UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL “FABIOLA SALAZAR LEGUÍA” DE BAGUA FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y APLICADAS INFORME N°02 PROFESOR Julio Cesar Montenegro Juarez CRUSO Multiplicación de microorganismos ESTUDIANTES Marleny Guevara Estela Viviana Abanto Fernández Jhina Ikam Montenegro Juan Lauro Flores Heredia CARRERA PROFESIONAL Biotecnología UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL FABIOLA SALAZAR LEGUÍA DE BAGUA______________________ PRÁCTICA N° 2 METABOLISMO MICROBIANO Se denomina metabolismo al conjunto de reacciones químicas que se producen en una célula u organismo. Las rutas metabólicas están formadas por una serie de reacciones que son catalizadas por enzimas. Dentro de una ruta metabólica ocurren una serie de pasos (reacciones) donde ocurren cambios en los elementos: se puede añadir, transferir o eliminar un átomo o un grupo funcional determinado. El precursor se transforma en producto mediante una serie de intermedios metabólicos, los metabolitos. El metabolismo es una actividad que ocurre a nivel celular, y está muy coordinada, de forma que los sistemas, las rutas metabólicas, colaboran en conjunto; para obtener energía química y para sintetizar y degradar las biomoléculas necesarias para algunas funciones celulares especializadas. II. OBJETIVO: - Evaluar los diferentes tipos de metabolismo de las bacterias Reconocer la degradación del citrato, TSI, LIA Conocer la fundamentación de las pruebas bioquímicas utilizadas. EXPERIENCIA N° 1: Sembrado en estría III. MATERIALES: - Caldo lactosa Caldo Mac Conkey Agar Mac Conkey Agar SS Agar citrato Agar Triple azúcar Hierro (TSI) Agar lisina hierro (LIA) 02 Matraz 250 ml 05 Matraz 100 ml 02 probetas 100 ml 03 espátulas 15 placas Petri . 1 UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL FABIOLA SALAZAR LEGUÍA DE BAGUA______________________ - 16 tubos pequeños 02 Cocina eléctrica Autoclave Balanza Estufa Muestra: orina, ceviche y suero de queso IV. PROCEDIEMIENTO: 4.1 Sembrar por agotamiento y estría las muestras de orina, suero de queso y ceviche en agar Mac Conkey y agar SS, e incubar a 37 °C por 24 horas. 4.2 Después de 24 horas observar las colonias fundamentar su crecimiento y el color de las colonias. 4.3 Posteriormente repicar una colonia para sembrarlo por puntura y estría en el agar citrato, TSI, LIA y caldo Mac Conkey, e incubar a 37 °C por 24 horas, transcurrido el tiempo hacer la lectura, interpretar y fundamentar. 4.4 Lectura de resultados. C1: Colonia aislada de agar SS. Agar verde citrato Agar LIA Agar TSI Citrato (-): Se mantiene el color Decarboxilación de la lisina (+): Superficie ácida/Profundidad superficie alcalina / ácida A/A: Pico amarillo/fondo característico del medio de cultivo k/k; . 2 UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL FABIOLA SALAZAR LEGUÍA DE BAGUA______________________ lo que indica que degradación de citrato. no hay profundidad alcalina (pico violeta / fondo violeta). Desaminación de la lisina (-): No presenta superficie rojiza / profundidad ácida. Producción de SH2 (-): Porque el medio permanece sin cambio de color. amarillo indica que el microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa. - El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido sulfhídrico. Caldo MacConkey Lactosa (-): Ausencia de color amarillo, por la turbidez en la parte inferior del tubo podemos decir que hay crecimiento de microorganismos anaerobios. C1: Es Shigella flexneri. C2: Colonia aislada de agar MacConkey. Agar verde citrato Agar LIA Agar TSI . 3 UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL FABIOLA SALAZAR LEGUÍA DE BAGUA______________________ Citrato (+): Crecimiento bacteriano con un intenso color azul en el pico, esto sucede por la degradación del citrato. Decarboxilación de la lisina (+): k/k; superficie alcalina / profundidad alcalina (pico violeta / fondo violeta). Superficie ácida/Profundidad ácida A/A: Pico amarillo/fondo amarillo indica que el microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa. Desaminación de la lisina (-): No presenta superficie rojiza / No hay producción de SH2. profundidad ácida. Si hay producción de gas. Producción de SH2 (-): Porque el medio permanece sin cambio de color. C2: Es Klebsiella pneumoniae. V. RESULTADOS La C1 (colonia 1) aislada es Shigella flexneri. Y la C2 (Colonia 2) es Klebsiella pneumoniae. VI. CUESTIONARIO Fundamentar sobre el agar citrato, TSI, LIA, caldo Mac Conkey, agar SS y agar Mac Conkey. Agar citrato En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimático. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino y el agar es el agente solidificante. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como única fuente de carbono usan sales de amonio como única fuente de nitrógeno, con la consiguiente producción de alcalinidad. El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato genera progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos que al ser utilizados como . 4 UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL FABIOLA SALAZAR LEGUÍA DE BAGUA______________________ fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción de citrato permeasa. Formula en gramos por litro Compuesto Gramos Citrato de sodio 2.0 Cloruro de sodio 5.0 Fosfato dipotásico 1.0 Fosfato monoamónico 1.0 Sulfato de magnesio 0.2 Azul de bromotimol 0.08 Agar 15.0 pH final 6.9 ± 0.2 Interpretación de los resultados - Positivo: Crecimiento bacteriano con un intenso color azul en el pico de flauta. - Negativo: Ausencia de crecimiento y permanencia del color verde del medio de cultivo. Agar TSI En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. El agar es el agente solidificante. Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro. . 5 UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL FABIOLA SALAZAR LEGUÍA DE BAGUA______________________ Formula en gramos por litro Compuesto Gramos Extracto de carne 3.0 PLURIPEPTONA 20 Cloruro de sodio 5.0 Lactosa 10.0 sacarosa 10.2 Glucosa 1.0 Sulfato de hierro y amonio 0.2 Tiosulfato de sodio 0.2 Rojo de fenol 0.025 Agar 13.0 pH final: 7.3 ± 0.2 Interpretación de los resultados Observar el color del medio de cultivo y la producción de gas. 1- Superficie alcalina/profundidad ácida (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa. 2- Superficie ácida/Profundidad ácida (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa. 3- Superficie alcalina/Profundidad alcalina (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azúcares. 4- La presencia de burbujas o la ruptura del medio de cultivo indican que el microorganismo produce gas. 5- El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido sulfhídrico. . 6 UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL FABIOLA SALAZAR LEGUÍA DE BAGUA______________________ Agar LIA En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y de aminasa. El citrato de hierro y amonio y el tiosulfato de sodio son los indicadores de la producción de ácido sulfhídrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de pH (su color es amarillo a pH igual o menor a 5.2 y violeta a pH igual o mayor a 6.8) y el agar es el agente solidificante. Los microorganismos fermentadores de glucosa acidifican el medio y provocan el viraje del color púrpura al amarillo. El ambiente ácido favorece la actividad enzimática decarboxilasa y se metaboliza la lisina a cadaverina elevando el pH del medio de cultivo y tornándolo al color púrpura o violeta. Los microorganismos fermentadores de glucosa que no tienen actividad lisina decarboxilasa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al color amarillo. A las 24 horas de incubación se observa el fondo del tubo color amarillo y la superficie de color violeta debido al consumo de las peptonas que producen alcalinidad. La generación de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formación de sulfuro de hierro. Formula en gramos por litro Compuesto Gramos PEPTONA DE GELATINA .... 5.0 Extracto de levadura 3.0 Glucosa 1.0 Lisina 10.0 Citrato de hierro y amonio 0.5 Tiosulfato de sodio 0.04 Purpura de bromocresol 0.02 Agar 15.0 pH final: 6.7 ± 0.2 . 7 UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL FABIOLA SALAZAR LEGUÍA DE BAGUA______________________ Interpretación de los resultados: Decarboxilación de la lisina: Resultado Positivo: superficie alcalina / profundidad alcalina (pico violeta / fondo violeta). Resultado negativo: superficie alcalina /profundidad ácida (pico violeta / fondo amarillo). Desaminación de la lisina: Resultado positivo: superficie rojiza / profundidad ácida. Esto sucede con cepas del género Proteus, Providencia y algunas de Morganella spp. Producción de SH2: Resultado positivo: ennegrecimiento del medio de cultivo (especialmente en el límite entre la superficie y profundidad). Resultado negativo: el medio de cultivo permanece sin cambio de color. Caldo Mac Conkey En el medio de cultivo, la peptona es la fuente de aminoácidos y de otros factores de crecimiento, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, la bilis de buey estimula el crecimiento de las bacterias coliformes e inhibe a gran parte de la flora gram positiva, y el púrpura de bromocresol es el indicador de pH. Los coliformes, son microorganismos que fermentan la lactosa, con producción de ácido y gas. Al acidificar el medio, se produce un viraje del indicador de pH del color púrpura al amarillo. Formula en gramos por litro Compuesto Gramos Peptona de gelatina 20.0 Lactosa 10.0 Purpura de bromocresol 0.01 Bilis de Buey 5.0 pH final: 7.3 ± 0.2 . 8 UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL FABIOLA SALAZAR LEGUÍA DE BAGUA______________________ Interpretación de los resultados: Positivo: medio de cultivo color amarillo y la producción de gas. Negativo: ausencia de color amarillo del medio de cultivo y/o ausencia de producción de gas. Agar SS En el medio de cultivo la pluripeptona y el extracto de carne aportan los nutrientes para el desarrollo microbiano. Las sales biliares y el verde brillante inhiben el desarrollo de una amplia variedad de bacterias Gram positivas, de la mayoría de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp. La lactosa es el hidrato de carbono fermentable. El tiosulfato de sodio permite la formación de SH2 que se evidencia por la formación de sulfuro de hierro. El rojo neutro es el indicador de pH y el agar es el agente solidificante. Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar, acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obteniéndose colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo. Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen adecuadamente en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes. La producción de ácido sulfhídrico se evidencia como colonias con centro negro debido a la formación de sulfuro de hierro. Formula en gramos por litro Compuesto Gramos Pluripeptona 5.0 Extracto de carne 5.0 Lactosa 10.0 Mezcla de sales biliares 8.5 Citrato de sodio 8.5 Tiosulfato de sodio 8.5 Citrato férrico 1.0 . 9 UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL FABIOLA SALAZAR LEGUÍA DE BAGUA______________________ Verde brillante 0.000033 Rojo neutro 0.025 Agar 13.5 pH final : 7.0 ± 0.2 Interpretación de los resultados: Microorganismos fermentadores de lactosa: colonias rosadas o rojizas. Microorganismos no fermentadores de lactosa: colonias del color del medio, incoloras. Microorganismos productores de SH2: colonias con centro negro. Agar Mac Conkey En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. El agar es el agente solidificante. Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en las colonias, y la precipitación de las sales biliares. Los microorgannismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras Formula en gramos por litro Compuesto Gramos Peptona 1.5 Peptona de gelatina 17.0 Tripteina 1.5 Lactosa 10.0 Mezcla de sales biliares n°3 1.5 Cloruro de sodio 5.0 Rojo neutro 0.03 Cristal violeta 0.001 Agar 13.5 . 10 UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL FABIOLA SALAZAR LEGUÍA DE BAGUA______________________ pH final: 7.1 ± 0.2 Interpretación de los resultados: Microorganismos fermentadores de lactosa: colonias rosadasrojizas. Puede observarse halo de precipitación biliar. Microorganismos no fermentadores de lactosa: colonias del color del medio, incoloras. . 11