PRÀCTICA 5. DETERMINACIÓ DE LA CONCENTRACIÓ DE PROTEÏNA PER UN MÈTODE COLORIMÈTRIC. MÈTODE DE BRADFORD M7.UF1 PRÀCTICA 5. DETERMINACIÓ DE LA CONCENTRACIÓ DE PROTEÏNA PER UN MÈTODE COLORIMÈTRIC. MÈTODE DE BRADFORD 1. OBJECTIUS Part A. Realització d'una recta patró Part B. Determinació de la concentració de proteïnes de diferents mostres de llet sense aïllament previ 2. FONAMENT TEÒRIC Hi ha diferents mètodes colorimètrics per tal de determinar la concentració total de proteïna d'una mostra: Biuret, Lowry i Bradford. El mètode de Biuret és el més antic i és utilitzat a els laboratoris de batxillerat per tal de detectar la presència de proteïnes. Aquest mètode és basa en dues reaccions; una reacció de quelació i una reacció redox. És el mètode menys sensible dels tres. El mètode de Lowry implica dues reaccions redox. És més sensible que l'assaig de Biuret, però és veu afectat per interferències provinents de substàncies i reactius d'ús habitual al laboratori. L'assaig de Bradford utilitza un colorant anomenat Coomassie Brilliant Blue G-250, l'ús del qual va ser descrita per primera vegada per M. Bradford l'any 1976. L'assaig de Bradford es basa en les propietats químiques del colorant i la seva habilitat d'interaccionar amb les cadenes laterals d'aminoàcids específics. El colorant Coomassie G-250 presenta diferents formes. Com a constituent de la solució de Bradford, el colorant existeix en el seu estat catiònic (protonat) i presenta un color roig - marronós. El pic d'absorció del colorant en aquest estat és de 470 nm. Quan el colorant s'uneix i interacciona amb els aminoàcids, el colorant és converteix en la seva forma estable desprotonada i el pic d'absorció és desplaçar des de 470 nm a 595 nm. Aquesta forma estable del colorant és pot observar i quantificar fàcilment en un espectrofotòmetre. Hi ha una correlació entre la intensitat del color blau i la quantitat de proteïna en la mostra. Així, com més intens és el color blau que pren la mostra, més quantitat de proteïna conté. Utilitzant dilucions seriades de proteïnes de concentració coneguda, es pot generar una corba estàndard. Aquesta corba és utilitzada per quantificar la quantitat de proteïna que conté una mostra problema, basant-nos en la intensitat del color blau que pren la mostra. L’assaig de Bradford és senzill, molt sensible i no resulta molt afectat per les substàncies i reactius d’ús habitual en el laboratori. Les interaccions químiques concretes del Coomassie G-250 i les seves propietats d’unió a les proteïnes es poden veure a la figura següent. El colorant (representat en color Blau) s’uneix a les proteïnes mitjançant tres tipus d’interaccions. Les interaccions primàries es donen a través dels residus d’arginina, un aminoàcid molt bàsic, que interacciona amb els grups sulfat del colorant mitjançant interaccions electrostàtiques. Altres interaccions de caràcter més feble, inclouen la interacció dels anells aromàtics del colorant amb els anells aromàtics dels aminoàcids, com el triptòfan, tirosina i fenilalanina a través d’interaccions d’apilament dels electrons. Finalment, el colorant també interacciona dèbilment amb els aminoàcids que presenten cadenes laterals hidrofòbiques, com la leucina. La intensitat del color blau indica la concentració de proteïna de la mostra: com més intens és el color blau, més proteïna conté la mostra. 1 PRÀCTICA 5. DETERMINACIÓ DE LA CONCENTRACIÓ DE PROTEÏNA PER UN MÈTODE COLORIMÈTRIC. MÈTODE DE BRADFORD M7.UF1 L’assaig de Bradford es realitza fàcilment en quatre etapes principals: 1. Preparació d’una dilució seriada d’estàndards de proteïna i preparació de les mostres problema. 2. Addició del colorant de Bradford (marró, forma catiònica) i incubació durant més de cinc minuts (no excedir 60 minuts). La unió del colorant a la proteïna porta a la formació de la forma desprotonada del colorant, el que produeix un viratge de color cap al blau. 3. Lectura quantitativa de l’absorció a A595 en un espectrofotòmetre. 4. Construcció d’una corba estàndard amb les dades obtingudes a partir dels patrons de concentració coneguda i determinació de la concentració de proteïna continguda a la mostra problema. En aquest assaig de laboratori, el mètode de Bradford s’utilitza per tal de quantificar el contingut de proteïna en tres tipus diferents de llet, en un preparat de soja i en una solució de caseïna de concentració desconeguda. La caseïna és la proteïna més abundant de la llet i la seva seqüència 2 PRÀCTICA 5. DETERMINACIÓ DE LA CONCENTRACIÓ DE PROTEÏNA PER UN MÈTODE COLORIMÈTRIC. MÈTODE DE BRADFORD M7.UF1 aminoacídica es pot veure a baix. La caseïna conté un total de 224 aminoàcids i té una massa molecular de 24967 daltons. Aquesta proteïna conté bastants aminoàcids que poden interaccionar fortament amb el colorant: arginines (R), triptòfan (W), tirosines (Y), histidines (H) i també lisines (K). Alguns d’aquests aminoàcids s’han marcat en negreta a la seqüència. Com que el Coomassie és molt més gran que un aminoàcid típic (854 daltons pel Coomassie, comparat amb el pes molecular promig de 110 daltons per un aminoàcid), és senzill visualitzar com poques molècules de Coomassie poden recobrir una proteïna típica en solució. 3. REACTIUS • • • • Tampó PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Fosfat sòdic, 2 mM Fosfat potàssic a pH 7,4). Reactiu de Bradford Solució estàndard de BSA (albúmina de sèrum boví) a una concentració de 0,1mg/ml 3 mostres de llet amb la informació nutricional de cadascuna i també una mostra de preparat de soja. Compost Pictograma Precaucions que cal prendre1. NaCl KCl Na3PO4 Blau de Coomassie G-250 H3PO4, 85% 1. Si són substàncies no perilloses cal posar-ho i a més anotar prendre mesures de protecció habituals al laboratori. 3 PRÀCTICA 5. DETERMINACIÓ DE LA CONCENTRACIÓ DE PROTEÏNA PER UN MÈTODE COLORIMÈTRIC. MÈTODE DE BRADFORD M7.UF1 4. PROCEDIMENT EXPERIMENTAL A.- PREPARACIÓ DE LES DISSOLUCIONS 500 mL de dissolució Tampó PBS a pH 7,4 (per a tots els grups) He de pesar: dissoldre amb un 60% de l'aigua, ajustar el pH fins pH 7,4 amb HCl 1M i aforar a 500 mL Reactiu Bradford (per a tots els grups) Dissoldre 0,10 g de Blau de Coomassie G-250 en 50 mL d'etanol. Afegir 100 mL d'àcid fosfòric al 85%, diluir fins a 1000 mL amb aigua destil·lada i mesclar. Filtrar la dissolució i conservar en un flacó de color àmbar a temperatura ambient. Durant la conservació es produeix la precipitació del colorant. Abans de la seva utilizació cal filtrar el reactiu. Mostres de llet. Prepareu una dilució 1 a 100 mL de les mostres de llet , Indica a continuació els tipus de llet utilitzats ii el contingut en proteïna indicat a l'envàs: Tipus de llet g de proteïna /100g de llet 4 PRÀCTICA 5. DETERMINACIÓ DE LA CONCENTRACIÓ DE PROTEÏNA PER UN MÈTODE COLORIMÈTRIC. MÈTODE DE BRADFORD M7.UF1 Solució estàndard de BSA (per a cada grup) Preparareu els patrons de 1000μL: 1 blanc i 6 dissolucions estàndard de BSA de concentracions de 1 a 10 μg/mL, tal com indica la següent taula. Prepareu els patrons en tubs eppendorf, Haureu de calcular els volums de dissolució stock de BSA de 0,1 mg/mL i de tampó PBS que cal agafar per a aconseguir 1000μL de dissolució final . μl d'un stock de BSA de 0,1 mg/ml μl de Tampó PBS Concentració final de proteïna BSA al tub en μg/ml 0 (blanc) 1000 0 (blanc) 1 2 4 6 8 10 Càlculs necessaris per emplenar la taula: 5 PRÀCTICA 5. DETERMINACIÓ DE LA CONCENTRACIÓ DE PROTEÏNA PER UN MÈTODE COLORIMÈTRIC. MÈTODE DE BRADFORD M7.UF1 B.- PREPARACIÓ I MESURA DE LA RECTA DE CALIBRAT I LES MOSTRES 1. Afegir a cadascun dels 7 eppendorfs( PRÈVIAMENT IDENTIFICATS, 1 amb blanc, 6 amb estàndards de proteïna) els μL de BSA (patró) i els μL de tampó PBS necessaris per realitzar la recta patró (valors de la taula anterior). 2. Preparar 3 eppendorf (IDENTIFICATS) per a les mostres de llet (desnatada, semidesnatada i sencera) afegint 20 μL de cada mostra de llet 1:100 a cada eppendorf i 980 μL de tampó PBS. 3. Afegir a cadascun dels eppendorf 800 μL de reactiu Bradford i anotar l'hora. Hora: 4. Incubar a temperatura ambient els tubs eppendorfs per un període comprés entre 5 minuts com a mínim i 1 hora com a màxim, les lectures òptimes es realitzen amb 20 min. Les absorbàncies dels 10 tubs s’han de llegir seqüencialment des de el blanc fins la última mostra. És important que tots els tubs estiguin el mateix temps en contacte amb el reactiu de Bradford 5. Passar el contingut del tub eppendorf “blanc” a una microcubeta d’espectrofotòmetre neta (important que no sigui de quars ja que aquest absorbeix el colorant). Posar-la dins de l’espectrofotòmetre en el que estarà seleccionada la longitud d’ona de 595 nm. Prémer el botó corresponent de l’espectrofotòmetre per a posar l’absorbància a zero. Hora inici lectura: 6. Tornar el contingut de la cubeta amb el blanc al seu eppendorf corresponent i afegir a la mateixa cubeta el contingut de l’eppendorf en el que hi havia el primer estàndard de proteïna BSA de 1 μg/mL. Anotar l’absorbància a 595 nm d’aquesta concentració de proteïna a la taula que es troba en l'apartat resultats. 7. Continuar així en sentit creixent de concentració de proteïna fins al darrer tub estàndard (10 μg/mL de BSA) 8. Agafar una cubeta nova i fer les lectures de les mostres. Observacions 6 PRÀCTICA 5. DETERMINACIÓ DE LA CONCENTRACIÓ DE PROTEÏNA PER UN MÈTODE COLORIMÈTRIC. MÈTODE DE BRADFORD M7.UF1 C.- RESULTATS RECTA CALIBRAT C (μg/mL) A (595 nm) blanc ---- 1 2 4 6 8 10 Observacions. (Instrument utilitzat, Cubetes.....): MOSTRES A(595nm) LLET DESNATADA LLET SEMIDESNATADA LLET SENCERA Observacions: 7 PRÀCTICA 5. DETERMINACIÓ DE LA CONCENTRACIÓ DE PROTEÏNA PER UN MÈTODE COLORIMÈTRIC. MÈTODE DE BRADFORD M7.UF1 5.- . ANÀLISI DELS RESULTATS 1. Representar les absorbàncies a 595 nm vs la concentració de proteïna estàndard (en μg/mL) que hi ha a cada tub. Assenyala la recta amb el coeficient de regressió. La representació de les absorbàncies vs les quantitats de proteïna de cada estàndard hauria de donar una corba de calibratge bastant lineal (encara que a les quantitats més altes de proteïna pot haver-hi una mica de desviació). 8 PRÀCTICA 5. DETERMINACIÓ DE LA CONCENTRACIÓ DE PROTEÏNA PER UN MÈTODE COLORIMÈTRIC. MÈTODE DE BRADFORD M7.UF1 2. Tenint en compte les dilucions fetes en les diferents mostres de llet, calculeu la concentració de proteïna a cada mostra de llet. Calculeu l'error comés respecte l'etiqueta. Comentari resultat: 9 PRÀCTICA 5. DETERMINACIÓ DE LA CONCENTRACIÓ DE PROTEÏNA PER UN MÈTODE COLORIMÈTRIC. MÈTODE DE BRADFORD M7.UF1 CONCLUSIONS Bibliografia i Webs INDICADORS D’AVALUACIÓ ASPECTES NO ASSOLIT POC ASSOLIT PRÀCTICAMENT ASSOLIT ASSOLIT PUNTS Test (15 %) Diagrama (15 %) Realització practica (30 %) Realització càlculs (20 %) Resultats i discussió (20%) QUALIFICACIÓ FINAL 10
