Tesis EVALUACION DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS ANTI PROTEINAS PEPTIDOS CARBAMILADOS 25-06-2019 (2)
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EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS ANTI PROTEÍNAS/PÉPTIDOS CARBAMILADOS Y SU ASOCIACIÓN CON VARIABLES DE ACTIVIDAD REUMATOLÓGICA Y PERIODONTAL EN PACIENTES CON AR TEMPRANA Y FAMILIARES EN PRIMER GRADO DE CONSANGUINIDAD Leidy Lorena Chila Moreno Trabajo de grado presentado como requisito para optar al título de Maestría en Ciencias Biológicas con énfasis en Inmunología Pontificia Universidad Javeriana Facultad de Ciencias Maestría en Ciencias Biológicas Bogotá. D.C Noviembre 2018 1 EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS ANTI PROTEÍNAS/PÉPTIDOS CARBAMILADOS Y SU ASOCIACIÓN CON VARIABLES DE ACTIVIDAD REUMATOLÓGICA Y PERIODONTAL EN PACIENTES CON AR TEMPRANA Y FAMILIARES EN PRIMER GRADO DE CONSANGUINIDAD Leidy Lorena Chila Moreno Director Dra. María Consuelo Romero Sánchez PhD. Profesor Titular Coordinadora área Inmunogenética Unidad de Investigación Básica Oral- UIBO Universidad El Bosque Servicio de Reumatología e Inmunología, Hospital Militar Central Co-director Dra. Luz Stella Rodríguez PhD. Profesora Asociada Instituto de Genética Humana Pontificia Universidad Javeriana Pontificia Universidad Javeriana Facultad de Ciencias Maestría en Ciencias Biológicas Bogotá. D.C Noviembre de 2018 2 EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS ANTI PROTEÍNAS/PÉPTIDOS CARBAMILADOS Y SU ASOCIACIÓN CON VARIABLES DE ACTIVIDAD REUMATOLÓGICA Y PERIODONTAL EN PACIENTES CON AR TEMPRANA Y FAMILIARES EN PRIMER GRADO DE CONSANGUINIDAD Jurado Dra Adriana Beltrán Médico Internista Reumatólogo MCs Epidemiologia Clínica Jefe Unidad de Investigación Hospital Militar Central Jurado Dra. Beatriz Aristizabal Bernal PhD en Ciencias Básicas Biomédicas Universidad De Antioquia UDEA Coordinadora Laboratorio de Biología Molecular HPTU Hospital Pablo Tobón Uribe Teléfono: 3104498719 correo: [email protected] Jurado Dra. Yeny Yasbleidy Acosta Ampudia Profesora Principal Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud Universidad El Rosario 3 EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS ANTI PROTEÍNAS/PÉPTIDOS CARBAMILADOS Y SU ASOCIACIÓN CON VARIABLES DE ACTIVIDAD REUMATOLÓGICA Y PERIODONTAL EN PACIENTES CON AR TEMPRANA Y FAMILIARES EN PRIMER GRADO DE CONSANGUINIDAD Leidy Lorena Chila Moreno Dra. Alba Alicia Trespalacios, PhD Directora programa de posgrados Facultad de Ciencias Pontificia Universidad Javeriana Dra. Concepción Judith Puerta, PhD Decana Facultad de Ciencias Pontificia Universidad Javeriana Pontificia Universidad Javeriana Facultad de Ciencias Maestría en Ciencias Biológicas Bogotá. D.C Noviembre de 2018 4 Nota de Advertencia Artículo 23 de la resolución No 13 de julio de 1946 “La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará porque no se publique nada contrario al dogma y la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo por buscar verdad y justicia” 5 AGRADECIMIENTOS. A mi madre quien gracias a su apoyo, colaboración y compresión pude realizar este estudio. A mi hermana quien admiro profundamente, siempre dispuesta a escucharme y darme una palabra de aliento para seguir adelante. Al Hospital Militar Central y la Universidad El Bosque quienes permitieron y dieron apoyo académico y financiero para realizar esta investigación. Gracias a la Universidad Pontificia Universidad Javeriana por haberme permitido formarme en ella, gracias a todas las personas que fueron participes de este proceso, ya sea de manera directa o indirecta que realizaron aportes, que se verán reflejado en la culminación de esta etapa. A mis tutoras de esta tesis al Dra. Consuelo Romero y Dra. Luz Stella Rodríguez por su trabajo y dedicación permanente y continua al presente trabajo de investigación, así como sus sugerencias y observaciones, siempre inteligentes y oportunas. Y por último, pero no menos importante el presente trabajo investigativo lo dedico principalmente a Dios y mi padre, que aunque no están presentes son la fuerza inspiradora y necesaria para continuar y finalizar este proceso. 6 TABLA DE CONTENIDO AGRADECIMIENTOS. ........................................................................................................................... 6 TABLA DE CONTENIDO....................................................................................................................... 7 LISTA DE TABLAS ................................................................................................................................. 9 LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................................... 9 INTRODUCCIÓN .................................................................................................................................. 10 1. MARCO TEÓRICO ....................................................................................................................... 12 1.1. ARTRITIS REUMATOIDE .................................................................................................. 12 1.1.1. 1.2. PRODUCCIÓN DE AUTOANTICUERPOS ....................................................................... 13 1.2.1. Factor Reumatoide (FR) ................................................................................................. 13 1.2.2. Anticuerpos anti péptidos cíclicos citrulinados (anti-CCP) ........................................ 14 1.2.3. Anticuerpos anti-proteínas carbamiladas (anti-CarP) ................................................ 15 1.3. FACTORES GENÉTICOS Y AMBIENTALES .................................................................. 17 1.3.1. Factores de riesgo genéticos ........................................................................................... 17 1.3.2. Factores de riesgo ambientales ...................................................................................... 18 1.4. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD REUMÁTICA. ....................................................... 19 1.4.1. Disease Activity Score 28 – DAS28. ............................................................................... 19 1.4.2. Multidimensional Health Assessment Questionnaire (MDHAQ) ............................... 21 1.4.3. Índice de Actividad de Enfermedad Simplificado (SDAI) .......................................... 21 1.5. 2. Definición ......................................................................................................................... 12 ENFERMEDAD PERIODONTAL Y P. gingivalis .............................................................. 22 MATERIALES Y METODOS ...................................................................................................... 22 2.1. Población....................................................................................................................................... 22 2.2. Detección y cuantificación de anticuerpos anti-CCP. ............................................................... 24 2.3. Proteína C Reactiva ultrasensible (hsPCR) .......................................................................... 24 2.4. Velocidad de sedimentación globular (VSG) ........................................................................ 24 2.5. Detección y cuantificación de anticuerpos anti-CarP. ......................................................... 24 2.6. Tipificación de alelos HLA-DRB1 ......................................................................................... 27 2.7. Factores ambientales .............................................................................................................. 27 2.8. Índices de actividad de la enfermedad .................................................................................. 27 2.9. Índices Periodontales .............................................................................................................. 27 2.10. Análisis de los datos. ........................................................................................................... 29 2.11. Consideraciones éticas ............................................................................................................... 30 7 3. OBJETIVOS E HIPÓTESIS ......................................................................................................... 31 3.1. Objetivo general ........................................................................................................................... 31 3.2. Objetivos específicos .................................................................................................................... 31 3.3. 4. Hipótesis ................................................................................................................................... 31 RESULTADOS ............................................................................................................................... 32 4.1. Características socio demográficas en los pacientes con ART y sus controles .................. 32 4.2. Características socio demográficas en FDR y controles ...................................................... 33 4.3. Variables serológicas y actividad reumática en pacientes con ART y controles. .............. 34 4.4. Variables serológicas y actividad reumática en FDR y controles ....................................... 35 4.5. Distribución de alelos HLA-DRB1 en pacientes con ART y epítope compartido. ............ 36 4.6. Distribución de alelos HLA-DRB1 en pacientes con FDR y epitope compartido. ............ 37 4.7. Variables periodontales de pacientes con ART y controles ................................................ 39 4.8. Variables periodontales de FDR y controles ........................................................................ 41 4.9. Presencia de anticuerpos carbamilados anti proteína y antipéptido, su asociación con HLA-DRB1, índices de actividad reumatológica y periodontal en pacientes con ART comparado con controles. ....................................................................................................................................... 42 4.10. Presencia de anticuerpos carbamilados anti proteína y anti péptido, su asociación con HLA-DRB1, variables de compromiso articular y periodontal en FDR y controles. ................... 46 5. RESUMEN DE RESULTADOS .................................................................................................... 53 6. DISCUSIÓN .................................................................................................................................... 55 7. CONCLUSION ............................................................................................................................... 67 8. REFERENCIAS .............................................................................................................................. 68 8 LISTA DE TABLAS Tabla 1 Variables sociodemográficas de individuos con ART y controles ........................................ 32 Tabla 2 Variables sociodemográficas de individuos FDR y controles ............................................... 33 Tabla 3 Variables serológicas y actividad reumática de ART y controles......................................... 34 Tabla 4 Variables serológicas y actividad reumática de FDR comparado con CTRL ..................... 35 Tabla 5 Variables Periodontales de individuos con ART y controles ................................................ 39 Tabla 6 Variables Periodontales en FDR comparado con Controles ................................................. 41 Tabla 7 Modelo de regresión logística condicional para indicadores asociados a la condición de ART .......................................................................................................................................................... 46 Tabla 8 Asociación entre Anti-Ca-Fib2 y variables periodontales en FDR ....................................... 51 Tabla 9 Modelo de regresión logística condicional para indicadores asociados a la condición de FDR –ajustado a edad y exposición actual de cigarrillo...................................................................... 52 Tabla 10 Modelo de regresión logística condicional para indicadores asociados a la condición de FDR –ajustado a edad y exposición previa de cigarrillo ..................................................................... 52 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Distribución de alelos HLA-DRB1 en ART. ............................................................ 36 Figura 2 Frecuencia de alelos Epítope compartido y número de alelos en ART. ............... 37 Figura 3 Distribución de alelos HLA-DRB1 en FDR. ............................................................ 38 Figura 4 Frecuencia de alelos EC en FDR. ............................................................................ 38 Figura 5 Frecuencia de anticuerpos anti-proteína (anti-FCS-Carp) y anti-péptidos carbamilados en ART comparado con CTRL ........................................................................ 42 Figura 6 Asociación entre Anti-FCS-Carp y alelos HLA-DRB1 en ART. ........................... 43 Figura 7 Asociación entre Anti-Ca-Fib2 y presencia de autoanticuerpos en ART. .......... 44 Figura 8 Asociación entre Anti-Ca-Fib2 y alelos HLA-DRB1 en ART. .............................. 44 Figura 9 Asociación entre Anti-Ca-Fib2 e índice de actividad en ART. ............................. 45 Figura 10 Frecuencia de anticuerpos anti-proteína (anti-FCS-Carp) y anti-péptidos carbamilados en FDR comparado con CTRL . ...................................................................... 47 Figura 11 Asociación entre Anti-FCS-Carp y alelo HLA-DRB1 EC *1402 en FDR. ........ 48 Figura 12 Asociación entre Anti-FCS-Carp y variables clínicas en FDR. .......................... 49 Figura 13 Correlación de niveles de anti-FCS-Carp y variables reumatológicas. .............. 49 Figura 14 Asociación entre Anti-Ca-Fib2 y alelos HLA-DRB1 *14501 y *0901 en FDR. .. 50 Figura 15 Asociación entre Anti-Ca-Fib3 y presencia de Factor reumatoide en FDR. ..... 51 9 INTRODUCCIÓN La Artritis Reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria crónica sistémica y de carácter autoinmune, que involucra la inflamación de las cavidades sinoviales de las articulaciones con posterior destrucción articular (1). A lo largo del tiempo se han sugerido una variedad de autoantígenos como inductores de la respuesta autoinmune en la AR, generando autoanticuerpos que han sido empleados como biomarcadores en el apoyo diagnóstico de la enfermedad (2). La identificación de anticuerpos anti péptidos cíclicos citrulinados (Anti-CCP) ha contribuido significativamente a la comprensión de la AR. Estos autoanticuerpos son generados en fases muy tempranas de la enfermedad a partir de una respuesta autoinmune específica dirigida contra varias proteínas generadas por modificaciones postraduccionales, específicamente, la citrulinación (34), sin embargo, este no es el único proceso involucrado en el desarrollo de la enfermedad, a estos procesos postraduccionales se le suman condiciones asociadas con la enfermedad como factores ambientales que incluyen consumo o antecedente de cigarrillo, sobrepeso, enfermedad periodontal, entre otros, y factores genéticos como la presencia de algunos alelos HLA-DRB1 considerados importantes en el reconocimiento autoinmune de proteínas citrulinadas denominados epítope compartido, así mismo, la heredabilidad de la enfermedad se ha estimado en alrededor del 60% (5). Se han reportado diferencias significativas entre la presentación de la enfermedad de acuerdo con la presencia o ausencia de anti-CCP, así como a la progresión de la enfermedad y la remisión. En los últimos años se ha obtenido una importante percepción sobre la ocurrencia y la etiopatogenia de la AR con anti-CCP positivo, sin embargo, hay poca información disponible en AR con antiCCP negativo. Esta falta de información se debe en parte a la ausencia de biomarcadores sólidos que caractericen esta manifestación de AR (2-4). No obstante, la búsqueda de nuevos biomarcadores ha llevado a descubrir nuevos anticuerpos presentes en la AR que pueden contribuir al daño en los tejidos, dirigidos a proteínas carbamiladas denominados anticuerpos anti-proteínas carbamiladas (anti-CarP), encontrándose tanto en grupos de pacientes anti-CCP positivos y negativos para anti-CCP, detectándose también en fases muy tempranas de la enfermedad e involucrados con alto daño radiológico, y en el desarrollo y 10 severidad de la enfermedad. Destacando así la importancia de estudiar estadios tempranos de la enfermedad y grupos de riesgo como familiares en primer grado de consanguinidad teniendo en cuenta la predisposición genética de la enfermedad. Numerosos trabajos anteriores han revelado los principales proteínas susceptibles a la citrulinación como lo son la filagrina, colágeno tipo I y II, fibrinógeno, vimentina entre otros, sin embargo, el antígeno al cual están dirigidos estos los anti-CarP no están definidos completamente, Algunos estudios se han centrado principalmente en el fibrinógeno o la mezcla de proteínas a partir de suero de fetal bovino carbamilado y más recientemente anticuerpos contra vimentina y α enolasa. Actualmente son pocos los estudios que involucran factores genéticos y/o factores ambientales asociados a la presencia de este nuevo biomarcador (anti-CCP). Debido a lo anterior, en este trabajo se quiso explorar las asociaciones que podría tener la presencia de anticuerpos anti-CarP y además anticuerpos anti péptidos carbamilados y su asociación con variables genéticas y ambientales en fases tempranas y fases de riesgo de la enfermedad. 11 1. MARCO TEÓRICO 1.1.ARTRITIS REUMATOIDE 1.1.1. Definición La AR es una enfermedad crónica e inflamatoria que conduce al deterioro en las articulaciones y discapacidad irreversible de naturaleza autoinmune dirigida principalmente contra el tejido de la membrana sinovial caracterizándose por la destrucción del cartílago, el hueso y la producción de autoanticuerpos (1-2). La AR puede afectar cualquier articulación, pero preferiblemente pequeñas articulaciones en manos y pies. Los síntomas de AR incluyen dolor, inflamación, rigidez y finalmente pueden conducir a la pérdida de las funciones de la articulación (3). Los síntomas sistémicos de la AR incluyen fatiga, malestar general, pérdida del apetito y dolor muscular. Junto a las articulaciones, la AR puede afectar otros órganos, como la piel, los pulmones, el corazón y los vasos sanguíneos (4). La etiología de la AR es incierta y se considera una enfermedad compleja debido a los múltiples factores que pueden llegar a condicionar el desarrollo de la enfermedad (5). Sin embargo, se han descrito condiciones asociadas con la enfermedad como factores endocrinos, ambientales los cuales incluyen el consumo de cigarrillo (6), niveles hormonales, embarazo y genéticos como la presencia de polimorfismos y de ciertos alelos del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II HLA-DRB1 (7-11). Además, se ha estimado que la heredabilidad de la enfermedad es de alrededor del 60% (12-13). La incidencia de AR es más alta en mujeres que en hombres con una proporción de 3:1. Esta diferencia ha sugerido la influencia de factores reproductivos y hormonales en la aparición de la enfermedad. Sin embargo, no está claro cómo el género influye en la aparición de AR (14,15). La edad de inicio de la enfermedad presenta un pico de 35 a 50 años de edad, que supone el 80% de los casos (16-17). La prevalencia de AR se encuentra de entre 0,5 y 1,0% en individuos caucásicos (18-22) incluyendo población colombiana que va de un 0,1 a 0,9%, sin embargo, se ha informado 12 una alta prevalencia de AR en nativos americanos en un 6% y muy pocas ocurrencias (0.2-0.3%) en las poblaciones de China y Japón (23). El desarrollo de AR puede ser agudo o puede estar precedido por etapas previas a la AR y no existe una definición uniforme y precisa de las etapas previas a la AR. Los estadios previos a la AR generalmente se refieren a individuos que presentan síntomas clínicos y/o factores de riesgo sean ambientales, hormonales o genéticos sin cumplir aún los criterios diagnósticos de AR u otras formas de artritis (24) lo que promueve a considerar que es probable que se requieran múltiples factores de riesgo antes de que se alcance un punto crítico que desencadene la enfermedad. La progresión de la enfermedad implica el inicio y la propagación de la autoinmunidad contra auto proteínas modificadas, que pueden ocurrir años antes del inicio de la sinovitis subclínica y los síntomas clínicos. Iniciando en una población de riesgo susceptible como por ejemplo individuos con historia familiar de AR y posteriormente a una etapa preclínica antes de que se desarrolle la inflamación articular que se definiría como una etapa temprana de la enfermedad y subsiguientemente una enfermedad establecida (25). 1.2.PRODUCCIÓN DE AUTOANTICUERPOS 1.2.1. Factor Reumatoide (FR) La AR generalmente se asocia con evidencia serológica de autoinmunidad sistémica según lo indicado por la presencia de autoanticuerpos. Uno de los autoanticuerpos descritos es el Factor Reumatoide (FR) (26). Estos autoanticuerpos son policlonales y reconocen principalmente la fracción constante de la IgG y son producidos de manera local por células plasmáticas presentes en estructuras similares a ganglios linfoides y folículos germinales que se forman en las cavidades sinoviales inflamadas de pacientes con AR (26-27). El FR está presente en aproximadamente el 50% -90% de los pacientes con AR, pero también puede estar presente en otras enfermedades reumáticas o no reumáticas. 13 1.2.2. Anticuerpos anti péptidos cíclicos citrulinados (anti-CCP) Para referirse a los anti–CCP se debe considerar hablar de autoanticuerpos detectados en los pacientes con AR, que incluyeron anticuerpos anti-queratina (AKA) en un inicio, anticuerpos anti factor perinuclear (APF) y anticuerpos anti-Sa. Posteriormente se demostró que estos autoanticuerpos reconocían péptidos/proteínas que contienen el aminoácido citrulina generadas por modificaciones postraduccionales (PTM), estos anticuerpos fueron denominados como anticuerpos anti péptidos cíclicos citrulinados (anti-CCP) (28). La citrulina es un aminoácido no convencional generado por la PTM denominada citrulinación en el cual se modifica enzimáticamente la arginina para dar lugar a la citrulina con las enzimas peptidilarginina deaminasa (PAD) durante una variedad de procesos biológicos, que incluyen inflamación (29). La enzima PAD media la citrulinación en presencia de concentraciones calcio (Ca2+), el cual es otorgado por los granulocitos quienes crean un ambiente propicio para la activación de la enzima, aumentando el nivel de Ca2+ citosólico mediante bombas de Ca2+ en la membrana plasmática, conllevando a un entorno inflamatorio, citrulinación de proteínas intracelulares y/o proteínas sinoviales produciendo proteínas citrulinadas localmente en las articulaciones, estas proteínas serán absorbidas por células presentadoras de antígeno y presentadas para la formación de anti-CCP (30-31). Varias proteínas citrulinadas han sido identificadas como antígeno blanco de los anticuerpos antiCCP en la AR, la principal proteína citrulinada en la articulación fue la fibrina. Además, varias proteínas sinoviales y no sinoviales (colágeno de tipo II, vimentina, proteínas nucleares, enolasa y proteínas de estrés etc.) (32) han sido descritas también por sufrir el proceso de citrulinación. Los osteoclastos y precursores de osteoclastos dependen de la actividad de las enzimas PAD por lo que estas células expresan proteínas citrulinadas en su superficie celular durante su maduración fisiológica. La presencia de proteínas citrulinadas en la superficie de los osteoclastos permite que los anti-CCP se unan a éstos, estimulando la liberación de IL-8 aumentando su maduración y su activación. Existe un mecanismo complementario propuesto donde los complejos inmunes formados por anti-CCP pueden contribuir aún más a la activación de los osteoclastos mediante la unión con los receptores Fc en los osteoclastos (33). 14 Los anti-CCP se encuentran en el 70-80% de los pacientes con AR con una alta especificidad, (90-95%), asociándose con la severidad en el desarrollo de la enfermedad, menor probabilidad de alcanzar remisión, mayores manifestaciones extra-articulares, mayor riesgo de enfermedad cardiovascular, mayor mortalidad y adicionalmente en individuos con valores positivos, mayor posibilidad de desarrollar AR. En dichos individuos este anticuerpo se detecta hasta 10 o más años antes de la aparición de síntomas y diagnóstico (34). En general, los anti-CCP se convirtieron en una molécula con mejor valor diagnóstico que el FR en términos de sensibilidad y especificidad, otorgándosele la inclusión en los criterios de clasificación actuales (28,35,36). Los anti-CCP rara vez se encuentran en otras enfermedades o en individuos sanos, sin embargo, existe un subgrupo de pacientes con AR sin ninguno de los autoanticuerpos mencionados conocidos como “seronegativos”. 1.2.3. Anticuerpos anti-proteínas carbamiladas (anti-CarP) Recientemente en un intento por identificar biomarcadores adicionales que sean útiles en el diagnóstico de progresión en etapas tempranas y en etapas de riesgo de la AR se identificaron anticuerpos dirigidos contra proteínas que han sido modificadas postraduccionalmente por un mecanismo descrito como carbamilación. La carbamilación es una PTM no enzimática en la que el cianato reacciona con los grupos amino o tiol primarios. La reacción de cianato con grupos amino o grupos tiol se llama N-carbamilación o S-carbamilación, respectivamente. Los aminoácidos lisina y arginina contienen cadenas laterales que pueden reaccionar con el cianato (37) creando una estructura homóloga a la citrulina que se extiende por un único residuo de carbono, también conocido como homocitrulina (38). La urea es la principal fuente de cianato en todos los individuos y está presente en los fluidos corporales en equilibrio con el cianato de amonio. Se ha sugerido que la relación de equilibrio entre cianato y urea es de alrededor de 1 a 500,000 (39). En condiciones normales, la urea y el cianato están a concentraciones demasiado bajas como para inducir alteraciones proteicas. Cuando se origina la carbamilación, N-carbamilación o S-carbamilación, en condiciones patológicas se puede producir de dos formas: la primera a partir de formación de isocianato por la descomposición de la urea en amoniaco y cianato en uremia secundaria y la segunda por procesos inflamatorios que pueden estimular excesivamente procesos de carbamilación. Wang y 15 Holzer et al. demostraron que procesos inflamatorios originan procesos de carbamilación a través de mecanismos dependiente de la mieloperoxidasa (MPO) (40,41) La MPO almacenada principalmente en gránulos de neutrófilos puede generar cianato utilizando el peróxido de hidrogeno (H2O2) para oxidar tiocianato a cianato que posteriormente en su forma activa de isocianato promueve la carbamilación de proteínas en los sitios de inflamación, por otro lado, el tiocianato, derivado de la ingesta de alimentos o por exposición a humo de cigarrillo, puede oxidarse por el peróxido de hidrógeno con la ayuda de la MPO, dando como resultado la formación de hipotiocianato que se descompone en cianato y otros iones (40). Originando diversas carbamilaciones por la interacción de isocianato (HNCO) con grupos α-amino y ε-amino de proteínas (42). Diversos trabajos han revelado antígenos o proteínas susceptibles a citrulinación como la filagrina, colágeno tipo I y II, fibrinógeno, vimentina, entre otros, (43,44), sin embargo, el antígeno al cual están dirigidos estos otros autoanticuerpos anti-CarP no se ha definido completamente. Trabajos anteriores se han centrado principalmente en el fibrinógeno o la mezcla de proteínas a partir de suero fetal bovino carbamilado y más recientemente anticuerpos contra vimentina y α enolasa (45-47). Se ha descrito que las proteínas modificadas postraduccionalmente tienen la capacidad de romper la tolerancia inmunológica e inducir respuestas de autoanticuerpos. La noción de que esto también puede ocurrir en el contexto de la carbamilación fue iniciada por Steinbrecher et al. quien reportó experimentos de inmunización con proteínas carbamiladas (48). Esta hipótesis también se vio respaldada por la presencia de anticuerpos anti-CarP en modelos animales en donde tanto los conejos (49) como los ratones (50) desarrollaron respuestas de anticuerpos tras la inmunización con péptidos que contenían homocitrulina o proteínas carbamiladas. Posteriormente se sugirió la presencia de anti-CarP en una pequeña cohorte de AR (51) y después fueron descritos por Shi et al. en pacientes con AR y se encontró que estos anticuerpos se asociaban con altos índices de daño articular, postulándose como prominentes biomarcadores de esta enfermedad (45-47) en fases tempranas precediendo la aparición de síntomas y diagnóstico (52). 16 1.3.FACTORES GENÉTICOS Y AMBIENTALES 1.3.1. Factores de riesgo genéticos La AR tiene una alta tasa de heredabilidad que alcanza el 60% (53-56) promoviendo la inclusión de estadios de riesgo como los familiares en primer grado de consanguinidad de pacientes con AR como una población potencialmente a estudiar (24). Los factores de riesgo genéticos más importantes en AR residen en el locus de clase II del antígeno leucocitario humano (HLA), más específicamente, los denominados epítopes compartidos (EC) en la cadena β del HLA-DR (HLA-DRB1). La asociación de HLA clase II DRB1 con la AR se conoce desde hace décadas (58). Diversos estudios subsiguientes condujeron a la identificación y definición del EC, aclarando que se trata de una secuencia conservada de aminoácidos en la tercera región hipervariable (posición 70-74) de la cadena β del HLA-DR (59). Algunos alelos que codifican esta secuencia en las posiciones 70-74 en el surco de unión al péptido son HLA-DRB1 *0401, *0404, *0405, *0101 *1001,entre otros (60,61). Los alelos HLA-DRB1 que codifican el EC confieren el mayor riesgo genético para AR, especialmente en la respuesta inmune asociada al desarrollo de anti-CCP (62), siendo los alelos *0401,*0404 y*0405 los que están más asociados con severidad y destrucción ósea en la enfermedad (63). El mecanismo exacto de cómo el EC interviene en la AR no está complemente claro. Basándose en el papel conocido de las moléculas de HLA en la presentación del antígeno, las hipótesis predominantes postulan que los HLA-DRB1 EC restringen la presentación de autoantígenos citrulinados debido a que la reacción química induce la reducción de la masa molecular de aproximadamente 1,0 Dapor cada arginina modificada. La carga positiva se pierde, por lo que el punto isoeléctrico (pI) también se ve modificado convirtiendo a la péptido en un blanco de reconocimiento por el EC y posterior presentación a linfocitos T, ocasionando la producción de estos autoanticuerpos por parte de las células plasmáticas(5,64,65,66) La asociación entre HLA-DRB1 EC y la producción de anti-CarP en AR esta poco descrita (59,66,67). Se ha revelado que en algunas poblaciones más del 80% de los pacientes con AR 17 presentan al menos uno de los alelos HLA-DRB1 EC (60,61), en Colombia no hay reportes previos por otros grupos de investigación. 1.3.2. Factores de riesgo ambientales Unos de las condiciones de mayor asociación con la enfermedad son los factores ambientales como el consumo de cigarrillo, si bien muchas de estas asociaciones solo se observan en estudios únicos o existen resultados discrepantes, en múltiples estudios existen varios factores ambientales que tienen asociaciones relativamente consistentes con la AR, y el más fuerte de estos es la exposición al tabaco (6,70). Múltiples estudios han estimado que la exposición al tabaquismo representa del 20 al 30% del riesgo ambiental para el desarrollo de AR. Principalmente, fumar está fuertemente asociado con presencia de anti-CCP y la presencia de FR, sugiriendo interacciones biológicas entre estos factores que impulsan el desarrollo de la AR o, al menos, la autoinmunidad relacionada con la AR. Como un ejemplo relevante, se ha propuesto que fumar puede conducir al proceso de citrulinación, lo que, en el contexto de la enfermedad, conduce a la presentación de proteínas citrulinadas y la generación de anti-CCP (7,54,70). Se ha evidenciado que el consumo del tabaco aumenta la respuesta inflamatoria, debido a que en fumadores se ha observado un incremento del fibrinógeno sérico, de la actividad de las células B auto-reactivas y un aumento de los reactantes de fase aguda y citoquinas pro-inflamatorias como el Factor de Necrosis Tumoral-alfa (TNF-α), IL-6 y de polimorfo-nucleares (PMN) circulantes (6) . Así mismo el tabaco tiene efectos inmunosupresores como la inhibición de las citoquinas: IL-1β, IL-2, INF-α, reduce las inmunoglobulinas circulantes y produce liberación de la IL-8 por los fibroblastos sinoviales. De igual forma el tabaco modula la proliferación y muerte celular de los linfocitos e induce la formación de nuevos epítopos permitiendo la exposición de antígenos intracelulares induciendo la estimulación de las células presentadoras de antígenos en el pulmón y por lo tanto aumentando la capacidad presentadora de nuevos antígenos en este tejido. Estos mecanismos descritos facilitan el desarrollo de procesos autoinmunes (5,71). El tabaquismo acelera la fase preclínica, permitiendo la citrulinación de péptidos e induce la generación de anticuerpos anti-CCP en fases tempranas de la enfermedad (5). La exposición al tabaco induce una reacción inflamatoria local y de necrosis celular, que favorece la citrulinación 18 de proteínas a nivel pulmonar representando un sustrato para la activación de la respuesta inmune, Igualmente, se ha observado un significativo aumento de péptidos y proteínas citrulinadas en muestras de lavado bronqueoalveolar de fumadores con relación a los no fumadores, que finalmente desencadenan una respuesta inmune con la producción de mediadores inflamatorios como el TNF y citoquinas (6). Adicionalmente, la exposición al humo de cigarrillo aumenta significativamente los niveles de tiocianato un metabolito del cianuro que está presente en el humo del cigarrillo, este último es clave para la formación de isocianato. La mieloperoxidasa de neutrófilos (MPO) presente en la cavidad oral representa un marcador de inflamación y es significativamente más alta en fumadores, esta MPO utiliza peróxido de hidrogeno (H2O2) para oxidar el tiocianato al cianato que luego promueve la carbamilación de proteínas en sitios de inflamación sugiriendo que podría estar relacionada la condición inflamatoria en cavidad oral en la formación de péptidos y/o proteínas carbamiladas induciendo la generación de anticuerpos anti-CarP (40,44). Por otro lado, estilos de vida saludables como dietas más balanceadas que conlleven a un índice de masa corporal más bajo se han asociado con menor riesgo de AR (72,73). Algunos estudios previos de nuestro grupo de investigación asocian el alto índice de masa corporal y el hábito continuo de fumar con el mayor riesgo de desarrollar AR en el futuro (74), sugiriendo que estos factores pueden actuar como riesgos adicionales parala progresión de autoinmunidad. 1.4.EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD REUMÁTICA. 1.4.1. Disease Activity Score 28 – DAS28. Este procedimiento se basa en el recuento de 28 articulaciones dolorosas (NAD28) e inflamadas (NAT28), velocidad de sedimentación globular (VSG) y la evaluación global de la salud efectuada por el paciente (VAS) sobre una escala analógica visual donde el número cero indica que el paciente se encuentra muy bien y el número 44 muy mal. Se debe tener en cuenta que la escala que se utiliza es análoga y por tanto hay que convertir las puntuaciones de las escalas 19 numéricas que van de 1 a 10 en sus correspondientes valores de 1 a 100 para el adecuado cálculo del índice. Según la Liga Europea Contra el Reumatismo (EULAR) el cálculo se realiza a partir de la siguiente fórmula: DAS28 = 0.56 (√NAD28) + 0.28 (√NAT28) + 0.70 (In VSG) + 0.014 (VAS), en la cual el DAS28 es igual a 0,56 por la raíz cuadrada del número de articulaciones dolorosas del recuento de 28 articulaciones más 0,28 por la raíz cuadrada del número de articulaciones inflamadas del recuento de 28 articulaciones más 0,70 por el logaritmo neperiano de la velocidad de sedimentación más 0,014 por la valoración global del paciente. También se puede emplear el valor de la proteína C reactiva (PCR) en reemplazo de la VSG (75). Se consideraron como actividad baja (DAS28<2.60), media (DAS28=2.6–3.2), moderada/alta (DAS28>3.2). 20 1.4.2. Multidimensional Health Assessment Questionnaire (MDHAQ) Se trata de un cuestionario desarrollado para valorar la discapacidad y la actividad de la enfermedad en pacientes con artritis que incluye una valoración de la función física de forma análoga al HAQ convencional. El MDHAQ incluye 5 escalas para evaluar la función física (FN), la condición psicológica, el dolor, la estimación global del paciente por una escala visual analógica (VAS) y un recuento articular. La escala FN incluye 10 actividades con una puntuación de 0 a 30, que se recodifica de 0 a 10 utilizando una plantilla de puntuación. El dolor MDHAQ y el VAS se puntúan de 0 a 10 en 21 círculos numerados (numerados en incrementos de 0,5).Este índice mide la capacidad funcional. Oscilando de 0 =no incapacidad y más de 3= mayor incapacidad Mediante este cuestionario se puede calcular el RAPID3. Las puntuaciones RAPID3 se calculan a partir de la suma de FN, dolor y VAS, cada una con una puntuación de 0 a 10 para un rango de puntuación total de 0 a 30. Las categorías de gravedad de RAPID3, definidas son 3 o menos para remisión, 3.1 a 6.0 para baja severidad, 6.1 a 12.0 para severidad moderada y más de 12 para severidad alta (92). 1.4.3. Índice de Actividad de Enfermedad Simplificado (SDAI) El índice simplificado de actividad de la enfermedad (SDAI), del inglés (Simplified Disease Activity Index) es una herramienta que permite evaluar la actividad de la enfermedad en el marco de la AR. Consta de cinco apartados: número de articulaciones inflamadas, número de articulaciones dolorosas, VAS del paciente y del médico y, por último, reactante de fase aguda (VSG o PCR) (93). Rango de valores posibles van de 0,1-86, los rangos de la evaluación de la actividad de la enfermedad: ≤3,3: remisión2, 3.3 -11 actividad baja/moderada > 11 actividad alta (94). 21 1.5.ENFERMEDAD PERIODONTAL Y P. gingivalis Paralelamente entre los factores ambientales involucrados en la AR, también se encuentra la infección periodontal denominada como EP o periodontitis, una enfermedad infecciosa inflamatoria crónica inducida por la bacteria periodontopatógena Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) que conduce a una respuesta inflamatoria que destruye el tejido y las estructuras óseas. La relación entre la AR y la periodontitis empezó a discutirse hace aproximadamente 50 años (76), ya que comparten características y se asocian con una mayor incidencia y severidad de la AR (77-79), se ha reportado una mayor prevalencia de periodontitis en pacientes con AR (80). Actualmente la EP se ha relacionado con la inducción de anti-CCP debido a que la P. gingivalis expresa una enzima homóloga a la PAD humana denominada PPAD que participa en procesos de citrulinación en el periodonto desencadenando la generación de anti-CCP (81-83), por otro lado, la NETosis de neutrófilos es otro mecanismo que puede desencadenarse por los patógenos de la EP. Este es un proceso en el que el contenido nuclear de las células se extruye desde la célula, liberando PAD4 intracelular, que ofrece otra fuente de citrulinación extracelular (84-89). Recientemente con la identificación de anti-CarP han surgido estudios que plantean la hipótesis que debido al gran infiltrado celular y la NETosis que existe en el periodonto se liberan grandes cantidades de MPO el cual va a promover la oxidación del tiocianato a cianato generando ácido isociánico y posiblemente podría conducir también a procesos de carbamilación de proteínas y por qué no pensar en desarrollo de anticuerpos anti-CarP (90-91). 2. MATERIALES Y METODOS 2.1. Población Muestra no probabilística por conveniencia. Se evaluaron 2 grupos: 51 pacientes clasificados como Artritis Reumatoide Temprana (ART) por los criterios de clasificación ACR / EULAR 2010 (36) y que tuvieran menos de dos años de duración de la enfermedad que asisten a la consulta regular de reumatología en el Hospital Militar Central y 22 Fundación Instituto Fernando Chalem y fueron pareados en una relación familiar:control de 1:1, por edad y género. 124 Familiares en primer grado de consanguinidad de pacientes con AR (FDR) incluidos por criterios definidos de acuerdo con las recomendaciones de EULAR de 2012 (24). Criterios de Inclusión Individuos Colombianos mayores de 18 y menores de 65 años, sanos, con artritis reumatoide temprana clasificados por los criterios de clasificación ACR / EULAR 2010 de menos de dos años de evolución, individuos relacionados consanguíneamente con pacientes con AR, según la guía de recomendaciones del consenso Europeo de reumatología (EULAR) de 2012. Criterios de exclusión Tener menos de 6 dientes en boca Individuos con proceso infeccioso en curso o diagnóstico de neoplasia. Individuos con diagnóstico de diabetes Mellitus Tipo II, y enfermedades autoinmunes. Individuos que se rehúsen entrar al estudio y por tanto no firmen el consentimiento informado. Individuos con dificultades para completar la información pertinente Individuos que se encuentren bajo tratamiento antibiótico antes de tres meses previos a la toma de las muestras. Individuos con aparatología ortodóntica. Individuos que hayan tenido terapia periodontal en los últimos 6 meses. Individuos en embarazo o lactancia. 23 2.2. Detección y cuantificación de anticuerpos anti-CCP. Para la medición cuantitativa de IgG/IgA contra péptido citrulinado en suero, se empleó un sistema ELISA tipo sándwich siguiendo las instrucciones del fabricante (Quanta lite® CCP 3.1 IgG/IgA, INNOVA Diagnosis, San Diego, CA, USA y IMTEC –ITC 60015). Una prueba positiva se definió como >20 U. El antígeno usado en QUANTA Lite™ CCP 3.1 IgG/IgA ELISA es un péptido sintético cíclico con citrulina incorporada. Los sueros fueron diluidos 1:101 e incubados y posteriormente del lavado, se añadió conjugado anti IgG humana acoplado a peroxidasa a cada pocillo. Tras un lavado que elimina el conjugado sobrante, se añadió un sustrato cromogénico (TMB), peróxido de hidrógeno y se paró la reacción con H2SO4. 2.3.Proteína C Reactiva ultrasensible (hsPCR) La medición y cuantificación de PCR ultrasensible se realizó por medio de quimioluminiscencia, El resultado final fue obtenido y expresado en mg/L y en UI/mL respectivamente (Immulite 1000, Siemens® refs: LKP1 No.10381411, 10286287, Gwynedd, Reino Unido) Valores positivos se consideraron mayores a 3 mg/L. 2.4.Velocidad de sedimentación globular (VSG) La determinación de la VSG se realizó por fotometría Capilar, utilizando sangre anti coagulada. Velocidades prolongadas se consideraron mayores a 20 mm / h. 2.5.Detección y cuantificación de anticuerpos anti-CarP. Los anticuerpos anti proteínas carbamilados (anti-FCS-Carp) se realizaron por ELISA, en donde el antígeno utilizado fue suero fetal bovino carbamilado con cianato de potasio, seguido de una fase de incubación con la muestra de suero y se detectó con anticuerpo anti-IgG acoplado a peroxidasa y se reveló con TMB, peróxido de hidrógeno y se detuvo la reacción con H2SO4. Para la detección de los anticuerpos anti péptidos (anti-Fib, Anti-Ca-Fib2 y Anti-Ca-Fib3) en primera instancia se seleccionaron tres secuencias de la cadena β de fibrinógeno humano tomado de Shi et al (45) y se realizaron predicciones de epítopos B empleando Bitered, BepiPred 1.0 y para epítopos T, los programas ProPred y MHCPred, para confirmar que estas secuencias fueran epítopos de células B y T, ya que Shi et al utiliza la secuencia de Anti-Ca-Fib2 solo para ensayos 24 de especificidad de anti-CCP. Así que este estudio utiliza la misma secuencia (Anti-Ca-Fib2) y adiciona una secuencia con una modificación no reportada (Anti-Ca-Fib3) con el fin de analizar anticuerpos anti-CarP dirigidos a las diferentes secuencias mencionadas.Los epítopos que tuvieron una puntuación de corte > 0.8 fueron utilizados. Se sintetizaron 3 péptidos en total: el primero un péptido nativo (anti-Fib) 37–52 [NEEGFFSA RHRPLDKK] y dos péptidos modificados: el primer péptido modificado (anti-Ca-Fib2) [NEEGFFSAHomoCitHRPLDKK] con una homocitrulina en la posición 45 y un segundo péptido modificado (anti-Ca-Fib3) [NEEGFFSARHRPLDHomoCitHomoCit] con homocitrulina en las posiciones 51 y 52. Se analizaron regiones de similitud entre secuencias mediante PSIBLAST Uniprot. Para la medición cuantitativa de IgG contra péptido carbamilado en suero, se empleó un sistema ELISA indirecta modificado basado en el protocolo establecido por Shi et al. (45). Se empleó como antígeno de superficie los péptidos sintetizados con una pureza del 98% derivado de la secuencia de la cadena beta del fibrinógeno posición 37–52 (16mers), identificado como anti-Fib, anti-Ca-Fib2 y anti-Ca-Fib3. PROCEDIMIENTO 1. Sensibilización de las placas con el antígeno. a. Se sensibilizaron las filas de las placas de ELISA (Greiner Bio One®) agregando 100 µL/pozo del péptido correspondiente a anti-Fib, anti-Ca-Fib2 o anti-Ca-Fib3 respectivamente, diluido en buffer PBS 1X + BSA 0.1%, a concentración de 5 µg/mL. La concentración de los péptidos y concentraciones de suero y anticuerpos se escogieron previamente mediante un checker board con el fin de identificar las concentraciones óptimas de los reactivos. Cada péptido conto como su respectivo control diluyente (PBS 1X + BSA 0.1%). b. Se cubrió la placa con papel termoadhesivo (Plate sealer - Easy seal®) y se llevaron a incubación durante 16 horas, a temperatura de 4 °C. 2. Lavado. 25 a. Con una solución PBS 1X (200 µL) se realizaron 3 ciclos de lavado de 1 minuto cada uno. 3. Estabilización y bloqueo de sitios específicos a. Las placas se bloquearon con una solución PBS 1X + BSA 1%, empleando 200 µL/pozo e incubación durante 1 hora a temperatura ambiente. 4. Procesamiento de las muestras. a. Se adicionaron 100 µL/pozo de suero de pacientes o controles según mapa de Elisa diseñado previamente diluido en PBS 1X/0.05%Tween/1% BSA, a concentración de 1/50 y 1/100 (por triplicado) tanto en la fila sensibilizada con el péptido como en la cubierta con el diluyente del péptido PBS 1X BSA 0.1% y se incubaron durante una hora a 37°C en atmósfera humidificada. b. Se realizaron 3 ciclos de lavado, con una solución PBS 1X + 0.05% Tween, empleando 200 µL/pozo. c. Se agregaron 100 µL/pozo de anticuerpo anti-human IgG (Dako®) acoplado a peroxidasa diluido en una solución PBS 1X/0.05% Tween/1% BSA, a concentración 1:10.000 y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente para posterior lavado con una solución PBS 1X + 0.05% Tween. d. El ELISA fue revelado con agregando 100 µL/pozo de una solución TMB-H2O2, permitiendo reaccionar durante 3 minutos. e. Se frenó la reacción del método ELISA adicionando 100 µL/pozo de ácido sulfúrico - H2SO4 2M. f. Finalmente, se midió la densidad óptica (DO) usando un lector de placas de ELISA (Tecan Infinite® 200 PRO) a una longitud de onda de 450 nm. Para la interpretación de los resultados obtenidos, se realizó una normalización con los valores de DO obtenidas al realizar el ensayo con el péptido anti-Fib. La positividad de una muestra se consideró como Densidad óptica ≥100 y doble del blanco (diluyente) y que la dilución fuera mayor a la del péptido nativo (anti-Fib). 26 2.6.Tipificación de alelos HLA-DRB1 Los pacientes AR y los individuos FDR fueron tipificados para todos los alelos HLA-DRB1 incluyendo alelos EC positivo y EC negativo. Se utilizó el kit comercial HLA-DRB1 (MILLIPLEX® MAP, refs: HADK1MAG61K03; IMMUCOR, LifeCode, 628923) por tecnología Luminex xMAP®, se consideraron epítopos compartidos positivos aquellos que incluyen alelos DRB1 * 0101, 0102, 0401, 0404, 0405, 0408, 0409, 1402 y 1001 tomando en cuenta las clasificaciones de Gregersen (7 alelos) y por de Vries (9 alelos) (23-24) cuyos alelos han sido asociados con el desarrollo y progresión de la enfermedad. 2.7.Factores ambientales Consideramos los factores epidemiológicos y ambientales asociados con la AR: edad, tabaquismo, índice de masa corporal (IMC), educación, comorbilidades. El IMC se dicotomizó como normal / con peso inferior a (<25 kg / m2) o con sobrepeso (≥25 kg / m2) o con obesidad (≥30 kg / m2). El tabaquismo actual y antecedente fue dicotomizado como ausencia / presencia. La edad fue considerada como una variable continua en años. 2.8.Índices de actividad de la enfermedad La actividad de la enfermedad de la AR se midió usando los índices de actividad de enfermedad simplificado (SDAI), Medida de la actividad de la enfermedad (DAS28), RAPID3 y de discapacidad MDHAQ, realizado por reumatólogos de más 5 años de experiencia (75,92) y para el grupo de familiares de pacientes con AR se realizó conteo articular de todos los individuos, incluyendo conteo articular tanto doloroso como inflamado de las 28 articulaciones que se encuentran incluidas en DAS-28. 2.9.Índices Periodontales La evaluación clínica periodontal se realizó por periodoncista calibrado con concordancia mayor a 95. El diagnóstico y la severidad de la periodontitis se basaron según los criterios del Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) (95). Se tomaron como variables: índice de placa bacteriana, inflamación gingival, sangrado al sondaje, profundidad de bolsa y de nivel de inserción. 27 La presencia de la bacteria periodontopatógena P. gingivalis (ATCC 33277), Se determinó por qPCR, la extracción de ADN se realizó a partir de muestra de placa subgingival contenidas en puntas de papel absorbente estéril introducidas durante 20 segundos en los seis sitios periodontales con bolsas periodontales de mayor profundad o con mayor índice de inflamación. Los anticuerpos IgG1 e IgG2 anti P. gingivalis se realizaron por ELISA in house en el cual se realizó un inmuno-ensayo indirecto en fase solida donde, se fijó el antígeno de P. gingivalisen placas de ELISA (Ref. 655061 Greiner Bio-one) usando buffer carbonato a una concentración de 5 μg/μl a partir de extractos sonicados de P. gingivalisATCC 33277 y W83 a 4°C durante 16 horas. Las placas de ELISA previamente sensibilizadas fueron bloqueadas usando una dilución 1:1 de solución estabilizadora, (SC01-2000 Stabilcoat SurModics) y solución PBS 1X - Leche descremada 1% con avidina (Ref. SP-2001 Vector Laboratories, INC) 150 μL/pozo incubando a temperatura ambiente durante 2 horas; en seguida, se aspiró la solución y se agregó 150 μL/pozo de solución PBS 1X con Biotina (Ref. SP-2001 Vector Laboratories, INC) se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas. Los sueros de los pacientes fueron diluidos en serie a partir de 1/100 hasta 1/400 en solución PBS 1X Tween 20 al 1% con BSA 1% agregando 100 μL/pozo, tanto en el pozo sensibilizado con el sonicado de P. gingivalis, como en el de PBS, se incubó durante 1 hora a 37°C, luego se adicionó anticuerpo secundario biotinilado anti-IgG1 (Ref. A10650 Invitrogen, EEUU) y/o anti-IgG2 (Ref. B3398 Sigma-Aldrich, EEUU) en una dilución 1/4000 en solución de PBS 1X Tween 20 1% y BSA 1%, 100 μL/pozo, incubándose durante 1 hora a 37°C. Posteriormente se adicionaron 100μL/pozo de estreptavidina peroxidasa (Ref. SNN1004, Invitrogen EEUU), en una dilución de 1/1500, 100 μL/pozo, y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente luego se preparó una solución reveladora O-Fenilendiamina (OPD) (Ref.34005 Pierce Laboratories), en buffer peróxido 1X (Ref. 34062 Thermo scientific, EEUU). Finalmente, la absorbancia se detectó después de parar la reacción utilizando 2 M de H2SO4 (Ref. 6057 Baker-analized). La lectura se realizó a una longitud de onda de 492 nm con una longitud de onda de referencia de 640 nm usando un lector de microplacas (Sunrise™ - Tecan) (96). 28 2.10. Análisis de los datos. Estadística descriptiva Se establecieron las frecuencias de la presencia de anticuerpos anti proteínas/péptidos carbamilados, variables de actividad reumatológica como niveles de anti-CCP (positivo, positivo alto y negativo), niveles de Proteína C Reactiva (PCR) (Normal e Incrementada), niveles de Velocidad de Sedimentación Globular (Normal e Incrementada) y niveles de Factor Reumatoide (positivo, positivo alto y negativo) y variables periodontales como diagnóstico periodontal, valorado por presencia o ausencia de periodontitis, niveles de severidad, niveles de anticuerpos contra P. gingivalis definido por presencia y ausencia (positivo y negativo) para ambos tipos IgG1 e IgG2, Se determinaron medidas de tendencia central y dispersión Se obtuvieron las medidas de tendencia central y dispersión (mediana y RIQ, promedio y DS) para los indicadores periodontales con datos continuos (nivel de inserción, profundidad de bolsa, índice de placa bacteriana) y variables genéticas como el alelos especifico HLA-DRB1 y su frecuencia. Estadística analítica Se hicieron comparaciones de la presencia de anticuerpos anti proteínas/péptidos carbamilados, variables de actividad reumatológica y variables periodontales entre los individuos ART y FDR frente al grupo control del grupo control utilizando pruebas de McNemar para grupos pareados ajustados por sexo. Se utilizó la prueba Shapiro Wilk para determinar si las variables continuas presentaban distribución normal o no normal y de acuerdo con esto para las variables con distribución normal se aplicaron pruebas paramétricas y para las que presentaron distribución no normal se utilizó la prueba no paramétrica de Signos de Wilcoxon. Se realizó Chi2 (X2) y test exacto de Fisher para el análisis de variables categóricas demográficas, clínicas reumatológicas y periodontales. La asociación de estas variables con respecto a la presencia de anti-Carp se evaluó por medio de prueba U mann- Whitney o T-test. Se realizó una regresión logística condicional ajustando posibles variables de confusión (edad y consumo de cigarrillo) para establecer la asociación entre anti-FSC-Carp o anti-Fib-Carp y la condición de AR y FDR. Se utilizó un modelo link test para validar los modelos. Todos los análisis se realizaron por SPSS V24 y STATA para Windows. Considerándose las diferencias estadísticamente significativas cuando p<0.05 29 2.11. Consideraciones éticas Este proyecto hace parte de los proyectos denominados “Asociación de marcadores óseos y anticuerpos anti carbamilados y su relación con índices periodontales y de actividad reumatológica en pacientes con AR temprana y en familiares en primer grado de pacientes con AR.” el cual ha sido aprobado por Hospital Militar Central (código 2013-047), “Seguimiento de la actividad clínica reumática en individuos con riesgo a desarrollar Artritis Reumatoide y pacientes en estados tempranos de la enfermedad asociados a indicadores periodontales”. Financiado por Colciencias convocatoria No. 657-2014. Ambos proyectos fueron avalados y aprobados por el comité de ética del Hospital Militar Central. El proyecto describe una investigación científica en seres humanos con un riesgo mínimo que estará sujeto a todo lo dispuesto en la resolución 008430 de 1993 del Ministerio de Salud de Colombia. Esta investigación tuvo en cuenta los artículos a los que hace alusión dicha resolución en el capítulo I de los aspectos éticos de la investigación en humanos y por las características del estudio que lo clasifica como riesgo mínimo, todo participante firmó un consentimiento informado antes de iniciar el estudio. Adicionalmente, las muestras que se tomaron para procesamiento en los individuos que ingresaron a la consulta, son consideradas como riesgo mínimo para los participantes ya que corresponden a exámenes rutinarios que no generan riesgo adicional. Las muestras de sangre fueron tomadas por personal totalmente entrenado y el total de sangre a extraer está dentro del rango que determina este capítulo para su clasificación como riesgo mínimo. 30 3. OBJETIVOS E HIPÓTESIS 3.1. Objetivo general Evaluar la asociación entre los niveles de anticuerpos anti proteínas/péptidos carbamilados con índices de actividad reumatológica y periodontal en pacientes con AR temprana (ART) y familiares en primer grado (FDR). 3.2. Objetivos específicos 1. Comparar la presencia de anticuerpos anti proteínas/péptidos carbamilados e índices clínicos reumatológicos y periodontales en el grupo de AR temprana y familiares en primer grado comparado con controles. 2. Evaluar la asociación entre los niveles de anticuerpos anti proteínas/péptidos carbamilados y HLA-DRB1, variables de actividad reumatológica y periodontal en pacientes con AR temprana. 3. Evaluar la asociación entre anticuerpos anti proteínas/péptidos carbamilados, HLA-DRB1 y, variables de actividad reumatológica y periodontal en grupo familiares en primer grado. 3.3.Hipótesis H°: No existen asociaciones estadísticamente significativas entre la presencia de anticuerpos anti proteínas/péptidos carbamilados en el grupo de ART y FDR comparado con controles sanos. H1: Existen asociaciones estadísticamente significativas entre la presencia de anticuerpos anti proteínas/péptidos carbamilados y las variables clínicas reumatológicas y periodontales en el grupo de ART y FDR comparado con controles sanos. H°: No existen asociaciones estadísticamente significativas entre anticuerpos anti proteínas/péptidos carbamilados y HLA-DRB1, las variables clínicas reumatológicas y periodontales en el grupo de ART y FDR comparado con controles sanos. H1: Existen asociaciones estadísticamente significativas entre anticuerpos antiproteínas/péptidos carbamilados con HLA-DRB1, las variables clínicas reumatológicas y periodontales en el grupo de ART y FDR comparado con controles sanos. 31 4. RESULTADOS 4.1.Características socio demográficas en los pacientes con ART y sus controles Con el fin de conocer las características sociodemográficas de los pacientes, se les realizó un formulario en el momento de la consulta. En total se incluyeron 51 individuos con diagnóstico de ART cuya media de edad fue de 48.55 ± 10.93 años, la mayor proporción fueron mujeres en 80.4%. La presencia de comorbilidades evaluadas estuvo presente en 54.9% de los pacientes. El 3.9% refirió habito actual de consumo de cigarrillo, el 33.3% tenía antecedente de cigarrillo y el 15.7% eran fumadores pasivos. El 37.3% tenían IMC correspondiente a sobrepeso y el 13.7% a obesidad. En cuanto al grupo control de ART, se analizaron 51 individuos sanos pareados por edad y sexo, cuya presencia de comorbilidades evaluadas estuvo presente en un 51%. El 5.9% refirió habito actual de consumo de cigarrillo, el 35.3% tenía antecedente de cigarrillo y el 21.6% eran fumadores pasivos. (Ver tabla 1). No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos descritos. Tabla 1 Variables sociodemográficas de individuos con ART y controles Masculino Femenino Ausencia Comorbilidad Presencia Exposición Actual De Cigarrillo Ausencia Presencia Exposición Pasada De Cigarrillo Ausencia Presencia Ausencia Fumador Pasivo Presencia Normal Índice de masa corporal Sobrepeso Obesidad Análisis por prueba de Mc Nemar Sexo CTRL 10 19.61% 41 80.39% 24 48.00% 26 52.00% 48 94.12% 3 5.88% 33 64.71% 18 35.29% 40 78.43% 11 21.57% 34 66.67% 14 27.45% 3 5.88% ART 10 19.61% 41 80.39% 23 45.10% 28 54.90% 49 96.08% 2 3.92% 34 66.67% 17 33.33% 43 84.31% 8 15.69% 25 49.02% 19 37.25% 7 13.73% Valor p 0.770 0,647 0.835 0.445 0.155 32 4.2.Características socio demográficas en FDR y controles Para el estudio de las variables mencionadas anteriormente se incluyeron 124 individuos familiares en primer grado de consanguinidad de pacientes con AR (FDR) cuya media de edad fue de 39.24 ± 12.22 años, la mayor proporción fueron mujeres en un 71.8%. La presencia de comorbilidades evaluadas estuvo presente en 41.1% de los FDR. El 4.8% refirió habito actual de consumo de cigarrillo, el 26.6% tenía antecedente de cigarrillo y el 14.5% eran fumadores pasivos. El 36.3% tenían IMC correspondiente a sobrepeso y el 4.8% a obesidad. En cuanto su grupo control se analizaron 124 individuos sanos pareados por edad y sexo, cuya presencia de comorbilidades evaluadas estuvo presente en un 32.3%, con IMC de sobrepeso en un 27.4%, valor más bajo que los FDR sin diferencias estadísticamente significativas y obesidad en un 4.8%, adicionalmente se observó una tendencia en el consumo actual de cigarrillo en donde los sujetos en riesgo FDR fuman actualmente en menor proporción con respecto a los sujetos sanos sin antecedente familiar en sujetos sanos. (Ver Tabla 2) Tabla 2 Variables sociodemográficas de individuos FDR y controles CTRL n Masculino 35 Sexo Femenino 89 Ausencia 84 Comorbilidad Presencia 40 Ausencia 110 Exposición Actual De Cigarrillo Presencia 14 84 Exposición Pasado De Cigarrillo Ausencia Presencia 40 Ausencia 107 Fumador Pasivo Presencia 17 Normal 84 Índice de masa corporal Sobrepeso 34 Obesidad 6 Comparaciones hechas porprueba de Mc Nemar FDR % 28.23% 71.77% 67.74% 32.26% 88.71% 11.29% 67.74% 32.26% 86.29% 13.71% 67.74% 27.42% 4.84% n 35 89 73 51 118 6 91 33 106 18 73 45 6 VALOR p % 28.23% 71.77% 58.87% 41.13% 95.16% 4.84% 73.39% 26.61% 85.48% 14.52% 58.87% 36.29% 4.84% 0.147 0.073 0.401 0.852 0.138 33 4.3.Variables serológicas y actividad reumática en pacientes con ART y controles. En cuanto a los marcadores serológicos y variables de actividad clínica en el grupo de ART se encontraron mayores niveles de PCR (media 14.21±28.95), FR (53.83±60.63) y anti-CCP (media 99.86±151.56) respecto a los niveles detectados en los controles. Para la PCR (media 3.68±4.66), FR (12.42±19.43) y anti-CCP (media 13.04±30.82). Respecto a la VSG no se encontraron diferencias. En cuanto al conteo articular se encontró que el 76.5% y 74.5% del grupo de ART presentaban articulaciones dolorosas e inflamadas. Finalmente, en cuanto a la actividad de la enfermedad se observó que el 62.75% presentó actividad severa medida por el índice DAS28VSG y el 58.82% actividad severa medida por el índice DAS28-PCR y el 58.82% tenían actividad severa medida por el índice SDAI (ver Tabla 3). Tabla 3Variables serológicas y actividad reumática de ART y controles CTRL Negativo 36 70.59% Positivo 15 29.41% Negativo 29 56.86% PCR* Positivo 18 35.29% Positivo alto 4 7.84% Negativo 48 94.12% FR* Positivo 3 5.88% Negativo 47 92.16% Anti-CCP* Positivo 4 7.84% Ausencia 37 72.55% Articulaciones dolorosas* Presencia 14 27.45% 45 88.24% Articulaciones inflamadas* Ausencia Presencia 6 11.76% Leve DAS28-VSG Moderado Severo Leve DAS28-PCR Moderado Severo < 50 VAS > 50 Leve SDAI Moderado Severo *p<0.05 significativo por prueba de Mc Nemar VSG ART 36 15 22 15 14 19 32 28 23 12 39 13 38 14 5 32 11 10 30 35 16 6 15 30 70.59% 29.41% 43.14% 29.41% 27.45% 37.25% 62.75% 54.90% 45.10% 23.53% 76.47% 25.49% 74.51% 27.45% 9.80% 62.75% 21.57% 19.61% 58.82% 68.63% 31.37% 11.76% 29.41% 58.82% Valor p 1.000 0.003 0.001 0.001 0.001 0.001 34 4.4.Variables serológicas y actividad reumática en FDRy controles Se observó mayor frecuencia en la aparición de anticuerpos anti-CCP en FDR (19.3%) comparado con el grupo CTRL (6.45%), mostrándose una asociación de riesgo tres veces mayor en este grupo de individuos (OR 3.6 95%IC: 21.44-11.05 p=0.002).Así mismo, este grupo de sujetos presentaron mayor número de articulaciones dolorosas (37.9%) vs CTRL (22.58%) (OR 2.18 95%IC: 1.17- 4.23 p=0.007), y mayor número de articulaciones inflamadas en FDR 15.32% vs 4.03% de los controles, (OR 5.6 95%IC: 1.63- 30.18 p=0.002), exponiendo una asociación de riesgo a presentar articulaciones dolorosas y articulaciones inflamadas de dos y cinco veces más, respectivamente. (Ver Tabla 4). Tabla 4Variables serológicas y actividad reumática de FDR comparado con CTRL CTRL FDR N n % VALOR p % Negativo 103 83.06% 107 86.29% 0.492 Positivo 21 16.94% 17 13.71% Negativo 84 67.74% 75 60.48% 0.711 PCR Positivo 28 22.58% 33 26.61% Positivo Alto 12 9.68% 16 12.90% Negativo 121 97.58% 119 95.97% 0.479 FR Positivo 2 1.61% 4 3.23% Positivo Alto 1 0.81% 1 0.81% Negativo 116 93.55% 100 80.65% 0.002 Anti-CCP** Positivo 8 6.45% 24 19.35% Ninguna 96 77.42% 77 62.10% 0.007 Articulaciones Dolorosas** Al menos una 28 22.58% 47 37.90% Ninguna 119 95.97% 105 84.68% 0.002 Articulaciones Inflamadas** Al menos una 5 4.03% 19 15.32% FR= factor reumatoide, PCR= proteína C reactiva, VSG = velocidad de sedimentación globular, ** p< 0.01 significativo por prueba de Mc Nemar VSG 35 4.5.Distribución de alelos HLA-DRB1 en pacientes con ART y epítope compartido. Con el fin de identificar los alelos HLA-DRB1 incluyendo además los descritos como EC, se evaluó el panel completo de alelos HLA-DRB1 mediante Luminex. Se encontró que en nuestra población de ART los alelos más frecuentes son HLA DRβ1 *0701 en un 19.6%, *0301 en 8.8%, *1501 en 8.8%, *0405 en 7.8%, *0101 en 7.8 y *0404 en 5.9% (Ver Fig. 1). El EC se encontró en un 52.9% de los pacientes en donde los más frecuentes son HLA DRβ1 *0101 y *0404 y *0405. De aquellos positivos para EC el 54.9% presentaban al menos un alelo y el 11.8% expresaron dos alelos HLA-DRB1 EC (Ver Fig. 2). Figura 1 Distribución de alelos HLA-DRB1 en ART. Cada barra representa el porcentaje de alelos encontrados en los pacientes de ART. 36 Figura 2 Frecuencia de alelos Epítopo compartido y número de alelos en ART. Cada barra representa el porcentaje de alelos EC, número de alelos y alelos encontrados en los pacientes de ART. 4.6.Distribución de alelos HLA-DRB1 en pacientes con FDR y epítope compartido. Al analizar los alelos HLA DRβ1 se encontró que en FDR los alelos más frecuentes fueron HLA DRβ1 *0701 en 19.4%, *0405 en 8.1%, *0407 en 8.1%,*0301 y *0404 en6.0% y *0101 en el 5.2% (Ver Fig. 3). La presencia de EC estuvo en el 53.2% en donde los más frecuentes fueron el HLA DRβ1 *0405 en 26.3%, *0404 en 19.7%, *0101 en 17.1% y *1402 en 15.8%. De aquellos positivos para EC, el 45.2% presentaban al menos un alelo y el 8.1% expresaron dos alelos HLADRB1 EC (Ver Fig. 4). 37 Figura 3 Distribución de alelos HLA-DRB1 en FDR. Cada barra representa el porcentaje de positividad del alelo HLA-DRB1 respectivo Figura 4 Frecuencia de alelos EC en FDR. Cada barra representa el porcentaje de positividad de la Presencia de EC, alelos HLA-DRB1 EC y número de alelos EC positivos 38 4.7.Variables periodontales de pacientes con ART y controles Con el fin de identificar la condición periodontal de pacientes con ART y controles se evaluaron variables como el diagnóstico periodontal, severidad de la enfermedad, índice de placa bacteriana, inflamación gingival, sangrado al sondaje, profundidad de bolsa y de nivel de inserción, presencia de P. gingivalis, anticuerpos anti IgG1 e IgG2 contra P. gingivalis en ambos grupos.. Se encontró que el diagnóstico de EP estuvo presente en un 72.5% de los pacientes con ART sin diferencias significativas respecto a su grupo control. Respecto a la presencia de P. gingivalis, se encontró en un mayor porcentaje en los pacientes al compararse con los controles, 78% en ART vs 45.1% CTRL, respectivamente (p=0.001). Los anticuerpos IgG1 e IgG2 anti P. gingivalis se encontraron en mayor frecuencia en los controles que en los pacientes con ART en títulos 1/100 y títulos 1/400 (p= 0.001 y p= 0.005, respectivamente). Para las demás variables periodontales evaluadas se encontraron diferencias significativas en la presencia de inflamación gingival (p=0.021) y en los sitios con profundidad de bolsas ≥4 (p=0.032) siendo mayor en los pacientes respecto a los controles. Para las demás variables no se encontraron diferencias (Ver tabla 5). Tabla 5Variables Periodontales de individuos con ART y controles Diagnostico Periodontal ° Severidad ° P. gingivalis °* Acs IgG1° * Acs IgG1 °* Acs IgG2 °** Ausencia Presencia Ninguna Leve Moderado Severa Ausencia Presencia < 1/100 ≥ 1/100 < 1/400 ≥ 1/400 < 1/100 CTRL ART n 15 36 15 5 27 4 28 23 22 29 33 18 20 n 14 37 14 6 21 10 11 40 34 17 43 8 37 % 29.41% 70.59% 29.41% 9.80% 52.94% 7.84% 54.90% 45.10% 43.14% 56.86% 64.71% 35.29% 39.22% VALOR p % 27.45% 72.55% 27.45% 11.76% 41.18% 19.61% 21.57% 78.43% 66.67% 33.33% 84.31% 15.69% 72.55% 0.826 0.328 0.001 0.017 0.023 0.001 39 Acs IgG2°** ≥ 1/100 < 1/400 ≥ 1/400 31 36 15 60.78% 70.59% 29.41% 14 47 4 27.45% 92.16% 7.84% 0.005 0.53 ± 0.29 0.61 ± 0.30 0.151 Índice de placa ◊ 0.40 ± 0.30 0.59 ± 0.30 Inflamación gingival ◊ 0.021 0.38 (0.22-0.57) 0.38 (0.32-0.28) 0.160 Sangrado al sondaje ▲ 7.68 (10.95-3.89) 0.032 Sitios con profundidad de bolsas ≥4 ▲ 1.19 (0.00-6.67) 1.44 (0.91-2.08) 1.58 (1.37-1.20) 0.433 Promedio de nivel de inserción ▲ 2.20 ± 0.44 2.11 ± 0.46 0.252 Profundidad de bolsa–Total Boca ◊ Acs: anticuerpos° =n (%), ◊= media ± DS, ▲=mediana (RIQ). * p<0.05 ** p< 0.01 significativo por prueba de Mc Nemar o prueba de signos de Wilcoxon. 40 4.8.Variables periodontales de FDR y controles En cuanto a las variables periodontales en FDR se observó que la frecuencia de EP en FDR fue similar a la de los controles (60.5% vs59%, respectivamente). La presencia de P. gingivalis se encontró en mayor porcentaje (62.1% en los FDR vs 42.7% en los controles (OR 2.14 95%IC: 1.25- 3.78 p=0.003). En cuanto a los anticuerpos anti P. gingivalis IgG1 e IgG2 se encontraron en mayor frecuencia en los controles que en FDR (p= 0.003 y p= 0.001 respectivamente) (Ver Tabla 6).Variables como Inflamación gingival y sitios con profundidad de bolsas ≥4 fueron superiores en FDR frente a controles. Tabla 6Variables Periodontales en FDR comparado con Controles CTRL FDR VALOR p n % n % 55 44.35% 49 39.52% 0.396 69 55.65% 75 60.48% 55 44.35% 49 39.52% 0.396 Severidad 17 13.71% 19 15.32% 44 35.48% 47 37.90% 8 6.45% 9 7.26% 71 57.26% 47 37.90% 0.003 P. gingivalis** 53 42.74% 77 62.10% 52 41.94% 80 64.52% 0.003 Acs IgG1 ** 72 58.06% 44 35.48% 85 68.55% 109 87.90% 0.001 Acs IgG1 ** 39 31.45% 15 12.10% 43 34.68% 91 73.39% 0.001 Acs IgG2 ** 81 65.32% 33 26.61% 86 69.35% 115 92.74% 0.002 Acs IgG2** 38 30.65% 9 7.26% 0.45 (0.30-0.70) 0.48 (0.29-0.78) 0.689 Índice de placa ▲ 0.26 (0.13-0.47) 0.44 (0.26-0.68) 0.001 Inflamación gingival ▲ 0.35(0.22-0.51) 0.25 (0.09-0.70) 0.121 Sangrado al sondaje ▲ 1.72 (0.00-6.90) 2.38 (0.68-9.48) 0.034 Sitios con profundidad de bolsas ≥4 ▲ 0.87 (0.32-1.48) 0.78 (0.32-1.39) 0.676 Promedio de nivel de inserción ▲ 2.14 (1.92-2.37) 2.09 (1.95-2.36) 0.921 Profundidad de bolsa–Total Boca ▲ ▲=mediana (RIQ). * p<0.05 ** p< 0.01 significativo por prueba de Mc Nemar o prueba de signos de Wilcoxon. Acs: anticuerpos Diagnostico Periodontal Ausencia Presencia Ninguna Leve Moderado Severa Ausencia Presencia < 1/100 ≥ 1/100 < 1/400 ≥ 1/400 < 1/100 ≥ 1/100 < 1/400 ≥ 1/100 41 4.9.Presencia de anticuerpos carbamilados anti proteína y antipéptido, su asociación con HLA-DRB1, índices de actividad reumatológica y periodontal en pacientes con ART comparado con controles. Con el fin de determinar si existían diferencias entre la presencia de anticuerpos anti proteína y anti péptido carbamilado entre pacientes con ART y controles, estos se midieron por ELISA. Se encontró un mayor porcentaje de anti-FCS-Carp positivo en el grupo de pacientes comparado con el grupo control (47.1% vs. l7.8%, respectivamente, (OR 7.6 95%IC: 2.3-39.88 p= 0.0001). En cuanto a la frecuencia positiva de los anticuerpos contra los péptidos carbamilados, los anti-CaFib2 positivos también se encontraron en mayor porcentaje 47,1% pacientes vs 13,7% en CTRL (OR 6.6 95%IC: 1.97- 35.0 p = 0.0005) mostrando una asociación de riesgo de presentar anticuerpos anti-FCS-Carp y anti-Ca-Fib2 siete y seis veces mayor en los pacientes, pero no se encontraron diferencias en la frecuencia los anti-Ca-Fib3 entre pacientes y controles. (31.4% vs 21.6% respectivamente OR 1.71 95%IC: 0.62-5.13, p = 0.359) (Ver Fig. 5). Adicionalmente, se encontraron anticuerpos anti-Fib ≥ 1/50 en un 68.6% en ART vs. 15.7% en CTRL (OR 6.4 95%IC: 2.47- 21.04 p=0.001) Figura 5 Frecuencia de anticuerpos anti-proteína (anti-FCS-Carp) y anti-péptidos carbamilados en ART comparado con CTRL. Cada barra representa el porcentaje de positividad de los respectivos anticuerpos. *p<0.05 ** p<0.01 significativo por prueba de Mc Nemar 42 Al evaluar la asociación entre los niveles de anticuerpos anti proteínas carbamiladas y la presencia de alelos HLA-DRB1, se encontró que los anti-FCS-Carp no se asociaron con la presencia de algún alelo HLA-DRB1 EC ni con el número de alelos HLA-DRB1 EC, sin embargo, cuando se analizó individualmente los alelos HLA-DRB1, los anti-FCS-Carp se asociaron con el alelo no EC *1501 (p= 0.033) y con el alelo EC*1402 (p=0.027) (Ver Fig. 6). El HLA DRB1 no se asoció con las variables periodontales o reumatológicas evaluadas. En cuanto a la asociación de la presencia de anticuerpos anti péptidos carbamilados, observamos que los anticuerpos anti-Ca-Fib2 se asociaron con la presencia de FR positivo (p = 0.022) y con anti-CCP positivo mayor a 60 U (p = 0.032) (Ver Fig. 7). Sin embargo, la presencia de anti-CaFib2 no se asoció con la presencia en general de alelos HLA-DRB1 EC (p= 0.507). No obstante, observamos asociación con alelos HLA-DRB1 individualmente, con el alelo EC *0405 (p= 0.050) y alelos no EC como*1501 (p=0.026) y *0407 (p=0.010) (Ver Fig. 8). Finalmente, la presencia de anti-Ca-Fib3 se asoció con el índice de actividad de la enfermedad DAS28-VSG (p= 0.046) y con el alelo HLA-DRB1 EC *1402 (p=0.050) y el alelo no EC *0301 (p=0.025) (Ver Fig. 9). Ningún anticuerpo anti proteínas/péptidos carbamilados se correlacionó con variables periodontales. A n t i- F C S - C a r p e n in d iv id u o s H L A - D R B 1 * 1 4 0 2 A n t i- F C S - C a r p e n in d iv id u o s H L A - D R B 1 * 1 5 0 1 * p = 0 .0 3 100 100 80 80 p o r ce n ta je p o r ce n ta je * p = 0 .0 2 60 40 60 40 20 20 0 0 A n t i- F C S - C a r p n e g a t iv o A n t i- F C S - C a r p p o s it iv o A n t i- F C S - C a r p n e g a t iv o A n t i- F C S - C a r p p o s it iv o Figura 6 Asociación entre Anti-FCS-Carp y alelos HLA-DRB1 en ART. Cada barra representa el porcentaje de positividad de los anticuerpos anti proteína carbamilada en el grupo de positivos para el alelo respectivo * p<0.05 ** p< 0.01 significativo por prueba de Chi2 y corrección por prueba de Fisher 43 Figura 7 Asociación entre Anti-Ca-Fib2 y presencia de autoanticuerpos en ART. Cada barra representa el porcentaje de positividad de los anticuerpos anti péptido carbamilado en el grupo de positivos para el alelo respectivo * p<0.05 ** p< 0.01 significativo por prueba de Chi2 o prueba de Fisher Figura 8 Asociación entre Anti-Ca-Fib2 y alelos HLA-DRB1 en ART. Cada barra representa el porcentaje de positividad de los anticuerpos anti péptido carbamilado en el grupo de positivos para el alelo respectivo. * p<0.05 ** p< 0.01 significativo por prueba de Chi2 o prueba de Fisher 44 Figura 9 Asociación entre Anti-Ca-Fib2 e índice de actividad en ART. Cada barra representa el porcentaje de índice DAS 28 VSG mayor a 2.6 en cada grupo de los anticuerpos anti péptido carbamilado. * p<0.05 ** p< 0.01 significativo por prueba de Chi2 o prueba de Fisher Finalmente, se evaluó la asociación entre la presencia de los anticuerpos anti proteína/péptido carbamilado (Anti-FCS-Carp, Anti-Ca-Fib2, Anti-Ca-Fib3) y variables asociadas con la condición de ART, para esto se desarrollaron dos modelos de regresión logística condicional. En el primer modelo (A) de regresión logística condicional se incluyeron Anti-FCS-Carp, AntiCa-Fib2, Anti-Ca-Fib3, anti-CCP y P. gingivalis y en el segundo (B) Anti-Ca-Fib2, Anti-CaFib3, Anti-CCP y P. gingivalis que fueron previamente asociados en los análisis bivariados. Ambos modelos fueron ajustados a edad y antecedente de cigarrillo. Al comparar el modelo A y el modelo B se utilizaron dos criterios de uso frecuente para la selección de modelos, los índices AIC y BIC (Criterio de información de Akaike y criterio de información bayesiano, respectivamente) y basados en los valores del BIC fue elegido el modelo (B) , donde se confirmó la asociación de riesgo entre la presencia de anti-Ca-Fib2 (OR 6.72 95%IC: 1.09-41.38 p= 0.040) y de anti-CCP positivo (OR 7.94 95%IC: 1.44-43.77 p= 0.017) con el diagnóstico de ART ajustados por edad y antecedente de consumo de cigarrillo ( Ver Tabla 7). 45 Tabla 7 Modelo de regresión logística condicional para indicadores asociados a la condición de ART MODELO AJUSTADO OR 95%CI Valor p Edad 1.348 0.437 - 4.158 0.603 Antecedente de cigarrillo 1.466 0.414 - 5.192 0.553 Anti-Ca-Fib2 6.726 1.093 - 41.384 0.040 Anti-Ca-Fib3 0.361 0.0514 - 2.540 0.306 Anti-CCP 7.948 1.443 - 43.77 0.017 P. gingivalis 3.463 0.940 - 12.759 0.062 4.10. Presencia de anticuerpos carbamilados anti proteína y anti péptido, su asociación con HLA-DRB1, variables de compromiso articular y periodontal en FDR y controles. Por otro lado, se observó un mayor porcentaje de los anti-FCS-Carp positivo en el grupo de FDR comparado con de los CTRL 25.00% vs 14.52%, respectivamente (OR 2.625 95%IC: 1.11-6.85 p=0.015). Los anti-Ca-Fib2 positivos estaban presenten un mayor porcentaje 34.68% vs 15.32% FDR respecto a los CTRL, respectivamente (OR 4.0 95%IC: 1.80-10.04 p=0.001)., Los anti-Ca- Fib3 positivos predominaron también en un mayor porcentaje en los FDR 33.06% vs 11.29% CTRL (Ver Fig. 10) (OR 4.85 95%IC: 2.11- 12.98 p=0.001) exponiendo una asociación de riesgo a presentar mayor frecuencia de anticuerpos anti péptido carbamilado en estos individuos sanos pero con riesgo genético. Sin embargo, no hubo diferencias entre la presencia de anticuerpos antiFib1 entre FDR y CTRL (p= 0.878). 46 40 30 20 10 ** 50 % a n t i- C a - F ib 3 p o s it iv o % a n t i- C a - F ib 2 p o s it iv o % a n t i-F C S -C a r p p o s it iv o * 50 40 30 20 10 0 0 CO N TRO L FD R p = 0 .0 1 5 ** 50 40 30 20 10 0 CO N TRO L p = 0 .0 0 1 FD R CO N TRO L FD R p = 0 .0 0 1 Figura 10Frecuencia de anticuerpos anti-proteína (anti-FCS-Carp) y anti-péptidos carbamilados en FDR comparado con CTRL . Cada barra representa el porcentaje de positividad de los respectivos anticuerpos.* p<0.05 ** p< 0.01 significativo por prueba de Mc Nemar o prueba de signos de Wilcoxon En el grupo de FDR, los anticuerpos anti-FCS-Carp se asociaron con la presencia del alelo EC *1402 (p=0.035) al igual que los pacientes con ART (Ver Fig. 11), también se encontró asociación con niveles de PCR (p=0.016) (Ver Fig. 12) y se correlacionó débilmente con FR (r =0.26 p=0.0034) y, con la presencia de articulaciones dolorosas (r = 0.18 p=0.0425) (Ver Fig. 13). La presencia de anticuerpos anti-Ca-Fib2 se asociaron con la presencia del alelo HLA-DRB1 EC *1501 (p=0.03) y con alelo no EC *0901 (p=0.01) (Ver Fig. 14). Sin embargo, no se asociaron con ninguna variable periodontal (Tabla 7). Los resultados para los anti-Ca-Fib3 demostraron una asociación con FR positivo (p= 0.0012) (Ver Fig. 15) y observamos una tendencia con la presencia del alelo EC *0405 (p=0.061). Con el fin de establecer la asociación de la presencia de anticuerpos anti proteína/péptido carbamilado y variables asociadas la condición de FDR se desarrollaron 2 modelos de regresión logística condicional ajustado a edad y exposición actual de cigarrillo y 2 modelos ajustados a edad y exposición previa de cigarrillo. En la primera regresión se escogió el modelo que incluía Anti-Ca-Fib3, presencia articulaciones dolorosas, anticuerpos IgG2 P. gingivalis y presencia de P. gingivalis ajustado a edad y exposición previa de cigarrillo, basado en los valores del BIC de validación (anteriormente descrito). Encontrando así que la condición de FDR se asocia con la presencia de anti-Ca-Fib3 (OR 4.715 95%IC: 1.89-11.75 p=0.001), con la presencia de articulaciones dolorosas (OR 2.183 47 95%IC: 1.01-4.68 p=0.045), así como una tendencia importante para la presencia de P. gingivalis (OR 1.90 95%IC: 0.96-3.74 p=0.062). En el segundo modelo de regresión se incluyeron como variables de interés anti-Ca-Fib2, antiCa-Fib3, presencia de articulaciones dolorosas, anticuerpos IgG2 P.gingivalis, anticuerpos IgG1 P.gingivalis, presencia de P. gingivalis encontrando de la misma manera que la condición de FDR se asocia con la presencia de anti-Ca-Fib3 (OR 2.976 95%IC: 1.084-8.166 p=0.034) y con la presencia de articulaciones dolorosas (OR 2.28295%IC: 1.047-4.971 p=0.038). No se encontró asociación en el grupo de FDR con la presencia de anticuerpos IgG2 anti P. gingivalis (OR 0.118 95%IC: 0.038-1.365 p=0.01) (Ver Tabla 9 y 10). A n t i- F C S - C a r p e n in d iv id u o s H L A - D R B 1 * 1 4 0 2 * p = 0 .0 3 100 P o r c e n ta je 80 60 40 20 0 A n t i- F C S - C a rp A n t i- F C S - C a rp n e g a t iv o p o s it iv o Figura 11 Asociación entre Anti-FCS-Carp y alelo HLA-DRB1 EC *1402 en FDR. Cada barra representa el porcentaje de positividad de los anticuerpos anti proteína carbamilado en el grupo de positivos para el alelo respectivo. * p<0.05 ** p< 0.01 significativo por prueba de Chi2 o prueba de Fisher 48 100 p = 0 .0 0 3 4 r= 0 .2 6 1 3 80 FR 60 40 20 0 0 20 40 60 A n ti-F C S -C a r p (U I ) 80 100 N ° d e a r tic u la c io n e s d o lo r o s a s Figura 12 Asociación entre Anti-FCS-Carp y variables clínicas en FDR. Cada barra representa el porcentaje de PCR mayor a 3 mg/L en el grupo de positivos y negativos para anticuerpos anti proteína carbamilado. * p<0.05 ** p< 0.01 significativo por prueba de Fisher 10 p = 0 .0 4 2 4 r= 0 .1 8 2 6 8 6 4 2 0 0 20 40 60 80 100 A n ti-F C S -C a r p (U I ) Figura 13 Correlación de niveles de anti-FCS-Carp y variables reumatológicas. *p<0.05 significativo por correlación de Spearman 49 Figura 14 Asociación entre Anti-Ca-Fib2 y alelos HLA-DRB1 *14501 y *0901 en FDR. Cada barra representa el porcentaje de positividad de los anticuerpos anti péptido carbamilado en el grupo de positivos para el alelo respectivo. * p<0.05 ** p< 0.01 significativo por prueba de Chi2 o prueba de Fisher 50 Tabla 8 Asociación entre Anti-Ca-Fib2 y variables periodontales en FDR Anti-Ca-Fib2 Negativo Positivo n % n % Ausencia 9 33.3% 5 20.8% Presencia 18 66.7% 19 79.2% Ninguna 9 33.3% 5 20.8% Severidad Leve 3 11.1% 3 12.5% Moderada 11 40.7% 10 41.7% Severa 4 14.8% 6 25.0% Ausencia 7 25.9% 4 16.7% P. gingivalis Presencia 20 74.1% 20 83.3% <1/100 19 70.4% 15 62.5% Acs IgG1 ≥1/100 8 29.6% 9 37.5% <1/400 23 85.2% 20 83.3% Acs IgG1 ≥1/400 4 14.8% 4 16.7% <1/100 19 70.4% 18 75.0% Acs IgG2 ≥1/100 8 29.6% 6 25.0% <1/400 25 92.6% 22 91.7% Acs IgG2 ≥1/400 2 7.4% 2 8.3% Acs= anticuerpos (valores en títulos); P. gingivalis= Porphyromonas gingivalis Enfermedad Periodontal Valor p 0.712 0.843 0.422 0.234 0.085 0.129 0.902 Figura 15 Asociación entre Anti-Ca-Fib3 y presencia de Factor reumatoide en FDR. Cada barra representa el porcentaje de FR positivo en la distribución de anticuerpos anti péptido carbamilado. * p<0.05 ** p< 0.01 significativo por prueba de Chi2 o prueba de Fisher 51 Tabla 9 Modelo de regresión logística condicional para indicadores asociados a la condición de FDR –ajustado a edad y exposición actual de cigarrillo MODELO AJUSTADO OR 95%CI Valor p Edad 0.840 0.450-1.568 0.584 Exposición actual de cigarrillo Anti-Ca-Fib3 0.618 4.716 0.169-2.264 1.892-11.750 0.468 0.001 Presencia Articulaciones dolorosas 2.184 1.016-4.689 0.045 Acs IgG2 P. gingivalis 0.107 0.035-0.324 0.010 Presencia de P. gingivalis 1.903 0.967-3.742 0.062 Tabla 10 Modelo de regresión logística condicional para indicadores asociados a la condición de FDR –ajustado a edad y exposición previa de cigarrillo MODELO AJUSTADO edad OR 0.770 95%CI 0.402-1.473 Valor p 0.43 exposición previa de cigarrillo 0.919 0.397-2.124 0.843 Anti-Ca-Fib2 2.800 0.931-8.411 0.067 Anti-Ca-Fib3 2.976 1.084-8.166 0.034 Presencia de Articulaciones dolorosas 2.282 1.047-4.971 0.038 Acs IgG2 P.gingivalis Acs IgG1 P.gingivalis 0.118 0.038-1.365 0.010 0.457 0.193-1.076 Presencia de P. gingivalis 1.778 0.876-3.604 0.073 0.111 52 5. RESUMEN DE RESULTADOS Existe una tendencia en el consumo actual de cigarrillo en donde los sujetos en riesgo FDR fuman en menor proporción con respecto a los sujetos sanos sin antecedente familiar en sujetos sanos. Hay mayor frecuencia de anticuerpos anti-CCP, articulaciones dolorosas y número de articulaciones inflamadas en FDR con respecto a los sujetos sanos sin antecedente familiar en sujetos sanos Los alelos HLA-DRB1 más frecuentes son HLA DRβ1 *0701, *0301, *1501, *0405, *0101 y *0404 en ART. El HLA-DRB1 EC está en más del 50% de los pacientes con ART y los más frecuentes son HLA DRβ1 *0101 y *04045. Los alelos HLA DRβ1 más frecuentes en FDR son HLA DRβ1 *0701, *0405, *0407,*0301 y *0404 y *0101. El HLA-DRB1 EC está presente en más del 50% en FDR y los más frecuentes fueron el HLA DRβ1 *0405, *0404, *0101 y *1402. La P. gingivalis está presente en mayor frecuencia en los pacientes de ART, mientras que los anticuerpos IgG1 e IgG2 anti P. gingivalis se encontraron en mayor frecuencia en los controles. Existe mayor presencia de inflamación gingival y sitios con profundidad de bolsas ≥4 en ART y en FDRcomparado con controles Existe mayor presenciaP. gingivalis en FDR y los anticuerpos anti P. gingivalis IgG1 e IgG2 se encontraron en mayor frecuencia en los controles. Hay mayor porcentaje de anticuerpos anti-Fibrinógeno nativo, anti-FCS-Carp y anti-CaFib2 positivos en ART. Los anti-FCS-Carp se asociaron los alelos HLA-DRB1 *1501 y con el *1402 siendo este último considerado EC en ART. Los anticuerpos anti-Ca-Fib2 se asociaron con la presencia de FR y con anti-CCP, con los alelos HLA-DRB1: el alelo EC *0405 y los alelos no EC *1501 *0407 y se asoció con tener la condición de ART. La presencia de anti-Ca-Fib3 se asoció con el índice de actividad de la enfermedad DAS28-VSG y con el alelo HLA-DRB1 EC *1402 y el alelo no EC *0301 en ART. 53 Los anticuerpos anti proteína/péptido carbamilado (Anti-FCS-Carp, Anti-Ca-Fib2, AntiCa-Fib3) no se asociaron con ninguna variable periodontalen ART y FDR. Los FDR tienen mayor porcentaje y mayor riesgo de presentar anticuerpos anti-FCS-Carp positivos, anti-Ca-Fib2 y anti-Ca-Fib3 pero no anticuerpos anti-Fibrinógeno. Los anticuerpos anti-FCS-Carp en FDR se asociaron con la presencia del alelo HLADRB1 *1402 y niveles positivos de PCR , además se correlacionó débilmente con FR y con la presencia de articulaciones dolorosas Los anticuerpos anti-Ca-Fib2 en FDR se asociaron con la presencia del alelo HLA-DRB1 *1501, *0901 y Los anti-Ca-Fib3 se asoció con FR positivo y con la condición de FDR. 54 6. DISCUSIÓN La AR es una de las enfermedades inflamatorias articulares más frecuentes, con una prevalencia de alrededor del 1%en diferentes poblaciones (18-23). A pesar de esta prevalencia tan elevada, no ha sido posible aclarar todos los aspectos de su etiopatogenia (5).Últimamente se han descubierto nuevos aspectos de la patogenia de la AR con numerosas consecuencias en el tratamiento y pronóstico de esta enfermedad tan agresiva. Para ello, la búsqueda de pruebas serológicas en el diagnóstico temprano de pacientes con la AR ha sido constante. Se han descrito muchos autoanticuerpos presentes en el suero de los pacientes con la AR, con una prevalencia variable, y que se han clasificado como específicos o inespecíficos de AR (21,23,24). Recientemente, se ha dirigido un mayor esfuerzo de investigación hacia las fases de "riesgo" de la AR, antes del desarrollo de signos clínicos de inflamación articular, para identificar a las personas con riesgo de desarrollar AR estudios epidemiológicos basados en la población han demostrado que tener un historial familiar de AR aumenta el riesgo de AR aproximadamente de tres a cinco veces, y el riesgo es mayor en los FDR debido a que este es un grupo de individuos sanos que comparten al algunos factores de riesgo genéticos y ambientales con los pacientes de AR en comparación con individuos sanos sin antecedentes familiares (97-101). En los últimos años se ha obtenido una importante percepción sobre la ocurrencia y la etiopatogenia de la AR con la presencia de autoanticuerpos que caractericen esta manifestación de AR(26-36),diversos estudios destacan los anticuerpos anti-CarP recientemente descritos como un novedoso e interesante sistema de autoanticuerpos con implicaciones potencialmente importantes en el diagnóstico, pronóstico y severidad de la AR (45-52).Los ensayos para probar la presencia de anti-CarP con mayor frecuencia utilizan Suero Fetal Bovino (SFB) que contiene una mezcla de proteínas carbamiladas. Los autoantígenos exactos a los que se une el anti-CarP siguen sin estar claros.Sin embargo, unos pocos han tratado de dilucidar el antígeno al cual están dirigidos estos autoanticuerpos anti-CarP específicamente incluyendo proteínas como fibrinógeno, vimentina y α enolasa entre otros teniendo en cuenta otras modificaciones postraduccionales como la citrulinación como guía (45-47). Nuestro estudio tiene en cuenta la presencia de anticuerpos dirigidos a múltiples proteínas a partir de SFB carbamilado y anticuerpos dirigidos a una secuencia de cadena beta del fibrinógeno 55 teniendo en cuenta que es una de las proteínas en la articulación que sufre más modificaciones postraduccionales en patologías como la AR. Esto seconfirmacon trabajos como el de Jones et al. quienes identificaron la reactividad de anticuerpos anti-CarP positivos frente a péptidos específicos y los sitios específicos de homocitrulinas (lisinas carbamiladas) presentes en la cadena beta del fibrinógeno humano carbamiladoen sueros de pacientes con AR establecida. Encontrando que los anticuerpos anti-FCS-CarP están dirigidos principalmente contra el fibrinógeno humano y específicamente hacia péptidos homocitrulinados en la cadena β de fibrinógeno, reiterando la presencia de epítopos inmunodominantes en esta secuencia (NEEGFFSAHomoCitHRPLDKK) utilizada en nuestro proyecto. (43-47,102). Al comparar la presencia de anticuerpos dirigidos a múltiples proteínas en nuestra población de ART encontramos que existe mayor porcentaje de anticuerpos anti-FCS-Carp (47.1%)comparado con controles (l7.8%) similar alo reportado por Shi J et al, quienes describen la presencia de antiFCS-CarP en los sueros de pacientescon AR establecida, a pesar de la diferencia en el tiempo de evolución de la enfermedad entre eses estudio y el nuestro (menos de dos años), la frecuencia encontrada es similar (más del 45%) (45).de la misma manera, Regueiro C et al.,describe en uno de sus trabajos resultados de la presencia y asociación de anticuerpos anti-FCS-CarP en pacientes AR establecida y ART, encontrando que la fracción de pacientes positivos para anti-FCS-CarP oscila entre 30,6 y 45,9% (103). Truchetet et al., identifica la presencia de anticuerpos anti-CarP en una cohorte de pacientes con ART en aproximadamente un tercio de los pacientes (32,6%) (104) y en otro estudio cuyo objetivo fue analizar la presencia de anti-FCS-CarP y su asociación con la pérdida ósea yuxtaarticular o sistémica en una cohorte de pacientes con ART, Regueiro C et al describe un porcentaje un poco más bajoen los pacientes ART anti-FCS-CarP positivo (26%). Esto puede ser debido al gran tamaño de la poblaciónevaluada que diluye el porcentaje, sin embargo, la cantidad de individuos que representa ese porcentaje es (considerable n= 138/ 532 pacientes) (105) y, esto nos reafirma que estos autoanticuerpos anti-CarP están presentes tanto en formas establecidas como en etapas tempranas de la enfermedad definiéndolos como otro grupo de autoanticuerpos dirigidos a modificaciones postranscripcionales de proteínas endógenas en la patogénesis de la AR. 56 En la búsqueda del blanco específico de los anticuerpos anti-FCS-CarP es importante destacar que nuestro estudio evalúa dos péptidos con la misma secuencia, pero con variaciones en la posición de la homocitrulina. Al encontrar que la presencia de anticuerpos anti péptidos carbamilados anti-Ca-Fib2 están en mayor porcentaje en pacientes ART (47,1%)vs 13,7% en CTRL (OR 6.6 95%IC: 1.97- 35.0) y que los anti-Ca-Fib3 no se presentan de manera diferente en los ART que a los CTRL, se puede sugerir que los pacientes con ART desarrollan de manera temprana modificaciones que incluyen carbamilaciones en la posición 45 y no en la parte extrema en posiciones 51-52. A nuestro conocimiento no existen reportes de producción de autoanticuerpos contra estos péptidos en pacientes con ARTsolo en AR de mayor tiempo de evolución. Podemos entonces comparar los resultados con dos estudios que utilizan las mismas secuencias específicas de cadena beta del fibrinógeno pero con grupos de pacientes con AR establecida: el primer estudio utiliza esta secuencia de la cadena beta del fibrinógenocon la modificación de homocitrulina en la posición 45, al igual que nuestro anti-Ca-Fib2,en pacientes con AR establecida para determinar si los anti-CCP también reconocen la homocitrulina cuando se encuentra en la misma posición que la citrulina en un péptido. Para este propósito, realizaron pruebas utilizando el péptido de fibrinógeno citrulinado y dentro del esqueleto peptídico, se introdujo un residuo de citrulina, arginina, homocitrulina o lisina para su posterior análisis, observando que los anti-CCP solo reconocen el péptido con la citrulina, pero no el péptido que contiene arginina o el que contiene homocitrulina. Estos datos indican que los anti-CCP pueden discriminar entre la presencia de citrulina y homocitrulina dentro del mismo esqueleto peptídico definiendo una vez más que este es un grupo independiente autoanticuerpos y que posiblemente uno de los blancos importantes en el reconocimiento de los anti-CarP son las secuencias del fibrinógeno (45). El segundo estudio muestra que péptidos de la cadena beta del fibrinógeno humano carbamilado en sueros de pacientes con AR establecida son blancos inmunodominantes a la hora de la generación de anti-CarP,describiendo que aquellas secuencias del fibrinógeno se carbamilan en posiciones 83,52, 264, 351, 367 y 374 principalmente en algunos sueros de pacientes con AR en etapas establecidas. Este estudio incluyela secuencia peptídica que se asemeja a los anti-Ca-Fib3 que contiene la homocitrulina en posición 52 y 53,sin embargo, este estudio anterior concluye que esta modificación única en la posición 52 no es suficiente para que esta secuencia sea un 57 epítopo inmunodominante (102). Lo anteriorpodríaexplicar por qué no existen diferencias entre la presencia de anti-Ca-Fib3 entre ART vs CTRL en nuestro trabajoy además también puede sugerir que esta modificación no se produce en etapas de enfermedad sino en etapas posteriores o que no son detectables sus niveles a nivel sérico en etapas inicialespor lo cual se haría necesario próximos estudios que analicen la presencia de estos anticuerpos en fluidos directamente de la articulación inflamada en pacientes con ART. Debido a la falta de datos que reporten frecuencias de anticuerpos anti péptidos carbamilados dirigidos a secuencias especificas nuestros datos fueron comparados con reportes de frecuencias de anticuerpos dirigidos hacia la molécula completa de fibrinógeno como en el caso de Scinocca M,quien presenta resultados de anticuerpos anti fibrinógeno carbamilado en diferentes enfermedades con afecciones reumáticas inflamatorias como AR establecida, artritis psoriásica y lupus eritematoso sistémico. Enestos grupos,al ser comparados contra sujetos sanos,se encontróque los anticuerpos contra fibrinógeno homocitrulinado estaban presentes específicamente en el 49% de los pacientes con AR, frecuencia no tan distante a nuestros resultados, teniendo en cuenta que nosotros utilizamos péptidos específicos y no la proteína completa, lo que refuerza la idea de la inmunodominancia del péptido seleccionado. Por otro lado Jiang X, quien en dos cohortes de pacientes ART, reporta que se detectaron anticuerpos anti-CarP-Fib en el 38.0% - 42.6% ,(62,106),reiterando una vez más que el fibrinógeno podría ser una de las proteínas que más sufre PTM como carbamilación y que puede ser uno de los posibles blancos de los autoanticuerpos anti-CarP al estar presente en una alta proporción de pacientes con AR y en estadios tempranos. Desde otro ángulo, el hecho de estudiar familiares de pacientes con AR podría considerarse una forma de investigar las fases preclínicas de la AR, ya que los pacientes y familiares comparten algunos de los riesgos genéticos y ambientales de la AR. Los resultados en nuestro grupo de riesgo FDR muestran un mayor porcentaje de anti-FCS-Carp, anti-Ca-Fib2 y anti-Ca-Fib3 comparado con el grupo de los CTRL. A nuestro conocimiento, este es el primer estudio donde se mide la frecuencia de anticuerpos anti péptido carbamilado en FDR. La literatura solo reporta la evaluación de anticuerpos anti-carbamilados usando el SFB carbamilado como antígeno. El primer estudio que analizó que analizó la prevalencia de anti-FCS-Carp en FDR y AR comparados con sujetos sanosfue el de Alessandri C, encontrando que estos anticuerpos se 58 encuentran en una frecuencia significativamente más alta en FDR que en sujetos sanos 9.2% vs 6.3% estos hallazgos confirman que los anti-CarP se presentan en grupos de riesgos como los familiares (99). Koppejan H, analiza pacientes con AR, FDR y controles nativos americanos,reportandoque los anticuerpos anti-CarP se presentan en mayor frecuencia en los FDR que en los controles 18.3% vs 4.7% (OR 4.55, 95% CI 1.49–13.88, P = 0.008) (p = 0,008) (100) sugiriendo que estos podrían desempeñar un papel en el inicio de la autoinmunidad en estas poblaciones de riesgo(16,22).Aunque comparado con nuestro estudio las frecuencias reportadas anteriormente en FDR son considerablemente más bajas que lo encontrado en nuestra población de FDR,sin embargo, los resultados en nuestro estudio son consistentes con el hecho de que los FDR presentaron mayor presencia de anti-FCS-Carp comparado con los CTRL 25.00% vs 14.52%, y presentan mayor riesgo de presentar estos autoanticuerpos como estos (OR 2.625 95%IC: 1.11-6.85 p=0.015). Todo anterior apoya y confirma la idea que los FDR representan un subgrupo de individuos sanos con riesgo elevado de presentar autoanticuerpos asociados con AR. además, estos hallazgos pueden proporcionar nuevos conocimientos sobre la evolución de la autoinmunidad que puede estarse presentando en fases preclínicas en dichos individuos. Se recomendaría realizar estudios de seguimiento en este subgrupo de individuos. Adicionalmente,como se mencionó anteriormente, cabe destacar que ningún estudio describe la frecuencia de anticuerpos anti péptidos carbamilados, por lo que nuestro estudio presenta evidencia importante en este grupo de individuos con riesgo genético, sugiriendo que los autoanticuerpos carbamilados generados en los FDR también están dirigidos principalmente a proteínas articulares como el fibrinógeno que están sufriendo modificaciones postraduccionales de manera temprana al desarrollo de la enfermedad y de manera importante, que esta nueva modificación asociada a AR está teniendo lugar en grupos de riesgo. Además,que la presencia de anticuerpos anti anti-Ca-Fib2 y anti-Ca-Fib3 encontrados en mayor frecuencia sugiere que en estas etapas preclínicas la presencia de estos autoanticuerpos podría ser reflejo de procesos inflamatorios articulares que ocurren en esta población, lo que podría proponerlos comopotenciales indicadores tempranos para el desarrollo de AR. Dado Que en los pacientes de ART solo se detectan losanti-Ca-Fib2. 59 La hipótesis de que los autoanticuerpos pueden ser de importancia fisiopatológica se ha visto impulsada por el descubrimiento de fuertes asociaciones con factores de riesgo genéticos. Entre los factores de riesgo genéticos mayormente asociados a la AR se encuentra la presencia de los alelos HLADRβ1 pertenecientes al grupo EC. La asociación de esta base genética esta descrita por varios estudios en donde los individuos que presentan el ECtienen una mayor afinidad a péptidos citrulinados (107-111), generando anti-CCP. Estos anticuerpos dirigidos contra péptidos citrulinados se han encontrado particularmente elevados en individuos EC positivos y menos frecuentemente en individuos EC negativos y conjuntamente, incidiendo directamente en mayor actividad de la enfermedad (63-65). Lo anterior sugiere que existe una presentación de péptidos citrulinados restringida por el EC a través de interacciones moleculares de alta afinidad entre los péptidos y los alelos HLA (107).Esto podría explicarque la presencia del HLA-DRB1 EC,en nuestro estudio,está en más del 50% en ART . A pesar de ello, nuestras frecuencias son un poco bajas a lo reportado por Konda Mohan en el 2015 (108), quien analiza en una población del Sur de la India, la presencia del EC en un grupo de pacientes con AR establecida reportando que el 61.5% tenía EC positivoEsto sugiere que el mestizaje en nuestro País interfiere de manera protectora en la susceptibilidad genética que aporta el EC como se ha descrito en otras entidades reumatológicas asociadas a alelos del HLA B27 (109). Kokkonen H et al., en el mismo año en su estudio realizado en Suecia, donde se determinó la presencia del EC en un 63.2% y que estos individuos positivos para el HLA-EC tenían una mayor frecuencia de anti-CCP positivos en comparación con los individuos negativos para HLA-EC (110). Todo estosugiereque la presencia del HLA-EC es un factor importante en la positividad de autoanticuerpos, sin embargo,la diferencia entre nuestra frecuencia de HLA-DRB1 EC y los estudios anteriormente mencionados se podría deber a la población analizada así que al comparar poblaciones más cercanas a la nuestra como las latinoamericanas,se encontraron datos como los reportados por Ruiz-Morales J, quien evaluó la presencia de alelos EC en una población de individuos con AR mexicanos con más de 3 años de evolución observando que el 64.3% presentaban alelos de EC (111). Estos datos son más cercanos a los datos reportados por estudios con poblaciones europeas que a los pacientes colombianos evaluados en este estudioaunque esto puede ser debido al tamaño de muestra utilizado en nuestro estudio, debido a la limitación de inclusión exclusivamente de etapas tempranas de AR, no obstante, el estudio de Rojas-Villarraga A determinó que en una cohorte de pacientes colombianos con AR establecida, el 51% de los individuos presentaban alelos EC 60 positivos (112), y el estudio de Anaya JM, reporta que en individuos con AR establecida colombianos la presencia de HLA-DRB1 EC*04 esta aproximadamente en el 53% (113), yendo en línea con nuestros resultados en población colombiana, y reiterando que el mestizaje de nuestro país al parecer tiene un papel importante al investigar riesgos genéticos de enfermedades. En cuanto a la población FDR,Kolfenbach JR examina el papel de los factores genéticos y ambientales en el desarrollo de la autoinmunidad relacionada con la AR, por lo cual describe estos factores enindividuos estadounidenses con AR de más de 4 años de evolución y familiares como una etapa preclínica de riesgo reportando que los alelos HLA-DRB1 EC están presentes en el 55% de los FDR (97), y de igual forma Sparks JA reporta que el 54.9% de alelos HLA-DR4 EC positivo en padres, hijos o hermanos de pacientes con AR (98). Solo Radstake TR, presenta una frecuencia más alta de 79% en la presencia de FDR holandeses, posiblemente debido a las características étnicas de la población (114). Los datos anteriores, a excepción del reportando con la población holandesa, son similares a nuestro estudio que presenta en FDR una frecuencia mayor del 50% reiterando que este subgrupo de individuos conforman un grupo susceptible genéticamente que los predispone a presentar características cercanas al desarrollo de AR. Al analizar la presencia de autoanticuerpos en esta población de individuos, de manera importante encontramos que los anti-CCP se presentan en mayor proporción 19.3% en FDR vs con el 6.45% de los CTRL (OR 3.6 95%IC: 21.44-11.05 p=0.002) así como, la mayor presencia de articulaciones dolorosas 37.9% vs CTRL en 22.58% (OR 2.18 95%IC: 1.17-4.23 p=0.007), de igual forma, el mayor número de articulaciones inflamadas 15.32% vs 4.03% (OR 5.6 95%IC: 1.63- 30.18 p=0.002).Esto se convierte en un tema interesante ya que ambos grupos son individuos sanos siendo los FDR un grupo que comparte, al menos, algunos factores de riesgo genéticos y ambientales con los pacientes de AR convirtiéndolo en un subgrupo con mayor riesgo a desarrollar AR (107,24). Lo anterior junto con la presencia de anti-CarP en los FDR reafirma el cambio de concepto donde los anti-CCP no son los únicos autoanticuerpos que anteceden y generan un riesgo a desarrollar AR. Además, que este grupo de pacientes FDR ya presentan síntomas que involucran inflamación y dolor en las articulaciones junto con los anti-CarP lo que podría indicar que estos autoanticuerpos podrían contribuir en la ruptura de la tolerancia a nivel articular dando inicio a procesos autoinmunes. 61 La predisposición genética como se detalla en la introducción, se asocia con la ruptura de la tolerancia y la generación de autoanticuerpos por medio de la fuerte asociación con el HLA en pacientes con AR.Teniendo en cuenta la alta frecuencia de HLA-DRB1 EC en este grupo de riesgo FDRmencionada anteriormente y que existe la hipótesis que supone que los bolsillos de anclaje del HLA-DRB1 EC podrían unir selectivamente péptidos artritogénicos para su presentación a linfocitos T CD4,diversos trabajos se han centrado en la unión de proteínas que contienen citrulina (107,115,116)por lo que el estudio de otras modificaciones postraduccionales ha tomado gran importancia y son pocos los estudios que detallan la participación de otras modificaciones como la carbamilación con diversos alelos específicos de HLA. En nuestro estudio al explorar la asociación entre los niveles de anticuerpos anti-FCS-CarP , antiCa-Fib2 y anti-Ca-Fib3 con la presencia de alelos HLA-DRB1. En el grupo de ART, encontramos que los anti-FCS-Carp no se asocian con la presencia de HLA-DRB1 EC en general ni con el número de alelos HLA-DRB1 EC similar al estudio de Jiang X, donde en dos cohortes de ART no encontraron ninguna asociación específica entre la presencia de anti-FCS-CarP con la presencia de cualquier alelo HLA-DRB1 EC, sin embargo, al evaluar los alelos individualmente encontraron una asociación con el alelo HLA-DRB1 *03. (62). Del mismo modo, en el estudio de Montes se reporta que los anticuerpos anti-CarP no están asociados con los alelos EC (117). Esto podría sugerir un mecanismo biológico diferente, que conduce a la formación de anticuerpos anti-CarP en comparación al mecanismo propuesto para los anti-CCP indicando que el aminoácido homocitrulina, aunque es muy similar a la citrulina, podría necesitar un punto de anclaje diferente en el bolsillo de HLA permitiendo que otros alelos no EC puedan reconocerlo. Sin embargo, al analizar individualmente los alelos HLA-DRB1 los anti-FCS-Carp se asociaron tanto con el alelo EC *1402 como con el alelo no EC *1501. Esta asociación con el alelo EC *1402 podría soportarse por la teoría postulada por Scinocca M, quien realiza un modelamiento informático de un residuo de homocitrulina en el bolsillo de un HLA EC, encontrando una unión sin impedimento estérico postulando que el EC podría acomodar homocitrulina, y el péptido homocitrulinado podría potencialmente unirse al EC (106),aunque al encontrar asociación con alelos no EC también fortalece la hipótesis que estos péptidos con homocitrulina pueden ser presentados por otrotipo de alelos. 62 En cuanto a la asociación de los anticuerpos anti péptidos carbamilados y su asociación con el EC, observamos que los anticuerpos anti-Ca-Fib2 no se asocian con la presencia en general de alelos HLA-DRB1 EC, esto concuerda con los resultados reportados anteriormente ya que no se ha estudiado la asociación de HLA con péptido específicos de fibrinógeno (62,106,117). Sin embargo, al analizar de manera individual los alelos HLA-DRB1 EC *0405 y alelos no EC como*1501 y *0407 se asociaron con anti-Ca-Fib2. La presencia del alelo no EC *1501 es igual a lo encontrado al analizar los anti-FCS-CarP en nuestro estudio lo que da fuerza a dicha asociación. Los anti-Ca-Fib3 se asociaron con la presencia del alelo HLA-DRB1 EC *1402 (p=0.050) y el alelo no EC *0301 (p=0.025). Este último similar a lo reportado por Jiang X, quien encuentra asociación entre HLA-DRB1 *03 con la presencia de anti-FCS-CarP (62). Los resultados anteriores pueden sugerir que los alelos no EC *15 *03 están jugando un papel importante en la formación de anticuerpos anti-CarP en nuestra población de ART a diferencia de los EC, teniendo en cuenta que en estos dos alelos hacen parte de aquellos con mayor frecuencia en nuestra población colombiana (HLA*15= 18-21% y HLA*03= 8-14%) (113,118). En cuanto a la asociación de la presencia de los anticuerpos anti-FCS-Carp con HLA-DRB1 en FDR, estos se asociaron con la presencia del alelo EC *1402 y los anti-Ca-Fib2 se asociaron con la presencia del alelo HLA-DRB1 no EC *1501 al igual que los pacientes con ART, como se describió anteriormente y, adicionalmente con alelo *0901. Esto comparado con el estudio de Koppejan H, donde los anticuerpos anti-FCS-CarP fueron más frecuentes en sujetos EC positivos (OR 3.1, IC 95% 1.2-8.4, P = 0.03). Sin embargo, la asociación entre positividad del EC y positividad anti-CarP no se sostiene en modelos multivariados (99), posiblemente puede relacionarse con el tamaño de muestra pequeño o la baja prevalencia de estos autoanticuerpos anti-CarP, se sugiere realizar estudios con mayor número de FDR y poder confirmar dicha asociación Hay varios factores que pueden cambiar el equilibrio hacia más cianato y, por ende, más carbamilación. Entre estos factores, la disfunción renal, la inflamación y el consumo de cigarrillo se considera lo más importante, sin embargo, en nuestro estudio el tener diabetes o la disfunción renal fue criterio de exclusión por lo cual esta característica no interfirió con nuestros resultados. En cuanto al consumo de cigarrillo no se encontraron resultados que respalden la hipótesis de que fumar induce anticuerpos anti-CarP, al igual que Jiang X (62), esto puede explicarse por la baja 63 frecuencia de consumo de cigarrillo en el momento del análisis en pacientes con AR debido a la previa sensibilización acerca de las consecuencias inflamatorias que tiene el cigarrillo. Finalmente, la asociación de los anticuerpos anti-FCS-CarP como también los anti-Ca-Fib2 y anti-Ca-Fib3 con las variables reumatológicas en ART muestra que los anticuerpos anti-Ca-Fib2 se asocian con la presencia de FR positivo y con anti-CCP en niveles altos y que los anti-CaFib3 se asocian con el índice DAS28-VSG sugiriendo estar implicados en la actividad de la enfermedad (118,120) esto podría sugerir que este último grupo de anticuerpos (anti-Ca-Fib3) podrían estar involucrado en mecanismos autoinmunes que conducen a la perpetuación del daño de la articulación. En el grupo de FDR los anticuerpos anti-FCS-Carp se asociaron con la presencia de PCR positiva y se correlacionó débilmente con FR y con la presencia de articulaciones dolorosas, loquepodría confirmar que este grupo presenta factores de riesgo asociadas a la AR y que estos autoanticuerpos al estar presentes en sujetos de riesgo están involucrados en procesos inflamatorios iniciales importantes. Los anti-Ca-Fib3 demostraron una asociación con el FR positivo sugiriendo una vez más que este último grupo podría considerarse una forma de investigar fases preclínicas de la AR, ya que al compartir algunos de los riesgos genéticos y ambientales de la AR, exhiben manifestaciones inflamatorias articulares tempranas que pueden establecer la posibilidad de que una persona progrese a desarrollar AR, sin embargo, esta asociación se pierde al establecerse la enfermedad lo que sugiere que este tipo de modificación en el péptido puede estar involucrada en procesos inflamatorios sistémicos en etapas tempranas antes de localizarse en la articulación. Todos nuestros datos anteriores ratifican la presencia de anticuerpos anti fibrinógeno carbamilado en gran proporción de los pacientes con ART y FDR apuntando a que el fibrinógeno es una de las proteínas blanco de estos anticuerpos, además de confirmar que la presencia de anti-FCS-CarP y anti-Ca-Fib2 se asocian con la condición de ART. Mientras que la condición de FDR se asocia con la presencia de anti-FCS-CarP, anti-Ca-Fib2 y anti-Ca-Fib3 sugiriendo que estos anticuerpos pueden jugar un papel importante en el desarrollo de AR dadoque los anti-Ca-Fib3 al encontrarse en mayor frecuencia solo en los FDR. 64 Por otro lado, otro evento ambiental asociado a la AR es la presencia de la enfermedad periodontal, donde estas dos son patologías crónicas que presentan mecanismos similares desde el punto de vista inflamatorio y de compromiso óseo (76). En nuestro grupo de ART no se encontraron diferencias entre la presencia de EP comparado con controles a pesar de que el grupo de pacientes tiende a presentar una leve mayor frecuencia 72.5% vs 70.59% de sujetos sanos. Porcentaje similar a lo reportado por Mikuls, quien observa en casos de AR establecida comparados con controles con osteoartritis de Centros Médicos de Veteranos de los EE. UU.,una mayor proporción de casos de EP en AR 71.9% vs 26.4% (80).Nuestra falta de diferencias significativas entre la población de ART y sujetos sanos podría ser explicado por de la alta prevalencia de EP en la población general colombiana dentro del rango de edad de 18 a 79 años donde la EP afecta al 61.8% (121). En cuanto a los FDR Unriza S., describe que El 79% de FDR tenía un diagnóstico de periodontitis, en comparación con el 56% en el grupo de control con una p = 0,001 (74). En nuestro estudio a pesar de observar una tendencia similar de mayor presentación de EP en FDR vs CTRL, curiosamente se observa un menor porcentaje respecto a lo reportado por Unriza. (60.5% vs 59%, respectivamente). Sin embargo, se encuentran variables clínicas periodontales significativamente mayores en este grupo frente a controles reflejando un proceso de inflamación periodontal importante que puede condicionar la fase preclínica de estos individuos dada la relación reportada entre EP y ART (96). La P. gingivalis es el microrganismo más asociado con aumento del riesgo de desarrollar EP (76,81),nuestro estudio mostro que la presencia de P. gingivalis en el grupo de ART evidenciamos que la presencia de P. gingivalis se encontró en un mayor porcentaje comparado con los controles con diferencias estadísticamente significativas al igual que Bello JM, donde reporta en el grupo ART mayor frecuencia de P. gingivalis vs controles(p=0.03) y a diferencia de Milkus TR quien no reporta diferencias entre la presencia de P. gingivalis en pacientes con AR de mayor tiempo de evolución de la enfermedad (AR establecida) vs individuos sanos (96,80). Esto podría sugerir que la presencia de la P. gingivalis en etapas tempranas puede jugar un papel importante debido a que la P. gingivalis es capaz de expresar y secretar la enzima peptidil-arginina deiminasa (PPAD) de manera casi exclusiva, la cual puede producir residuos del aminoácido citrulina como 65 consecuencia de la citrulinación de las proteínas del hospedero y, como se ha mencionado anteriormente, esto tendría como consecuencia la producción de anti-CCP y estos autoanticuerpos pueden desarrollar un proceso inflamatorio en las articulaciones y promover la citrulinación de proteínas de matriz extracelular que desencadenarían reclutamiento y activación de células autorreactivas, la producción de anticuerpos anti-CCP además conduciría a formación de complejo antígeno-anticuerpo a nivel del espacio sinovial conduciendo a la perpetuación de la inflamación y la destrucción articular (122,123). En el grupo de FDR la presencia de P. gingivalis se encontró en 62.1% comparado con el 42.7% de los controles (OR 2.14 95%IC: 1.25- 3.78 p=0.003), a diferencia del estudio previo del grupo de Bello JM (96),quien evalúa la condición reumatológica y periodontal en 119 individuos con FDR comparados con controles pareados, observa una mayor frecuencia de esta bacteria en el grupo de FDR sin encontrar diferencia estadísticamente significativa. Esto puede ser debido a las diferencias geográficas de los pacientes o a diferencias en los hábitos de higiene. Finalmente, ni en ART ni en FDR se encontraron asociaciones con variables y condición periodontal con la presencia de la presencia de anticuerpos anti proteínas/péptidos carbamilados en nuestro estudio lo que no apoyaría la hipótesis de que la periodontitis también puede contribuir con procesos de carbamilación de proteínas (90). Aunque muy pocos estudios han evaluado la relevancia de los niveles de anti-CarP circulantes con la periodontitis en pacientes con AR, recientemente se ha reportado la presencia de anti-CarP en el tejido periodontal inflamado de pacientes con periodontitis leve a moderada (124) y en un solo estudio retrospectivo de casos y controles que incluyeron 40 pacientes con AR establecida con periodontitis, 30 pacientes con periodontitis únicamente y 43 controles sanos sistémicamente y periodontalmente y evaluaron los niveles circulantes de anti-CarP y presencia de trampas extracelulares de neutrófilos (NET) junto a afecciones reumatológicas y periodontales, se encontró que los pacientes con AR y periodontitis mostraron niveles séricos significativamente más altos de anti-CarP y NET que el grupo de control (32.5% en el grupo de periodontitis y AR vs 7.0% en el grupo control (P = 0.04) (125). Esta diferencia de resultados invita a estudiar más a fondo estas dos condiciones y su aporte a la autoinmunidad en pacientes con AR debido a que a la AR y la periodontitis son enfermedades complejas con múltiples factores causales. 66 7. CONCLUSION La respuesta humoral en ART puede estar restringida en parte a regiones específicas de la cadena β de fibrinógeno carbamilado pudiéndose considerar a futuro como otro biomarcador de esta enfermedad en un subgrupo de pacientes. Los autoanticuerpos anti péptidos anti-Ca-Fib3 y anti- Ca-Fib2 pueden ser importantes marcadores en sujetos sanos con riesgo genético (FDR) debido a la relación encontrada con manifestaciones inflamatorias articulares que podría sugerirlos potenciales biomarcadores tempranos para el desarrollo de AR. 67 8. REFERENCIAS 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. Firestein GS. Evolving concepts of rheumatoid arthritis. Nature 2003;423:356–61. McInnes IB, Schett G. 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