Manual Prácticas BM 2023-1-comprimido

UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC
PLANTEL QUERÉTARO
LICENCIATURA EN MÉDICO CIRUJANO
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
LABORATORIO DE BIOLOGÍA
MOLECULAR
Elaboró: QFB. Arlen Peña Cardeña
Ciclo escolar 2023-1
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC QUERÉTARO
LIC. EN MÉDICO CIRUJANO
DIRECTORIO
Lic. Santiago Cardoso Casado
Rector
Dr. Roberto Romero García
Director Académico
Dr. Omar Jesús Pineda Oliva
Coordinador de la Lic. Médico Cirujano
QFB. Arlen Peña Cardeña
Coordinadora de laboratorios de la Lic. Médico Cirujano
LBT. Estefany Granados Avalos
Auxiliar de laboratorios de la Lic. Médico Cirujano
2
ÍNDICE
Contenido
Página
Introducción
4
Reglamento de laboratorio y medidas generales de seguridad
5
PRÁCTICAS
Práctica No. 1 Manejo y cuidado de las micropipetas
9
Práctica No. 2 Diversidad celular
16
Práctica No. 3 Observación de mitosis en células vegetales
23
Práctica No. 4 Extracción y cuantificación de ácido desoxirribonucleico (ADN) a
partir de una muestra animal
27
Práctica No. 5 Electroforesis de ADN en geles de agarosa
32
Práctica No. 6 Cuantificación de proteínas por el método de Bradford
36
Práctica No. 7 Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico
(SDS-PAGE)
39
ANEXOS
Anexo 1. Identificación de material y equipo de laboratorio usado en el
laboratorio de Biología Molecular
46
Anexo 2. Manejo de residuos y medidas de seguridad
52
Anexo 3. NORMA Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección
ambiental - Salud ambiental - Residuos peligrosos biológico-infecciosos Clasificación y especificaciones de manejo
57
Anexo 4. Técnicas frecuentes utilizadas en el laboratorio de Biología Molecular
68
Anexo 5. Uso del microscopio óptico
74
Anexo 6. Toma de muestra sanguínea/venopunción
76
Bibliografía
81
3
INTRODUCCIÓN
La Biología Molecular es la rama de la Biología que se encarga del estudio de la estructura y
función de las moléculas que forman a los seres vivos. Particularmente, esta área se centra en
la investigación del ADN, el ARN, el proceso de síntesis de proteínas; y cómo estos se regulan
entre sí para una función celular adecuada. Por tanto, evidentemente esta es una disciplina
estrechamente relacionada con la Bioquímica, la Genética, la Biología Celular, entre otras
áreas.
El desarrollo de la Biología Molecular inició a partir de estudios realizados en organismos
unicelulares (bacterias) que dieron pauta al análisis en seres vivos pluricelulares más
complejos, incluyendo al ser humano. Esta primera etapa se centró principalmente en el estudio
e investigación de los mecanismos de almacenamiento, herencia y replicación de la información
genética contenida en las moléculas de ácidos nucleicos. Posteriormente, a partir de la
segunda mitad del siglo XX, el descubrimiento de la estructura de doble hélice del ADN y el
“Dogma Central” marcó el inicio de la Biología Molecular moderna. El avance de esta disciplina,
a la par con las técnicas de laboratorio, fue cada vez más importante lográndose así descubrir y
desarrollar diversas metodologías, por ejemplo el uso de enzimas de restricción, la
secuenciación del genoma, la tecnología del ADN recombinante, la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), entre muchas otras.
Gracias a estas herramientas se han elucidado los aspectos relacionados con la salud y
enfermedad en el ser humano que están determinados por la información contenida en el
material genético. Como muestra, la identificación de variaciones genéticas ha permitido
comprender cómo éstas determinan o contribuyen, junto con diversos factores
medioambientales, a distintas enfermedades multifactoriales, como hipertensión, diabetes,
obesidad, preeclampsia, cáncer, etc. En relación a lo anterior, se ha desarrollado la llamada
“Medicina Genómica” que se define como el uso de la información de los genomas y sus
derivados (ARN, proteínas y metabolitos) para guiar la toma de decisiones médicas, siendo así
un componente clave de la medicina personalizada. Por tanto, el uso de ácidos nucleicos con
fines de diagnóstico, monitoreo o estimación de riesgos asociados a los procesos mórbidos, así
como para el pronóstico de ciertas enfermedades ha sido de gran relevancia en la práctica
médica representando una herramienta valiosa en las Ciencias de la Salud debido a la certeza
y velocidad con la que se obtienen los resultados.
La Licenciatura en Médico Cirujano de la Universidad Cuauhtémoc plantel Querétaro incluye en
su plan de estudios la asignatura de Biología Molecular en su programa académico, ya que el
Médico en formación tiene la responsabilidad de conocer los fundamentos y mecanismos que
rigen a las bases moleculares de la célula, cómo están implicados en las patologías humanas y
qué herramientas moleculares tiene a su disposición para diagnosticar y tratar dichas
patologías.
En estas prácticas de laboratorio se incluyen técnicas básicas utilizadas en los laboratorios de
Biología Molecular, que permitirán al estudiante reforzar y ampliar los conocimientos teóricos
adquiridos en el aula, a través de una experiencia práctica. Lo anterior fortalecerá la capacidad
de análisis y pensamiento crítico imprescindible en esta área.
Las sesiones prácticas de este manual están relacionadas con los temas contenidos en el
programa teórico del curso de Biología Molecular correspondiente al segundo semestre de la
carrera de Médico Cirujano que de manera general contiene los siguientes tópicos:
I. Estructura y función celular
II. Organización, estructura y propiedades de los ácidos nucleicos
III. Replicación, transcripción y expresión de genes
IV. Tecnología del ADN recombinante
Al concluir la asignatura de Biología Molecular, el estudiante tendrá las bases para continuar
con su programa formativo, ya que habrá adquirido nuevos conocimientos, actitudes y valores
requeridos en un profesional de las Ciencias de la Salud.
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REGLAMENTO DE LABORATORIO Y MEDIDAS GENERALES DE
SEGURIDAD
El presente reglamento deberá acatarse por todos los miembros que hagan uso de las
instalaciones del laboratorio, es decir, alumnos, docentes y si es el caso, pacientes invitados.
Disposiciones generales
• Conocer los materiales y equipos para su manejo adecuado en cada práctica (consultar
Anexo 1. Identificación de material y equipo de laboratorio usado en el laboratorio de
Biología Molecular).
• Están estrictamente prohibidas las siguientes acciones:
I. Fumar
II. Consumir alimentos y bebidas dentro del laboratorio
III. Masticar chicle
IV. Usar dispositivos electrónicos como teléfono celular, laptops o tablets
V. Jugar, correr o empujar dentro del laboratorio
VI. Dañar las instalaciones del laboratorio mediante rayones, manchones, golpes, etc.
• El material y equipo no debe sustraerse del laboratorio.
• Si se rompe, deteriora o daña algún material de laboratorio se deberá avisar al responsable
del laboratorio.
• Queda prohibido la entrada de personas ajenas al grupo.
• Cada alumno deberá tener el manual impreso en cada sesión de trabajo, aquel que no lo
tenga no tendrá acceso al laboratorio y no podrá realizar la práctica.
• Tanto el docente como los alumnos deberán portar bata blanca de algodón con manga
larga y abotonada, así como zapatos cerrados durante toda la práctica (no sandalias ni
zapatos flats). NO SE DARÁ ENTRADA SIN BATA DE LABORATORIO.
Con relación directa al alumno
• Se dará una tolerancia máxima de 10 min. respecto a la hora de inicio de clase para la
entrada al laboratorio, pasado este tiempo el alumno no podrá ingresar.
• El alumno deberá leer con anticipación la práctica a realizar.
• El alumno tendrá la obligación de revisar el material y equipo de laboratorio, y en caso de
desperfecto o anomalía deberá reportarlo inmediatamente al responsable del laboratorio.
• Será responsabilidad del equipo, cuando así se le solicite, traer los materiales adicionales a
los existentes en laboratorio, así como el uso correcto de los mismos.
• Los alumnos deberán lavarse las manos con agua y jabón antes y después de la práctica
de laboratorio.
• Limpiar las mesas de trabajo antes y después de cada práctica. Al final de la práctica la
mesa de trabajo deberá estar perfectamente limpia y ordenada, colocando los bancos o
sillas como se encontraron al inicio de la sesión.
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• Al concluir cada sesión, el estudiante debe dejar perfectamente limpios y en orden todos
los equipos utilizados (microscopios, balanzas analíticas, autoclave, potenciómetro, etc.).
• El lavado del material de laboratorio usado es responsabilidad y obligación de los alumnos.
Es fundamental que antes de iniciar el lavado, borrar o quitar cualquier marca o anotación
colocada.
Con relación a la higiene y seguridad
• Las mochilas u otros objetos deben colocarse lejos de pasillos y puertas, es decir, sin
obstruir el paso libre dentro del laboratorio.
• Se debe mantener la mesa lo más libre posible para el trabajo experimental.
• Durante la práctica en el laboratorio, no se permite portar lo siguiente: aretes largos,
pulseras, collares, gorras/sombreros, paliacates, piercing, bufandas y/o cualquier otro tipo
de accesorio que pueda poner en riesgo la integridad física.
• Ingresar sin maquillaje al laboratorio y con uñas cortas.
• No debe ingresar al laboratorio vistiendo ropas que dejen al descubierto el abdomen,
pecho, las piernas o los pies.
• Por seguridad, no se usarán lentes de contacto. La presencia de sustancias irritantes y
contaminantes puede comprometer seriamente su visión de forma permanente al penetrar
entre la superficie del lente y el ojo.
• En el caso de tener cabello largo, este deberá estar perfectamente recogido.
• El alumno deberá localizar donde se encuentran las regaderas, extintores de incendio,
botes de basura, caja para material punzocortante, contenedor y bolsa roja para desecho
de material biológico, salidas de emergencia, etc.
• No deben desecharse sustancias tóxicas o residuos sólidos en las tarjas.
• No ingerir ni oler reactivos, compuestos, soluciones, etc.
• El material punzocortante y desechos biológicos deberán depositarse en los contenedores
correspondientes.
• En caso de derrames de líquidos biológicos, debe absorberse el derrame con toallas de
papel y desecharse en el contenedor adecuado. Luego, desinfectar el sitio del derrame con
una solución de hipoclorito de sodio a 5% en dilución 1:10; dejar 30 minutos (min.),
absorber con toallas de papel y lavar con agua para quitar el olor.
• En caso de que se rompa material de vidrio contaminado con sangre u otro líquido
corporal, recoger los trozos con escoba y recogedor, NUNCA con las manos, y depositarlos
en el contenedor de punzocortantes.
• Cuando se manipulen sustancias químicas no deben frotarse los ojos y debe evitarse el
contacto con la piel.
• Se deberán apagar los mecheros y/o planchas calientes cuando éstos no se utilicen.
• Se deberán emplear gradillas o pinzas para sostener o transportar tubos calientes.
• Mantener las sustancias químicas inflamables alejadas del fuego, planchas calientes o
ambos.
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• Utilizar guantes de látex y gafas de seguridad cuando se manejen ácidos, hielo seco o
sustancias desconocidas.
• Utilizar guantes desechables cuando se manejen muestras biológicas. Considerar que
cualquier material biológico es potencialmente infeccioso aun cuando proceda de personas
aparentemente sanas.
• Utilizar propipetas o perillas de goma para la medición de líquidos, NUNCA aspirar con la
boca.
• Para diluir cualquier ácido se vierte el ácido sobre el agua, nunca el agua sobre el ácido
con el fin de prevenir quemaduras por proyección.
• Mantener los frascos de reactivos y soluciones tapados para evitar derrames.
• Depositar en los recipientes apropiados las puntas de micropipetas.
• Emplear gafas de seguridad durante procedimientos que puedan generar salpicaduras.
Estas deben ser de material transparente resistente al impacto. Deben cubrir totalmente los
ojos desde el inicio de la cuenca ocular en el borde exterior del cráneo, hasta el borde
externo de la nariz. Igualmente, debe cubrir desde la parte superior de las cejas hasta la
parte inferior de la cuenca ocular.
• Utilizar la campana de extracción cuando se trabaje directamente con solventes tipo
alcohol y ácidos (sulfúrico, clorhídrico, etc.) o con soluciones disueltas en los mismos.
• En caso de que exista contacto de ácidos o bases con la piel, ojos o boca se recomienda
enjuagar el área con abundante agua con el propósito de disminuir su acción por dilución;
para ello en el laboratorio existen las tarjas, regaderas especiales y lavaojos.
• En caso de ingestión de corrosivos NUNCA provocar vómito. Si existe ingestión de ácidos
hacer beber inmediatamente una solución de bicarbonato de sodio (2 cucharadas soperas
en 2 vasos de agua); en caso de ingestión de soluciones cáusticas (hidróxido de sodio o de
potasio) ingerir una cucharada de vinagre o 25 mL de jugo de limón en agua.
• Al ingerir otras sustancias químicas hacer vomitar a la persona accidentada. Vigilar que
exista una ventilación adecuada y mantener las vías aéreas permeables mientras se
traslada al hospital.
• Si hay derramamiento de un ácido, neutralizar agregando bicarbonato de sodio y en caso
de bases agregar ácido acético (vinagre). NUNCA tratar de adicionar agua. Emplear bata,
guantes y gafas durante la limpieza.
• La bata se deberá retirar antes de salir del laboratorio, está estrictamente prohibido
permanecer con ella en otras instalaciones de la Universidad.
• Reportar inmediatamente al profesor y responsable del laboratorio cualquier accidente o
lesión que suceda para la toma de medidas apropiadas.
• Para mayor información consultar Anexo 2. Manejo de residuos y medidas de seguridad, y
Anexo 3. NORMA Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental Salud ambiental - Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y
especificaciones de manejo.
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Manejo del bromuro de etidio
El bromuro de etidio (BrEt) es un agente mutagénico (induce mutaciones) de efecto
acumulativo y se sospecha que es carcinógeno, ya que se intercala entre el ADN. Por tanto,
todos los desechos de BrEt deben ser considerados como tóxicos.
Debe evitarse el contacto con las manos, piel y ojos, por lo que se deberán usar guantes
durante todo el tiempo en que se manipule este compuesto. Cuando se vayan a preparar las
soluciones de BrEt, se recomienda utilizar guantes de nitrilo, en lugar de los de látex, ya que
estos últimos brindan menor protección. Cuando se trabaje con las soluciones líquidas de
BrEt se recomienda cambiarse los guantes constantemente y no tocar objetos de uso común
al tener los guantes puestos.
Los geles teñidos con BrEt no deben eliminarse en la basura convencional, sino a través de
los sistemas de eliminación de mutágenos inactivándolos e incinerándolos.
En caso de alguna contaminación con la solución líquida de BrEt en piel u ojos, avise a su
profesor y enjuáguese con abundante agua por 15 min.
Manejo del transiluminador
El transiluminador trabaja con luz ultravioleta de onda media (302 nm), por lo que debe
evitarse al máximo mirarla directamente durante la visualización del ADN. La exposición a
ella debe de ser mínima y siempre empleando protección para cara y ojos (careta y/o lentes)
y guantes.
Disposiciones adicionales
• Además del material correspondiente a cada práctica, es indispensable tener por equipo:
- guantes de látex (un par por cada integrante),
- una franela o pedazo de tela sin pelusa para limpiar,
- marcador de tinta permanente,
- tijeras.
• Antes de preparar cualquier solución, debe estar etiquetado cada tubo o vaso donde se
colocará.
• Por ningún motivo se alterará el orden del experimento, principalmente cuando se trate de
adición de reactivos.
• Utilizar solo la cantidad requerida de reactivos en la práctica de laboratorio: procurar no
regresar excedentes de reactivo al frasco principal, esto con el fin de evitar contaminación.
El alumno que incumpla con lo establecido en este reglamento será sancionado,
de acuerdo con la gravedad del hecho. Las sanciones pueden ser amonestación
verbal, amonestación por escrito, suspensión del servicio o incluso baja de
acuerdo a lo estipulado por la Universidad Cuauhtémoc Plantel Querétaro.
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UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC CAMPUS QUERÉTARO
FACULTAD DE MEDICINA
PRÁCTICA NO. 1
MANEJO Y CUIDADO DE LAS MICROPIPETAS
Introducción
La elección del material y equipo de laboratorio para llevar a cabo una práctica, estará de acuerdo
con las características y objetivo de la prueba a realizar. Respecto a la medición de volúmenes de
líquidos en el laboratorio, puede llevarse a cabo a través de diversos instrumentos tales como
buretas, probetas y pipetas graduadas.
Específicamente, las técnicas experimentales del laboratorio de Biología Molecular se realizan a
pequeña escala, trabajando con volúmenes del orden de mL y µL. Por tanto, se utilizan instrumentos
especializados para poder tomar y depositar estos pequeños volúmenes con exactitud y
reproducibilidad.
En este sentido, las micropipetas, también llamadas pipetas automáticas, son dispositivos de
laboratorio que nos permiten cuantificar estos volúmenes mínimos.
Existen diferentes tipos de micropipetas: manuales o electrónicas, monocanal o multicanal, de
desplazamiento de aire o desplazamiento positivo, de volumen fijo o de volumen variable, etc.
En el Laboratorio de Biología Molecular las más utilizadas son las de tipo monocanal de
desplazamiento de aire y de volumen variable. De manera general, este tipo de micropipetas
funcionan transmitiendo la fuerza que un operador ejerce de forma manual sobre un émbolo el cual a
su vez se encuentra unido a un pistón desplazando un volumen de aire a lo largo de un cilindro de
longitud fija que controla el volumen a dispensar.
Las micropipetas de volumen variable nos permiten ajustar el volumen a ser dispensado dentro de un
intervalo determinado en las especificaciones de la pipeta. El volumen que puede tomarse con la
micropipeta puede ir desde 0.1 a 5000 µL, en intervalos como son:
• 0.1 - 2.5 µL,
• 0.5 - 10 µL,
• 2 - 20 µL,
• 10 o 20 - 100 µL,
• 100 - 1000 µL,
• 100 - 5000 µL.
Cabe mencionar que el conocimiento del manejo y cuidado apropiado de las micropipetas, y demás
equipos de laboratorio, nos permite la obtención de resultados satisfactorios. Por lo anterior, el
personal que se desenvuelve en un laboratorio es responsable de proteger su salud y la de los
demás, en seguimiento con las reglas establecidas. Así, es de suma importancia que el neófito
conozca los aspectos básicos de seguridad (regularmente plasmados en un reglamento) así como los
propios en relación a la identificación del material y equipos usados cotidianamente, con el fin de
disminuir y/o evitar accidentes e incluso, ciertas infecciones.
Objetivos
• Conocer el manejo apropiado y cuidado de las micropipetas de desplazamiento del aire.
• Entender las habilidades necesarias para manejar las micropipetas de desplazamiento del aire.
Material
• Micropipetas de diferentes volúmenes y puntas
• Microtubos de 1.5 o 2 mL
Reactivos/Soluciones
• Agua destilada
Equipos
• Balanza analítica
9
Metodología
Identificación de partes de la micropipeta
Identificar las principales partes de una micropipeta de desplazamiento de aire de acuerdo a la
1.
Figura 1. El docente responsable dará una explicación breve de la función de cada una de ellas.
Émbolo o botón de
accionamiento
Rueda o tornillo de
ajuste de volumen
Botón eyector de punta
Empuñadura o cuerpo de
la micropipeta
Display indicador de
volumen
Eje y eyector de punta
Soporte de punta
!
Figura 1. Partes de una micropipeta de desplazamiento de aire marca Science Med
(Modificado de: https://science-med.com/product.php?cat=1&id=14)
Uso general de las micropipetas mediante pipeteo directo
1. Primeramente, se debe seleccionar la micropipeta a usar de acuerdo al volumen que se tomará,
esto debido a que la precisión disminuye al acercarnos al volumen de trabajo mínimo. El intervalo
de trabajo óptimo de las micropipetas es del 35% al 100% de su volumen nominal; por lo que no
se debe usar una micropipeta para tomar menos del 10% de su volumen máximo. Ejemplo: una
micropipeta con un volumen máximo de 1000 µL, tendrá un rango efectivo de trabajo entre 350 y
1000 µL, por lo que, aunque en las especificaciones nos indiquen que podemos tomar 100 µL, lo
ideal es emplear esta micropipeta solo para volúmenes superiores a 350 µL.
10
2. Una vez seleccionada la micropipeta, se debe ajustar el volumen a tomar mediante el giro suave
(pero no extremadamente lento) de la rueda o tornillo de ajuste de volumen hasta que aparezca el
volumen deseado en el display indicador. Según el fabricante, los dígitos pueden leerse de arriba
a abajo o de izquierda a derecha, siendo regularmente 3 o 4 dígitos.
3. La toma de la muestra se realiza a través de una punta de plástico, las cuales deben estar
perfectamente limpias y estériles antes de utilizarse. El tipo de puntas a usar depende de la
marca y volumen de la micropipeta, siguiendo regularmente un código de colores:
Color de punta
Rango a tomar
Blanca/Cristal
0.1 - 10 μL
Amarilla
2 - 200 μL
Azul
100-1000 μL
La mayoría de las puntas son de tipo universal, es decir, que pueden ajustarse a diferentes modelos
y marcas de micropipetas; no obstante, también se pueden encontrar en el mercado algunas con
diseños especiales para adaptarse a necesidades concretas como puntas más finas y largas, puntas
con filtros, etc.
De manera regular, las puntas para micropipeta se encuentran listas para su toma en cajas
especiales (Figura 2).
!
Soporte de punta
Figura 2. Cajas de almacenamiento para puntas
(Tomado de: www.velaquin.com.mx)
11
La punta debe tomarse mediante una presión suave pero firme (Figura 3); es importante mencionar
que no es necesario ejercer demasiada fuerza, pues un “golpe” entre la punta y la micropipeta puede
ocasionar la descalibración de la misma. Si no se tienen cajas, la punta puede colocarse directamente
con la mano mediante un empuje suave.
!
Figura 3. Toma correcta de la punta a partir de caja de almacenamiento
(Tomado de: www.eppendorf.com/manuals)
4. Una vez que se tiene la punta lista, colocar la micropipeta en posición vertical y presionar
suavemente el émbolo con el pulgar hasta el primer tope (tope de absorción) (Figura 4).
Posición inicial
Primer tope
Segundo tope
!
Figura 4. Posiciones del émbolo de micropipeta
(Tomado de: https://onlinesale.cheaps2022.ru/content?c=uso%20de%20micropipetas&id=4)
12
5. Manteniendo la micropipeta en forma vertical con el émbolo en el primer tope (Figura 5), sumergir
la punta en el líquido y soltar suavemente el émbolo hasta que regrese a la posición inicial.
!
Figura 5. Forma correcta y errónea de la toma del líquido con la micropipeta
(Modificado de: Fuentes López y col., 2020)
La profundidad de inmersión de la punta dependerá del volumen de la misma que se esté utilizando,
en la Figura 6 se observa la profundidad de inmersión recomendada durante la toma de muestra.
!
Figura 6. Profundidad de inmersión de la punta durante la toma de muestra
(Tomado de: Fuentes López y col., 2020)
13
Se recomienda tomar el líquido de 1 a 3 veces y descartarlo antes de aspirar el volumen definitivo. Lo
anterior se realiza con el fin de formar una película de líquido en la punta para mejorar el aspirado del
mismo, principalmente de líquidos densos. Cabe mencionar que se debe mantener un ritmo firme y
constante al aspirar el líquido pues pipetear muy rápido provocará la entrada del aire a la punta y por
tanto una medición incorrecta (Figura 7).
!
Figura 7. Forma correcta y errónea del llenado de la punta con el líquido
(Tomado de: Fuentes López y col., 2020)
Ya que se tomó el líquido, sacar la punta y tocar con ella las paredes del recipiente para descartar los
excesos de líquido del exterior de la punta.
6. Una vez que se tiene cargado el líquido en la punta, vaciar este tocando ligeramente la pared
lateral del tubo o recipiente destino. Tocar suavemente la superficie o introduciendo ligeramente la
punta (Figura 8) y apretar el émbolo hasta el primer tope. Cuando deje de salir líquido presionar
hasta el segundo tope para dispensar completamente el líquido de la punta. Ya que se descargó
todo el líquido de la punta, sacar la micropipeta y soltar el émbolo que regresará a su posición
original. NOTA: también puede presionarse desde inicio hasta el segundo tope para dispersar
todo el líquido en un solo movimiento, solo debe asegurarse que el ritmo sea constante para
evitar dejar líquido en la punta.
!
Figura 8. Formas correctas de vaciado de líquido al tubo o recipiente destino
(Tomado de: Fuentes López y col., 2020)
7. Para retirar la punta de la micropipeta, presionar de manera firme el botón eyector (Figura 1) y de
esta forma la punta se expulsa de manera automática. Las puntas deben colocarse en un
contenedor destinado para ello.
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Cuidado de las micropipetas
Entre las recomendaciones para el buen uso de las micropipetas se encuentran las siguientes:
1. Asegurarse que se está usando la micropipeta correcta para el volumen que necesita medir.
2. No ajustar el volumen de la micropipeta por arriba o por debajo del intervalo de volumen debido a
que la medición no sería exacta y además se podría provocar la descalibración de la misma.
3. No utilizar la micropipeta sin la punta correspondiente, esto contaminará la micropipeta y la puede
dañar.
4. No colocar las micropipetas con la punta llena de líquido en posición horizontal o invertida, pues
ocasionaría la introducción del líquido en el interior y por ende su contaminación.
5. No pipetear líquidos que emitan vapores o a más de 40ºC.
Ejercicio práctico
1. Seleccionar uno o dos volúmenes definido para tomar, ejemplo: 50 µL, 100µL, 200 µL o 1000 µL.
2. Tomar la micropipeta adecuada para medir el volumen a pipetear siguiendo las indicaciones
anteriormente mencionadas.
3. Verter el volumen en un microtubo de 1.5 o 2 mL previamente tarado.
4. Pesar el tubo y anotar el peso en g del volumen agregado.
5. Repetir este proceso 5 veces en 5 microtubos diferentes.
6. Con los datos obtenidos, calcular el porcentaje de coeficiente de variación (C.V.) mediante la
siguiente fórmula:
Donde,
S = desviación estándar
= media aritmética
!
7. Con los datos obtenidos, calcular el porcentaje de error relativo porcentual mediante la siguiente
fórmula:
!
Donde,
Ve = valor experimental promedio
Vt = valor teórico x 100
Observaciones y resultados
Incluir en reporte de práctica. Relacionar el %C.V. y el %error con los conceptos de precisión y
exactitud.
Cuestionario
1. ¿Qué es la calibración y cuál es su importancia en los laboratorios de Ciencias Biológicas?
2. Definir qué es exactitud, precisión y reproducibilidad.
3. Investigar qué es el pipeteo inverso y en qué situaciones se utiliza.
4. ¿Cuáles son las condiciones ambientales óptimas para el uso de las micropipetas y porqué es
importante?
5. Investigar algunos ejemplos de problemas que pueden presentarse al trabajar con las
micropipetas y cómo pueden solucionarse.
Discusión y conclusión
Incluir en reporte de práctica.
Bibliografía
Incluir en reporte de práctica.
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FACULTAD DE MEDICINA
PRÁCTICA NO. 2
DIVERSIDAD CELULAR
Introducción
La forma más básica y simple de vida humana es la célula. Los seres humanos, considerados por
algunos autores como los organismos más complejos, somos meramente un conjunto de células que
han crecido y se han diferenciado para dar origen a cada tejido especializado. Así, cada célula se
desarrolló con un propósito a partir de otra precursora, con un linaje específico para adquirir una
organización estructural determinada.
Estas mismas diferencias celulares pueden ser observadas en un mismo organismo, donde, a través
de la adquisición de rutas metabólicas propias, se tiene una gran variedad de funciones distintas
aunque cada una de ellas conserva el mismo genoma.
Al hablar de la célula hay que tener en cuenta todos los componentes de la misma que son
esenciales para el desarrollo de la vida. Como límite externo de la célula, la membrana plasmática
protege el interior de aquélla del ambiente. Sin embargo, también es una estructura dinámica que
permite las interacciones con el medio y facilita la función de la célula.
Dentro del espacio de la membrana plasmática se identifican las proteínas del citoesqueleto que no
sólo aportan un marco estructural para la célula, sino que también participan en el movimiento
intracelular. Por su parte, los organelos (hablando específicamente de eucariontes) son centros
especializados dentro de cada célula que llevan a cabo procesos fisiológicos, como la producción de
energía en las mitocondrias, la digestión de macromoléculas en los lisosomas, o la síntesis de ADN y
ARN en el núcleo, por ejemplo. Respecto a lo anterior, los procesos implicados en la expresión del
ADN hacia proteínas funcionales requieren acciones conjuntas tanto del núcleo, como de los
ribosomas, el retículo endoplasmático y el aparato de Golgi.
Por tanto, aunque cada organelo es una máquina compleja por si misma pues desempeña un papel
único dentro de la célula, estas estructuras tienen un vínculo físico entre sí y cooperan para llevar a
cabo sus tareas con un propósito unificado.
Si bien el cuerpo humano está constituido por cerca de 200 tipos distintos de células de distintos
tamaños, esta medida se conserva más o menos constante en un mismo tipo celular y organismo.
Esta característica se ha tomado también como referencia para la clasificación de los distintos tipos
celulares. Los cambios en el tamaño y número de células han servido para correlacionar y arrojar
información en algunas patologías por ejemplo.
Específicamente, las muestras de fluidos corporales como son la sangre y orina, y en el caso de los
hombres el semen, son muy utilizados para conocer el estado general del individuo empleándose
para realizar distintos análisis bioquímicos y moleculares.
Familiarizarse con la morfología celular es uno de los primeros acercamientos al estudio de las
Ciencias Biológicas. Aunado a lo anterior, la correcta toma de muestra y manejo de la misma es
determinante para una posterior interpretación de resultados.
Objetivos
• Conocer las indicaciones para la toma correcta de orina, sangre y semen.
• Reconocer al microscopio diferentes formas, tamaños y características morfológicas de distintos
tipos de células.
• Aprender el uso de la cámara de Neubauer para el recuento manual de células.
Material
• Aplicadores de madera con punta de algodón
• Cámara de Neubauer improved (100 µm de profundidad)
• Cubreobjetos
• Cubreobjetos para cámara de Neubauer
• Guantes
• Lámpara de alcohol
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•
•
•
•
•
•
•
•
Lancetas
Material para venopunción (consultar Anexo 6. Toma de muestra sanguínea/venopunción)
Micropipetas de diferentes volúmenes y puntas
Microtubos de 1.5 o 2 mL
Pipetas de transferencia
Portaobjetos
Tubos para centrífuga
Vasos estériles para recolección de muestra
Material biológico
• Muestra de células bucales
• Muestra de orina
• Muestra de semen
• Muestra de sangre (consultar Anexo 6. Toma de muestra sanguínea/venopunción)
Reactivos/Soluciones
• Agua destilada
• Azul de metileno 0.2%
• Cloruro de sodio (NaCl) 0.9%
• Colorante de Wright
• Medio de dilución Weigman
• Solución amortiguadora pH 6.0 para tinción de Wright
Equipos
• Centrífuga clínica (consultar Anexo 4. Técnicas frecuentes utilizadas en el laboratorio de Biología
Molecular)
• Microscopio óptico (consultar Anexo 5. Uso del microscopio óptico)
Metodología
NOTA: utilizar guantes en todo momento, recordar que se está trabajando con muestras
potencialmente infecciosas. Toda muestra debe etiquetarse con nombre, fecha y hora.
Toma y observación de células bucales
1. Con un hisopo frotar ligeramente la cara interna de la mejilla.
2. Mezclar la muestra anterior con una gota de NaCl 0.9% previamente colocada en un portaobjetos
limpio.
3. Mezclar con movimientos rotatorios hasta obtener un material con aspecto lechoso homogéneo, y
luego extender la muestra con el mismo hisopo.
4. Calentar unos segundos en la flama para fijar la muestra cuidando que no se reseque por
completo.
5. Agregar una gota de azul de metileno 0.2% y cubrir con un cubreobjetos.
6. Observar la muestra al microscopio con los objetivos 10x y 40x.
Toma de muestra de orina
Indicar al paciente la limpieza sus genitales externos con agua (lo más pura posible) y jabón neutro
nuevo antes de la toma de muestra (no se deben utilizar otro tipo de antisépticos). NOTA: El paciente
no debe realizar ejercicio intenso las 48 h previas al tomado de la muestra.
1. Solicitar al paciente que recoja la primera orina de la mañana en un vaso estéril de boca ancha.
Si no es posible, tomarla después <3 h de retención urinaria.
2. Descartar la primera porción del chorro miccional.
3. Recoger en el vaso estéril el chorro medio.
4. Descartar la última parte de la micción sobre todo si en ese momento la orina sale con esfuerzo y
mayor velocidad.
5. La muestra debe conservarse en frío a 4ºC, temperatura a la que puede permanecer de 24-48 h.
No debe mantenerse a temperatura ambiente por espacios mayores de 1 h.
17
Observación microscópica de sedimento urinario
1. Agitar el frasco con numerosos movimientos del bote.
2. Colocar de 5 a 10 mL de orina en un tubo para centrífuga y centrifugar a 2500 rpm durante 5 min.
NOTA: equilibrar los tubos por peso, no por volumen.
3. Decantar el sobrenadante y resuspender la pastilla en un volumen pequeño de agua destilada.
4. Colocar una gota de esta muestra en un portaobjetos y cubrir con un cubreobjetos.
5. Observar la muestra al microscopio con los objetivos 10x y 40x. Determinar la presencia o
ausencia de células epiteliales, leucocitos, eritrocitos, cilindros, cristales, bacterias u hongos
levaduriformes.
NOTA: si la muestra es difícil de observar, puede colocarse una gota de azul de metileno 0.2%.
Toma de muestra de semen
El paciente debe guardar abstinencia sexual de mínimo 3 días para evitar pérdidas de semen, ya sea
por coito o por autoestimulación durante dichos días. Indicar al paciente la limpieza sus genitales
externos con agua (lo más pura posible) y jabón neutro nuevo antes de la toma de muestra. No se
deben utilizar otro tipo de antisépticos.
1. Obtener la muestra por autoestimulación genital con las manos limpias y secas. Si es posible, la
muestra debe obtenerse inmediatamente antes de llevar a cabo el análisis para que esté lo más
fresca posible; de lo contrario, utilizarla máximo 1 h desde la obtención.
2. Recolectar la totalidad del semen eyaculado en un vaso estéril de boca ancha.
3. De ser posible, mantener la muestra a 37ºC para evitar su coagulación.
Observación microscópica de la muestra de semen
1. Colocar una gota de semen en el centro de un portaobjetos.
2. Agregar una gota de azul de metileno 0.2% y cubrir con un cubreobjetos.
3. Observar la muestra al microscopio con los objetivos 10x y 40x e identificar las estructuras.
4. En 40x, elegir un campo definido y empezar a contar siguiendo el sentido de las manecillas del
reloj (Figura 9). NOTA: si es posible, realizarlo de un solo golpe visual para reducir el error.
!
Figura 9. Procedimiento de contaje en un campo. A) simulación de una rejilla en el campo visual. B) punto de
partida y trayectoria visual del contaje
(Tomado de: López García y col., 2012)
5. Anotar el número aproximado de espermatozoides contado por campo.
18
Recuento de espermatozoides
1. Para decidir la dilución a utilizar para el recuento de espermatozoides, se debe considerar el
análisis microscópico anterior de la muestra sin diluir y la observación por campo (objetivo 40x y
ocular 10x = 400x) de acuerdo a la Tabla 1.
Tabla 1. Factores de dilución y conversión para hacer el recuento en cámara de Neubauer
Espermatozoides
por campo 400x
Dilución
<15
Factores de conversión
Número de cuadrados contados
25
10
5
1:5
20
8
4
15-40
1:10
10
4
2
40-200
1:20
5
2
1
>200
1:50
2
0.8
0.4
2. Una vez decidida la dilución, preparar por duplicado 1 mL de esta dilución usando el medio de
dilución Weigman. NOTA: es importante tener homogenizada la muestra mediante aspiración con
una pipeta de transferencia por 10 ocasiones.
3. Colocar el cubreobjetos para cámara de Neubauer y llenar cada subcámara (Figura 10A) con 10
µL de cada una de las diluciones preparadas.
4. Dejar reposar durante 5 min. en un ambiente sin corrientes de aire ni alta temperatura.
5. Con el objetivo 40x, ubicar la rejilla central 5 (Figura 10B), que a su vez está formada por 25
cuadrados grandes (Figura 10C).
!
Figura 10. Cámara de Neubauer improved. A) Dos subcámaras. B) Cada subcámara tiene 9 rejillas cada una de
las cuales tiene un área de 1 mm2 y una profundidad de 0.1 mm3. Las rejillas de los extremos tienen 16 cuadros
que se utilizan para el conteo de leucocitos. C) La rejilla central está formada por 25 cuadrados grandes que
mide cada uno 0.2 mm de lado que se utilizan para el conteo de eritrocitos. D) Cada cuadrado grande está
enmarcado por una triple línea y se divide en 16 cuadrados pequeños
(Modificado de: López García y col., 2012)
19
6. Una vez ubicada la rejilla 5, contar el número de espermatozoides en el cuadrado grande central
marcado como 3 en la Figura 11A. Si se cuentan:
• Menos de 10 espermatozoides, contar los 25 cuadrados de toda la rejilla 5
• Entre 10 a 40 espermatozoides, contar 10 cuadrados de la rejilla 5
• Más de 40 espermatozoides, contar 5 cuadrados de la rejilla 5
7. Si hay espermatozoides sobre la línea que divide a dos cuadrados adyacentes, solo se cuentan
los que están en el lado superior y en el lado izquierdo, descartando los que están en el lado
inferior y el lado derecho (Figura 11B).
8. Para calcular el número de espermatozoides:
• Los resultados de ambas subcámaras se promedian.
• El valor se divide por el factor de dilución de acuerdo al número de cuadrados contados de
acuerdo a la Tabla 1.
• El resultado corresponde al número (en millones) de espermatozoides/mL de eyaculado. Si se
tiene el dato del volumen total del eyaculado, el recuento se multiplica por los mL para tener un
recuento total en millones de espermatozoides en la muestra.
A
B
!
Figura 11. Detalles del área central de una subcámara de la cámara de Neubauer improved. A) El número de
cuadros a contar se decide de acuerdo al número de espermatozoides en el cuadro 3. B) Los círculos marcados
en naranja son los considerados en el conteo, los de color verde no se consideran
(Modificado de: Toro Montoya, 2009)
Toma de muestra de sangre
Realizar la toma de muestra sanguínea de una persona de acuerdo al Anexo 6. Toma de muestra
sanguínea/venopunción.
También puede utilizarse una lanceta para obtener sangre capilar mediante la siguiente metodología:
1. Con una torunda impregnada en etanol al 70%, limpiar el dedo que se va a puncionar.
2. Realizar una presión del dedo a puncionar hacia la dirección donde se realizará la punción.
3. Con una lanceta, puncionar la yema del dedo.
4. Obtener una gota de sangre al ejercer presión en el dedo puncionado.
20
Frotis de sangre
1. Tomar una gota de sangre obtenida, colocarla en el extremo del portaobjetos y hacer un
extendido con otro portaobjetos (Figura 12). Dejar secar al aire.
A
B
C
!
Figura 12. Técnica de frotis extendido. A) Se coloca una gota de sangre a un centímetro del borde. B) El
portaobjetos superior extensor se desplaza hacia la gota de sangre y se llena por capilaridad. C) Desplazar el
portaobjetos extensor hacia el otro lado hasta que la gota se termine
(Modificado de: https://edulabc.com.mx/recomendaciones-para-la-realizacion-del-extendido-de-sangreperiferica/)
2. Agregar colorante de Wright cubriendo todo el extendido y dejar reposar durante 5 min.
3. Sobre el mismo colorante agregar la solución amortiguadora para Wright y dejarlo reposar
durante 15 min. En intervalos de 5 min., soplar el frotis con una pipeta de transferencia hasta
observar la presencia de una capa metálica.
4. Eliminar el exceso de colorante y lavar suavemente el frotis con agua durante 5-30 seg.
5. Escurrir el excedente en papel absorbente y dejar secar al aire.
6. Observar la muestra al microscopio e identificar las diferentes tipos de células sanguíneas.
NOTA: si no se tiene colorante de Wright, la muestra de sangre puede teñirse también con la técnica
de hematoxilina y eosina.
Recuento de eritrocitos en muestra de sangre
1. Realizar por duplicado una dilución 1:200 con NaCl 0.9%.
2. Colocar el cubreobjetos para cámara de Neubauer y llenar cada subcámara (Figura 10A) con 10
µL de la dilución 1:200. De esta forma cada uno de los 25 cuadros de la rejilla central tendrá un
volumen de 0.04 mm3 .
3. Dejar reposar durante 5 min. en un ambiente húmedo pero sin corrientes de aire ni alta
temperatura.
4. Con el objetivo 40x, ubicar la rejilla central 5 (Figura 10B).
5. Una vez ubicada la rejilla 5, contar el número de eritrocitos en los cuatro cuadros de los extremos
y en el central (en la Figura 11A, los marcados como 1, 2, 3, 4 y 5). Tomar en cuenta la ubicación
anteriormente mencionada (Figura 11B).
6. Obtener la suma del conteo en los 5 cuadros, y luego el promedio de los resultados de cada
subcámara. Este será el número de células contadas.
7. Calcular el número de eritrocitos por mm3 de acuerdo a la siguiente fórmula:
no. de eritrocitos/mm3 = no. de eritrocitos contados x 5 x 10 x D
Donde,
5= ya que la rejilla central tiene 25 cuadrados grandes, habrá que multiplicar el resultado por 5
10= el volumen de la rejilla central es 0.1 mm3, habrá que multiplicar el resultado por 10 para
determinar la cantidad de hematíes en 1 mm3
D= factor de dilución (200)
21
Observaciones y resultados
Incluir en reporte de práctica.
Cuestionario
1. ¿Cuál es la importancia del análisis del sedimento urinario?
2. ¿Qué provocaría la falta de homogenización de la muestra de semen sobre el análisis de la
misma?
3. Investigar la importancia clínica de la aglutinación de espermatozoides.
4. Investigar ejemplos específicos de patologías donde el conteo de eritrocitos esté disminuido.
5. Explicar brevemente la función de cada una de las células sanguíneas.
Discusión y conclusión
Incluir en reporte de práctica. Incluir las diferencias y semejanzas de los diferentes tipos de células
observadas, en relación con diversidad, estructura externa e interna, presencia/ausencia de
organelos, complejidad, función, motilidad, etc.
Bibliografía
Incluir en reporte de práctica.
22
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FACULTAD DE MEDICINA
PRÁCTICA NO. 3
OBSERVACIÓN DE MITOSIS EN CÉLULAS VEGETALES
Introducción
La forma en cómo la vida se perpetúa de generación en generación y cómo los padres determinan en
gran medida las características de su descendencia, fueron interrogantes cruciales de resolver para
las Ciencias Biológicas. La capacidad de reproducción es fundamental para la existencia,
propagación y continuación de las células que se realiza mediante un conjunto ordenado de eventos
denominado ciclo celular.
El ciclo celular es el proceso mediante el cual las células se duplican y dan lugar a dos nuevas
células. Este ciclo tiene distintas fases, que se denominan G1 (G, del inglés growth), S (S, del inglés
synthesis), G2 y M (M, de mitosis). G1, S y G2 se denominan en conjunto interfase, y la mayor parte
del tiempo del ciclo corresponde a ésta.
La fase G1 es aquella en que la célula se prepara para dividirse, duplica su tamaño y aumenta la
cantidad de organelos y diversas moléculas. Luego, entra en la fase S, que es cuando la célula
realiza la duplicación de todo su ADN. Una vez que se dispone del ADN duplicado y hay una dotación
extra completa del material genético, la célula entra en la fase G2 donde condensa y organiza el
material genético y se prepara para la división celular.
En la fase M, correspondiente a la mitosis, la célula reparte las dos copias de su material genético
entre sus dos células hijas. Después de haber completado la fase M, se obtienen dos células (de
donde había sólo una) y el ciclo celular empieza de nuevo para cada una de ellas. La mitosis se
divide a su vez en cuatro etapas: profase, metafase, anafase y telofase (Figura 13).
!
Figura 13. Célula en las diferentes fases de la mitosis
(Tomado de: Ducolomb y col., 2012)
A pesar de ocupar una pequeña fracción de todo el ciclo celular los procesos de la fase M o mitosis
son fácilmente visibles en células somáticas tanto en crecimiento como regeneración. Esto debido a
que la división celular es necesaria para el reemplazo de las células perdidas por lesión (necrosis) o
por muerte celular programada (apoptosis), con el fin de mantener el estado de equilibrio del
organismo. De tal suerte, si la división celular se detiene o se incrementa el individuo moriría o
presentaría organomegalia (agrandamiento de órganos) o procesos de cáncer.
En las células vegetales la mitosis es fácilmente observable en los meristemos mediante una tinción
sencilla.
Objetivos
• Identificar morfológicamente células que se encuentren tanto en interfase como en los diferentes
estadios de división celular.
• Reconocer las diferentes etapas de la mitosis en células vegetales.
23
Material
• Cubreobjetos
• Estuche de disección (pinzas)
• Goteros o pipetas de transferencia
• Guantes
• Lámpara de alcohol
• Microtubos de 1.5 o 2 mL
• Navaja de afeitar o de bisturí
• Palillos
• Papel parafilm
• Portaobjetos
• Tijeras
• Vaso de plástico
Material biológico
• Raíces de cebolla en crecimiento
Reactivos/Soluciones
• Agua destilada
• Acetocarmín 6%
• Ácido clorhídrico (HCl) 0.1 M
• Solución de Carnoy (precaución: contiene ácido acético y cloroformo)
Equipos
• Microscopio óptico (consultar Anexo 5. Uso del microscopio óptico)
Metodología
Preparación previa de la muestra
1. Seis o siete días antes de la práctica, tomar una cebolla fresca de tamaño mediano.
2. Quitar las raíces y fibras secas de la base del bulbo.
3. Insertar 3 palillos de forma que la cebolla quede suspendida en un vaso o recipiente con agua, de
tal forma que la parte inferior toque siempre el agua (Figura 14).
4. Cambiar diariamente el agua del frasco por agua limpia.
NOTA: la raíz de la cebolla debe estar sumergida en agua hasta el momento de realizar la práctica.
!
Figura 14. Dispositivo de preparación de muestra para la observación del proceso de mitosis
(Tomado de: http://bobbyversechmx.blogspot.com/p/bii-3_23.html)
24
Fijación de la muestra
1. Un día antes de la práctica, cada equipo debe llevar la cebolla al laboratorio que ya debe tener
numerosas raicillas nuevas. NOTA: la raíz en crecimiento debe seguir sumergida en agua.
2. Con la navaja realizar cortes transversales de aprox. 1 cm de longitud de la mitad inferior de la
punta de varias raicillas, es decir la zona apical.
3. Colocar el corte anterior en un microtubo y agregar solución de Carnoy hasta tapar la raíz.
4. Sellar el tubo con papel parafilm y reposar toda la noche hasta el momento de la tinción.
Tinción de la muestra e impronta
1. Sacar la raíz del microtubo con ayuda de una pinzas y colocarla en un portaobjetos que contiene
unas gotas de HCl 0.1 M.
2. Utilizando una lámpara de alcohol calentar el portaobjetos por 5-10 seg (ayudarse de una pinza).
3. Dejar reposar por 2 min.
4. Con la pinza, tomar suavemente la raíz y transferirla a un microtubo que contiene 1 mL de agua
destilada para enjuagar la raíz.
5. Transferir la raíz a un portaobjetos que contiene unas gotas de acetocarmín 6%.
6. Utilizando una lámpara de alcohol calentar el portaobjetos por 5-10 seg (ayudarse de una pinza).
NOTA: evitar que la muestra se reseque.
7. Dejar reposar por 10 min.
8. Transferir la raíz a un portaobjetos que contiene una gota de agua destilada.
9. Con la navaja, realizar cortes transversales finos de aprox. 1 mm de longitud de la zona apical.
Descartar el resto de la raíz.
10. Colocar un cubreobjetos y presionarlo sin que se rompa la muestra (puede usarse la goma de un
lápiz); mientras esté más aplanada la muestra las células se separarán mejor y se encontrarán en
el mismo plano distinguiéndose mejor las distintas etapas de mitosis. NOTA: la preparación debe
tener un color rosa tenua casi transparente.
11. Observar la muestra al microscopio con los objetivos 10x y 40x.
Para un mejor seguimiento de la metodología, consultar Figura 15.
!
Figura 15. Diagrama de flujo de fijación y tinción de células en mitosis
(Creado en biorender.com por: Granados Avalos Estefany)
25
Cálculo del % de índice mitótico (IM)
1. Considerando 3 campos, contar en cada uno mínimo 100 células para calcular el IM, de acuerdo
a la siguiente fórmula:
!
Observaciones y resultados
Incluir en reporte de práctica.
Cuestionario
1. ¿Cuántos tipos de reproducción existen? Describir sus características.
2. ¿Porqué se utiliza en esta práctica la sección de los ápices de la cebolla?
3. Investigar cuál es la acción de un agente mitógeno y uno mitostático. Dar ejemplos de cada uno.
4. ¿Qué relevancia tiene el cálculo del IM?
5. Explicar la diferencia entre cariocinesis, mitosis y citocinesis.
Discusión y conclusión
Incluir en reporte de práctica.
Bibliografía
Incluir en reporte de práctica.
26
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FACULTAD DE MEDICINA
PRÁCTICA NO. 4
EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (ADN) A
PARTIR DE UNA MUESTRA ANIMAL
Introducción
El ADN es una cadena polimérica de desoxirribonucléotidos unidos por enlaces fosfodiéster. Los
nucleótidos que forman al ADN están constituido por el azúcar 2′-desoxirribosa unida mediante enlace
éster al ácido fosfórico y mediante enlace N-glucosídico a una de las cuatro bases nitrogenadas
(adenina, guanina, timina o citosina). Los nucleótidos del ADN forman una hélice constituida por dos
hebras antiparalelas que se mantienen unidas mediante puentes de hidrógeno. En los organismos
eucariontes, los desoxirribonucléotidos de ADN cuyas cargas externas son negativas, se encuentran
asociados a proteínas básicas las histonas (cargadas positivamente a pH fisiológico), lo que le
confiere estabilidad y permite su empaquetamiento en el núcleo celular.
El aislamiento del ADN requiere una serie de etapas que incluyen desde la toma y mantenimiento del
tejido en las condiciones adecuadas, hasta la conservación del ADN extraído.
Según el tipo de célula en estudio, tiene que romperse la pared celular y/o la membrana plasmática
mediante métodos físicos, químicos o enzimáticos. Para facilitar la degradación del tejido sin dañar el
material genético se pueden combinar diversos métodos como la congelación de la muestra y su
posterior macerado en un mortero precongelado; o el uso de una licuadora o triturador si la muestra
es fresca. Luego, la precipitación del ADN se realiza con solventes orgánicos, utilizándose
comúnmente etanol o isopropanol; en algunos casos puede requerirse sucesivos lavados con alcohol
para eliminar las sales. Una vez formado el precipitado, el etanol debe eliminarse mediante
centrifugación, decantación o evaporación; y la muestra se resuspende en un solvente acorde al uso
que se le dará. Por último, la conservación de la muestra se realiza a bajas temperaturas, por ejemplo
a -20ºC cuando se utilizará a corto plazo, o hasta -80ºC en ultracongelador para mantenerla por
meses o incluso años.
Al obtener una muestra de ADN es importante conocer su concentración para utilizarlo posteriormente
para diversos fines (clonación, amplificación, etc.). Respecto a lo anterior, la absorción en UV del ADN
debido a la presencia de bases aromáticas nitrogenadas a lo largo de las cadenas es una
característica que es usada eficientemente para realizar su cuantificación, es decir, determinar su
concentración. Cada una de las bases tiene su propio y único espectro de absorción y por lo tanto
contribuye de manera diferente a la propiedad total de absorción de UV de una molécula de ADN.
La lectura de la absorbancia se realiza a 260 nm (A260), longitud de onda en la que el ADN tiene su
máximo de absorción de luz, que debe encontrarse entre 0.1 y 1.0. Sin embargo, el ARN también
tiene absorbancia a 260 nm, mientras que los aminoácidos aromáticos presentes en las proteínas
absorben a 280 nm. Por lo anterior, para evaluar la pureza del ADN por espectrofotometría, se debe
medir la absorbancia desde 230 nm hasta 320 nm con el objetivo de detectar otros posibles
contaminantes en la solución.
En la actualidad es posible obtener ADN de diferentes células, tales como bacterias, hepatocitos,
espermatozoides, células vegetales, etc.
Objetivos
• Realizar la extracción de ADN a partir de una muestra animal empleando métodos físicos y
químicos.
• Conocer el manejo general del espectrofotómetro UV-Vis.
• Conocer los principios básicos de la determinación de concentración y pureza del ADN mediante
espectrofotometría UV-Vis.
27
Material
• Agitador de vidrio
• Celdas para espectrofotómetro
• Cuchillo
• Embudo de cola larga
• Gasa
• Gradilla para microtubos
• Micropipetas y puntas
• Pipetas graduadas de 1 o 2 mL o pipetas de transferencia
• Probeta graduada de 50 mL
• Tabla/charola de disección
• Tubos tipo Falcon de 50 mL
• Vasos de precipitado de 250 mL
Material biológico
• Hígado de pollo fresco (1 pieza)
Reactivos/Soluciones
• Ácido etilendiaminotetraacético salino (EDTA 0.1 M/NaCl 0.15 M) pH 8.5
• Difenilamina 1.5% (precaución: contiene ácido acético y ácido sulfúrico)
• Etanol absoluto 99.2% frío (colocar en refrigeración mínimo 1 h antes de utilizar)
• HCl concentrado
• Lauril sulfato de sodio (SDS) 4%
• Solución amortiguadora TE (Tris-HCl 10 mM/EDTA 1 mM) pH 8.0
• Solución de citrato de sodio salino (CSC: citrato de sodio 0.15 M/NaCl 1.5 M)
• Solución SAS (Tris 0.01 M, Sacarosa 0.3 M, cloruro de magnesio 0.005 M, β-mercaptoetanol 0.005
M)
• Tris 0.4 M pH 8.5
Equipos
• Balanza analítica
• Baño de agua
• Centrífuga clínica (consultar Anexo 4. Técnicas frecuentes utilizadas en el laboratorio de Biología
Molecular)
• Congelador o ultracongelador
• Espectrofotómetro UV-Vis (consultar Anexo 4. Técnicas frecuentes utilizadas en el laboratorio de
Biología Molecular)
• Mortero y pistilo
• Parrilla de calentamiento
• Vórtex
Metodología
Extracción de ADN
1. Pesar aprox. 10 g de hígado de pollo y colocar en el mortero.
2. Agregar 20 mL de solución SAS y moler suavemente hasta obtener un puré fino.
3. Pasar el contenido anterior a un tubo tipo Falcon de 50 mL. Vortexear suavemente la muestra
para una mejor homogeneización.
4. Dejar reposar durante mínimo 10 min. en congelamiento.
5. Transcurrido este tiempo, descongelar el tubo bajo el chorro de agua de la llave.
6. Pasar el homogeneizado a través de una gasa doble colocada en un embudo de vidrio y exprimir.
7. Centrifugar el filtrado a 3000 rpm durante 10 min.
8. Desechar el sobrenadante y resuspender el botón en 10 mL de Tris 0.4 M pH 8.5 mediante
agitación con vórtex.
9. Vaciar este contenido a un vaso de precipitado y agregar 5 mL de SDS 4%.
10. Homogeneizar suavemente con el agitador de vidrio y agregar 0.5 mL de EDTA salino
continuando la agitación suave.
28
11. Añadir 1 mL de solución CSC y volver a homogeneizar suavemente.
12. Dejar reposar mínimo 10 min.
Para un mejor seguimiento de la metodología, consultar Figura 16.
!
Figura 16. Diagrama de flujo de extracción de ADN a partir de hígado
(Creado en biorender.com por: Granados Avalos Estefany)
Precipitación de ADN
1. Dejar escurrir el etanol absoluto frío poco a poco por las paredes del vaso de precipitado que
contiene el filtrado obtenido en la sección anterior (aprox. 30-50 mL).
2. Dejar reposar la solución por 5-10 min. sin moverla.
3. Observar la formación de un precipitado blanco que corresponde al ADN, como una especie de
mucosa blanca.
4. Con ayuda de un palillo de madera, recoger el ADN y colocarlo un microtubo limpio. NOTA:
intentar tomar lo menos posible de solvente.
5. Para eliminar completamente el etanol, centrifugar la muestra a 5000 rpm durante 5 min.
6. Dejar secar al aire para eliminar todo remanente de etanol.
7. Resuspender el botón de ADN en un volumen adecuado de solución amortiguadora TE (ej. 0.5
mL, 1 mL o 1.5 mL dependiendo del tamaño del botón) (conservar en refrigeración o a -20ºC si se
desea preservar por más tiempo).
Para un mejor seguimiento de la metodología, consultar Figura 17.
29
!
Figura 17. Diagrama de flujo de precipitación de ADN de hígado
(Creado en biorender.com por: Granados Avalos Estefany)
Cuantificación de ADN por espectrofotómetro UV-Vis
Encender el espectrofotómetro 25 min. antes de iniciar las lecturas. Realizar la cuantificación por
duplicado.
1. En una celda de espectrofotómetro realizar una dilución de la muestra (1:100, 1:200) en solución
amortiguadora TE. NOTA: el volumen total en la celda debe ser de 1000 µL.
2. Mezclar perfectamente el contenido con una micropipeta de 1000 µL o mediante la agitación
suave con vórtex.
3. En otra celda para espectrofotómetro perfectamente limpia colocar 1000 µL de solución
amortiguadora TE y ajustar el espectrofotómetro a 0.
4. Leer la muestra a 260 nm y 280 nm. Anotar las lecturas.
5. Calcular la concentración de ADN en µg/mL (ng/µL) a partir de la fórmula:
ADN (µg/mL) = 50 x A260 x D
Donde,
50 = una solución de ADN de doble hebra (dsADN) con una concentración de 50 µg/mL debe
tener una A260 igual a 1.0.
A = Absorbancia de la muestra a 260 nm
D = Factor de dilución
6. Calcular el ADN total obtenido mediante la fórmula:
ADN (µg) = Concentración de ADN en µg/mL x volumen total de la muestra en mL
7. Calcular la relación A260/A280 e interpretar.
30
Identificación de la desoxirribosa
1. Tomar 3 microtubos, enumerarlos y agregar las siguientes soluciones:
Microtubo
no.
ADN de hígado
Solución
amortiguadora TE
HCl
concentrado
Difenilamina
1.5 %
1
—
100 µL
50 µL
200 µL
2
100 µL
—
50 µL
—
3
100 µL
—
50 µL
200 µL
2. Colocar los microtubos en baño de agua hirviendo durante 10 min. o hasta la aparición de color.
3. Anotar las observaciones.
Observaciones y resultados
Incluir en reporte de práctica.
Cuestionario
1. ¿Qué otros tejidos de origen animal pueden usarse para la obtención de ADN? Justificar la
respuesta.
2. ¿Porqué es mejor resuspender al ADN en TE que en agua destilada y qué sucede si quedan
restos de etanol en la muestra de ADN?
3. ¿De qué depende la elección del método de extracción de ADN? Incluir ejemplos de algunos
métodos distintos al realizado en esta práctica.
4. Investigar qué longitudes de onda específicas son utilizadas para medir otro tipo de
contaminantes del ADN.
5. Investigar otro método para la cuantificación de ADN.
Discusión y conclusión
Incluir en reporte de práctica.
Bibliografía
Incluir en reporte de práctica.
31
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FACULTAD DE MEDICINA
PRÁCTICA NO. 5
ELECTROFORESIS DE ADN EN GELES DE AGAROSA
Introducción
La electroforesis es una técnica comúnmente utilizada en las Ciencias Biológicas que consiste en
separar moléculas cargadas, como proteínas y ácidos nucleicos, por la acción de un campo eléctrico
a través de un soporte. La velocidad de migración se encuentra influenciada por la naturaleza de la
biomolécula en cuanto a su carga, la intensidad del campo eléctrico, y las características del medio
en la que tiene lugar la migración, ya que se realiza en un medio amortiguador o tampón que juega un
papel clave para mantener el pH del sistema (consultar Anexo 4. Técnicas frecuentes utilizadas en el
laboratorio de Biología Molecular).
Específicamente, las moléculas de ADN se encuentran cargadas negativamente por lo que en un
campo eléctrico migran al ánodo (+) (Figura 18), con una movilidad que permite además diferenciar
tanto la forma como el tamaño aproximado de la molécula. Por ejemplo, las moléculas grandes
migran a menor velocidad debido al incremento de las fuerzas electrostáticas y de fricción ejercidas
por su interacción con el medio circundante. Esto puede llevarse a cabo gracias al soporte en el que
se realiza la separación electroforética.
Respecto a lo anterior, regularmente se utilizan moléculas inertes como soportes pero capaces de
ejercer diversos efectos sobre la resolución de la electroforesis. Los geles de agarosa son utilizados
frecuentemente para la separación de ácidos nucleicos ya que forman una matriz gelatinosa. El
tamaño de los poros puede ser variable en función de la concentración de agarosa a utilizar (%p/v) y
de esta manera puede elegirse el tamaño de poro adecuado según el rango de las moléculas a
separar y así, la velocidad de migración.
Para determinar de una forma sencilla el tamaño molecular aproximado de un fragmento de ADN se
utiliza un marcador de tamaño molecular de tipo comercial, el cual se separa en el mismo gel de
agarosa. La separación de los fragmentos de ADN, medidos en pares de bases (pb) o kilopares de
bases (kb) proporcionan una guía para estimar el tamaño de otros fragmentos de ADN.
Por último, para la visualización del ADN se emplea bromuro de etidio (BrEt), un colorante
fluorescente que al intercalarse entre las bases de los ácidos nucleicos amplifica su fluorescencia 25
veces, que en presencia de luz ultravioleta (UV) puede detectarse fácilmente.
!
Figura 18. Electroforesis horizontal en gel agarosa para ADN. La muestra de ADN se deposita en el pozo
del gel de agarosa y el amortiguador de corrida electroforético cubre el gel para evitar que se seque por el
calentamiento al paso de la corriente eléctrica
(Modificado de: Matzumura y col., 2013)
32
Objetivos
• Conocer los principios básicos de la electroforesis horizontal de ADN en geles de agarosa.
• Interpretar el perfil de migración de una muestra de ADN en un gel de agarosa.
Material
• Espátulas de plástico
• Gradilla para microtubos
• Micropipetas y puntas
• Microtubos de 1.5 o 2 mL
• Vasos de prcipitado de 250 mL o recipientes de vidrio con tapa
Material biológico
• Muestras de ADN
Reactivos/Soluciones
• Agarosa
• Agua destilada
• Amortiguador de carga para ADN 6x (amortiguador de carga)
• Amortiguador TBE 1x (a partir de Stock 5x: Tris base 0.5 M/Ácido bórico 0.5 M//EDTA 10 mM)
• Marcador de peso molecular de ADN
• Solución amortiguadora TE (Tris-HCl 10 mM/EDTA 1 mM) pH 8.0
• Solución de bromuro de etidio (BrEt) (10 µg/mL)
Equipos
• Equipo de electroforesis de ADN: cámaras horizontales, peines, contenedor para gel, fuente de
poder
• Transiluminador UV
Metodología
NOTA: usar guantes en todo momento.
Preparación del gel de agarosa y montaje de la cámara horizontal de electroforesis
Antes de iniciar, confirmar que la cámara de corrida, el contenedor del gel y el peine estén
completamente limpios. Regularmente la bandeja donde se prepara el gel es la misma que se utiliza
para realizar la electroforesis.
1. Montar en una mesa nivelada el contenedor donde se preparará el gel.
2. Colocar el peine donde se desea que queden hechos los pozos para las muestras.
3. Depositar de manera uniforme la agarosa preparada y completamente disuelta en amortiguador
TBE 1x (no debe estar muy caliente, la temperatura debe ser soportable al toque de la mano)
(Figura 19A). NOTA: el gel no debe ser muy grueso.
4. Dejar reposar hasta que la agarosa solidifique completamente.
5. Una vez que el gel está sólido (aprox. 20-30 min), retirar el peine.
6. Colocar la charola en la cámara de electroforesis y agregar solución TBE 1x hasta cubrir el gel.a
Preparación y cargado de la muestra
1. A partir de la muestra de ADN de concentración conocida, tomar el volumen necesario
correspondiente a 1 µg y colocarlo en un fragmento de papel parafilm. En caso que la
concentración del ADN sea baja y se requiera más de 10 µL para tener 1 µg, tomar 10 µL como
máximo.
2. Agregar el amortiguador de carga en un volumen adecuado para una concentración final de 1x
(aprox. 2 µL para 10 µL) de muestra . NOTA: Si se requiere, completar el volumen a 10 µL (12 µL
como máximo) con solución amortiguadora TE.
3. Homogeneizar la mezcla anteior suavemente con una punta.
33
4. Tomar toda la muestra con la punta y depositarla cuidadosamente en uno de los pozos del gel de
agarosa. (a partir del no. 2). NOTA: evitar tomar aire con la punta de la micropipeta, ya que las
burbujas producirán que la muestra se salga del pozo. Asimismo, no tocar el fondo del pozo con
la punta para evitar perforar el gel (Figura 19B).
5. En el pozo no. 1, cargar 5 µL de marcador de peso molecular (1 kb) previamente preparado con
amortiguador de carga.
Electroforesis (corrida)
1. Una vez que se cargaron todas las muestras, colocar la tapa con los electrodos correctamente
tanto de la cámara como de la fuente de poder (Figura 19C).
2. Cerrar la cámara y aplicar la corriente aproximadamente de 75-85 V, hasta que el color azul
alcance 3/4 partes del gel. NOTA: si la cámara está conectada correctamente, se observará la
formación de burbujas en los electrodos.
3. Transcurrido este tiempo, apagar la fuente de poder y sacar el gel de la cámara con ayuda de una
espátula de plástico teniendo cuidado de no romperlo y colocarlo en un recipiente para teñirlo.
Tinción del gel y observación de bandas
1. Verter la solución de BrEt (10 µg/mL) procurando cubrir todo el gel durante aprox. 10 min. Puede
colocarse en un agitador oscilatorio con movimiento suave. NOTA: el BrEt es un agente
mutagénico, por lo que debe siempre manipularse con guantes y no se debe desechar ningún
residuo en la tarja del laboratorio. Todo el material que contenga bromuro de etidio se deben
depositar en un envase especial perfectamente etiquetado.
2. Retirar el BrEt, regresando la solución al frasco.
3. Tomar el gel con la ayuda de una espátula y colocarlo en el transiluminador.
4. Observar las bandas a una longitud de onda de 254 nm (Figura 19D). La exposición debe ser
mínima y siempre empleando protección para cara, ojos y manos.
Observaciones y resultados
Incluir en reporte de práctica.
Cuestionario
1. ¿Qué ventajas tiene la agarosa para la preparación de geles?
2. Explicar diferencias y similitudes entre el amortiguador TBE y el amortiguador TAE.
3. ¿Cuál es la composición del amortiguador de carga? Explicar la función de cada componente.
4. ¿Qué otros colorantes se utilizan actualmente para la visualización del ADN? Incluir ventajas y
desventajas en comparación con el BrEt.
5. Investigar los problemas más frecuentes que pueden surgir durante la separación del ADN en la
electroforesis y cómo solucionarlos. Incluir imágenes ilustrativas.
Discusión y conclusión
Incluir en reporte de práctica.
Bibliografía
Incluir en reporte de práctica.
34
!
A
B
C
D
Figura 19. Electroforesis horizontal de ADN en gel de agarosa. A) Preparación del gel de agarosa. B) Cargado
de muestras. C) Montaje y conexión de la cámara de electroforesis. D) Visualización del gel en transiluminador
(Modificado de: Yerena Aguilar y Ramírez Aguilera, 2018; https://www.lifeder.com/electroforesis/)
35
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FACULTAD DE MEDICINA
PRÁCTICA NO. 6
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD
Introducción
Como se sabe, las proteínas son los compuestos bioquímicos más abundantes en los seres vivos y
constituyen aproximadamente la mitad del peso seco de la mayor parte de los organismos. Existen
numerosos tipos de proteínas con funciones variadas por ejemplo: enzimáticas, transportadoras,
estructurales, de defensa, hormonales, receptoras, entre otras.
Para el estudio de una proteína o de una enzima es necesario conocer la concentración en una
muestra dada, por lo que la cuantificación es una técnica que se realiza de manera rutinaria en el
laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular.
Los métodos de determinación de proteínas totales están basados en sus características
diferenciales respecto del resto de biomoléculas presentes en las muestras biológicas.
Respecto a la medición de concentración, existen diferentes métodos para la cuantificación de
proteínas basados en diversas características como son:
a) cantidad de nitrógeno presente,
b) presencia de enlace peptídico,
c) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz UV,
d) la capacidad que tienen las proteínas de formar complejos con otras moléculas mediante una
determinada reacción, etc. (Roca y col., 2003).
Entre aquellos basados en la formación de complejos colorimétricos se encuentra el método de
Bradford. Este se fundamenta en el cambio de color del colorante azul brillante de Coomasie en
respuesta a diferentes concentraciones de proteínas, específicamente mediante la interacción con los
aminoácidos básicos y aromáticos. El cambio de color de marrón-rojo a azul intenso, relacionado con
la cantidad de proteína en la muestra, se mide espectrofotométricamente a una absorbancia de 595
nm. Este método es muy rápido, barato y sensible detectando de 1-15 µg.
La medición de especies químicas por métodos espectrofotométricos implica la elaboración de curvas
de calibración, es decir, la representación gráfica en un eje de coordenadas de la absorbancia (eje de
ordenadas) frente a la concentración (eje de abscisas). Estas curvas de calibración se basan en la
propiedad de las sustancias absorbentes de seguir la ley de Lambert-Beer que establece que cuando
se incide luz a una determinada longitud de onda la absorción depende de:
• El coeficiente de extinción molar de la especie química
• El espesor del recipiento que la contiene
• La concentración de la especie en solución.
Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina básica
cuando se realiza la purificación de una proteína concreta, si se quiere conocer la actividad específica
de una enzima, para el diagnóstico de cierta patología o daño tisular (proteínas séricas, enzimas
intracelulares, etc.), así como para otros muchos propósitos.
Objetivos
• Construir una curva de calibración de proteínas con albúmina de suero bovino (BSA).
• Determinar la concentración de una muestra problema por el método de Bradford mediante
espectrofotometría UV-Vis.
Material
• Celdas para espectrofotómetro
• Gradilla para microtubos
• Micropipetas de diferentes volúmenes y puntas
• Microtubos de 1.5 o 2 mL
36
Material biológico
• Muestra de proteína
Reactivos/Soluciones
• Agua destilada
• Muestra problema de proteína
• Reactivo de Bradford
• Solución estándar de albúmina de suero bovino (BSA) 2 mg/mL
Equipos
• Espectrofotómetro UV-Vis (consultar Anexo 4. Técnicas frecuentes utilizadas en el laboratorio de
Biología Molecular)
• Vórtex
Metodología
Encender el espectrofotómetro 25 min. antes de iniciar las lecturas. Realizar la cuantificación por
duplicado.
Curva estándar de BSA para cuantificación de proteína por método de Bradford
1. Preparar el patrón de BSA: disolver 20 mg de BSA en 10 mL de agua destilada, teniendo un
patrón de 2 mg/mL.
2. Tomar 4 microtubos, enumerarlos y agregar las siguientes soluciones para preparar un volumen
total de 500 µL de cada dilución:
Microtubo
no.
BSA
2 mg/mL
Agua destilada para un
vol. total de 500 µL
Concentración final
(mg/mL)
1
62 µL
438 µL
0.25
2
125 µL
375 µL
0.5
3
250 µL
250 µL
1.0
4
350 µL
150 µL
1.4
3. Tomar 6 microtubos, enumerarlos y preparar la curva patrón de BSA de acuerdo con la siguiente
tabla:
Microtubo
no.
Agua
destilada
Dilución de cada
concentración
Concentración de BSA
(mg/mL)
0 (Blanco)
1000 µL
———
———
1
50 µL
———
0
2
———
50 µL
0.25
3
———
50 µL
0.5
4
———
50 µL
1.0
5
———
50 µL
1.4
4. A los microtubos no.1 al no. 5 agregar 1.5 mL de reactivo de Bradford, mezclar bien en vórtex e
incubar por al menos 5 min.
5. Colocar las muestras en celdas para espectrofotómetro perfectamente limpias.
37
6. Seleccionar la longitud de onda a 595 nm y ajustar el espectrofotómetro a 0 con la muestra del
tubo “blanco”.
7. En la misma longitud de onda de 595 nm, realizar la lectura de las muestras de los tubos no. 1 a
no. 5. NOTA: el color es estable hasta 60 min.
8. Graficar absorbancia vs. concentración de proteína (mg/mL), incluyendo la absorbancia del tubo
no. 1.
9. Obtener la ecuación de la recta y el coeficiente de correlación R2.
Cuantificación de proteína en muestra problema por método de Bradford
1. Agregar a un microtubo 50 µL de la muestra problema de proteína proporcionada por el docente.
2. Agregar 1.5 mL de reactivo de Bradford, mezclar bien en vórtex e incubar por al menos 5 min.
3. Colocar la muestras en celda para espectrofotómetro perfectamente limpia.
4. Realizar la lectura de la absorbancia a 595 nm en el espectrofotómetro.
5. Calcular la concentración de proteína (mg/mL) usando la ecuación de la recta de la curva de BSA
anteriormente obtenida.
Observaciones y resultados
Incluir en reporte de práctica la curva estándar obtenida, incluyendo la ecuación de la recta y el R2
obtenido.
Cuestionario
1. Menciona algunas buenas prácticas para el uso del espectrofotómetro.
2. Además del método de Bradford, ¿qué otros métodos colorimétricos existen para la cuantificación
de proteínas? Explicar fundamento, ventajas y desventajas.
3. Comparar las proteínas principales de la leche y del suero sanguíneo.
4. Si la absorción de una muestra problema dada no se encuentra dentro del rango de la curva
estándar ¿cómo realizarías la cuantificación?
5. Investigar el protocolo para la cuantificación de proteínas solubles en microplacas por el método
de ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).
Discusión y conclusión
Incluir en reporte de práctica.
Bibliografía
Incluir en reporte de práctica.
38
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FACULTAD DE MEDICINA
PRÁCTICA NO. 7
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA CON DODECILSULFATO SÓDICO
(SDS-PAGE)
Introducción
La electroforesis es una de las técnicas que más se utilizan en Bioquímica y Biología molecular que
se realiza regularmente en geles de poliacrilamida o de agarosa como soporte de separación. Los
poros del gel actúan como un “colador”, permitiendo que las moléculas más pequeñas se muevan
más rápido que las grandes. Las condiciones utilizadas durante la electroforesis se pueden ajustar
para separar moléculas en el rango de tamaño que se desee.
Específicamente, la técnica de SDS-PAGE es una variación ampliamente usada para la separación
de proteínas. Los geles de acrilamida permiten un tamaño de poro muy pequeño, logrando una
separación adecuada de moléculas desde pequeñas a grandes (aprox. 5 a 250 kDa). El tamaño de
poro de los geles de acrilamida viene determinado por la concentración de poliacrilamida en el gel y el
número de entrecruzamientos entre moléculas. Por otro lado, el dodecil sulfato de sodio (SDS) es un
detergente con carga negativa que se une a las regiones hidrófobas de las moléculas de proteína, lo
cual hace que las proteínas se desnaturalicen. Debido a que la mayoría de moléculas se une al SDS
de manera casi proporcional a sus pesos moleculares, durante la electroforesis las proteínas tratadas
con SDS migran hacia el cátodo (electrodo con carga positiva) solo en relación con su peso molecular
(Figura 20). Además del SDS, se utilizan agentes reductores del grupo tiol como el β-mercaptoetanol
que rompe los puentes disulfuro inter e intramoleculares para alcanzar una desnaturalización proteica
completa.
El sistema discontinuo utiliza un gel dividido en dos secciones: un gel concentrador o stacking: gel de
poro grande en la parte superior; y el gel separador o resolving: de poro pequeño en la parte inferior.
Este sistema es el más utilizado porque permite la formación de bandas altamente concentradas de
muestra en el gel superior y mayor resolución de los componentes de la muestra en el gel inferior.
Una vez lograda la separación, las bandas en el gel pueden visualizarse mediante varias técnicas:
tinción con colorantes, detección con fluorescencia, radiactividad, etc. Debido a su elevado poder de
resolución, la electroforesis en gel aunado con la tinción de los geles con un colorante, como el azul
brillante de Coomassie, suele utilizarse para valorar la pureza de las muestras de proteínas.
Por otro lado, la separación de proteínas también puede realizarse en condiciones no
desnaturalizantes (PAGE nativa) donde las proteínas pueden recuperarse después de la separación.
Amortiguador de
corrida
Muestra en pozo
Corrida de la muestra
!
Amortiguador de
corrida
Figura 20. Sistema SDS-PAGE
(Modificado de: https://www.linkedin.com/pulse/simulador-de-electroforesis-prote%C3%ADnas-en-gel-con-sds-l
%C3%B3pez-dom%C3%ADnguez/?originalSubdomain=es)
39
Objetivos
• Comprender los fundamentos de la técnica de SDS-PAGE.
• Realizar un ensayo de SDS-PAGE empleando distintas muestras y concentraciones de
proteínas.
Material
• Gradilla para microtubos
• Micropipetas de diferentes volúmenes y puntas
• Microtubos de 1.5 o 2 mL
• Tubos tipo Falcon de 50 mL o frascos de vidrio pequeños
Reactivos/Soluciones
• Agua destilada
• Amortiguador de carga (Laemmli 2x)
• Amortiguador de corrida 1x pH 8.3 (a partir de Stock 5x: Tris base 0.12 M/Glicina 1 M/SDS
0.5%)
• Colorante azul de Coomasie (manejar con precaución, contiene ácido acético glacial) o
colorante comercial para tinción de proteínas
• Marcador de peso molecular de proteínas
• Mezcla de poliacrilamida 30%: acrilamida 29.2% y bis-acrilamida 0.8%
• N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina (TEMED)
• Persulfato de amonio (APS) 10%
• SDS 10%
• Solución desteñidora (manejar con precaución, contiene ácido acético glacial)
• Tris-HCl 1.5 M pH 8.8
• Tris-HCl 0.5 M pH 6.8
Equipo
• Agitador oscilatorio
• Baño de agua
• Equipo de electroforesis de proteínas: caster, vidrios, peines, separadores, cámaras verticales,
fuente de poder (consultar Anexo 4. Técnicas frecuentes utilizadas en el laboratorio de Biología
Molecular)
Metodología
NOTA: usar guantes en todo momento.
Montaje del caster para preparación de gel
Dependiendo la marca del equipo de electroforesis de proteínas, será la manera en que se realice el
montaje del caster. De manera general se realiza mediante los siguientes pasos:
1. Ensamblar el vidrio y la alúmina en el caster colocando los separadores de manera adecuada.
2. Apretar el dispositivo anterior, sin demasiada fuerza para evitar romper el vidrio.
3. Verificar que no haya fugas añadiendo un poco de agua y esperar algunos minutos.
4. Una vez que se corrobora que el dispositivo no tiene fugas, colocar el peine y realizar con un
plumón una marca en cada pozo (Figura 21A).
Preparación de gel separador
1. Elegir el porcentaje del gel de acuerdo al tamaño de las proteínas que se quieren identificar. De
manera general, si se desconoce el tamaño aproximado se utiliza el gel al 10%.
2. Mezclar en un tubo tipo Falcon de 50 mL o en un frasco pequeño de vidrio las siguientes
soluciones para preparar el gel separador. NOTA: al final agregar APS y TEMED.
40
Para preparar 10 mL al:
6%
8%
10%
12%
15%
5.3 mL
4.6 mL
4 mL
3.3 mL
2.3 mL
2 mL
2.7 mL
3.3 mL
4 mL
5 mL
Tris-HCl 1.5 M pH 8.8
2.5 mL
2.5 mL
2.5 mL
2.5 mL
2.5 mL
SDS 10%
100 µL
100 µL
100 µL
100 µL
100 µL
APS 10%
100 µL
100 µL
100 µL
100 µL
100 µL
8 µL
6 µL
4 µL
4 µL
4 µL
Agua destilada
Poliacrilamida 30%
TEMED
3. Mezclar la solución mediante un movimiento suave o con la punta de la micropipeta.
4. Verter la solución lentamente en el espacio entre los vidrios montados anteriormente, hasta aprox.
1 cm por debajo de los pozos marcados (Figura 21B).
5. Agregar etanol sobre el gel separador para que quede lo más lineal posible.
6. Esperar aprox. 20 min. para que el gel separador solidifique.
7. Una vez que el gel solidificó, retirar el etanol mediante inversión del caster.
Preparación de gel concentrador
1. Mezclar en un tubo tipo Falcon de 50 mL o en un frasco pequeño de vidrio las siguientes
soluciones para preparar el gel concentrador. NOTA: al final agregar APS y TEMED.
Gel concentrador
1 mL
2 mL
3 mL
4 mL
5 mL
Agua destilada
680 µL
1.4 mL
2.1 mL
2.7 mL
3.4 mL
Poliacrilamida 30%
170 µL
333 µL
500 µL
670 µL
830 µL
Tris-HCl 0.5 M pH 6.8
130 µL
250 µL
380 µL
500 µL
630 µL
SDS 10%
10 µL
20 µL
30 µL
40 µL
50 µL
APS 10%
10 µL
20 µL
30 µL
40 µL
50 µL
TEMED
1 µL
2 µL
3 µL
4 µL
5 µL
2. Mezclar la solución mediante un movimiento suave o con la punta de la micropipeta.
3. Verter la solución lentamente sobre el gel separador anteriormente colocado.
4. Esperar aprox. 20 min. para que el gel concentrador solidifique.
Montaje de gel en cámara de electroforesis
1. Retirar del caster el gel completo ya solidificado y colocar en la cámara de electroforesis. NOTA:
sin retirar todavía el peine.
2. Agregar amortiguador de corrida 1x en cada compartimento (superior e inferior) (Figura 21C).
41
Preparación y cargado de muestras a analizar
1. Tomar 8 microtubos, enumerarlos y preparar las muestras de acuerdo a la siguiente tabla:
Muestra
BSA (albúmina
sérica bovina)
[1 µg/ µL]
Disolución de
leche en polvo
[3.8 µg/ µL]
2.
3.
4.
5.
Microtubo
no.
Muestra
(µL)
Amortiguador
de Laemmli 2x
(µL)
Agua
destilada
(µL)
Cantidad
de proteína
(µg)
Volumen
total
(µL)
1
20
20
-
20
40
2
15
15
-
15
30
3
10
15
5
10
30
4
5
15
10
5
30
5
16.5
16.5
-
62.7
33
6
12
13.0
-
45.6
25
7
7.5
12.5
5
28.5
25
8
4.5
12.5
8
17.1
25
Hervir los microtubos durante 5 min. en el baño de agua.
Una vez listas las muestras, retirar cuidadosamente el peine del gel.
En el pozo no. 1 cargar 5 µL de marcador de peso molecular.
En los siguientes pozos cargar las muestras previamente preparadas (microtubo no.1 al no. 8).
NOTA: evitar la formación de burbujas en la punta de micropipeta y al cargar la muestra (Figura
21D).
Electroforesis (corrida)
1. Cerrar la cámara de electroforesis, conectarla a la fuente de poder y aplicar un voltaje constante
de 120 V (40 mA). Si la corrida inicia se observará la formación de burbujas en los electrodos.
2. Apagar la fuente de poder cuando el colorante se encuentre en el borde inferior de los vidrios,
aprox. tarda 90 min. en migrar a ese nivel (Figura 21E y 21F).
Tinción del gel y observación de bandas
1. Una vez terminada la corrida, sacar el gel de la cámara y colocarlo en un recipiente adecuado.
NOTA: el gel debe quedar completamente extendido, no doblado de ninguna sección.
2. Enjuagar con agua destilada por 10 min. en agitador oscilatorio con movimiento suave.
3. Retirar el agua y agregar el colorante durante 1 h en agitación.
4. Transcurrido este tiempo retirar el colorante. NOTA: los colorantes se pueden guardar en un
frasco para su reuso.
5. En el caso del colorante azul de Coomasie preparado, agregar solución desteñidora por 1 h en
agitador oscilatorio con movimiento suave. Si se utilizó un colorante comercial, seguir las
indicaciones del fabricante.
6. Transcurrido este tiempo, quitar las soluciones anteriores y conservar el gel en agua destilada.
7. Observar el patrón de bandas y realizar el análisis correspondiente.
Observaciones y resultados
Incluir en reporte de práctica.
42
Cuestionario
1. ¿Por qué se emplean distintas concentraciones (porcentajes) del gel de poliacrilamida según el
peso molecular de las proteínas a separar?
2. ¿En qué casos es útil realizar un gel NO desnaturalizante?
3. ¿Cuál es la composición del amortiguador de carga (Laemmli)? Explicar la función de cada
componente.
4. Además del azul de Coomasie, ¿qué otros colorantes pueden usarse para la tinción del gel?
Incluir ventajas y desventajas.
5. ¿De qué manera podrías identificar un tipo de proteína en específico después de haber separado
el conjunto de proteínas de una muestra mediante la electroforesis?
Discusión y conclusión
Incluir en reporte de práctica.
Bibliografía
Incluir en reporte de práctica.
43
el!siguiente!paso.!
3. 3.Agregar!la!mezcla!lentamente!en!el!espacio!entre!los!vidrios,!hasta!la!marca!previamente!
Agregar!la!mezcla!lentamente!en!el!espacio!entre!los!vidrios,!hasta!la!marca!previamente!
8. Agregar!la!mezcla!lentamente!en!el!espacio!entre!los!vidrios,!hasta!llegar!al!borde.!
realizada!(Fig.!3).!
realizada!(Fig.!3).!
9. Colocar!el!peine!cuidando!de!no!atrapar!ninguna!burbuja,!porque!provocan!distorsión!en!
olución!Laemmli!2X!y!hervir!por!4!min!a!95°!C!(en!cada!po
a!y!el!volumen!máximo!que!le!cabe!a!cada!uno!es!de!!50!µL
A
B
la!superficie!del!gel.!
10. Esperar!a!que!el!gel!solidifique!(aproximadamente!15!min).!
13. 13.
Remover!cuidadosamente!el!peine!y!cargar!lentamente!el!marcador!de!peso!molecular!
Remover!cuidadosamente!el!peine!y!cargar!lentamente!el!marcador!de!peso!molecular!
11. Colocar!el!gel!en!la!cámara!de!electroforesis!y!agregar!amortiguador!de!corrida!a!cada!
en!el!pozo!#1!y!el!resto!de!las!muestras!en!los!pozos!adyacentes!(Fig.!5).!
en!el!pozo!#1!y!el!resto!de!las!muestras!en!los!pozos!adyacentes!(Fig.!5).!
compartimiento!(Fig.!4).!
! El!
de! peso!
molecular!
debe!
mantenerse!
en! en!
hielo.!
Su! Su!
preparación!
para!
ser!ser!
!marcador!
El! marcador!
de! peso!
molecular!
debe!
mantenerse!
hielo.!
preparación!
para!
12. Preparar!las!muestras!con!solución!Laemmli!2X!y!hervir!por!4!min!a!95°!C!(en!cada!pozo!
cargado!
en! el!
puede!
variar!
dependiendo!
de! de!
la! marca,!
verifica!
las!las!
instrucciones!
del!del!
cargado!
en!gel!
el! gel!
puede!
variar!
dependiendo!
la! marca,!
verifica!
instrucciones!
deberás!cargar!10!µg!de!proteína!y!el!volumen!máximo!que!le!cabe!a!cada!uno!es!de!!50!µL)!
proveedor.!!
proveedor.!!
! !
C
D
!Evita!burbujear!con!la!micropipeta!mientras!se!coloca!la!muestra!para!que!ésta!no!se!salga!
4. 4.!Evita!burbujear!con!la!micropipeta!mientras!se!coloca!la!muestra!para!que!ésta!no!se!salga!
Agregar!
agua!
destilada!
con!con!
una!una!
micropipeta!
sobre!
el! gel!
separador,!
para!
evitar!
que!que!
la! la!
Agregar!
agua!
destilada!
micropipeta!
sobre!
el! gel!
separador,!
para!
evitar!
del!pozo.!
del!pozo.!
presencia!de!oxígeno!inhiba!la!polimerización!al!bloquear!los!radicales!libres.!
presencia!de!oxígeno!inhiba!la!polimerización!al!bloquear!los!radicales!libres.!
14. Cargar!30!µL!de!solución!Laemmli!2X!en!los!pozos!que!no!tendrán!muestras!proteicas,!o!
Cargar!30!µL!de!solución!Laemmli!2X!en!los!pozos!que!no!tendrán!muestras!proteicas,!o!
5. 5.14.
Esperar!a!que!el!gel!solidifique!(aproximadamente!30!min).!!
Esperar!a!que!el!gel!solidifique!(aproximadamente!30!min).!!
de!lo!contrario,!la!muestra!adyacente!se!extenderá!lateralmente.!
de!lo!contrario,!la!muestra!adyacente!se!extenderá!lateralmente.!
39
39
15. 15.
Cerrar!la!cámara!de!electroforesis!y!aplicar!una!corriente!de!120!V!(si!la!cámara!se!coloca!
Cerrar!la!cámara!de!electroforesis!y!aplicar!una!corriente!de!120!V!(si!la!cámara!se!coloca!
adecuadamente,!se!observará!la!formación!de!burbujas!en!los!electrodos,!Fig.!6,!7).!
adecuadamente,!se!observará!la!formación!de!burbujas!en!los!electrodos,!Fig.!6,!7).!
E.
!
F.
40
!
16.
! !
Figura 21. Preparación y montaje de SDS-PAGE. A) Ensamblaje en caster. B) Preparación del gel.
C) Montaje de gel en cámara de electroforesis. D) Cargado de muestras.
E) Conexión de corriente eléctrica. F) Corrida de muestras
16.
Apagar!la!fuente!de!poder!cuando!el!colorante!se!encuentre!en!el!borde!inferior!de!los!
Apagar!la!fuente!de!poder!cuando!el!colorante!se!encuentre!en!el!borde!inferior!de!los!
(Tomado de: González de la Rosa y col., 2014).
vidrios!(tardará!aproximadamente!60!min!en!migrar!hasta!ahí)!
vidrios!(tardará!aproximadamente!60!min!en!migrar!hasta!ahí)!
Sacar!
el! gel!
de!cámara!
la! cámara!
y! teñirlo!
la! solución!
Coomassie!
durante!
min!
17. 17.
Sacar!
el! gel!
de! la!
y! teñirlo!
con!con!
la! solución!
de! de!
Coomassie!
durante!
30!30!
min!
en!en!
agitación!(usa!un!volumen!suficiente!para!cubrir!el!gel)!
agitación!(usa!un!volumen!suficiente!para!cubrir!el!gel)!
44
Retirar!la!solución!de!Coomassie!y!cubrir!el!gel!con!la!solución!desteñidora.!Después!de!
18. 18.
Retirar!la!solución!de!Coomassie!y!cubrir!el!gel!con!la!solución!desteñidora.!Después!de!
ANEXOS
45
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC CAMPUS QUERÉTARO
FACULTAD DE MEDICINA
ANEXO 1.
IDENTIFICACIÓN DE MATERIAL Y EQUIPO USADO EN EL LABORATORIO
DE BIOLOGÍA MOLECULAR
Material
Agitador de vidrio
Descripción
Uso común
Representación
Cilindro fino macizo Agitar y homogeneizar
de vidrio.
soluciones.
!
Dispositivo cilíndricos
Barra de agitación con imán. Existen de Agitar y homogeneizar
magnética
diferentes tamaños y soluciones, se requiere una
placa magnética.
formas.
!
Cámara de
Neubauer
Realizar el recuento de
esporas y células en un
D i s p o s i t i v o d e medio líquido, que puede
precisión hecho de ser; un cultivo celular,
vidrio óptico especial. s a n g r e , o r i n a , l í q u i d o
cefalorraquídeo, líquido !
sinovial, etc.
Contener muestras líquidas
Celdas para
Recipiente de vidrio, para realizar la lectura
espectrofotómetro plástico o cuarzo.
espectrofotométrica de su
absorbancia.
46
Material
Descripción
Uso común
Cubreobjetos
Fina hoja de material
transparente de
forma cuadrada
(normalmente 20 mm
x
20
mm)
o
rectangular (de 20
mm x 40 mm).
Se coloca sobre un objeto
que va a ser observado
bajo microscopio, el cual se
suele encontrar sobre un
portaobjetos.
Embudo
Representación
!
Material de vidrio o Verter líquidos, filtración.
plástico.
!
Gradilla
Matraz
Erlenmeyer
Rejillas que pueden
ser de diferentes
m a t e r i a l e s , t a l e s Sostener tubos de ensayo.
como madera,
plástico o metal.
Material de vidrio
graduado de varios
tamaños
y
capacidades, angosto
en la parte superior y
ensanchado en la
base plana.
!
Preparar soluciones,
calentar soluciones,
titulaciones, análisis
cualitativos, filtraciones.
!
Matraz
volumétrico o
aforado
Material de vidrio de
v a r i o s ta m a ñ o s y
capacidades, angosto
en la parte superior y
ensanchado en la
base plana. No es
graduado, solo tiene
una marca para
completar el volumen
total.
Medir un volumen exacto de
líquido con base a la
capacidad del propio
matraz, que aparece
indicada.
!
47
Material
Micropipeta
Descripción
Uso común
Representación
Instrumento calibrado
p a r a r e c o l e c t a r Medir alícuotas de µL a mL
muestras
e n con alta precisión.
volúmenes muy
pequeños.
!
Microtubo
Mortero y pistilo
Contenedor pequeño
cilíndrico de plástico,
con un fondo cónico y
típicamente una tapa
unida al cuerpo del
tubo para evitar su
desprendimiento.
Existen en diferentes
capacidades y
volúmenes (0.6 mL,
1.5 mL, 2.0 mL).
Para la centrifugación, o
como simples viales
contenedores de volúmenes
pequeños.
!
Vasija de porcelana M a c h a c a r o t r i t u r a r
con utensilio incluido s u s t a n c i a s s ó l i d a s ,
del mismo material.
homogeneizar mezclas.
!
Pipeta graduada
Tubo graduado,
transparente de vidrio
con punta cónica. Medir alícuotas de líquido
Existen de varios con precisión.
volúmenes (1, 2, 5,
10 mL, etc.).
!
Pipeta de
transferencia
Tu b o d e v i d r i o o
plástico con borde Transferencia de pequeñas
cónico, puede tener o cantidades de líquidos.
no bulbo.
!
48
Material
Portaobjetos
Descripción
Uso común
Pieza delgada y
plana de vidrio,
generalmente de 75 x Ob s e r v a r o b j e t o s p a r a
26 mm y 1 mm de examinarlos al microscopio.
grosor.
Representación
!
Material cilíndrico
graduado, tiene una
base, regularmente
de vidrio pero
también existen de
plástico, de varios Medir alícuotas de líquido
Probeta graduada t a m a ñ o s
y con mediana precisión.
capacidades. Su
extremo superior
tiene una proyección
que facilita el vertido
!
de su contenido.
Propipeta
Utensilio vertical de Succionar líquidos para
plástico o goma, con transferir en las pipetas
un émbolo.
graduadas.
!
Puntas para
micropipeta
Puntas fabricadas
con polipropileno, Tomar volúmenes con la
a u t o c l a v a b l e s . micropipeta (desde µL
Existen de diferentes hasta mL).
volúmenes.
!
Termómetro
Instrumento de vidrio
alargado, consta de
un bulbo de vidrio
que incluye un
pequeño tubo capilar;
éste contiene
m e r c u r i o ( u o t r o Medir la temperatura de los
de
agua,
material con alto b a ñ o s
incubadoras,
etc.
coeficiente de
dilatación), que se
dilata de acuerdo a la
temperatura y
!
permite medirla sobre
una escala graduada.
49
Material
Descripción
Uso común
Tubo de ensayo
Tubos de vidrio
cerrados por uno de
sus extremos. Tienen
d i f e r e n t e s
capacidades, el
tamaño se expresa
en mm para diámetro
y altura, por ejemplo:
13 x 100 mm.
Pueden existir con o
sin borde, con o sin
tapón. Regularmente
de vidrio refractario
para resistir altas
temperaturas pero
también existen de
plástico.
Se utiliza generalmente
para ensayos cualitativos
con cantidades pequeñas
de reactivos.
Tubo tipo Falcon
Representación
!
Tu b o d e p l á s t i c o
graduado con tapón Centrifugar, preparar
de rosca. Pueden reservar soluciones.
existir de varios
volúmenes.
y
!
Vaso de
precipitado
Vasos regularmente
de vidrio de varios
tamaños
y
capacidades,
regularmente son
graduados. Los más
usados son los que
tienen pico para
facilitar el vertido de
líquidos.
Preparar soluciones,
calentar soluciones,
reservar, pesar reactivos,
análisis cualitativos.
!
50
Equipo
Agitador
universal
(oscilador)
Balanza
analítica
Descripción
Uso común
Mezclar o agitar sustancias
tanto en tubo, matraz ou
otro recipiente apropiado.
Equipo de laboratorio P u e d e n
agitarse
electrónico que tiene una s u s t a n c i a s d e g r a n
placa oscilante.
volumen, o en caso de que
se requiera agitación
simultánea.
Representación
!
Instrumento electrónico
que contiene un platillo Pesar reactivos sólidos.
de medición.
!
Parrilla de
calentamiento
con agitación
Placa de calentamiento
electrónica fabricada en
aleación de aluminio que
transfiere la temperatura
en forma uniforme y en
periodos cortos.
Calentar sustancias muy
inflamables y peligrosas, y
para reacciones que
necesitan temperatura
controlada.
!
Equipo electrónico que
utiliza luz ultravioleta y Visualización de muestras
Transiluminador una base que deja pasar m a r c a d a s
con
fluorescencia
.
la radiación UV.
!
Vórtex
Dispositivo electrónico
formador de un flujo A g i t a r
pequeños
turbulento en rotación volúmenes de líquido.
espiral con trayectorias
de corriente cerradas.
!
51
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC CAMPUS QUERÉTARO
FACULTAD DE MEDICINA
ANEXO 2.
MANEJO DE RESIDUOS Y MEDIDAS DE SEGURIDAD
El laboratorio de Bioquímica es un lugar de aprendizaje donde se complementa la
información adquirida en el aula. Durante el desarrollo de las prácticas de laboratorio se
pueden llegar a utilizar sustancias o muestras que, podrían representar riesgos potenciales a
la salud, debido a que pueden ser: corrosivas, reactivas, explosivas, tóxicas, inflamables o
biológico infecciosas.
El personal que se desenvuelve en el laboratorio debe ser responsable de proteger su salud,
por lo que es obligación de uno mismo cumplir con todas las normas de seguridad. Los
laboratorios se deben considerar lugares de trabajo seguros, únicamente cuando se conocen
y se siguen las normas de seguridad en materia de clasificación, manejo y disposición final
de las sustancias anteriormente mencionadas, lo cual nos permite identificar los peligros y
disminuir los riesgos.
Manejo de materiales peligrosos y residuos peligrosos biológico infecciosos (RPBI)
1. Manejar cualquier tipo de líquido corporal, sangre, plasma, suero, orina, tejido, cadáver o
cultivo como potencialmente infeccioso; con el fin de minimizar la difusión de
enfermedades transmisibles.
2. Deben usarse guantes para efectuar punciones vasculares y para manipular sangre,
líquidos corporales, cultivos de microorganismos, sustancias o superficies contaminadas.
Después del uso de cualquier material biológico, se procede al lavado de manos con los
guantes puestos, que se depositarán en el contenedor correspondiente. Después de
quitarse los guantes debemos lavarnos nuevamente las manos.
3. Se debe conocer los símbolos y los códigos de color sobre las precauciones y los
peligros en el laboratorio.
4. Asegurarse de conocer la localización de extinguidores, del botiquín y de las salidas de
emergencia.
5. Los elementos punzocortantes como cubreobjetos, portaobjetos y agujas deben
desecharse en recipientes especiales destinados para ello, los cuales deben estar
etiquetados con la leyenda que indique "Peligro, residuos punzocortantes biológicoinfecciosos" y marcados con el símbolo universal de riesgo biológico.
6. Limpiar las superficies potencialmente contaminadas con hipoclorito de sodio 1%, con
etanol 70% o con agua oxigenada.
7. Todas las sustancias químicas son potencialmente tóxicas y peligrosas, por lo que se
debe:
a) Conocer en términos generales las propiedades y el uso correcto de las mismas.
b) Nunca probar, así como tampoco inhalar, directamente las sustancias. Para
determinar el olor se acerca la tapa del frasco cuidadosamente a la nariz, o bien, si se
trata de sustancias volátiles o vapores acercar éstos con la mano a la nariz.
c) Evitar el contacto de sustancias con la piel, especialmente la cara. Nunca dirigir un
tubo de ensayo o la boca de un matraz con líquidos en ebullición o material de
reacción hacia un compañero, o a sí mismo, ya que puede proyectarse el contenido.
52
Respecto a las sustancias que no tienen un efecto pronunciado sobre la piel, pero
cuya ingestión es peligrosa, evitar la contaminación de alimentos o manos que
después se llevarán a la boca o con las que se tocarán alimentos (nunca ingerir
alimentos en el laboratorio).
d) Nunca se debe pipetear con la boca, especialmente los ácidos fuertes, productos
cáusticos, oxidantes fuertes y compuestos venenosos.
8. Seguir las indicaciones del profesor y del personal a cargo del área de prácticas.
Cualquier accidente en el laboratorio debe comunicarse inmediatamente al profesor y/o
responsable de laboratorios.
9. Manejar adecuadamente los residuos peligrosos derivados de las prácticas, identificando
su nivel de riesgo y el medio adecuado para su desecho. Queda prohibido desechar
sustancias a la tarja o por cualquier otro medio, sin autorización del responsable del
grupo. Las hojas de seguridad correspondientes incluyen qué hacer en caso de
accidentes y la forma correcta de desechar los residuos.
10. En cuanto a los solventes inflamables (alcohol, éter, cloroformo, acetona, tolueno, xilol,
etcétera) se recomiendan las siguientes precauciones:
a) No fumar en el interior del laboratorio.
b) No utilizar la llama del mechero sin cerciorarse de que no hay cerca líquidos
inflamables. No dejar el mechero encendido cuando esté fuera de uso.
c) Si se vierten accidentalmente sobre las mesas, secar de inmediato con un trapo
húmedo y enjuagar éste en el chorro de agua, exprimiéndolo.
d) Nunca calentar un líquido orgánico sobre una flama.
e) En caso de incendio debe hacerse lo siguiente: para un incendio pequeño en un
vaso, un matraz, etcétera, éste se cubrirá con un recipiente mayor o se ahogará el
fuego con un trapo mojado o se combatirá con un extinguidor. Cuando el fuego sea de
un solvente derramado sobre la mesa o el piso, se utilizará un extinguidor de dióxido
de carbono. Si el fuego no puede vencerse de inmediato, se evacuará el laboratorio y
se avisará al departamento contra incendios de la institución.
11. Los accidentes más frecuentes en el laboratorio son las lesiones debidas a cortes,
laceraciones, etcétera, por cristalería rota en su mayoría. En caso de heridas pequeñas
dejar que sangre unos segundos; tener cuidado de no dejar partículas de vidrio en la
herida y aplicar un desinfectante. Las heridas de mayor importancia deben ser atendidas
por un médico. Mientras tanto, se debe evitar el sangrado aplicando presión en un punto
más arriba la herida o antes de ella, sin mantener la presión por más de 5 min.
12. Para evitar los choques eléctricos en el laboratorio nunca tocar un aparato eléctrico con
las manos húmedas o si se está parado sobre un piso húmedo. Siempre apagar y
desconectar los aparatos luego de cualquier manipulación.
13. Para mayor información consultar: Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002,
Protección ambiental - Salud ambiental - Residuos peligrosos biológico-infecciosos Clasificación y especificaciones de manejo (Anexo 3).
53
cen de la naturaleza del peligro. Nunca tocar un aparato
rico con las manos húmedas o cuando se esté parado
e un piso húmedo. Siempre apagar y desconectar los
atos antes de cualquier manipulación.
Símbolos de seguridad
ogramas de seguridad
E = EXPLOSIVO
s etiquetas de
químicos
de uso en elquímicos
laboratorio
Enproductos
las etiquetas
de productos
de uso en el laboratorio además
de la identificación
del contenido,
calidad y límite
de lo que contiene, se puede encontrar pictogramas
más de la identificación
del contenido,
calidaddey pureza
límite de
Es toda sustancia sólida o líquida o mezcla
(símbolos
za de lo que
contiene, internacionalmente
se puede encontrar aceptados
pictogramasy reconocidos) que indican los riesgos principales.
sustancias que pueden desprender gases a una temperatur
Los pictogramas
de seguridad
son:
bolos internacionalmente
aceptados
y reconocidos)
que
presión y velocidad tales que pueden detonar, produ
an los riesgos principales.
Los pictogramas Significado
de seguridad
Pictograma
Definición
violentas deflagraciones, o explotar al exponerse al ca
cuando están parcialmente confinadas. Ejemplo: azida
plomo, fluoruro de carbono.
Todo aquello que pueda contener bacterias, virus u otros
Medidas deconprevención:
alejadas de otr
microorganismos
capacidad dealmacenarlas
infección o cuando
productos,
todo choque,
fricción y mantener
alejadas
contiene
toxinas evitar
producidas
por microorganismos
que
Todo aquello que pueda contener bacterias, virus u
causen
efectos
nocivos
a
los
seres
vivos.
Ejemplo:
Riesgo
biológico
fuentes
de
calor,
chispas
o
fuego.
microorganismos con capacidad de infección o cuando
jeringas, sangre. Medidas de prevención: evitar el
ene toxinas producidas por microorganismos que causen
contacto con los ojos, la piel y las vías respiratorias.
os nocivos a los seres vivos. Ejemplo: jeringas, sangre.
Utilizar elementos de protección personal.
das de prevención: evitar el contacto con los ojos, la piel y
as respiratorias. RIESGO
Utilizar elementos
de protección personal.
BIOLÓGICO
Sustancias de menor toxicidad, pero pueden causa
Es toda sustancia sólida o líquida o mezcla de
daños
a
la salud.
También
se incluyen
aquellas
mezclas
sustancias que
pueden
desprender
gases a
una
temperatura,
y velocidad
tales que que
pueden
preparadospresión
que tienen
alguna sustancia
puede ser tóxic
detonar,
producir
violentas deflagraciones,
o explotar alen la mezcla
pero que
se encuentra
a una baja concentración
Explosivo
O = OXIDANTE
E = EXPLOSIVO
Sustancias capaces
de aportar oxígeno cuando
onan con otra sustancia, por lo que cuando entran en
Es toda sustancia sólida o líquida o mezcla de
cto con combustibles o inflamables avivan la reacción
ncias que pueden desprender gases a una temperatura,
ndo desarrollar reacciones violentas. Ejemplo: nitrito de
ón y velocidad tales que pueden detonar, producir
hiposulfito de sodio.
ntas deflagraciones, o explotar al exponerse
al calor
Oxidante
as de prevención: mantener alejadas de las sustancias
do están parcialmente confinadas. Ejemplo: azida de
ustibles o inflamables, ya que pueden favorecer los
o, fluoruro de carbono.
dios y dificultar su extinción.
das de prevención: almacenarlas alejadas de otros
uctos, evitar todoOchoque,
fricción y mantener alejadas de
= OXIDANTE
es de calor, chispas o fuego.
Sustancias capaces de aportar oxígeno cuando
nan con otra sustancia, por lo que cuando entran en
o con combustibles o inflamables avivan la reacción
Nocivode
do desarrollar reacciones violentas. Ejemplo: nitrito
hiposulfito de sodio.
s de prevención: mantener alejadas de las sustancias
stibles o inflamables, ya que pueden favorecer los
34
os y dificultar su extinción.
Xn = NOCIVO
exponerse al calor cuando están parcialmente
confinadas. Ejemplo: azida de plomo, fluoruro de
carbono.
Medidas de prevención: almacenarlas alejadas de otros
productos, evitar todo choque, fricción y mantener
alejadas de fuentes de calor, chispas o fuego.
Sustancias de menor toxicidad, pero pueden causar
Sustancias
de aportar
oxígeno aquellas
cuando mezclas o
daños a lacapaces
salud. También
se incluyen
reaccionan
con
otra
sustancia,
por
lo
que
cuando
preparados que tienen alguna
sustancia queentran
puede ser tóxica
Xi =o IRRITANTE
en contacto con combustibles
inflamables avivan la
pero
que
se
encuentra
a
una
baja
concentración
en la mezcla.
reacción pudiendo desarrollar reacciones violentas.
Ejemplo: nitrito
de sodio,que
hiposulfito
sodio. Medidas
Sustancias
puedende causar
irritación a la pie
de mucosas,
prevención:o mantener
alejadas
de
las
sustancias
los ojos, por contacto inmediato, prolongado
combustibles o inflamables, ya que pueden favorecer los
repetido,
pudiendo
también provocar inflamación. Ejemplo
incendios y dificultar su extinción.
cloroformo, SDS, hipoclorito de sodio, aminoantipirina.
Medidas de prevención: evitar el contacto con los ojos, la piel
las vías respiratorias. Utilizar elementos de protección persona
Sustancias de menor toxicidad, pero pueden causar
daños a la salud. También se incluyen aquellas mezclas
o preparados que tienen alguna sustancia que puede ser
Xi = IRRITANTE
tóxica pero que se encuentra a una baja concentración
en la mezcla.
Sustancias que pueden causar irritación a la piel,
mucosas, o los ojos, por contacto inmediato, prolongado o
repetido, pudiendo también provocar inflamación. Ejemplo:
cloroformo, SDS, hipoclorito de sodio, aminoantipirina.
Medidas de prevención: evitar el contacto con los ojos, la piel y
F+ = EXTREMADAMENTE INFLAMABLE
las vías respiratorias. Utilizar elementos de protección personal.
54
3
as de prevención: mantener alejadas de las sustancias
ustibles o inflamables, ya que pueden favorecer los
dios y dificultar su extinción.
Xi = IRRITANTE
Sustancias que pueden causar irritación a la piel,
osas, o los ojos, por contacto inmediato, prolongado o
ido, pudiendo también provocar inflamación.Irritante
Ejemplo:
formo, SDS, hipoclorito de sodio, aminoantipirina.
das de prevención: evitar el contacto con los ojos, la piel y
as respiratorias. Utilizar elementos de protección personal.
Sustancias cuyo punto de ignición es menor de 0°C y su
de ebullición máximo de 35°C.
Xn = NOCIVO
Extremadamente
inflamable
Sustancias cuyo punto de ignición es menor de 0°C y su
nto de ebullición máximo de 35°C.
F+ = EXTREMADAMENTE INFLAMABLE
35
F = INFLAMABLE
Inflamable
Sustancias líquidas cuyo punto de ignición es menor a
Ejemplo: etanol, tolueno, éter dietílico.
as de prevención: mantener alejado de fuentes de calor,
nición o eventuales chispas, de materiales combustibles y
ntes.
F = INFLAMABLE
Sustancias líquidas cuyo punto de ignición es menor a
Aquellas
o preparados
°C.
Ejemplo: sustancias
etanol, tolueno,
éter dietílico. que cuando son
os
al
medio
ambiente
pueden
efecto
didas de prevención: mantener
alejadopresentar
de fuentes un
de calor,
Nocivos
para el
ato
o diferido,
poniendo
a alguna
especie.
ignición
o eventuales
chispas,endepeligro
materiales
combustibles
y
medio ambiente
o: tiourea, o-toluidina.
dantes.
as de prevención: evitar que los derrames alcancen los
ües, tratar los residuos en condiciones ambientalmente
adas.
N = NOCIVO PARA EL MEDIO AMBIENTE
N = NOCIVO PARA EL MEDIO AMBIENTE
Tóxico
Sustancias que pueden causar irritación a la pie
mucosas, o los ojos, por contacto inmediato, prolongado
repetido, pudiendo también provocar inflamación. Ejemplo
cloroformo, SDS, hipoclorito de sodio, aminoantipirina.
Medidas de prevención: evitar el contacto con los ojos, la piel
las vías respiratorias. Utilizar elementos de protección persona
Sustancias que pueden causar irritación a la piel,
mucosas, o los ojos, por contacto inmediato, prolongado
o repetido, pudiendo también provocar inflamación.
Ejemplo: cloroformo, SDS, hipoclorito de sodio,
aminoantipirina. Medidas de prevención: evitar el
contacto con
los ojos,sustancias
la piel y las
respiratorias.
Aquellas
o vías
preparados
que cuando so
Utilizar elementos de protección personal.
liberados al medio ambiente pueden presentar un efect
inmediato o diferido, poniendo en peligro a alguna especie
Ejemplo: tiourea, o-toluidina.
Medidas de prevención: evitar que los derrames alcancen lo
= EXTREMADAMENTE
INFLAMABLE
desagües, F+
tratar
los residuos en condiciones
ambientalment
adecuadas.
Sustancias cuyo punto de ignición es menor de 0°C y su
punto de ebullición máximo de 35°C.
Aquellas sustancias o preparados que cuando son
liberados al medio ambiente pueden presentar un efecto
inmediato o diferido, poniendo en peligro a alguna especie.
Ejemplo: tiourea, o-toluidina.
Medidas de prevención: evitar que los derrames alcancen los
desagües, tratar los residuos en condiciones ambientalmente
adecuadas.
Sustancias líquidas cuyo punto de ignición es menor a
40°C. Ejemplo: etanol, tolueno, éter dietílico.
Medidas de prevención:
mantener alejado
de fuentes
de
T+ = ALTAMENTE
TÓXICO,
T TÓXICO
calor, de ignición o eventuales chispas, de materiales
combustibles y oxidantes.
Sustancias que pueden causar daño en forma aguda
crónica a la salud o causar la muerte si son inhaladas, ingerida
o se absorben por la piel, aún en pequeñas cantidades
Ejemplo: azida de sodio, dinitrofenol, bromuro de etidio.
Medidas
prevención:TÓXICO,
evitar todo
contacto directo. Utiliza
T+ de
= ALTAMENTE
T TÓXICO
Aquellas
sustancias
o
preparados
que
cuando
son estrictas medida
elementos de protección personal. Emplear
liberados
al medio que
ambiente
pueden
presentar
un
efecto
Sustancias
pueden
causar
daño
en
forma
aguda o
de higiene
personal
y delen
ambiente
laboratorio.
inmediato
o diferido,
poniendo
peligro adel
alguna
crónica a la salud o causar la muerte si son inhaladas, ingeridas
especie. Ejemplo: tiourea, o-toluidina. Medidas de
o se absorben por la piel, aún en pequeñas cantidades.
prevención: evitar que los derrames alcancen los
Ejemplo:
azida
delos
sodio,
dinitrofenol,
bromuro de etidio.
desagües,
tratar
residuos
en condiciones
Medidas
de
prevención:
evitar
todo
contacto directo. Utilizar
ambientalmente adecuadas.
elementos de protección personal. Emplear estrictas medidas
de higiene personal y del ambiente del laboratorio.
Sustancias que pueden causar daño en forma aguda o
crónica a la salud o causar la muerte si son inhaladas,
ingeridas o se absorben por la piel, aún en pequeñas
cantidades. Ejemplo: azida de sodio, dinitrofenol,
bromuro de etidio. Medidas de prevención: evitar todo
contacto directo. Utilizar elementos de protección
personal. Emplear estrictas medidas de higiene personal
y del ambiente del laboratorio.
T+ = ALTAMENTE TÓXICO, T TÓXICO
Sustancias que pueden causar daño en forma aguda o
a a la salud o causar la muerte si son inhaladas, ingeridas
absorben por la piel, aún en pequeñas cantidades.
o: azida de sodio, dinitrofenol, bromuro de etidio.
as de prevención: evitar todo contacto directo. Utilizar
3
55
3
36
casos se mencionan combinaciones de frases R o de frases S,
cuando dos o más riesgos tienen relación entre sí (cuadro I.6).
Sustancias capaces de atacar y destruir los tejidos
orgánicos si entran en contacto con ellos o bien atacar
ciertos
metalesde
o materiales.
Ejemplo:
hidróxido
de Protection
El símbolo
la N.F.P.A.
(National
Fire
sodio,
ácido
clorhídrico,
ácido
acético.
Corrosivo
Association)
Medidas de prevención: evitar el contacto con los ojos, la
piel y las vías respiratorias. Utilizar elementos de
El símbolo de la N.F.P.A. es un sistema de identificación de
protección personal.
riesgos de un producto químico, en tres categorías principales:
"salud", "inflamabilidad" y "reactividad" indicando el grado de
severidad por medio de una escala numérica desde (4) que
C = CORROSIVO
indica el riesgo mayor, (3) riesgo severo, (2) riesgo moderado,
Simbología
NFPA
(National
Fire
Protection
Association)
Sustancias capaces de atacar y destruir los tejidos
(1) riesgo menor, hasta (0) que representa ausencia de riesgo.
ánicos si entran en contacto con ellos o bien atacar ciertos
Este símbolo es útil para alertar acerca del riesgo de ese
Es un Ejemplo:
sistema hidróxido
de identificación
de riesgosproducto
de uny producto
químico,
tres categorías
ales o materiales.
de sodio, ácido
a su vez, puede
ayudar en
a determinar
los cuidados a
"salud", "inflamabilidad" y "reactividad"
de severidad
hídrico, ácidoprincipales:
acético.
tener en indicando
cuenta en el
el grado
almacenamiento
y en por
caso de
didas de prevención:
el contacto
los ojos, desde
la piel y (4) que
emergencias,
derrames
o salpicaduras.
medio evitar
de una
escalacon
numérica
indica el de
riesgo
mayor,
(3) riesgo severo, (2)
vías respiratorias.
Utilizar
elementos(1)
deriesgo
protección
personal.
La información
se presenta
por medio de una estructura
riesgo
moderado,
menor,
hasta (0) que representa
ausencia
de riesgo.
espacial
en
forma
de
rombo
principal,
dividido
a suayudar
vez en otros
Este símbolo es útil para alertar acerca del riesgo de ese producto y a su vez,
puede
ntificación sobre
los riesgos específicos
y los aconsejos
cuatro. en el almacenamiento y en caso de
a determinar
los cuidados
tener en cuenta
prudencia emergencias, de derrames o salpicaduras.
El rombo azul a la izquierda identifica el riesgo para la
rombo rojo espacial
en la parteen
superior
riesgo por
La información se presenta por medio de salud.
una Elestructura
formaindica
de el
rombo
ses "R" éstas advierten acerca del riesgo más común
inflamabilidad.
principal, dividido a su vez en otros cuatro (Figura 22):
gnado a esa sustancia química, por medio de la enumeración
El rombo amarillo a la derecha señala el riesgo por
riesgos específicos en frases cortas que son adaptables a
reactividad o inestabilidad. El rombo blanco en la parte inferior
distintas sustancias.
Clasificación
de los re
indica riesgos especiales tales como: W reactivo
al agua, COR
Las frases "S" brindan los consejos de prudencia o las
corrosivo, AIR reactivo al aire, OXY oxidante. Ejemplo:
Los residuos que se gen
didas de prevención más importantes relacionadas con el
enseñanza o investigac
go asignado a esa sustancia química y que permitirán su
nipulación y almacenamiento en forma segura. En algunos
contienen residuos no
biológicos infecciosos y
Ácido clorhídrico
Figura 22. Rombo NFPA (Tomado de: NFPA 704)
Hojas de seguridad
•
•
•
•
Residuos peligrosos b
37
aquello que ha entrado
sus muestras biológica
clasifican en: sangre, c
partes y fluidos corpora
algodones, jeringas, e
agujas, pipetas Pasteur,
El rombo azul a la izquierda identifica el riesgo para la salud.
Cada práctica cuenta con las hojas de seguridad para cada
Residuos municipales: s
El rombo rojo en la parte superior indica el riesgo por inflamabilidad.
reactivo o sustancia que se utilice en el laboratorio.
El rombo amarillo a la derecha señala el riesgo por reactividad o inestabilidad. para la salud y sus cara
Las hojas de seguridad proveen información sobre (cuadro I.8,
El rombo blanco
en la parte inferior indica riesgos/peligros especiales talesdomésticos
como: Wcomunes.
pág.
43):
reactivo al agua, COR corrosivo, AIR reactivo al aire, OXY oxidante.
• Los componentes de un producto, su reactividad, las
medidas precautorias principales o las advertencias más
importantes.
• Los elementos de protección personal que se recomienda
emplear en la manipulación.
• Las vías de ingreso y los órganos blanco.
• Las medidas por derrame accidental y de primeros auxilios.
• La información toxicológica.
• Las recomendaciones para su almacenamiento.
• Las condiciones para la disposición de los residuos.
Residuos especiales: so
peligro para la salud p
como: Corrosividad, R
Inflamabilidad (CRETI).
de residuos municipale
hace que se consider
56 mientras q
infecciosos,
infecciosos con peligros
peligrosos CRETI.
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC CAMPUS QUERÉTARO
FACULTAD DE MEDICINA
ANEXO 3.
NORMA Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental - Salud ambiental - Residuos
peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones de manejo.
Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.- Secretaría de Medio Ambiente y
Recursos Naturales.
CASSIO LUISELLI FERNANDEZ, Presidente del Comité Consultivo Nacional de Normalización de Medio Ambiente y
Recursos Naturales, y ERNESTO ENRIQUEZ RUBIO, Presidente del Comité Consultivo Nacional de Normalización, de
Regulación y Fomento Sanitario, con fundamento en lo dispuesto en los artículos 32 bis fracciones I, II, IV, V y 39 fracciones
I, VIII y XXI de la Ley Orgánica de la Administración Pública Federal; 4 de la Ley Federal de Procedimiento Administrativo; 5
fracciones V, VI y XIX, 15, 36, 37, 37 Bis, 150, 151, 151 Bis, 160 y 171 de la Ley General del Equilibrio Ecológico y la
Protección al Ambiente; 3 fracciones XIII y XIV, 13, apartado A) fracción I, 45, 116, 117, 118, 128, 129 y 393 de la Ley
General de Salud; 38 fracción II, 40, fracciones I, III, V, IV, X y XI, 41, 43, 44 y 47 de la Ley Federal sobre Metrología y
Normalización; 1o., 2o. y 4o. fracciones II, III y IV, 5o., 6o. y 58 del Reglamento de la Ley General del Equilibrio Ecológico y
la Protección al Ambiente en materia de Residuos Peligrosos; 2 fracción I incisos a) y c), y 7o. y 66
del Reglamento de la Ley General de Salud en materia de Control Sanitario de Actividades, Establecimientos, Productos y
Servicios; 10 del Reglamento de la Ley General de Salud en materia de Prestación de Servicios de Atención Médica; 28, 31
fracción II, 33 y 34 del Reglamento de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 8 fracción V del Reglamento Interior
de la Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales; 2 literal C fracción II del Reglamento Interior de la Secretaría de
Salud y 2, fracciones I, II, III, VII, VIII y IX, 7 fracción XVI, y 12 fracción VI del Decreto por el que se crea la Comisión Federal
para la Protección contra Riesgos Sanitarios, ordenan la publicación en el Diario Oficial de la Federación de la Norma
Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental-Salud ambiental-Residuos peligrosos biológicoinfecciosos-Clasificación y especificaciones de manejo, y
CONSIDERANDO
Que en cumplimiento a lo establecido en la fracción I del artículo 47 de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización,
con fecha 1 de noviembre de 2001 se publicó en el Diario Oficial de la Federación, con carácter de proyecto la Norma
Oficial Mexicana PROY-NOM-087-ECOL-SSA1-2000, Protección ambiental- Salud ambiental-Residuos peligrosos biológicoInfecciosos-Clasificación y especificaciones de manejo, mismo que fue elaborado de manera conjunta con la Secretaría de
Salud, con el fin de que dentro de los 60 días naturales siguientes a su publicación, los interesados presenten sus
comentarios ante el Comité Consultivo Nacional de Normalización para la Protección Ambiental, sito en bulevar Adolfo Ruiz
Cortines número 4209, piso 5o., colonia Jardines en la Montaña, código postal 14210, Delegación Tlalpan, Distrito Federal o
se enviaron al correo electrónico o al fax que se señalaron. Durante el citado plazo, la Manifestación de Impacto Regulatorio
correspondiente estuvo a disposición del público en general para su consulta en el citado domicilio, de conformidad con el
artículo 45 del citado ordenamiento.
Que en el plazo de los 60 días antes señalado, los interesados presentaron sus comentarios al proyecto en cuestión, los
cuales fueron analizados por el citado Comité, realizándose las modificaciones procedentes al mismo. La Secretaría de
Medio Ambiente y Recursos Naturales publicó las respuestas a los comentarios recibidos en el Diario Oficial de la
Federación el día 20 de enero de 2003.
Que habiéndose cumplido con el procedimiento establecido en la Ley Federal sobre Metrología y Normalización, el
Comité Consultivo Nacional de Normalización para la Protección Ambiental aprobó la Norma Oficial Mexicana NOM-087ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental-Salud ambiental-Residuos peligrosos biológico-infecciosos-Clasificación y
especificaciones de manejo, misma que abroga a su similar NOM-087-ECOL-1995 y su aclaración publicada en el citado
órgano informativo el 12 de junio de 1996, Que establece los requisitos para la separación, envasado, almacenamiento,
recolección, transporte, tratamiento y disposición final de los residuos peligrosos biológico-infecciosos que se generan en
establecimientos que presten atención médica, actualizando el año de su expedición. Por lo expuesto y fundado se expide la
siguiente:
57
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-087-ECOL-SSA1-2002, PROTECCION AMBIENTAL-SALUD AMBIENTALRESIDUOS PELIGROSOS BIOLOGICO-INFECCIOSOS- CLASIFICACION
Y ESPECIFICACIONES DE MANEJO
INDICE
0.
Introducción
1.
Objetivo y campo de aplicación
2.
Referencias
3.
Definiciones y terminología
4.
Clasificación de los residuos peligrosos biológico-infecciosos
5.
Clasificación de los establecimientos generadores de residuos peligrosos biológico-infecciosos
6.
Manejo de residuos peligrosos biológico-infecciosos
7.
Grado de concordancia con normas y lineamientos internacionales y con las normas mexicanas tomadas como
base para su elaboración
8.
Bibliografía
9.
Observancia de esta Norma
Apéndice normativo
0. Introducción
La Ley General del Equilibrio Ecológico y la Protección al Ambiente, define como residuos peligrosos a todos aquellos
residuos que por sus características corrosivas, reactivas, explosivas, tóxicas, inflamables y biológico-infecciosas, que
representan un peligro para el equilibrio ecológico o el ambiente; mismos que serán manejados en términos de la propia ley,
su Reglamento y normas oficiales mexicanas que expida la Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales previa
opinión de diversas dependencias que tengan alguna injerencia en la materia, correspondiéndole a la citada SEMARNAT su
regulación y control.
Con fecha de 7 de noviembre de 1995, se publicó en el Diario Oficial de la Federación la Norma
Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-1995, Que establece los requisitos para la separación, envasado, almacenamiento,
recolección, transporte, tratamiento y disposición final de los residuos peligrosos
biológico-infecciosos que se generan en establecimientos que presten servicios de atención médica.
Los establecimientos de atención médica son regulados por la Secretaría de Salud por lo que en la revisión de la norma
mencionada, se incluye a los representantes del sector.
Esta revisión consideró las características de los diferentes tipos de unidades médicas que prestan atención a
poblaciones rurales.
Los residuos peligrosos biológico-infecciosos se han venido manejando en términos de las regulaciones ambientales
antes señaladas, sin embargo fue necesario actualizar la NOM-087-ECOL-1995, tomándose en consideración las
experiencias y competencias de los sectores involucrados en su cumplimiento, con el fin de que sus disposiciones sean
operativas y adecuadas para proteger el medio ambiente y la salud de la población en general.
1. Objetivo y campo de aplicación
La presente Norma Oficial Mexicana establece la clasificación de los residuos peligrosos
biológico-infecciosos así como las especificaciones para su manejo.
Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria para los establecimientos que generen residuos peligrosos
biológico-infecciosos y los prestadores de servicios a terceros que tengan relación directa con los mismos.
2. Referencias
Norma Oficial Mexicana NOM-052-ECOL-1993, Que establece las características de los residuos peligrosos, el listado
de los mismos y los límites que hacen a un residuo peligroso por su toxicidad al ambiente, publicada en el Diario Oficial de
la Federación el 22 de octubre de 1993. Esta Norma contiene la nomenclatura en términos del Acuerdo Secretarial
publicado el 29 de noviembre de 1994, por el cual se actualiza la nomenclatura de 58 normas oficiales mexicanas.
58
3. Definiciones y terminología
Para efectos de esta Norma Oficial Mexicana, se consideran las definiciones contenidas en la Ley General del Equilibrio
Ecológico y la Protección al Ambiente, su Reglamento en materia de Residuos Peligrosos, la Ley General de Salud, sus
Reglamentos, y las siguientes:
3.1 Agente biológico-infeccioso
Cualquier microorganismo capaz de producir enfermedades cuando está presente en concentraciones suficientes
(inóculo), en un ambiente propicio (supervivencia), en un hospedero susceptible y en presencia de una vía de entrada.
3.2 Agente enteropatógeno
Microorganismo que bajo ciertas circunstancias puede producir enfermedad en el ser humano a nivel del sistema
digestivo, se transmite vía oral-fecal.
3.3 Bioterio
Es un área o departamento especializado en la reproducción, mantenimiento y control de diversas especies de animales
de laboratorio en óptimas condiciones, los cuales son utilizados para la experimentación, investigación científica y desarrollo
tecnológico.
3.4 Carga útil
Es el resultado de la sustracción del peso vehicular al peso bruto vehicular.
3.5 Centro de acopio
Instalación de servicio que tiene por objeto resguardar temporalmente y bajo ciertas condiciones a los residuos
peligrosos biológico-infecciosos para su envío a instalaciones autorizadas para su tratamiento o disposición final.
3.6 Cepa
Cultivo de microorganismos procedente de un aislamiento.
3.7 Establecimientos generadores
Son los lugares públicos, sociales o privados, fijos o móviles cualquiera que sea su denominación, que estén
relacionados con servicios de salud y que presten servicios de atención médica ya sea ambulatoria o para internamiento de
seres humanos y utilización de animales de bioterio, de acuerdo con la tabla 1 del presente instrumento.
3.8 Irreconocible
Pérdida de las características físicas y biológico-infecciosas del objeto para no ser reutilizado.
3.9 Manejo
Conjunto de operaciones que incluyen la identificación, separación, envasado, almacenamiento, acopio, recolección,
transporte, tratamiento y disposición final de los residuos peligrosos biológico-infecciosos.
3.10 Muestra biológica
Parte anatómica o fracción de órganos o tejido, excreciones o secreciones obtenidas de un ser humano o animal vivo o
muerto para su análisis.
3.11 Organo
Entidad morfológica compuesta por la agrupación de tejidos diferentes que concurren al desempeño de un trabajo
fisiológico.
3.12 Prestador de servicios
Empresa autorizada para realizar una o varias de las siguientes actividades: recolección, transporte, acopio, tratamiento
y disposición final de residuos peligrosos biológico-infecciosos.
3.13 Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos (RPBI)
Son aquellos materiales generados durante los servicios de atención médica que contengan agentes biológicoinfecciosos según son definidos en esta Norma, y que puedan causar efectos nocivos a la salud
y al ambiente.
3.14 Sangre
El tejido hemático con todos sus elementos.
59
3.15 SEMARNAT
Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales.
3.16 SSA
Secretaría de Salud.
3.17 Separación
Segregación de las sustancias, materiales y residuos peligrosos de iguales características cuando presentan un riesgo.
3.18 Tejido
Entidad morfológica compuesta por la agrupación de células de la misma naturaleza, ordenadas con regularidad y que
desempeñan una misma función.
3.19 Tratamiento
El método físico o químico que elimina las características infecciosas y hace irreconocibles a los residuos peligrosos
biológico-infecciosos.
4. Clasificación de los residuos peligrosos biológico-infecciosos
Para efectos de esta Norma Oficial Mexicana se consideran residuos peligrosos biológico-infecciosos
los siguientes:
4.1 La sangre
4.1.1 La sangre y los componentes de ésta, sólo en su forma líquida, así como los derivados no comerciales, incluyendo
las células progenitoras, hematopoyéticas y las fracciones celulares o acelulares de la sangre resultante (hemoderivados).
4.2 Los cultivos y cepas de agentes biológico-infecciosos
4.2.1 Los cultivos generados en los procedimientos de diagnóstico e investigación, así como los generados en la
producción y control de agentes biológico-infecciosos.
4.2.2 Utensilios desechables usados para contener, transferir, inocular y mezclar cultivos de agentes biológicoinfecciosos.
4.3 Los patológicos
4.3.1 Los tejidos, órganos y partes que se extirpan o remueven durante las necropsias, la cirugía o algún otro tipo de
intervención quirúrgica, que no se encuentren en formol.
4.3.2 Las muestras biológicas para análisis químico, microbiológico, citológico e histológico, excluyendo orina y
excremento.
4.3.3 Los cadáveres y partes de animales que fueron inoculados con agentes enteropatógenos en centros de
investigación y bioterios.
4.4 Los residuos no anatómicos
Son residuos no anatómicos los siguientes:
4.4.1 Los recipientes desechables que contengan sangre líquida.
4.4.2 Los materiales de curación, empapados, saturados, o goteando sangre o cualquiera de los siguientes fluidos
corporales: líquido sinovial, líquido pericárdico, líquido pleural, líquido Céfalo-Raquídeo o líquido peritoneal.
4.4.3 Los materiales desechables que contengan esputo, secreciones pulmonares y cualquier material usado para
contener éstos, de pacientes con sospecha o diagnóstico de tuberculosis o de otra enfermedad infecciosa según sea
determinado por la SSA mediante memorándum interno o el Boletín Epidemiológico.
4.4.4 Los materiales desechables que estén empapados, saturados o goteando sangre, o secreciones de pacientes con
sospecha o diagnóstico de fiebres hemorrágicas, así como otras enfermedades infecciosas emergentes según sea
determinado por la SSA mediante memorándum interno o el Boletín Epidemiológico.
4.4.5 Materiales absorbentes utilizados en las jaulas de animales que hayan sido expuestos a agentes enteropatógenos.
4.5 Los objetos punzocortantes
60
4.5.1 Los que han estado en contacto con humanos o animales o sus muestras biológicas durante el diagnóstico y
tratamiento, únicamente: tubos capilares, navajas, lancetas, agujas de jeringas desechables, agujas hipodérmicas, de
sutura, de acupuntura y para tatuaje, bisturís y estiletes de catéter, excepto todo material de vidrio roto utilizado en el
laboratorio, el cual deberá desinfectar o esterilizar antes de ser dispuesto como residuo municipal.
5. Clasificación de los establecimientos generadores de residuos peligrosos biológico-infecciosos
5.1 Para efectos de esta Norma Oficial Mexicana, los establecimientos generadores se clasifican como se establece en
la tabla 1.
TABLA 1
NIVEL I
Unidades hospitalarias de 1 a
5 camas e instituciones de
investigación con excepción
de los señalados en el
Nivel III.
Laboratorios clínicos y
bancos de sangre que
realicen análisis de 1 a 50
muestras al día.
Unidades hospitalarias
psiquiátricas.
Centros de toma de muestras
para análisis clínicos.
NIVEL II
NIVEL III
Unidades hospitalarias de 6
hasta 60 camas;
Unidades hospitalarias de
más de 60 camas;
Laboratorios clínicos y
bancos de sangre que
realicen análisis de 51 a
200 muestras al día;
Centros de producción e
investigación experimental
en enfermedades
infecciosas;
Bioterios que se dediquen a
la investigación con agentes
biológico-infecciosos, o
Laboratorios clínicos y
bancos de sangre que
realicen análisis a más de
200 muestras al día, o
Establecimientos que
generen de 25 a 100
kilogramos al mes de RPBI.
Establecimientos que
generen más de 100
kilogramos al mes de RPBI.
5.2 Los establecimientos generadores independientes del Nivel I que se encuentren ubicados en un mismo inmueble,
podrán contratar los servicios de un prestador de servicios común, quien será el responsable del manejo de los residuos
peligrosos biológico-infecciosos.
6. Manejo de residuos peligrosos biológico-infecciosos
6.1 Los generadores y prestadores de servicios, además de cumplir con las disposiciones legales aplicables, deben:
6.1.1 Cumplir con las disposiciones correspondientes a las siguientes fases de manejo, según el caso:
a) Identificación de los residuos.
b) Envasado de los residuos generados.
c) Almacenamiento temporal.
d) Recolección y transporte externo.
e) Tratamiento.
f) Disposición final.
6.2 Identificación y envasado
6.2.1 En las áreas de generación de los establecimientos generadores, se deberán separar y envasar todos los residuos
peligrosos biológico-infecciosos, de acuerdo con sus características físicas y biológicas infecciosas, conforme a la tabla 2 de
esta Norma Oficial Mexicana. Durante el envasado, los residuos peligrosos biológico-infecciosos no deberán mezclarse con
ningún otro tipo de residuos municipales o peligrosos.
61
TABLA 2
TIPO DE RESIDUOS
ENVASADO
COLOR
4.1
Sangre
Líquidos
Recipientes herméticos
Rojo
4.2
Cultivos y cepas de agentes
infecciosos
Sólidos
Bolsas de polietileno
Rojo
4.3
Patológicos
Sólidos
Bolsas de polietileno
Amarillo
Líquidos
Recipientes herméticos
Amarillo
Sólidos
Bolsas de polietileno
Rojo
Líquidos
Recipientes herméticos
Rojo
Sólidos
Recipientes rígidos
polipropileno
Rojo
4.4
Residuos no anatómicos
4.5 Objetos punzocortantes
a)
ESTADO FISICO
Las bolsas deberán ser de polietileno de color rojo traslúcido de calibre mínimo 200 y de color amarillo traslúcido de
calibre mínimo 300, impermeables y con un contenido de metales pesados de no más de una parte por millón y
libres de cloro, además deberán estar marcadas con el símbolo universal de riesgo biológico y la leyenda Residuos
Peligrosos Biológico-Infecciosos (Apéndice Normativo), deberán cumplir los valores mínimos de los parámetros
indicados en la tabla 3 de esta Norma Oficial Mexicana.
Las bolsas se llenarán al 80 por ciento (80%) de su capacidad, cerrándose antes de ser transportadas al sitio de
almacenamiento temporal y no podrán ser abiertas o vaciadas.
TABLA 3
PARAMETRO
UNIDADES
2
ESPECIFICACIONES
Resistencia a la tensión
Kg/cm
SL: 140
ST: 120
Elongación
%
SL: 150
ST: 400
Resistencia al rasgado
G
SL: 90
ST: 150
SL: Sistema longitudinal.
ST: Sistema transversal.
6.2.2 Los recipientes de los residuos peligrosos punzocortantes deberán ser rígidos, de polipropileno color rojo, con un
contenido de metales pesados de no más de una parte por millón y libres de cloro, que permitan verificar el volumen
ocupado en el mismo, resistentes a fracturas y pérdidas de contenido al caerse, destructibles por métodos físicos, tener
separador de agujas y abertura para depósito, con tapa(s) de ensamble seguro y cierre permanente, deberán contar con la
leyenda que indique “RESIDUOS PELIGROSOS PUNZOCORTANTES BIOLOGICO-INFECCIOSOS” y marcados con el
símbolo universal de riesgo biológico (Apéndice Normativo).
a)
La resistencia mínima de penetración para los recipientes tanto para punzocortantes como para líquidos, debe ser
de 12.5 N (doce punto cinco Newtons) en todas sus partes y será determinada por la medición de la fuerza
requerida para penetrar los lados y la base con una aguja hipodérmica calibre 21 x 32 mm mediante calibrador de
fuerza o tensiómetro.
b)
Los recipientes para los residuos peligrosos punzocortantes y líquidos se llenarán hasta el 80% (ochenta por
ciento) de su capacidad, asegurándose los dispositivos de cierre y no deberán ser abiertos o vaciados.
c)
Las unidades médicas que presten atención a poblaciones rurales, con menos de 2,500 habitantes y ubicadas en
zonas geográficas de difícil accceso, podrán utilizar latas con tapa removible o
botes de plástico con tapa de rosca, con capacidad mínima de uno hasta dos litros, que deberán marcar
previamente con la leyenda de “RESIDUOS PELIGROSOS PUNZOCORTANTES BIOLOGICO-INFECCIOSOS".
62
6.2.3 Los recipientes de los residuos peligrosos líquidos deben ser rígidos, con tapa hermética de polipropileno color rojo
o amarillo, con un contenido de metales pesados de no más de una parte
por millón y libres de cloro, resistente a fracturas y pérdidas de contenido al caerse, destructible por
métodos físicos, deberá contar con la leyenda que indique RESIDUOS PELIGROSOS LIQUIDOS BIOLOGICOINFECCIOSOS y marcados con el símbolo universal de riesgo biológico (Apéndice Normativo)
En caso de que los residuos líquidos no sean tratados dentro de las instalaciones del establecimiento generador,
deberán ser envasados como se indica en la tabla 2 de esta Norma Oficial Mexicana.
6.3 Almacenamiento
6.3.1 Se deberá destinar un área para el almacenamiento temporal de los residuos peligrosos biológico-infecciosos.
Los establecimientos generadores incluidos en el Nivel I de la tabla 1 de esta Norma Oficial Mexicana, quedan exentos
del cumplimiento del punto 6.3.5 y podrán ubicar los contenedores a que se refiere el punto 6.3.2 en el lugar más apropiado
dentro de sus instalaciones, de manera tal que no obstruyan las vías
de acceso.
6.3.2 Los residuos peligrosos biológico-infecciosos envasados deberán almacenarse en contenedores metálicos o de
plástico con tapa y ser rotulados con el símbolo universal de riesgo biológico, con la leyenda “RESIDUOS PELIGROSOS
BIOLOGICO-INFECCIOSOS”.
6.3.3 El periodo de almacenamiento temporal estará sujeto al tipo de establecimiento generador,
como sigue:
(a)
Nivel I: Máximo 30 días.
(b)
Nivel II: Máximo 15 días.
(c)
Nivel III: Máximo 7 días.
6.3.4 Los residuos patológicos, humanos o de animales (que no estén en formol) deberán conservarse a una
temperatura no mayor de 4°C (cuatro grados Celsius), en las áreas de patología, o en almacenes temporales con sistemas
de refrigeración o en refrigeradores en áreas que designe el responsable del establecimiento generador dentro del mismo.
6.3.5 El área de almacenamiento temporal de residuos peligrosos biológico-infecciosos debe:
a)
Estar separada de las áreas de pacientes, almacén de medicamentos y materiales para la atención de los mismos,
cocinas, comedores, instalaciones sanitarias, sitios de reunión, áreas de esparcimiento, oficinas, talleres y
lavanderías.
b)
Estar techada, ser de fácil acceso, para la recolección y transporte, sin riesgos de inundación e ingreso de
animales.
c)
Contar con señalamientos y letreros alusivos a la peligrosidad de los mismos, en lugares y formas visibles, el
acceso a esta área sólo se permitirá al personal responsable de estas actividades.
d)
El diseño, construcción y ubicación de las áreas de almacenamiento temporal destinadas al manejo de residuos
peligrosos biológico-infecciosos en las empresas prestadoras de servicios, deberán ajustarse a las disposiciones
señaladas y contar con la autorización correspondiente por parte de la SEMARNAT.
e)
Los establecimientos generadores de residuos peligrosos biológico-infecciosos que no cuenten con espacios
disponibles para construir un almacenamiento temporal, podrán utilizar contenedores plásticos o metálicos para tal
fin, siempre y cuando cumplan con los requisitos mencionados en los incisos a), b) y c) de este numeral.
6.3.6 Los residuos peligrosos biológico-infecciosos podrán ser almacenados en centros de acopio, previamente
autorizados por la SEMARNAT. Dichos centros de acopio deberán operar sistemas de refrigeración para mantener los
residuos peligrosos biológico-infecciosos a una temperatura máxima de 4°C (cuatro grados Celsius) y llevar una bitácora de
conformidad con el artículo 21 del Reglamento en materia de Residuos Peligrosos de la Ley General del Equilibrio Ecológico
y la Protección al Ambiente. El tiempo
de estancia de los residuos en un centro de acopio podrá ser de hasta treinta días.
6.4 Recolección y transporte externo
6.4.1 La recolección y el transporte de los residuos peligrosos biológico-infecciosos referidos en esta Norma Oficial
Mexicana, deberá realizarse conforme a lo dispuesto en los ordenamientos jurídicos aplicables y cumplir lo siguiente:
63
a) Sólo podrán recolectarse los residuos que cumplan con el envasado, embalado y etiquetado o rotulado como se
establece en el punto 6.2 de esta Norma Oficial Mexicana.
b) Los residuos peligrosos biológico-infecciosos no deben ser compactados durante su recolección
y transporte.
c) Los contenedores referidos en el punto 6.3.2 deben ser desinfectados y lavados después de cada ciclo de
recolección.
d) Los vehículos recolectores deben ser de caja cerrada y hermética, contar con sistemas de captación de
escurrimientos, y operar con sistemas de enfriamiento para mantener los residuos a una temperatura máxima de 4°C (cuatro
grados Celsius).
Además, los vehículos con capacidad de carga útil de 1,000 kg o más deben operar con sistemas mecanizados de carga
y descarga.
e) Durante su transporte, los residuos peligrosos biológico-infecciosos sin tratamiento no deberán mezclarse con ningún
otro tipo de residuos municipales o de origen industrial.
6.4.2 Para la recolección y transporte de residuos peligrosos biológico-infecciosos se requiere la autorización por parte
de la SEMARNAT. Dicho transporte deberá dar cumplimiento con los incisos a), b), d) y e) del numeral 6.4.1 de esta Norma
Oficial Mexicana.
6.5 Tratamiento
6.5.1 Los residuos peligrosos biológico-infecciosos deben ser tratados por métodos físicos o químicos que garanticen la
eliminación de microorganismos patógenos y deben hacerse irreconocibles para su disposición final en los sitios
autorizados.
6.5.2 La operación de sistemas de tratamiento que apliquen tanto a establecimientos generadores como prestadores de
servicios dentro o fuera de la instalación del generador, requieren autorización previa de la SEMARNAT, sin perjuicio de los
procedimientos que competan a la SSA de conformidad con las disposiciones aplicables en la materia.
6.5.3 Los residuos patológicos deben ser incinerados o inhumados, excepto aquellos que estén destinados a fines
terapéuticos, de investigación y los que se mencionan en el inciso 4.3.2 de esta Norma Oficial Mexicana. En caso de ser
inhumados debe realizarse en sitios autorizados por la SSA.
6.6. Disposición final
Los residuos peligrosos biológico-infecciosos tratados e irreconocibles, podrán disponerse como residuos no peligrosos
en sitios autorizados por las autoridades competentes.
6.7 Programa de contingencias
Los establecimientos generadores de residuos peligrosos biológico-infecciosos y los prestadores de servicios deberán
contar con un programa de contingencias en caso de derrames, fugas o accidentes relacionados con el manejo de estos
residuos.
7. Grado de concordancia con normas y lineamientos internacionales y con las normas mexicanas tomadas
como base para su elaboración
7.1 Esta Norma Oficial Mexicana no concuerda con ninguna Norma Internacional por no existir referencia en el momento
de su elaboración, ni existen normas mexicanas que hayan servido de base para su elaboración.
8. Bibliografía
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8.40 Who/PEP/RUD/94.1. General. Managing Medical Wastes in Developing Countries World Health Organization 1994.
8.41 Reglamento de la Ley General de Salud en materia de Control Sanitario de la Disposición de Organos, Tejidos y
Cadáveres de Seres Humanos publicado en el Diario Oficial de Federación el 20
de febrero de 1985.
8.42 Censo de Universo de Trabajo 1999/INEGI/estimaciones CONAPO.
9. Observancia de esta Norma
9.1 La SEMARNAT, a través de la Procuraduría Federal de Protección al Ambiente y la SSA, a través de la Comisión
Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios en el ámbito de sus respectivas atribuciones y competencias, vigilarán
del cumplimiento de la presente Norma Oficial Mexicana de conformidad con las Bases de Colaboración que celebren entre
SSA y SEMARNAT, mismas que se publicarán en el Diario Oficial de la Federación. Las violaciones a la misma se
sancionarán en los términos de la Ley General del Equilibrio Ecológico y la Protección al Ambiente, y su Reglamento en
materia de Residuos Peligrosos, la Ley General de Salud y sus Reglamentos, así como los demás ordenamientos jurídicos
aplicables.
9.2 Los gobiernos del Distrito Federal, de los estados y de los municipios, podrán realizar actos de vigilancia para la
verificación del cumplimiento de esta Norma Oficial Mexicana, previa la publicación en el Diario Oficial de la Federación de
los Acuerdos de Coordinación que se celebren con la SEMARNAT.
9.3 Dentro del marco de los Acuerdos de Coordinación para la Descentralización Integral de los Servicios de Salud, las
entidades federativas verificarán el cumplimiento de esta Norma Oficial Mexicana.
TRANSITORIOS
PRIMERO.- Provéase la publicación de esta Norma Oficial Mexicana en el Diario Oficial de
la Federación.
SEGUNDO.- La presente Norma Oficial Mexicana entrará en vigor a los 60 días posteriores al de su publicación en el
Diario Oficial de la Federación.
TERCERO.- Los establecimientos generadores de residuos peligrosos biológico-infecciosos deben cumplir con la fase
de manejo señalada en el punto 6, a los 90 días posteriores al de la entrada en vigor
de la presente Norma, tiempo en el cual seguirá surtiendo sus efectos legales en lo conducente la
NOM-087-ECOL-1995.
CUARTO.- La presente Norma Oficial Mexicana abroga a su similar NOM-087-ECOL-1995, Que establece los requisitos
para la separación, envasado, almacenamiento, recolección, transporte, tratamiento y disposición final de los residuos
peligrosos biológico-infecciosos que se generan en establecimientos que presten atención médica, publicada en el Diario
Oficial de la Federación el 7 de noviembre de 1995 y su aclaración publicada en el citado órgano informativo el 12 de junio
de 1996.
66
México, Distrito Federal, a los veintidós días del mes de enero de dos mil tres.- El Presidente del Comité Consultivo
Nacional de Normalización de Medio Ambiente y Recursos Naturales, Cassio Luiselli Fernández.- Rúbrica.- El Presidente
del Comité Consultivo Nacional de Normalización, de Regulación y Fomento Sanitario, Ernesto Enríquez Rubio.- Rúbrica.
APENDICE NORMATIVO
SIMBOLO UNIVERSAL DE RIESGO BIOLOGICO
RESIDUOS
PELIGROSOS
BIOLOGICO–INFECCIOSOS
__________________________
67
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC CAMPUS QUERÉTARO
FACULTAD DE MEDICINA
ANEXO 4.
TÉCNICAS FRECUENTES UTILIZADAS EN EL LABORATORIO DE
BIOLOGÍA MOLECULAR
• Centrifugación
La centrifugación es un método empleado para separar partículas de diferente densidad
suspendidas en un líquido. Mediante esta técnica, la acción de la fuerza centrífuga da como
resultado que las partículas pesadas se sedimenten más rápido que las partículas ligeras.
La fuerza centrífuga (f) depende de la masa (m), de las revoluciones por minuto (n) y de la
distancia radial (r) y se expresa por la fórmula:
f (en dinas) = 0.01096 n2m r
En el sistema métrico decimal, la unidad de f es la dina, la de m es el gramo y la de r es el
centímetro.
El equipo empleado para realizar la centrifugación es la centrífuga. Está compuesta por un
motor eléctrico unido a un dispositivo (rotor) que gira a gran velocidad alrededor de un eje
vertical, provocando el aumento de la atracción gravitacional en el fondo del tubo que
contiene la muestra.
El resultado de la centrifugación es la separación en dos fases:
- fase insoluble: precipitado, botón o pellet,
- fase soluble líquida: sobrenadante.
La sedimentación se expresa en unidades Svedberg (símbolo: S) y se aplica a la
comparación práctica de tamaños moleculares que no sólo dependen de la masa de las
moléculas implicadas sino también de su forma. La velocidad y el tiempo con el que se
somete una muestra a centrifugación para separar sus componentes depende de la distancia
que recorren las partículas, además de la viscosidad del medio. Esta distancia se relaciona
con la forma y el tamaño del rotor; por ello, en las centrífugas suelen seleccionarse las
revoluciones por minuto (rpm). Las centrífugas ordinarias operan a rotaciones menores de 10
000 rpm. En cambio, las ultracentrífugas que operan en cámaras refrigeradas, evacuadas de
aire y se alcanzan velocidades de 20 000 a 70 000 rpm.
Es importante considerar que los valores de S no son aditivos, es decir, dos partículas 5S no
crean una partícula 10S.
La unidad S es igual a 10–13 segundos; no pertenece al SI y puede suplirse por 0,1
picosegundos (ps) o 100 femtosegundos (fs). En las moléculas menos densas que el medio
de suspensión, como las lipoproteínas, el desplazamiento es hacia la superficie y se expresa
en S de flotación (Sf) y permite la clasificación en: LDL, HDL y VHDL (low density, high
density y very high density) con Sf de 0 a 10, 10 a 400 y las muy densas que no flotan y
tienen una densidad mayor de 1.
Debido a que existen varios modelos y capacidades de centrífuga, en todas las publicaciones
donde se utiliza este equipo no se emplean como dato, dentro de la técnica, las rpm sino las
fuerzas g o Fuerza Relativa Centrífuga (FCR), la cual representa las fuerzas de gravedad a
la que son sometidas las muestras para lograr la separación. Para realizar la conversión
entre fuerzas g y rpm y viceversa, se puede utilizar convertidores disponibles en la red.
68
En la Figura 23 se muestra de manera general las partes de una centrífuga.
Tapa
Rotor
Pantalla
Ajuste de tiempo
Ajuste de velocidad
Botón “Open”
Botón “Start/Stop”
Botón “Short spin”
Figura 23. Partes de una centrífuga clínica
(Modificado de: https://quimi-lab.com.ar/)
El uso de la centrífuga requiere el seguimiento y atención de los siguientes puntos:
- Los tubos en las centrífugas deberán colocarse por pares para que no haya diferencia
de peso hacia un lado de la centrífuga. Enfrente de un tubo de un peso determinado
debe estar otro, en la misma posición, con el mismo peso. El descuido de esta regla
implica un desnivel que, a las velocidades y fuerzas señaladas, puede romper los tubos
y dañar el aparato. Para balancear por pares los tubos lo mejor es usar una balanza, y
no solo por volumen.
- Para no forzar el motor arrancar gradualmente la centrífuga hasta alcanzar la velocidad
requerida.
- Nunca frenar la centrífuga con las manos u otro instrumento, dejar parar por su propia
inercia; el no hacer esto conduce a que se agite el contenido de los tubos y se pierda el
trabajo experimental.
- No levantar la tapa de la centrífuga cuando está en movimiento, únicamente se levanta
hasta que el rotor quede inmóvil por completo.
- En caso de ruptura de un tubo dentro de la centrífuga, deberá hacerse un aseo completo
de inmediato, empleando desinfectantes como cloro y benzal.
69
• Espectrofotometría
El uso de técnicas colorimétricas en Bioquímica se basa en que muchas moléculas poseen
color propio, y/o algunas otras cuando reaccionan con otras moléculas pueden dar lugar a
productos finales coloreados que pueden detectarse a simple vista (cualitativamente). Así,
puede relacionarse la concentración del sustrato, producto y la intensidad de color.
Aunado a lo anterior, se puede medir cuantitativamente la coloración mediante un aparato
llamado espectrofotómetro.
Un espectrofotómetro es un instrumento para medir la absorbancia de una solución, es decir,
la cantidad de luz que una muestra absorbe.
Los componentes de un espectrofotómetro son los siguientes (Figura 24):
1. Fuente de luz: es una lámpara o combinación de lámparas que tienen un espectro de
emisión entre 190 y 1100 nm. En los laboratorios de rutina el espectrofotómetro más
utilizado es aquel donde la absorción por las moléculas dispersas en un medio
adecuado son las radiaciones comprendidas entre el ultravioleta y el espectro visible
(UV-Vis) del espectro electromagnético. Existen lámparas de deuterio, tungsteno y
halógenos como el xenón.
2. Filtro/selector de longitud de onda (monocromador): dispositivo que tiene la función de
permitir el paso de luz de una longitud de onda específica.
3. Celda: suelen ser tubos redondos o rectangulares de espesor constante, de diversos
materiales, como vidrio, cuarzo o plástico. En este compartimento se coloca la
muestra problema.
4. Detector: mide la transmitancia (cantidad de luz que pasa completamente a través de
intensidad del haz emergente disminuirá hasta un valor de I por que la solución absorbe
la muestra) y la absorbancia (medición de luz que es absorbida por la muestra).
parte de la luz (Mathews, 2002)
Intensidad de
luz incidente
Lámpara
Intensidad de
luz transmitida
Monocromador
Detector
Celda de muestra
con c moles/litro
de especies
absorbentes
Figura 2. Modelo del funcionamiento de un espectrofotómetro (Stryer, 2005)
Figura 24. Partes generales de un espectrofotómetro
(Modificado de Berg y col., 2005)
Sin embargo, la medición de especies químicas por métodos esprectrofotométricos implica
la elaboración de curvas de calibración, es decir, la representación gráfica en un eje de
coordenadas de la Absorbancia (eje de ordenadas) frente a la Concentración (eje de
abcisas). Se ensayan varias soluciones de concentración conocida y se determinan sus
absorbancias, construyéndose la curva de calibrado, que es una recta. Una vez ensayadas
las soluciones problemas, su concentración se averigua por interpolación de las
absorbanacias de las soluciones problema en la curva de calibración.
Estas curvas de calibración se basan en la propiedad de las sustancias absorbentes de
seguir en la ley de Lambert y Beer. De acuerdo con esta ley, cuando se incide luz en una
determinada longitud de onda sobre una especie absorbente, la absorción depende de:
70
La determinación cuantitativa de una sustancia depende de la cantidad de luz absorbida por
la muestra problema, y su relación con las absorbancias de una sustancia de referencia de
concentración conocida; es decir, una curva de calibración; así como la absorbancia de la
mezcla sin la sustancia de estudio (blanco).
Es importante seguir las indicaciones del manual del equipo para un mejor funcionamiento y
resultados. En términos generales se debe considerar lo siguiente:
- El equipo debe prenderse mínimo 15 min. antes para que la lámpara se caliente.
- Se debe seleccionar la longitud de onda deseada.
- Se debe leer el blanco antes de leer las muestras
- No colocar al equis en un lugar con vibraciones, calor, humedad o luz excesiva.
- Proteger del polvo con una funda adecuada.
- Cuidar que las celdas estén limpias, sin rayones, polvo o huellas digitales.
• Electroforesis
La electroforesis consiste en la migración de partículas cargadas sometidas a la influencia de
un campo eléctrico, de tal forma que las moléculas con carga positiva migran al cátodo
(electrodo con carga negativa) y las moléculas con carga negativa migran al ánodo (electrodo
con carga positiva). La velocidad de esta migración se encuentra influenciada por las
características de la biomolécula que migra (carga y tamaño), la intensidad del campo
eléctrico y las características del medio en la que tiene lugar la migración.
La movilidad electroforética de una molécula es directamente proporcional a la carga que
presenta, e inversamente proporcional a su tamaño y a la viscosidad del medio en el que
transcurre la electroforesis.
Por lo tanto, la electroforesis es una técnica que permite separar moléculas con carga neta y
que presentan diferencias de carga, forma y tamaño. Así, mediante esta metodología pueden
separarse proteínas, ácidos nucleicos, péptidos, nucleótidos, aminoácidos, etc.
La realización de una separación electroforética requiere varios componentes (Figura 25):
• Soporte: donde se realiza la separación propiamente dicha pues contiene las muestras que
a su vez están disueltas en un amortiguador apropiado. Los geles son empleados
frecuentemente como soportes, los cuales producen un efecto de cribado molecular.
• Cámara electroforética: es el espacio donde se introduce el soporte con las muestras en un
medio amortiguador que mantiene el pH del sistema y que debe encontrarse en contacto
con los electrodos.
• Fuente electroforética (también llamada fuente de poder): es el dispositivo que genera la
corriente eléctrica continua estabilizada. Dependiendo del equipo, pueden proporcionar una
corriente eléctrica de hasta 2000 mA y un voltaje de hasta 300V. La resistencia durante la
electroforesis puede variar, ya que, al calentarse el soporte ésta disminuye; por ello en el
diseño de las fuentes electroforéticas se tiene en cuenta la posibilidad de elegir mantener
constante el voltaje o la intensidad.
71
!
Figura 25. Componentes del sistema de electroforesis
(Creado en biorender.com por: Granados Avalos Estefany)
• Potenciometría
Muchas de las reacciones que se realizan en los sistemas biológicos son reacciones redox,
es decir, donde se transfieren electrones. La oxidación es la pérdida de electrones y la
molécula que los cede se denomina agente reductor; por el contrario, la reducción es la
ganancia de electrones siendo la molécula que los acepta el agente oxidante. La
determinación cuantitativa de la concentración de las moléculas oxidantes y reductoras en
una solución es el objeto de estudio de la potenciometría.
La potenciometría es un método analítico electroquímico basado en la medida de la
diferencia de potencial generado por la transferencia de electrones en una reacción redox en
la cual están involucradas las moléculas a estudiar.
Los pares redox de interés para las Ciencias Biológicas incluyen a menudo la transferencia
del ion hidrógeno (protón). La determinación más precisa del potencial de hidrógeno (pH) se
realiza en un potenciómetro diseñado con un sistema de electrodo de vidrio. Como una
unidad de pH corresponde a 59 milivoltios a 25ºC, el mismo medidor se puede usar con dos
escalas para hacer lecturas en mv o en pH. El electrodo de vidrio consiste en una membrana
de vidrio sensible al pH situada al final de un tubo de vidrio o plástico de paredes más
gruesas. El pH se determina mediante la diferencia de potencial a través de la membrana de
vidrio que separa la solución a la cual se quiere determinar el pH y la solución en el interior
del electrodo de referencia cuya concentración de hidrogeniones se conoce.
72
Los electrodos de referencia permiten mantener un potencial eléctrico constante, entre los
más comunes se encuentran el de calomel y el de plata, que se encuentran inmersos en una
solución de cloruro de potasio (Figura 26).
Figura 26. Partes de un electrodo
(Tomado de: https://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Electrodo_de_vidrio_para_medici%C3%B3n_de_pH.jpg)
La sensibilidad del medidor se puede ajustar para cambios de acuerdo con la temperatura
(botón de control de temperatura). El medidor se calibra antes de usarlo, primero con una
solución reguladora de pH 7; se lava el electrodo con agua destilada o desionizada y se
calibra con una segunda solución reguladora de pH 4 o 10. Luego se determina el pH de la
solución problema.
Es importante seguir las indicaciones del manual del equipo para un mejor funcionamiento y
resultados. En términos generales se debe considerar lo siguiente:
- El potenciómetro debe calibrarse de manera periódica (una vez al día al inicio de la
jornada de laboratorio), con el fin de asegurar la precisión de la lectura.
- El electrodo de vidrio es relativamente resistente a las interferencias por color, turbidez,
etc.; no obstante, la membrana de vidrio se afecta en presencia de grasas u otro
material insoluble. Por ello debe limpiarse de manera cotidiana con agua destilada,
secarlo con un papel que no libere pelusas.
El electrodo siempre debe mantenerse húmedo, guardados en cloruro de potasio (KCl) 4 M o
en solución de pH 4 o 7; nunca en agua destilada.
73
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FACULTAD DE MEDICINA
ANEXO 5.
USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO
Consultar la Figura 27 para identificar las partes del microscopio óptico compuesto.
1. Usar siempre el microscopio sobre una superficie plana y estable.
2. Nunca usar un adaptador entre el cable y la fuente de alimentación.
3. Antes de empezar, asegurarse que tanto los oculares, objetivos y condensador estén
limpios. Si se requiere, limpiar con un paño especial o papel seda en seco (Nota: nunca
limpiar con alcohol u otros solventes).
4. Conectar el cable de alimentación del microscopio a una toma de corriente con conexión
a tierra.
5. Encender el microscopio girando el botón de encendido/apagado que regularmente se
encuentra en la parte inferior/trasera del equipo.
6. Colocar el interruptor de ajuste de iluminación en el nivel más bajo.
7. Usando el botón de enfoque del condensador, subir el condensador hasta el extremo
superior de su desplazamiento.
8. Abrir completamente el diafragma hasta lograr que el campo esté brillante y
uniformemente iluminado.
9. Seleccionar el objetivo 4x o el de menor aumento.
10. Ajustar los tubos oculares a la distancia de los ojos.
11. Colocar la preparación de la muestra en la platina.
12. Subir la platina girando el tornillo macrométrico hasta que observe la preparación lo más
cercano posible al objetivo (corroborar lateralmente que no se toque la preparación).
13. Colocar la muestra de interés en el centro del campo microscópico con ayuda de la perilla
coaxial de la platina.
14. Para mejorar la nitidez, enfocar la muestra con precisión utilizando el tornillo micrométrico
ajustando si se requiere la intensidad de la luz cerrando el diafragma.
15. Girar el revólver y seleccionar el objetivo de 40x.
16. Observar por los oculares y verificar que la imagen permanezca enfocada, de no ser así,
ajustar si es necesario solo con el tornillo micrométrico.
17. Girar el revólver, colocar sobre el cubreobjetos de la preparación una gota de aceite de
inmersión y seleccionar el objetivo 100x.
18. Observar por los oculares y verificar que la imagen permanezca enfocada, de no ser así,
ajustar si es necesario solo con el tornillo micrométrico y aumentar la intensidad de luz.
19. Al término del uso del microscopio apagar la fuente de luz.
20. Bajar la platina y retirar la muestra.
21. Apagar el equipo.
22. Limpiar oculares y objetivos con un paño especial o papel seda en seco. Tener cuidado
especial de que no queden residuos del aceite de inmersión.
23. Colocar el revólver de los objetivos de manera que el 4x sea el que quede en dirección de
la lámpara, bajar platina y cerrar diafragma.
24. Desconectar el equipo y enrollar el cable.
25. Colocar al microscopio la funda contra el polvo para mantenerlo en buenas condiciones
físicas y mecánicas.
74
• Precauciones adicionales:
- Nunca tocar las lentes con los dedos.
- No retirar la preparación con el objetivo de inmersión en posición de observación.
- Cuando el microscopio no se esté utilizando, debe permanecer apagado.
- El microscopio debe estar lejos de la orilla de la mesa de trabajo.
- En caso de derrames accidentales sobre el microscopio, se debe limpiar con una
solución neutra y paño, nunca con cloro, etanol, etc.
Oculares
Ajuste de
dioptrías
Cabezal
Revólver
Brazo
Objetivos
Pinzas/clip
Apertura
Platina
Tornillo macrométrico
Diafragma
Condensador
Tornillo micrométrico
Fuente de luz
Perilla coaxial de
movimiento de platina
Base
Ajuste de
iluminación
Botón de Encendido/
Apagado
Figura 27. Partes del microscopio óptico compuesto
(Modificado de: https://www.microscopio.pro/partes-del-microscopio/)
75
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FACULTAD DE MEDICINA
ANEXO 6.
TOMA DE MUESTRA SANGUÍNEA/VENOPUNCIÓN
Introducción
Uno de los objetivos principales del laboratorio de Bioquímica clínica es dar al médico
información sobre la salud de los pacientes para la selección adecuada del tratamiento. Los
análisis bioquímicos se utilizan en Medicina, tanto si se trata de una enfermedad metabólica
per se (por ejemplo, diabetes) o en aquella en donde los cambios bioquímicos son
consecuencia de otra enfermedad (por ejemplo, insuficiencia renal).
En la actualidad, la mayoría de las determinaciones de metabolitos se realizan en muestras
sanguíneas (sangre total, suero o plasma), debido a que es en este fluido donde se
cuantifican las concentraciones de metabolitos de importancia tales como glucosa, urea,
ácido úrico, colesterol, triglicéridos, lipoproteínas, o incluso enzimas, y así relacionar alguna
alteración de estas concentraciones con una falla en la función renal, hepática, etc.
La venopunción es la técnica por la cual se accede a través de una aguja con características
especiales al torrente sanguíneo.
Si bien no es un procedimiento que el Médico en su momento realizará rutinariamente; es
importante que el estudiante de Medicina esté preparado para la situación si fuese requerido.
Es importante considerar que todas las muestras deben considerarse potencialmente
infecciosas aun cuando proceda de personas aparentemente sanas. Es por ello que la
higiene es crucial en la extracción de sangre.
Los patógenos trasmitidos por la sangre pueden entrar al torrente sanguíneo por medio de
una lesión accidental con un objeto punzante, como una aguja, un bisturí o cualquier otro
elemento que perfore la piel. Los cortes, las abrasiones de la piel e incluso de las
membranas mucosas de la boca, los ojos y la nariz pueden actuar como puerta de entrada.
El médico debe lavarse las manos con agua y jabón entre paciente y paciente y desechar los
guantes en cada vez.
La manera más común de recolección de las muestras de sangre es el empleo de un sistema
de tubo de vacío, llamado Vacutainer® (Figura 28). En estos sistemas, los tubos son de
plástico y contienen una cantidad preestablecida de un aditivo sellado al vacío.
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Aguja de
Vacutainer
Bisel
Adaptador/
Soporte de
Vacutainer
Tubo estéril al
vacío
Aguja dentro
de tapón
Aguja
Eje de rosca
Pestaña/
borde
Manga de goma
sobre aguja
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Sistema
Vacutainer
ensamblado
Figura 28. Componentes de sistema Vacutainer
(Modificado de: https://slideplayer.com/slide/5946176/)
Respecto a la selección de la vena para la venopunción, las venas superficiales de la cara
anterior del antebrazo son las más comunes para la misma. Las tres venas principales que
se utilizan son (Figura 29):
1) vena cefálica, ubicada en la parte superior del antebrazo y del lado del pulgar de la mano;
2) vena basílica, ubicada en la parte inferior del antebrazo y del lado del dedo meñique de la
mano; y
3) vena cubital/cubito mediana, que conecta las venas basílica y cefálica en la fosa
antecubital (flexión del codo). Esta es la vena de primera elección debido a su visibilidad.
!
Figura 29. Venas de selección en la parte interior del brazo para la extracción de sangre
(Tomado de: https://sites.google.com/site/neomedicexpert/venopuncion)
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Material y equipo:
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Adaptador/soporte del sistema Vacutainer
Aguja Vacutainer
Bolsa roja para desechos con sangre
Contenedores para desecho de punzocortantes
Guantes
Ligadura/torniquete de caucho
Torundas de algodón con etanol 70%
Tubos Vacutainer: con anticoagulante EDTA (tapa morada);
roja)
sin anticoagulante (tapa
NOTA: antes de iniciar, asegúrese que tiene todo el material listo. Si no se tiene sistema
Vacutainer puede usarse aguja con jeringa.
Metodología con Sistema Vacutainer
Se trabajará en parejas, cada alumno extraerá sangre de su compañero.
1. El paciente debe de estar de preferencia semi-acostado o sentado cómodamente y con el
brazo descubierto y apoyado en una mesa o soporte.
2. Localizar en el antebrazo una vena palpable, visible y de buen calibre.
3. Una vez localizada la vena para la extracción, se limpia la zona con ayuda de una torunda
con etanol, realizando movimientos circulares/espirales desde el centro hacia afuera. Es
importante que el área se seque al aire antes de efectuar la venopunción, NUNCA se
debe soplar.
4. Colocar la aguja en el adaptador/soporte del sistema Vacutainer, dejando la aguja
protegida para evitar accidentes.
5. Coloque el torniquete con un medio nudo para poder retirarlo fácilmente,
aproximadamente 10 centímetros arriba del lugar de punción (no efectue demasiada
presión ya que podría retener la circulación arterial).
6. Pida al paciente que abra y cierre el puño varias veces para obtener mayor distensión de
las venas (algunas veces las venas no se ven con claridad pero se palpan).
7. Quitar el protector de la aguja y verificar que el bisel se encuentre hacia arriba.
8. Fijar la vena sosteniendo el brazo del paciente con la mano no dominante, mientras se
estiran y comprimen con el pulgar los tejidos blandos justo debajo del sitio elegido para
puncionar.
9. Cuando la vena es prominente se punciona en forma directa con aguja colocada
horizontalmente y dirigida en paralelo a la vena, la aguja se debe introducir con suavidad
pero con rapidez.
10. Sujetar firmemente el brazo y el adaptador/soporte del sistema Vacutainer para evitar que
se salga .
11. Con la mano dominante se introduce el tubo al vacío para el llenado. Al realizar el cambio
de tubo, si es el caso, se debe tener cuidado de seguir manteniendo firme el brazo y
soporte.
12. Quitamos el torniquete. A medida que la sangra vaya ingresando al tubo, girar el tubo
para que la sangre entre en contacto con el anticoagulante.
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13. Al terminar la extracción de sangre, pida al paciente que abra el puño coloque una
torunda con etanol en el sitio de la punción (no frotar) y en seguida retire la aguja.
14. El paciente debe hacer poca presión con la torunda en el sitio de la punción mantener el
brazo flexionado durante unos min. para evitar hematomas.
15. Si la determinación que se va efectuar exige sangre completa o plasma, la muestra se
coloca con un tubo con anticoagulante y se mezcla por inversión, con suavidad varias
veces (6-8 veces).
16. Si se desea obtener suero la sangre se coloca en un tubo sin anticoagulante (tapa roja)
de preferencia a 37° C para que el coágulo se forme más rápido.
17. La aguja se desecha en el contenedor para punzocortantes. Las medidas de desecho
deben realizarse según la NORMA Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002,
Protección ambiental - Salud ambiental - Residuos peligrosos biológico-infecciosos Clasificación y especificaciones de manejo.
Para un mejor seguimiento de la metodología, consultar Figura 30.
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A
B
C
D
E
F
!
Figura 30. Técnica para la extracción de sangre venosa. A) Colocación del torniquete. B) Limpieza del área
antes de la venopunción. C) Venopunción con sistema Vacutainer. D) Llenado de tubo Vacutainer. E) Retiro de
la aguja. F) Depósito de muestra en tubos Vacutainer
(Modificado de: Sánchez Enríquez y col., 2014)
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Julio 2022
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