
2.
BIOSEGURIDAD .................................................................................................... 20
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En este capítulo se muestra cómo debe organizarse un laboratorio de citogenética o
biología molecular para tener un grado de eficiencia óptimo. También se describen a
grandes rasgos las operaciones técnicas que se llevan a cabo, así como los protocolos que
mantienen las condiciones recomendables de seguridad.
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GLOSARIO BÁSICO:

Área o zona estéril: Conjunto de instalaciones libres de patógenos.

Ácidos nucleicos (AN): Grandes moléculas formadas por la repetición de monómeros
(nucleótidos) que cumplen la función de almacenar la información genética. Existen
dos tipos básicos: ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN).

Fluorescent in situ hibridation (FISH): técnica citogenética de marcado de
cromosomas mediante la cual éstos se hibridan con sondas que emiten fluorescencia
y permiten la visualización, distinción y estudio de cromosomas, así como de las
anomalías que pueden presentar.

Cultivo celular: es el proceso mediante el que células, ya sean células procariotas o
eucariotas, pueden cultivarse en condiciones controladas.

Estudio citogenético (cariotipo): consiste en el análisis detallado de los cromosomas
que forman la dotación de diversas células que proceden de una muestra cultivada
de un único individuo. Los cromosomas de una misma célula se agrupan en pares
homólogos y se disponen según un orden establecido. Los distintos cromosomas se
distinguen por su patrón de bandas característico.

Cromosoma: estructura que condensa todo el contenido del núcleo de una célula
eucariota. Está formada por la asociación de ADN y Proteínas.

Organigrama: resumen o esquema de la organización de una entidad, de una
empresa o de una tarea.

Procedimiento normalizado de trabajo (PNT): es el protocolo técnico detallado de
cada uno de los procesos que se realizan en el laboratorio. Incluye materiales,
reactivos, equipos, y detalles de manipulación de las muestras.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): técnica de biología molecular que
permite amplificar de forma exponencial pequeñas cantidades de ADN.
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
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I. INTRODUCCIÓN
La biología molecular es la parte de la biología que estudia los procesos vitales de los seres vivos
en función de las características de su estructura molecular. Estudia, por tanto, la composición,
la estructura y la función de las moléculas más importantes.
Esta ciencia está relacionada con otras áreas de conocimiento como la Bioquímica, la Citología,
o la Genética. En concreto, la biología molecular se ocupa solo de dos macromoléculas: los
ácidos nucleicos y las proteínas, estando aceptado en la actualidad que la denominación de
biología molecular se reserve para el estudio de ácidos nucleicos (ADN y ARN). De manera
equivalente, la disciplina que estudia específicamente las proteínas es la proteómica.
Por su parte, la citogenética es una disciplina derivada de la genética que estudia la función y el
comportamiento de los cromosomas en la célula. La citogenética y la biología molecular son dos
campos de la genética. De hecho, no existen como unidades asistenciales reguladas, y el RD
1277/2003 de 10 de octubre define la Unidad de Genética como la "unidad asistencial que, bajo
la responsabilidad de un facultativo con formación adecuada, está dedicada a la realización de
pruebas genéticas y emisión de dictámenes con fines diagnósticos". Por tanto, ambas unidades
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(biología molecular y citogenética) quedan incluidas dentro de la UNIDAD de GENÉTICA.
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Cada laboratorio cuenta con un equipamiento propio, y habitualmente se diferencian áreas
"sucias" y "limpias" para evitar la contaminación. Dicha contaminación suele proceder de las
muestras que se procesan, de la contaminación de equipos, superficies de trabajo, pipetas,
refrigeradores, guantes, gradillas, o incluso lápices marcadores… Para disminuir los riesgos, es
fundamental no mezclar equipamiento, es decir, utilizar el material propio de cada área.
DIRECTOR
TÉCNICO
También es importante el papel que cumple el personal de
laboratorio. Un organigrama se estructura en niveles de creciente
responsabilidad y a través de él se canaliza todo el flujo de
información respecto al proceso analítico de cada una de las
muestras que llega al laboratorio.
DIRECTOR DE
LABORATORIO
Debe existir un director de laboratorio o un jefe de servicio con
amplia experiencia y formación, que coordine las secciones del
laboratorio, actúe de enlace con el director técnico y proporcione
una atención directa a los clientes. También se encargará de la
COORDINADOR
DE ÁREA
validación de nuevas metodologías y de supervisar las técnicas en
uso.
Bajo la supervisión del responsable de laboratorio es fundamental
la figura del coordinador de área o jefe de sección. Cada
COORDINADOR
TÉCNICO
coordinador controla y gestiona las técnicas y el personal asociado
a cada tipo de muestra. Se encarga de analizar la recepción de
muestras, los estudios que se realizan en ellas, las anomalías y la
PERSONAL
TÉCNICO
elaboración de los informes.
Finalmente, el coordinador técnico se encarga de supervisar y organizar el equipo humano que
trabaja recepcionando y analizando las muestras en el laboratorio. También realiza la gestión de
stock de reactivos.
Este esquema suele estar presente en laboratorios con gran volumen de trabajo (grandes
hospitales, por ejemplo); sin embargo, en laboratorios de pequeño o mediano tamaño, ciertas
categorías pueden fusionarse.
Todos los protocolos técnicos y PNT deben ser autorizados por el director y el coordinador de
área correspondiente y han de ponerse en conocimiento y a disposición de todo el personal. Se
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reevaluarán anualmente y los cambios que se realicen en ellos se tendrán que notificar.
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La selección y formación/adaptación del personal es fundamental para el correcto
funcionamiento del laboratorio. Los valores a destacar serían personas metódicas, ordenadas,
responsables, aptas para el trabajo en equipo y con iniciativa. Todos deben conocer
perfectamente los PNT que se utilizan habitualmente.
Las funciones del personal técnico serán variadas y deberán estar perfectamente definidas para
evitar errores (según el área de trabajo): calibración, limpieza y mantenimiento de equipos,
recepción e identificación de muestras, puesta en marcha de cultivos, inventario y control,
procesado de cultivos, preparación de reactivos, almacenamiento de muestras…
II. LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR
El laboratorio de biología molecular se organiza alrededor de la técnica de la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR). Esta técnica, permite obtener un gran número de copias de un
fragmento de ADN (amplificación del ADN) que servirán para distintos fines: clonación,
identificación de material genético, análisis funcional de genes, diagnóstico de trastornos
hereditarios…La veremos con más detenimiento más adelante en la asignatura.
Debido a esta técnica empleada, donde se suelen obtener un gran número de copias de un
fragmento concreto de ADN partiendo de una cantidad mínima de material genético, es
indispensable que el flujo de trabajo sea UNIDIRECCIONAL para evitar posibles contaminaciones.
Además, como veremos más adelante, las salas de trabajo estarán separadas.
De manera general, podemos encontrar en los laboratorios de biología molecular o citogenética
un equipamiento genérico común con otros laboratorios, y un equipamiento específico para la
realización de las técnicas exclusivas, cómo la PCR.
1. EQUIPAMIENTO GENÉRICO
Algunos de los equipos genéricos pueden incluir modificaciones para ser utilizados en biología
molecular, pero por regla general, se pueden encontrar similares en cualquier laboratorio:
 Autoclave: Aparato para esterilización de materiales por vapor (presión y temperatura
elevadas). Es imprescindible para trabajar con microorganismos y en cualquier procedimiento
de biología molecular (en condiciones asépticas). Casi la totalidad del material fungible del
laboratorio reduciendo costes.
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laboratorio puede adquirirse estéril (en bolsas cerradas), o bien esterilizarlo en el propio
 Baño termostático, placa calefactora o termobloque: Para biología
molecular es necesario que se pueda regular con precisión 95oC -100oC
para desnaturalizar ADN.
 Centrífuga: Equipo que aplica una gran fuerza centrífuga a la muestra
acelerando el proceso de sedimentación de sus componentes como técnica de separación. El
rotor de la centrífuga debe estar adecuado a los volúmenes que se manejan en biología
molecular y lo habitual es que permitan centrifugar desde tubos Eppendorf (PCR: 200 μl) hasta
tubos de 50 ml. Debido a las particularidades de la separación por centrifugación de los
componentes celulares, las velocidades de giro deben ser muy elevadas y durante un tiempo
prolongado. Esto origina calentamiento de la muestra y, por consiguiente, estos equipos deben
estar refrigerados.
 Cabina de bioseguridad: Se utilizan cabinas verticales de flujo laminar
de clase II. Su cometido es la protección de la muestra y de la persona
que manipula la muestra. Como cualquier equipo de laboratorio, para
asegurar su funcionamiento es necesario que tenga un mantenimiento
periódico (filtros, lámpara UV, aspiración…).
 Espectrofotómetro: Este aparato analiza la concentración de una
muestra en función de la absorción de luz en una determinada longitud de onda (absorbancia).
Para proteínas y ácidos nucleicos, es preciso que abarque el rango de longitudes de onda
ultravioleta y que el volumen de la cubeta de muestra sea de 1µl.
 Incubador: También llamado estufa. Es un equipo clásico de los laboratorios de microbiología.
Para trabajar con cultivos celulares, requieren de un ambiente controlado con una humedad
alta y una presión parcial de CO2 elevada.
 Microscopio: En biología molecular la microscopía óptica es claramente insuficiente. Por este
motivo debe contar con un microscopio de fluorescencia para las técnicas de hibridación in
situ fluorescente (FISH). Actualmente, estos microscopios llevan asociados sistemas de captura
de imágenes para su tratamiento y archivo.
 Congelador: Es totalmente necesario contar con un sistema que garantice la conservación de
leer las recomendaciones comerciales), mientras que las muestras deben hacerse en
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reactivos, enzimas y muestras. Las enzimas se almacenan a -20o C (aunque siempre debemos
ultracongeladores a -80o C (proporcionan una mayor viabilidad, por ejemplo, para muestras de
ADN que deben ser conservadas durante más de veinte años por cadena de custodia). Por
tanto, la temperatura de conservación varía dependiendo del tiempo que va a tardar en
emplearse el reactivo o la muestra y las condiciones de laboratorio.
 Purificación agua: El laboratorio de biología molecular requiere un suministro permanente de
agua de calidad ultrapura tipo I. El agua ultrapura tiene un nivel máximo de impureza de 1µg/l
(rango de ppb) mucho menos que otros reactivos empleados.
Los botes dispensadores de agua ultrapura deben rellenarse a diario y por ningún motivo
deben contener otro líquido. El sistema de purificación suele ser una resina de intercambio
iónico que garantiza un aporte continuo de agua a un precio bastante asequible.
2. EQUIPAMIENTO ESPECÍFICO PARA BIOLOGÍA MOLECULAR
En biología molecular, el equipamiento específico permite realizar la técnica de PCR y analizar
los productos obtenidos (ADN amplificado). La infraestructura principal para el análisis de ácidos
nucleicos por PCR consta del termociclador, equipo de electroforesis y un visualizador de geles.
Complementariamente, se pueden encontrar los extractores de ácidos nucleicos y los
secuenciadores. Estos últimos son equipos automatizados que se estudian en las unidades de
extracción (3) y secuenciación (8) respectivamente.
 Termociclador: Es el equipo en el que se lleva a cabo la técnica de la PCR. Esta técnica se basa
en la sucesión de ciclos de incubación a temperaturas diferentes. Como resultado, el fragmento
de ADN de estudio es copiado por la ADN polimerasa miles de veces.
El termociclador se compone de un bloque de incubación termostatizado. Tiene múltiples
pocillos donde se colocan los microtubos de PCR y su cometido es mantener la temperatura
programada, durante cada uno de los ciclos de PCR. Esta temperatura oscila entre 4o C y 96o C.
Para calentar y enfriar de manera homogénea el bloque, los termocicladores actuales se basan
en el efecto Peltier. Se produce entre dos semiconductores unidos por dos soldaduras. Cuando
una corriente eléctrica continua los atraviesa, uno de ellos se calienta y el otro se enfría. Si la
polaridad de la corriente se invierte, se invierte el calentamiento/enfriamiento de cada
semiconductor. Gracias a este efecto, los bloques pueden calentarse y enfriarse rápidamente a
la temperatura programada, y de manera homogénea.
tapa de los microtubos de PCR y evitar que se condense en ella el agua evaporada de la mezcla.
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La tapa del bloque es otro elemento importante. Está termostatizada a 103o C para calentar la
Esto supondría una alteración de la concentración de los reactivos y por tanto del desarrollo de
la reacción.
La PCR a tiempo real "Real-Time PCR" (no se debe confundir con la RT-PCR) consta de un tipo
especial de termociclador que incorpora un sistema láser y detectores de fluorescencia. Durante
el desarrollo de la reacción, el láser mide la síntesis de los productos amplificados en tiempo
real. La PCR en tiempo real permite cuantificar el nivel de producto obtenido en cualquier
momento de la amplificación. Esta PCR a tiempo real se conoce también como PCR cuantitativa.
*La PCR en tiempo real, permite prescindir de la electroforesis necesaria para el análisis de los
productos amplificados en la PCR tradicional.
 Equipo de electroforesis: Esta técnica de biología molecular permite separar moléculas con
carga neta en función de su tamaño, su carga y su estructura tridimensional (forma). Se
fundamenta en la migración que experimentan las moléculas cuando son colocadas en un
campo eléctrico.
Los fragmentos de ADN amplificados (producto de la PCR) deben ser separados para su
identificación. Para ello se colocan en un gel de agarosa o de poliacrilamida. La elección de uno
u otro depende del tamaño de las moléculas, siendo la agarosa la elección para moléculas de
mayor tamaño y la acrilamida para moléculas más pequeñas.
La electroforesis en gel de agarosa es más rápida, pero tiene menos poder de resolución.
El equipo de electroforesis consta de un soporte de plástico donde se solidifica el gel elegido
que se coloca en una cubeta.
La cubeta puede ser vertical u horizontal y contiene un tampón de electroforesis que donde está
sumergido el gel (evita que se modifique el PH y se afecte a las cargas de las moléculas). En los
extremos del gel y también en contacto con el tampón, se encuentran los electrodos positivo y
negativo.
La electroforesis se complementa con una fuente de alimentación de corriente continua, que
permite graduar el voltaje y la intensidad.
 Visualizador de geles: Este dispositivo permite visualizar las bandas de ácidos nucleicos o
proteínas obtenidas en la electroforesis.
Para su visualización, se realiza una tinción
fluorescente con bromuro de etidio que emite una luz anaranjada cuando está unido al ADN.
Este producto es mutagénico y cancerígeno, por lo que se utilizan alternativas tales como el
El visualizador de geles consta de un transiluminador de luz ultravioleta donde se colocan los
geles para visualizar la separación y un sistema de captura de imágenes.
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RedSafe®. También fluorescente con luz UV, en este caso verde.
Debido al riesgo que supone para el técnico la exposición a la luz UV, el transiluminador se
encuentra dentro de una cámara oscura, de forma que solo se puede visualizar el resultado por
la captura de imagen.
En modelos antiguos, el transiluminador no está dentro de una cámara oscura, siendo necesario
el uso de gafas de protección y reducir el tiempo de exposición al mínimo.
En la asignatura de Técnicas Generales de Laboratorio se estudian las bases y los
procedimientos de la electroforesis en detalle en la tercera evaluación.
3. ESTRUCTURA DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR
Como hemos dicho, los equipos y la estructura del laboratorio giran en torno a la técnica de PCR.
Previamente a la reacción en cadena de la polimerasa deben prepararse los reactivos y
purificarse los ácidos nucleicos. Después de amplificarse mediante la PCR, el resultado de la
misma debe ser analizado mediante electroforesis.
Cada actividad debe realizarse en un área determinada e independiente del laboratorio para
evitar contaminación. Cada una de ellas debe contar con su propio equipamiento y material de
trabajo, de manera que no sean intercambiables.
El laboratorio de biología molecular debe contar como mínimo con cuatro áreas
independientes. Preferiblemente en salas independientes.
Preparación
de
Reactivos
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Preparación
de muestras
y
Extracción
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
Preparación de reactivos: Es el área LIMPIA del
pre-PCR
laboratorio. No hay ADN ni muestra. Aquí se prepara la
mezcla de reacción para la PCR. Cuenta con una cabina de
REACTIVOS
EXTRACCIÓN ADN
bioseguridad y a ser posible presión positiva (evita que
entre contaminación). Forma parte del proceso que se
entiende como pre-PCR.

NO
NO
O
Extracción o preparación de las muestras: Es el área
SUCIA. Debe contar con una cabina de bioseguridad de
clase II y un espectrofotómetro. Lo ideal es que tenga
PCR
presión negativa (evita que la contaminación se disperse).
Es el otro proceso que forma parte de la pre-PCR

NO
PCR o de amplificación: Sala con los termocicladores y un
Post-PCR
espacio de trabajo para añadir a la mezcla de trabajo la
muestra de ADN. Es una sala SUCIA, por contener muestras procesándose.
Post-PCR o electroforesis: Dispone de los equipos de electroforesis y visualización de geles. Es
una sala SUCIA por tener productos génicos. El visualizador de geles y el microscopio de
fluorescencia se suelen situar en una dependencia que se pueda oscurecer.
PRE-PCR
POST-PCR
Es de vital importancia que las muestras y los reactivos preparados tengan un flujo
unidireccional, desde las áreas limpias hacia las áreas sucias y nunca al revés (Pre-PCR  PCR 
post PCR). Este flujo de trabajo implica que cada área de trabajo sea autónoma, debiendo
disponer de su propio equipo (neveras, cabinas, centrífugas, etc.) pues no es posible el
intercambio entre salas.
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
Tampoco es intercambiable el material de trabajo, como las pipetas, puntas de pipetas, guantes,
rotuladores, gafas de protección batas desechables, etc.
4. CONDICIONES DE TRABAJO Y PREVENCIÓN DE LA CONTAMINACIÓN
El termino contaminación debe ser entendido como la introducción accidental de elementos
extraños que alteran su pureza. El resultado de la contaminación es un resultado erróneo o la
ocasiones, si se contamina el procedimiento no se podrá volver a repetir, por ello, debemos
prestar especial cuidado.
Deben ser tenidos en consideración (como posible contaminación):
1. Ácidos nucleicos extraños a la muestra analizada
2. Enzimas, como las nucleasas, que degradan los ácidos nucleicos
El origen de la contaminación es variable, siendo las fuentes más habituales:

Ambiente. Microorganismos o material genético no amplificado proveniente de aerosoles
debidos a la manipulación de muestras (pipeteo, centrifugas…).

Personal técnico: células epidérmicas, pelos, guantes contaminados…

Superficies de trabajo: Carryover o contaminación por arrastre de ADN del propio
laboratorio.

Contaminación por los reactivos y/o material fungible: La esterilización
no garantiza la presencia de ADN o nucleasas. Para PCR además de estéril
debe estar libre de ADN y libre de DNAasa / RNAasa.
Una vez identificadas las fuentes de contaminación, se debe proceder a anularlas o prevenirlas.
La separación física de las estancias y el flujo unidireccional de las muestras son unas de las
medidas que ya se han estudiado, muy importantes para evitar contaminaciones.
Para evitar la contaminación por nucleasas provenientes de reactivos, se deben usar solo
aquellos certificados como libres de tales enzimas. La presencia de ADN en los mismos no se
certifica y por ello se debe llevar un control de los lotes, fechas de apertura, caducidad, factores
de dilución etc. Además, se deben realizar controles negativos en todas las técnicas (emplear
Se denomina técnica aséptica al conjunto de actividades encaminadas a prevenir la
contaminación por microorganismos, ácidos nucleicos y nucleasas.
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reactivos libres de contaminación y compararlos con los que vamos a emplear).
En el siguiente esquema se detallan las actuaciones más importantes de técnica aséptica para el
laboratorio de biología molecular:

LAVADO DE MANOS

USO DE EQUIPOS DE PROTECCIÓN INDIVIDUAL (EPI):
Guantes,
mascarilla, bata…

DESCONTAMINACIÓN DE SUPERFICIES: Luz ultravioleta, Hipoclorito
sódico, DNA Zap (Esta mezcla es capaz de degradar instantáneamente
altos niveles de ADN y ARN contaminantes de las superficies).

PREVENCION CARRYOVER: Uso de cabinas de flujo laminar clase II.

PREVENCIÓN CONTAMINACIÓN AMBIENTAL: Flujo unidireccional de
muestras.
5. USO EFICIENTE DE LOS RECURSOS
El laboratorio de biología molecular es un laboratorio muy específico con costes muy elevados,
en infraestructuras, equipos y reactivos. Es imprescindible establecer un sistema de gestión de
los recursos y contar con indicadores de calidad que permitan comprobar que las técnicas
efectuadas funcionan correctamente. El uso eficiente de los recursos abarca los siguientes
puntos:

Recursos humanos: Adiestramiento y formación continua para adecuar los conocimientos
del personal del laboratorio a los procedimientos utilizados en biología molecular.

Técnicas: Todos los procedimientos deben estar estandarizados en protocolos normalizados
de trabajo (PNT) desde la recepción de la muestra hasta la emisión de informes. Además,
estos informes deben revisarse de forma continuada.

Infraestructuras y equipos: Incluyendo un plan de mantenimiento (diario, semanal o
mensual, según proceda) que incluya el calibrado y limpieza de equipos

Reactivos: Asegurando la trazabilidad de los mismos desde su recepción hasta su consumo o
eliminación (etiquetado, fecha de caducidad, temperatura de conservación…).
Gestión ambiental: Contando con un código de buenas prácticas medioambientales (GEP:
Good Enviromental Practiques) para minimizar el riesgo de impacto ambiental negativo por
su actividad. Entre ellas cabe citar el uso de lámparas de bajo consumo, aislamiento térmico,
y gestión adecuada de residuos.
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
III. LABORATORIO DE CITOGENÉTICA Y CULTIVOS CELULARES
Se trata de dos laboratorios con objetivos y campos de investigación diferentes. En el laboratorio
de cultivos celulares se logran las condiciones adecuadas para el crecimiento y propagación de
células eucariotas de organismos pluricelulares en medios de cultivo artificiales bajo condiciones
controladas.
Por su parte, en el laboratorio de citogenética, se estudian los cromosomas de las células
eucariotas. La citogenética humana abarca desde el estudio de la morfología de los cromosomas
hasta el enfoque molecular de los mismos. El laboratorio de citogenética puede considerarse
una especialización del laboratorio de cultivos celulares, donde encontramos áreas específicas
para la obtención de células en mitosis y para el estudio de los cromosomas metafásicos.
Los laboratorios de citogenética, cultivos celulares y biología molecular comparten un problema
común: La contaminación por microorganismos. En el área de biología molecular, dicha
contaminación supone una alteración de la pureza por inclusión de ADN exógeno. En los cultivos
celulares, la contaminación por microorganismos supone la muerte del cultivo pues la velocidad
de crecimiento de los organismos procariotas es muy superior a la de las células eucariotas.
Además del problema de contaminación por microorganismos, los laboratorios de cultivos
celulares y citogenética también deben implementar una política de calidad y gestión de
recursos similar a la del laboratorio de biología molecular
De la misma forma que en el laboratorio de Biología molecular, en este laboratorio
encontraremos equipamiento común a otros laboratorios y equipamiento específico; por un
lado, para técnicas de cultivos celulares y por otro, para técnicas de citogenética.
1. EQUIPAMIENTO ESPECÍFICO PARA CULTIVOS CELULARES
 Cabina de flujo laminar: Se trata de una infraestructura donde se realizan todos los procesos
y manipulaciones de cultivos celulares. Preparación de medios, siembras, cambios de medio
etc. Las cabinas de flujo laminar de clase II disponen de un filtro HEPA (High Effciency
99.95%. Esto supone que el aire dentro de dichas cabinas está libre de partículas y también
libre de microorganismos incluidos bacterias, hongos, esporas y levaduras.
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Particle Arresting) que retienen partículas de tamaño superior a 0.2 µm con una eficacia del
El aire es circulado desde la rejilla de trabajo hacia la parte
superior de la cabina por la parte trasera. Una vez filtrado,
vuelve una parte (70%) al interior de la cabina en forma laminar
creando una cortina de aire estable que impide:
1- La entrada de contaminantes del exterior
2- La salida del cultivo al exterior, protegiendo al trabajador
y al medio ambiente.
El 30% del aire que no se recircula al interior de la cabina, es
expulsado al exterior, a través de otro filtro HEPA.
 Incubador de CO2: Esta estufa de incubación dispone de sistema
de control de temperatura, recirculación de aire y control de
CO2. El CO2 se suministra en botellas presurizadas y se inyecta en el interior del incubador,
manteniendo en todo momento una concentración constante de este gas.
El control de la humedad en los incubadores antiguos no existe como tal y para ello se coloca
una bandeja de agua en el nivel más bajo para. Si bien se consigue un nivel de humedad
elevado, que impide la evaporación del medio de cultivo, esta
bandeja se contamina con mucha facilidad y no es la solución ideal.
Los incubadores actuales incluyen un sistema de inyección de agua
estéril. La recirculación de aire garantiza que la temperatura sea
homogénea en el interior del incubador.
**Incubador Roller: Dispositivo que permite que las botellas de cultivo giren lentamente y
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las células crecen en toda la superficie.
Unidad 1 Biología Molecular y Citogenética
 Microscopio invertido: La observación de las células se
realiza por técnicas de microscopía convencional. Sin
embargo, el tamaño de los frascos de cultivo impide el uso
del microscopio habitual. El microscopio invertido se
caracteriza por tener la fuente de luz por encima de la
platina y el revolver de objetivos por debajo.
Como
resultado, el espacio de trabajo encima de la platina es
mucho mayor. Para mejorar la visualización de las células
en vivo, se utiliza un sistema de contraste de fases, pues de
manera natural, carecen de color.
 Criogenia: Este equipo permite conservar a largo plazo y de forma viable líneas celulares. El
equipo de criogenia está constituido por un contenedor de nitrógeno líquido. De manera
centralizada, existe un tanque nodriza para rellenar los contenedores.
2. EQUIPAMIENTO ESPECÍFICO PARA CITOGENÉTICA
Como ya hemos visto, el laboratorio de citogenética es una especialización del laboratorio de
cultivos celulares. El equipo específico de citogenética se centra en el estudio microscópico y
análisis de imagen de las células en metafase. Para ello, es imprescindible contar con un equipo
de análisis de imagen microscópica. Este equipo consta básicamente de:
-
Microscopio óptico convencional: de luz transmitida.
-
Cámara digital acoplada al microscopio.
-
Software para análisis de imagen específico para el reconocimiento del patrón de
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bandas y el emparejamiento de cromosomas.
Unidad 1 Biología Molecular y Citogenética
Además, es habitual disponer de otro microscopio convencional de fluorescencia para estudios
de viabilidad, morfología celular e hibridación in situ fluorescente (FISH).
El equipo común del laboratorio de citogenética, es el habitual de biología celular y de muchos
otros laboratorios biomédicos. Incluye equipos de esterilización, equipo de agua ultrapura,
Congeladores de -20ºC y -80ºC, placas calefactoras, pipeteadores automáticos, centrífugas,
pHmetros, etc.
3. ESTRUCTURA DEL LABORATORIO DE CITOGENÉTICA
La estructura del laboratorio está definida para minimizar el riesgo de contaminación. Al igual
que en el laboratorio de biología molecular, se aplica la separación física de áreas "limpias" y
"sucias".
El laboratorio de citogenética debe contar como mínimo con tres salas:

Sala de cultivos: Área LIMPIA del laboratorio donde se realizan procedimientos relacionados con
el cultivo celular. Debe tener un sistema que suministre aire filtrado y dispondrá de los
incubadores, campanas de flujo laminar y el microscopio invertido.

Laboratorio convencional: Área SUCIA. En ella se realizan todos los procedimientos que no están
relacionados con el cultivo, tales como cariotipo, extensiones, tinciones etc. Dispondrá del resto
del equipamiento salvo el equipo de criogenia. El microscopio de fluorescencia se ubica en un
compartimiento que se pueda oscurecer.

Sala de frio: Donde se localizan los congeladores y el equipo de criogenia. Idealmente, esta sala
debería ser una cámara frigorífica para minimizar el consumo de nitrógeno.
4. TÉCNICA ASÉPTICA
Las áreas estériles son zonas libres de agentes patógenos (o se encuentran en cantidades muy
reducidas). Las normas para mantener estas condiciones son de obligado cumplimiento e
incumben al personal, a las instalaciones y a los equipos.
Las técnicas asépticas, realizadas en el laboratorio de citogenética, están dirigidas a evitar la
contaminación del cultivo por microorganismos:
la campana de flujo laminar tiene un protocolo bien definido. Entre los puntos más importantes
cabe citar:
Unidad 1 Biología Molecular y Citogenética
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a. Todas las manipulaciones se deben realizar dentro de la campana de flujo laminar. El trabajo en
1. Lavado frecuente de manos
2. Uso de guantes y bata desechables
3. Uso de reactivos estériles, no intercambiables con otras salas
4. No mecheros en la cabina. Generan turbulencias que alteran el flujo laminar
5. Colocar dentro de la cabina solo el material que se va a utilizar
6. No abrir el embalaje estéril hasta su momento de uso
7. Retirar el material fungible utilizado de la cabina
8. Limpieza de las cabinas con desinfectante al final de cada sesión de trabajo
9. Luz germicida UV después de la limpieza 30 min
10. Mantenimiento programado de la cabina y comprobación de los filtros HEPA
11. En la sala de cultivos no se permiten visitas
b. Restringir el acceso a todo el personal que no sea imprescindible
c. Todo el personal debe recibir una formación específica, previa al inicio de trabajo en su
sección.
d. Seguir un protocolo estricto de manipulación de muestras y cultivos celulares.
e. Es necesario reglamentar el equipo de trabajo (EPI) y seguir unas pautas establecidas de
cambios y lavados.
f.
Los equipos de aire acondicionado deben estar equipados con filtros especiales a fin de evitar
propagación de agentes patógenos.
g. Es necesario desinfectar diariamente poyatas y suelos.
IV. SEGURIDAD EN EL LABORATORIO
El diseño del laboratorio responde a exigencias de prevención de la contaminación de las
muestras. De manera simultánea, deben satisfacerse criterios de seguridad. La seguridad en el
laboratorio hace referencia a la prevención de la exposición del personal a agentes nocivos y
también impedir la liberación de estos al exterior.
Según la naturaleza de los agentes, podemos hablar de exposición a agentes químicos y
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exposición a agentes biológicos.
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1. SEGURIDAD QUÍMICA
El RD 363/1995 establece el reglamento sobre la clasificación, envasado y etiquetado de
sustancias peligrosas. Las buenas prácticas de laboratorio (BPL) referidas a seguridad química
deben incluir medidas para prevenir la exposición (cutánea, inhalación o ingestión)
almacenamiento seguro y gestión de los residuos que generen.
La ficha de seguridad (FDS) se suministra por el distribuidor del producto y se guarda en el
laboratorio para su consulta por todo el personal. Aporta información relativa a la composición,
manipulación, peligro, vía de exposición, efectos tóxicos, almacenamiento, eliminación y
primeros auxilios.
Como ejemplos de sustancias peligrosas habituales en los laboratorios de biología molecular y

Inflamables: Alcoholes (isopropanol, etanol, metanol)

Tóxicos: acrilamida, azida, DAB (diaminobencidina), tetrametil-urea

Carcinógenos: Acrilamida, DAB, formaldehido

Múgatenos: Acrilamida, Bromuro de etidio
Incompatibilidades para el almacenamiento de productos químicos
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citogenética se pueden mencionar los siguientes:
2. BIOSEGURIDAD
Conjunto de normas aplicables a la prevención de la exposición accidental del personal a gentes
biológicos potencialmente peligrosos (patógenos y toxinas) o su liberación al medio ambiente.
Cualquier muestra biológica debe considerarse potencialmente peligrosa y deben adoptarse
medidas mínimas de protección en referencia al uso de equipos de protección individual.
El principal problema de bioseguridad en biología molecular lo plantean los organismos
modificados genéticamente (GMO). El RD 178/2004 establece el marco jurídico para la
utilización confinada, liberación y comercialización de organismos modificados genéticamente.
En virtud del riesgo para la salud humana y el medio ambiente, se clasifican las actividades de
laboratorio en 4 tipos:

tipo 1: Riesgo nulo

tipo 2: Riesgo bajo

tipo 3: Riesgo moderado

tipo4: Riesgo alto
El propio Real decreto en su anexo I establece los criterios para la evaluación del riesgo y los
procedimientos de protección y confinamiento mínimos, según las actividades desarrolladas en
el laboratorio.
** CURIOSIDAD: El virus de la hepatitis B es la infección más frecuente entre el personal de
laboratorio. Por este motivo, todos los empleados deberán vacunarse, excepto si ya lo han hecho
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con anterioridad.
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