Sobre el CRISPR-CAS9 y algunas Aplicaciones como Terapia Génica Grupo: J2 Docente: Dra. Carmona Miranda Claudia Quispe Condori Isabel Grissel Brith Sayritupa Mejía Karol Andrea Introducción El campo de la edición genética está trabajando en modificar la función de estos, manipulando la secuencia de ácido desoxirribonucleico (AND) de un organismo, como lo puede ser el ser humano. El Sistema CRISPR-Cas9 es una herramienta de edición genómica de alta relevancia en el aspecto medico desde hace unas décadas atrás, por tanto, mediante la siguiente revisión bibliográfico compilamos fuentes que abordan los avances en la aplicación del Sistema CRISPR/Cas9 como terapia génica dirigida a algunas enfermedades frente a las cuales se ha comprobado con mayor interés los efectos de este sistema. El artículo se centra en resaltar la tecnología CRISPR-CAS9 como el método elegido para la edición génica por su mecanismo, rapidez y eficacia, además de la utilización del CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas a intervalos regulares); a lo largo del artículo se mencionan trabajos relacionados con el Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, la Fibrosis Quística y el Sarcoma de Kaposi en inmunodeficiencias, donde todas estas investigaciones tienen el particular de utilizar la herramienta CRISPR-CAS9. Desarrollo Mecanismo del CRISPR-CAS y su clasificación El sistema CRISPR-CAS es una herramienta de edición génética, también llamada “tijera genética o molecular”, por su capacidad de suprimir, corregir un fragmento del genoma específico (“target”) de cualquier célula, incluyendo las células humanas. Por esta capacidad, está posicionado como el mayor avance de la biología molecular, luego de que se desarrolle el método del PCR (Polymerase Chain Reaction), el significado de las siglas CRISPR-Cas9 provienen de Clustered Regularly Interespaced Short Palindromic Repeats, lo que en español quiere decir “Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente interespaciadas”, siendo secuencias de DNA cortas desde 23 hasta 55 bp de largo .Además de su capacidad de editar el ADN (adicionando o restando genoma), puede hacerlo de forma controlada y precisa. Los sistemas CRISPR/CAS se encuentran en microorganismos como bacterias y arqueas, siendo que estas han desarrollado una especie de sistema inmune adaptativo cuando un fago (que puede ser por ejemplo, un virus) las intenta invadir, este sistema actúa incorporando un fragmento genético (ADN) de este microorganismo cuando sobrevive a la invasión, para luego reconocerlo, si es que vuelve a hacer contacto con el mismo, esto se descubrió en el año 1987 cuando en un estudio se publicó un estudio que nos explicaba este insólito fenómeno en el genoma bacteriano de la Escherichia Coli (1). La inmunidad del CRISPR en bacterias y arqueas se desarrolla en varias etapas mecanismos. Mecanismo básico de acción 1. Fase de adaptación, donde las enzimas asociadas a CRISPR van a adquirir los protospacer del ADN exógeno y lo integran en el locus CRISPR dentro del código genético de la bacteria, produciendo la síntesis de una nueva replicación. Durante esta fase se genera la memoria genética (también llamado sistema inmune adaptativo) para poder realizar las siguientes fases que le siguen. 2. Fase de expresión, donde se transcribe la secuencia de repeticiones-spacer (llamadas locus CRISPR), y después las proteínas Cas lo cortan en pequeños fragmentos (crRNA), cada tipo de CRISPR puede actuar de manera distinta para replicar estos fragmentos. 3. Fase de interferencia, el crRNA guía a la maquinaria hacia el ADN complementario que está flanqueado por la secuencia PAM para que haga el corte de ADN exógeno en un área determinada, cada tipo de CRISPR hace la escisión con un complejo diferente, lo relevante de esta última dase es que impide la infección Dentro de su localización, se incluyen 2 clases de sistemas CRISPR con 6 tipos de sistemas y hasta 33 subtipos, siendo que la proteína CAS9 pertenece al tipo 2 y a la clase 2 de las proteínas CAS implicadas en cada etapa de la inmunidad CRISPR. Existe una distinción importante dentro de la clasificación (2) , y es que los sistemas CRISPR -CAS de clase 1 son los que desarrollan las arqueas y bacterias que utilizan un mayor número de genes, por el contrario, los sistemas de CRISPR-CAS de 2 clase son de tipo más sencillo por su menor número genes, siendo idóneos para ser herramientas de edición genómica al momento de transferir un sistema CRISPR-CAS bacteriano a otras células. Componentes y estructura básica de los sistemas CRISPR-CAS9 Poseen dos componentes: el componente genómico y otro proteómico. - ARN guía o gRNA - Endonucleasa CAS9 La CAS9 va utilizar un ARN de guía para realizar el clivaje de ADN, en la edición del ADN se va usar un ARN guía no codificante de secuencia complementaria a la secuencia “target” (la que se quiere editar). Además el gRNA tiene dos componentes moleculares que serán combinados en una misma molécula de transcripto: - RNA específico para la secuencia “target” (crRNA) - RNA trans-activador del crRNA (trancrRNA) El gRNA le trazará el camino a la proteína CAS9 para un locus específico mediante el apareamiento de bases entre la secuencia del crRNA y la secuencia del “target” (20 pb de largo) por el extremo 5´del gRNA. Por otro lado, la unión de la secuencia target, la CAS9 producirá un corte de doble cadena específica (DSB). Luego del clivaje del DNA, este corte será reparado por la unión de extremos no homóloga (NHEJ) o por los mecanismo de reparación por homología (HDR) (3). La endonucleasa CAS9 es una proteína de tipo recombinante de la proteína CAS9 de Streptococcus Pyogenes purificada de la E. Coli que tiene la función de editar el genoma con la tecnología CRISPR , por lo que forma un complejo muy estable de ribonucleoproteína (RNP) con el componente guía de ARN (gRNA) ; a la vez la incorporación de una señar de localización nuclear (NLS) ayudará a la entrada del núcleo, aumentado la tasa de clivaje de ADN genómico. Los CAS cumplen muchas funciones: son responsables de incorporar nuevas secuencias espaciadores, permiten la exploración de secuencias diana, reconocen los ARN transcritos de CRISPR a las mismas, su apareamiento y separación. Dentro de los tipos de edición que pueden hacerse se encuentran: - Knock out de un gen de interés, que se apoya en el sistema de reparación NHEJ donde se unen ambos extremos de las cadenas, y como es posible que hayan errores, se puede adicionar o eliminar pocas pares de bases, teniendo un nuevo marco de lectura o en una terminación prematura acortando la proteína. - Knock in dentro del ADN (4) refiere que se le une complejo gRNA/CAS9 una secuencia con homologías y el sistema de Recombinación Homóloga lo repara usándolo como molde. Aparte, este puede tener un promotor, un gen específico con un reportero. Investigaciones actuales que utilizan el sistema CRISPR-Cas9 CRISPR-CAS9 frente al Parkinson Encontramos que el gen SNCA es un elemento importante en la fisiopatología de la EP, porque el producto codificado por este es el elemento principal de los cuerpos de Lewy, no solo en la EP, también en otras alfa sinucleopatías. La mutación A53T del gen SNCA conlleva a un inicio temprano de la EP al acelerar el proceso de formación de fibrillas de alfa sinucleína. Por lo que, en el 2020, Yoon et al. (5) aplicaron el sistema CRISPR-CAS9 para la eliminación de la mutación de este gen de forma in vitro e in vivo, donde en el primer ensayo aplicaron este sistema en un cultivo celular HEK293T portadoras de esta mutación, reduciendo su expresión sin cambiar el alelo de tipo salvaje, por lo que, el siguiente paso era probarlo in vivo en un modelo de rata portador de la mutación A53T, se mostró que la delección de esta mutación previno de forma sustancial la sobreexpresión de alfa sinucleína, el proceso de degeneración dopiaminérgica y los síntomas motores que se relacionan. En el 2019, en Corea (6) se utilizó diana terapeútica llamada RAGE, donde se generaron células madre mesenquimatosas derivadas de la sangre del cordón umbilical (UCB-MSC) que secretan sRAGE (receptor soluble) que evita la unión de este mismo receptor con su ligando en la célula, la producción de este tipo celular se logró por el método del CRISPR-Cas9. Donde las células UCB-MSC fueron trasplantadas al Corpus Striatum en un modelo animal (ratones con Parkinson inducido por rotenona). Los resultados revelaron la muerte neuronal y el movimiento mejoró, por lo que este enfoque de tratamiento con base en células UCB-MSC puede ser una opción para tratar el parkinson. Aplicación del CRISPR CAS-9 en la enfermedad de Alzheimer Dentro de las formas familiares del Alzheimer están las mutaciones del gen APP, en el 2021 se reportó una corrección del V717I que es una mutación importante de APP que apoya a la acumulación de péptido amiloide, en un modelo de células madre pluripotentes que fueron inducidas generado antes por Karth et al. , se definió que el objetivo era generar un control isogénico negativo para esta mutación, donde se demostró de nuevo que el sistema tiene la capacidad de corregir (in vitro) mutaciones de heredabilidad autosómica dominante mediante el principio de recombinación homóloga. Modificación genética de la Fibrosis Quística por CRISPR-CAS9 Sabemos que la fibrosis quística es un trastorno que es causada por defectos en la proteína de la conductancia transmembrana (CFTR), siendo de base genética, en la que se forma mucosa espesa y pegajosa en los pulmones, lo que lleva a la dificultad de respiración y una insuficiencia respiratoria prematura, siendo igual de grave que llegue a diseminarse a otros órganos. En adición es considerada una patología autosómica recesiva causada por el CTFR, en base a esto se ha aplicado un método de corrección de su mutación en células madre pluripotenciales inducidas (iPSCs) derivadas de fibroblastos de pacientes con FQ. Luego, la corrección se realizó por el sistema CRISPR, para después ser diferenciadas en células epiteliales respiratorias. Este procedimiento se realizó con éxito observado en un aumento en las corrientes de cloruro. En segundo lugar, se vio que en las células corregidas había una modificación post tradicional que no había cuando el gen estaba mutado, esta edición permite que el CFTR se adhiera a la membrana plasmática, puesto que, en ausencia de esta, la proteína permanece en el citosol, donde será degradada (7). Reducción de la latencia del Herpesvirus relacionado al Sarcoma de Kaposi Sabemos que el Herpes virus humano tipo 8 está relacionado al desarrollo del Sarcoma de Kaposi (KS), denominado como cáncer que genera tejido anormal en forma de parches que crecen bajo la piel de zonas como la nariz, la boca, garganta ,etc. En adición, es un factor importante que en personas sanas no suele causar síntomas por que el sistema inmunitario logra controlarlo, sin embargo, en personas inmunodeficientes existen complicaciones. Este cáncer defina el diagnóstico de SIDA en personas infectadas por el VIH-1 o en pacientes inmunosuprimidos con trasplantes. Y es que en la actualidad no hay tratamiento efectivo contra el KS, por lo cual, el sistema CRISPR-Cas9 se está usando como parte del estudio de un antígeno nuclear asociado a la latencia (LANA), con la función de mantenimiento, replicación y segregación de los episomas (moléculas de ADN que puede replicarse de forma autónome en el citosol de la célula huésped o cuando está integrada físicamente al cromosoma de esta) de KSHV durante la mitosis , lo que hace de LANA un objetivo específico para le modificación con CRISPR-CAS9. Un estudio en Nebraska-USA demostró la viabilidad del CRISPR-CAS9 dirigido a LANA de KHSV mediante un sistema de administración de adenovirus para interrumpir la latencia de KSHV en líneas celulares epiteliales y endoteliales afectadas. Esto nos mostró la importancia de investigar la capacidad de infección de los Adenovirus y su asociación con el CRISPR, siendo así por ejemplo, que el efecto es más bajo cuando se trabaja con células B del sistema inmune por la baja eficacia de infección (8). Conclusión Mediante la revisión bibliográfica realizada llegamos a la conclusión de que el desarrollo sistema CRISPR- CAS9 se ha expandido a un ritmo vertiginoso, desde sus primeros estudios en 1987, que revelaron el curioso fenómeno de adaptación inmunitaria de cierta bacteria, hasta los anteriores años en estudios que pretenden incluir al este sistema como parte de la aplicación génica . porque es barata, rápida y fácil de realizar, y ahora se utiliza en casi todos los laboratorios de biología molecular en el mundo en un sin fín de organismos para la edición exacta de genomas; cabe recalcar que su aplicación a estudios de genomas, todavía se encuentra en desarrollo, esto nos permitirá una amplia pesquisa de blancos de fenotipos y ayudara a generar modelos experimentales modificados genéticamente para la comprensión y solución de enfermedades en seres humanos Referencias Bibliográficas 1. Pallitto Nathuel; Folguera Guillermo. Una alarma nada escepcional: CRISPR -CAS9 y la edición de la línea germinal en seres humanos. Universidad de Buenos Aires.. 2. Corzán López Miguel. Aplicaciones de Herramientas CRISPR en Covid-19. Trabajo de Fin de Grado. Universidad de Zaragoza , Facultad de Veterinaria. 3. Víctor RB. Los sistemas CRISPR- CAS de defensa microbiana. Publicaciones Didácticas. 2018;(96). 4. David CL. CRISPR-CAS9: Técnicas y aplicaciones. Universitat Oberta de Catalunya. 2017. 5. Yoon. et al. CRISPR/CAS9 mediated gene editing induces neurological recovery in an A53T-SNCA overexpression rat model of Parkinson´s disease. 2020. 6. B. LJ, Bayarsaikhan D, R. A, Park H, Lim Bea. CRISPR-CAS9 Edited sRAGE-MSCs Protect Neuronal Death in Parkinson´s Disease Model. Int J Stem Cells. 2019 ; 12(1). 7. Castillo Kelly, Chacón Paula, Chacón Rosibel, Martinez Raiza, et al. CRISPR CAS9 en la modificación genética de Fibrosis Quística. Revista Ciencia y Salud: Integrando conocimientos.. 8. Oliva Martinez Brenda. CRISPR, una herramienta para editar genomas : Gac Med Bol ; 2020.
