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Clase 8 de Proteínas

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PROTEÍNAS 8
Presentación elaborada por el Prof. José Bubis
[email protected]
Trimestre Sep-dic 2021
1
Métodos para determinar la estructura secundaria
de proteínas
• Dicroísmo circular
α – hélices α
β – hojas β
R – random coil
T - vueltas β
Mediciones usando péptidos
sintéticos con estructuras
conocidas han sido usados para
definir los espectros CD de hélices
α, hebras β y la conformación
de enrollamiento al azar o
random coil.
Hélices α → bandas
negativas a ~ 208 y ~ 222 nm,
y una banda positiva a ~ 192
nm.
-
Hojas β → una banda
positiva (~ 196 nm) seguida
de una banda negativa (~ 218
nm), aunque las λ de las
bandas son menos regulares
(la forma se mantiene).
Random coils → banda
negativa a ~ 199 nm y banda
positiva a ~ 212.
Se puede hacer un estimado del contenido de hélices α y estructuras β de una
proteína a partir de su espectro CD y estos estimados por lo general están de
acuerdo con los valores obtenidos de los estudios cristalográficos de difracción
de rayos X.
Los espectros CD pueden ser complejos → hay que “desenmarañarlos”
Existen programas Bioinformáticos que nos ayudan a desenmarañar los
espectros CD mediante relaciones matemáticas y rinden estimados de estas
estructuras 2rias en %.
Aplicación: CD es muy útil para determinar cambios conformacionales en
proteínas.
Métodos para determinar estructura secundaria
de proteínas
• Espectroscopía de Absorción Infrarroja
de Transformada de Fourier (FTIR)
En la espectroscopía FTIR se determina cuáles longitudes de onda en la
region infrarroja del espectro son absorbidas por una muestra, al incidir
radiación infrarroja sobre dicha muestra.
Cada tipo de compuesto tiene una serie característica de bandas de
absorción en su espectro infrarrojo.
Métodos para determinar estructura secundaria
de proteínas
• Espectroscopía de Absorción Infrarroja
de Transformada de Fourier (FTIR)
Este tipo de espectroscopia se fundamenta en la absorción de la radiación
IR por las moléculas en vibración. Una molécula absorberá la energía de un
haz de luz infrarroja cuando dicha energía incidente sea igual a la necesaria
para que se de una transición vibracional de la molécula.
Por lo general tiene una aplicación principalmente cualitativa, o sea, para
detectar las moléculas presentes en el material que se está analizando.
→ también se utiliza para determinar la estructura 2ria de las
proteínas y al igual que el CD es muy útil para determinar cambios
conformacionales en proteínas.
Las bandas características que se
consiguen en los espectros
infrarrojos de proteínas se producen
a partir de los enlaces amida que
unen a los aminoácidos.
Las bandas características que se encuentran en los espectros infrarrojos de proteínas
incluyen las bandas Amida I y Amida II, las cuales se producen de los enlaces amida que
unen a los aminoácidos.
La absorción asociada con la Amida I se produce principalmente por las vibraciones de
estiramiento del enlace C=O de la amida. La absorción asociada con la Amida II se
produce principalmente por las vibraciones causadas por las dobleces del enlace N-H.
from L. K. Tamm and S. A. Tatulian, Quarterly Reviews of Biophysics 30 (1997) 365-429
→
from L. K. Tamm and S. A. Tatulian, Quarterly Reviews of Biophysics 30 (1997) 365-429
Las bandas características que se encuentran en los espectros infrarrojos de proteínas
incluyen las bandas Amida I y Amida II, las cuales se producen de los enlaces amida que
unen a los aminoácidos.
La absorción asociada con la Amida I se produce principalmente por las vibraciones de
estiramiento del enlace C=O de la amida. La absorción asociada con la Amida II se
produce principalmente por las vibraciones causadas por las dobleces del enlace N-H.
Debido a que tanto los enlaces C=O como los N—H están involucrados en la
formación de los enlaces de hidrógeno que ocurren entre los diferentes
elementos descritos para la estructura secundaria, las bandas Amida I y Amida II
son sensibles al contenido de estructura secundaria de las proteínas.
Estudios con proteínas de estructura tridimensional conocida han sido usados
para correlacionar sistemáticamente la forma de la banda Amida I con el
contenido de estructura secundaria.
The vibrational frequency of the C=O stretching mode of the amide
groups depends on the protein secondary structure
α-helix
1648-1660 cm-1
β-turn
β-sheet
1660-1685 cm-1
1625-1640 cm-1
The Amide I band due mainly to the C=O stretching mode
can be used to differentiate among different secondary structures
from L. K. Tamm and S. A. Tatulian, Quarterly Reviews of Biophysics 30 (1997) 365-429
Ejemplo:
Amide I and Amide II bands of Candida rugosa lipase 1
.12
.1
Absorbance
.08
.06
.04
Amide II
.02
0
1900
Amide I
1800
1700
1600
1500
Wavenumber (cm-1)
FT-IR absorption and its second derivative spectra of CRL1 (20 mg/ml) at 20°C, at 2 cm-1 spectral
resolution. The derivative spectrum at 4 cm-1 is also reported (dotted line) for comparison.
Thermal unfolding of Candida rugosa lipase 1
Second Derivative
0
Tyr
Amide II
20°C
87°C
aggregates
Amide I
1700
1650
1600
Wavenumber
1550
1500
(cm-1)
Second derivative spectra of CRL1 as function of temperature in the Amide I and Amide II region from
20 to 87 °C. The arrows point to the direction of the increasing temperature.
PREDICCIÓN DE
ESTRUCTURA SECUNDARIA
Inicio: Tenemos que conocer la secuencia de AAs de la proteína
Hay métodos estadísticos empíricos que usan parámetros
derivados de estructuras 3D conocidas almacenadas en bases de
datos computacionales, como el método de Chou y Fasman.
En este método, se calcula la propensión (probabilidad) de que un
AA adopte conformaciones de hélice α (< Pα >), hoja β (< Pβ >) o
vuelta (vuelta β) (< Pt >) para los 20 AAs usando las siguientes
ecuaciones:
< Pα > = Xαi/<Xα >, < Pβ > = Xβi/<Xβ > y <Pt> = Xti/<Xt>
donde Xαi, Xβi y Xti representan los números obtenidos para un
tipo i de residuo que ocurre en una estructura de hélice α, hoja β o
vuelta β, respectivamente, entre el número total de AA del mismo
tipo i en la base de datos analizada (frecuencia).
< Xα >, < Xβ >, y < Xt > son los valores promedio de Xαi, Xβi y Xti
para todos los 20 AAs, respectivamente (al promediar las
frecuencias de los 20AAs).
P=1
P>1
P<1
Reglas para predecir la estructura 2ria:
1. Asigne símbolos (H, h, I, i, B, b para los residuos que son formadores fuertes,
formadores, formadores débiles, formadores indiferentes, rompedores o no
formadores, y rompedores fuertes, respectivamente)
2. Busque sitios de nucleación para hélices α y hojas β :
a. Para hélices α: Un péptido con 6 residuos conteniendo al menos 4
formadores de hélices (Hα o hα), donde Iα cuenta como ½ hα, y no más de un
rompedor de hélice (Bα o bα).
b. Para hojas β: Un péptido con 5 residuos conteniendo al menos 3 formadores
de hojas β (Hβ o hβ) y no más de un rompedor de hojas (Bβ o bβ).
3. Cuando las asignaciones de hélices α y hojas β son similares: calcule el
promedio de < Pα > y < Pβ > para el grupo de residuos. El sitio de nucleación es
asignado como hélice α u hoja β dependiendo del valor que de la probabilidad
más alta.
4. Propagación: Extienda la hélice α y la hebra β desde el sitio de nucleación en
ambas direcciones hasta que la probabilidad promedio para el tetrapéptido final
caiga por debajo de 1. Los residuos que están al final y que corresponden a
rompedores no se deben incluir en la estructura 2ria.
5. Predicción de vueltas (vueltas β): Las frecuencias de cada tipo de AA
presente en la vuelta β que consta de 4 residuos se calcula a partir de la
base de datos (fi, fi+1, fi+2 and fi+3). Para cada péptido que no se le pueda
asignar una estructura de hélice α u hoja β, se calcula la probabilidad de que
sea una vuelta como el producto de 4 residuos contiguous (el cálculo es más
complejo).
Ejemplo:
Predicciones al azar ~ 30%
El éxito de estas predicciones está
entre ~ 50% a ~ 80%
Las vueltas se caracterizan por ocurrir en regiones de la cadena polipeptídica
donde existe un mínimo de hidrofobicidad.
Método de Rose → las vueltas ocurren en posiciones de la cadena donde la
hidropatía es mínima. Así se puede deducir por inspección la posición de la
mayoría de las vueltas.
Índice de hidropatía
• Una escala que expresa las tendencias relativas de
hidrofobicidad e hidrofilicidad de un grupo químico.
• Aminoácidos altamente cargados
(+ y -mente) presentan altos valores negativos de
índice de hidropatía.
• Aminoácidos hidrofóbicos tienen altos valores
positivos de índice de hidropatía
Las vueltas se caracterizan por ocurrir en regiones de la cadena polipeptídica
donde existe un mínimo de hidrofobicidad.
Método de Rose → las vueltas ocurren en posiciones de la cadena donde la
hidropatía es mínima. Así se puede deducir por inspección la posición de la
mayoría de las vueltas.
Proteinas en membranas biologicas
Glicoforina
La suma de los índices de hidropatía de 9 residuos consecutivos
Si el índice de hidropatía da + es una región hidrofóbica
Si el índice de hidropatía da - es una región hidrofílica
Bacteriorodopsina
MÉTODOS PARA DETERMINAR LA
ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE UNA
PROTEÍNA
• DIFRACCIÓN DE RAYOS – X
• RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
CRISTALOGRAFIA - DIFRACCIÓN DE RAYOS X
Principios basicos:
-Los electrones dispersan a los rayos
X. La amplitud de la onda dispersada
por un atomo es proporcional a su
numero de electrones
-Las ondas dispersadas no son
independientes sino que se
recombinan. Se refuerzan si estan en
fase o se cancelan si estan fuera de
fase
-La manera como las ondas
dispersadas se recombinan depende
solo del arreglo atomico
Estos son los datos experimentales. La intensidad de cada mancha se mide y la imagen
de la proteina se reconstruye a partir de las intensidades observadas.
Hay que aplicar una relacion matematica llamada Transformada de Fourier
Uno de los grandes
problemas es cristalizar la
proteina, es decir, lograr
que las proteinas se
dispongan de forma
ordenada en el espacio
formando un cristal
Procedimientos empiricos
Sustitución isomórfica o reemplazo isomórfico
PLEGAMIENTO
Plegamiento
• Conduce a las proteínas a adoptar su conformación nativa, la
cual es estabilizada por interacciones no covalentes.
• En el caso de proteinas citosólicas o en ambientes hidrofilicos, su
interior está constituído por un núcleo de aa’s hidrofóbicos/no
polares estabilizados por interacciones hidrofóbicas. En su
exterior encontraremos numerosos enlaces H, interacciones
iónicas e interacciones dipolo-dipolo.
• Para las proteínas de membrana ocurre lo contrario.
48
PLEGAMIENTO
La desnaturalización consiste en la pérdida
de estructura nativa de la proteína y la
formación de un enrrollamiento al azar u
ovillo aleatorio (random coil).
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Enrollamiento al azar (ovillo aleatorio) o random coil:
Conformación parecida a un polímero lineal, en la cual hay total libertad de rotación
en los enlaces que unen los AAs de una proteína → no existen interacciones de tipo
no covalente entre los residuos ni ningún tipo de interacción entre los grupos R.
Enrollamiento al azar (ovillo aleatorio) o random coil:
Conformación parecida a un polímero lineal, en la cual hay total libertad de rotación
en los enlaces que unen los AAs de una proteína → no existen interacciones de tipo
no covalente entre los residuos ni ningún tipo de interacción entre los grupos R.
Estado desplegado o
desnaturalizado
Agentes desnaturalizantes
Curva sigmoidea
Desnaturalización de proteínas
Proceso Cooperativo
Ambas gráficas demuestran cooperatividad en el proceso de plegamiento.
*Apomioglobina= mioglobina sin el grupo hemo
GdnHCl= hidrocloruro de guanidina (agente desnaturalizante)
55
PLEGAMIENTO
La estructura tridimensional de una
proteína particular depende en gran parte
de su secuencia de aminoácidos.
60
Experimento de Anfinsen
Renaturalización de la ribonucleasa
Urea es un agente
desnaturalizante, al igual
que GdnHCl.
El mercaptoetanol
reduce los enlaces disulfuros
Evidenció que la secuencia
aminoacídica de la
ribonucleasa
contiene la información
requerida para adoptar su
conformación nativa y
plegarse.
La diálisis permite
eliminar la urea y el
mercaptoetanol y
renaturalizar la ribonucleasa.
61
Conclusion:
La informacion necesaria para que una
proteina se pliegue y obtenga su estructura
tridimensional esta contenida en su
estructura primaria.
Uno de los primeros pasos en el estudio del plegamiento de proteínas, se debe a C. Levinthal, quien en
1968 demostró que el problema de hallar la conformación terciaria de una proteína no es un proceso al
azar. Para llegar a esta conclusión, observó que si una proteína estuviese integrada por N aminoácidos, y si
cada uno de ellos pudiese adquirir, en promedio, un número ν de conformaciones espaciales, entonces el
número C de posibles conformaciones tridimensionales está dado por
C = νN
Si consideramos el caso de una proteína de dimensiones pequeñas, digamos, con N = 100, y suponiendo
para el parámetro ν su valor mínimo ν = 2, tendríamos que el número de conformaciones posibles C es,
C = 2100,
el cual es número astronómicamente grande. El tiempo necesario para que una proteína con estas
características explorase al azar todas las posibles conformaciones tridimensionales hasta encontrar la
estructura más estable correspondería a un tiempo mayor que la edad del Universo.
Las proteínas más pequeñas (N ~ 64 aminoácidos), alcanzan su estructura terciaria en tiempos del orden de
milisegundos (t ~ 10–3 seg), en tanto que proteínas más complejas se pliegan en tiempos no mayores a
algunas decenas de segundos (t ~ 101 seg)
La Paradoja de Levinthal planteó la necesidad
de que los mecanismos de plegamiento deben
poseer elementos de presión evolutiva que
dirigen el proceso en una dirección particular y
evitan una búsqueda aleatoria dentro de todo el
espacio de posibles conformaciones.
INTERMEDIARIOS
Simulación de ruta de plegamiento-vilina
Contiene 36 residuos aa’s
Simulación en un lapso teórico de 1µs
1. se forman estructuras secundarias
2. se forman interacciones de largo alcance que
dan lugar a estructuras super-secundarias
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PREDICCION DE
ESTRUCTURA SECUNDARIA
Termodinámica del plegamiento de proteínas: como un
embudo de energía libre
Alto número de conformaciones
Entropía conformacional alta
Aumenta Entropía
Decrece la energía libre
Intermediarios
Semi-estables
*
*Glóbulo fundido: alto
contenido de estructuras
secundarias,
pero las cadenas de aa’s no
han alcanzado su
conformacion nativa
CONFORMACION NATIVA
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Formacion de interacciones especificas
BPTI
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