Traducido del inglés al español - www.onlinedoctranslator.com 11 Productos para el cuidado de la salud Los antibióticos son probablemente el grupo más importante myces peucetiusyS. caepitosus, respectivamente, tienen papeles de compuestos sintetizados por microorganismos industriales. como agentes antitumorales; y otros antibióticos se utilizan para No se producen en la mayor cantidad, ni son los más valiosos controlar las enfermedades microbianas de las plantas de cultivo, o económicamente. Sin embargo, durante los últimos 60 años su como herramientas en la investigación de bioquímica y biología influencia en la mejora de la salud humana ha sido inmensa. Los molecular. También se añaden varios antibióticos a la alimentación otros productos importantes para el cuidado de la salud animal como promotores del crecimiento. Sin embargo, las derivados de fermentaciones y/o biotransformaciones preocupaciones sobre el desarrollo de resistencia han significado microbianas son alcaloides, esteroides, toxinas y vacunas; junto que algunos antibióticos, utilizados o destinados para uso humano, con vitaminas (ver Capítulo 13), ciertas enzimas (ver Capítulo 9) pueden retirarse del uso en la alimentación animal. Por ejemplo, la y preparaciones de células microbianas viables utilizadas como Comisión de la UE votó para prohibir la aplicación de bacitracina, probióticos (ver Capítulo 12). Además, las técnicas de ingeniería espiromicina, tilomicina y virginiamicina como promotores del genética han hecho posible que los microorganismos crecimiento después de enero de 1999. produzcan una amplia variedad de proteínas y péptidos de mamíferos que tienen diversas propiedades terapéuticas. Entre los de considerable importancia médica y con mercados b-Lactámicos establecidos se incluyen la insulina, los interferones, la hormona Más de 100b-los lactámicos, en su mayoría penicilinas y del crecimiento humano y los anticuerpos monoclonales (véase cefalosporinas, han sido aprobados para uso humano y el capítulo 17). Aparte de estos agentes terapéuticos, que curan representan más de la mitad de los antibióticos producidos en o reducen la incidencia de enfermedades, muchos productos de todo el mundo. Este grupo es especialmente útil por su amplio diagnóstico también se derivan de microorganismos. Estos se margen de seguridad. Se dirigen específicamente a la síntesis utilizan ampliamente para probar la presencia de diversos de peptidoglicano, un componente vital de la pared celular estados de salud y enfermedades. bacteriana, que no está presente en los organismos eucariotas, proporcionando así un alto nivel de selectividad. Principalmente antibióticos inhiben la reacción de transpeptidación de entrecruzamiento, lo que da como resultado la formación de peptidoglucano La mayoría de los antibióticos son metabolitos secundarios incompleto, lo que debilita gravemente la estructura de la pared producidos por hongos filamentosos y bacterias, celular bacteriana (consulte el Capítulo 2, Antibióticos, y el particularmente los actinomicetos. Se han aislado más de 4 000 Capítulo 3, Síntesis de peptidoglucano). antibióticos de varios organismos, pero solo unos 50 se usan con regularidad en la quimioterapia antimicrobiana (ver Capítulo 2). Los antibióticos más conocidos y probablemente los PENICILINA más importantes desde el punto de vista médico son losb La penicilina fue descubierta por Fleming en 1928 tras su -lactámicos, penicilinas y cefalosporinas; junto con famosa observación de una zona inhibitoria que rodeaba aminoglucósidos, como la estreptomicina, y el de amplio un contaminante fúngico,Penicillium notatum, en un plato espectrotetraciclinas (Cuadro 11.1). El resto no cumple ciertos deestafilococo aureus. A fines de la década de 1930, Florey, criterios importantes, en particular su falta de selectividad, su Chain y Heatley caracterizaron el compuesto inhibidor toxicidad para humanos o animales, o sus altos costos de responsable, la penicilina, y desarrollaron un protocolo que producción. Algunos antibióticos tienen otras aplicaciones permitió producirlo en forma pura. El descubrimiento de la además de la quimioterapia antimicrobiana. Por ejemplo, la penicilina y su posterior caracterización y purificación actinomicina y la mitomicina, producidas porEstrepto- finalmente condujo a importantes avances en 165 Tabla 11.1Ejemplos de antibióticos importantes Antibiótico organismo productor Actividad contra Sitio o modo de acción Penicillium chrysogenum bacterias grampositivas Síntesis de pared b-Lactámicos penicilinas naturales Penicilina G (bencilpenicilina) Penicilina V (fenoximetilpenicilina) Penicilinas semisintéticas Penicilinas de espectro mejorado Algunos bacilos Gram-negativos aminopenicilinas ampicilina amoxicilina hetacilina Antiestafilococo Penicilinas resistentes a la penicilinasa meticilina cloxacilina dicloxacilina nafcilina oxacilina antipseudomonas penicilinas de espectro extendido Carboxipenicilinas carbenicilina ticarcilina ureidopenicilinas Azlocilina Mezlocilina piperacilina cefalosporinas monobactámicos cefalosporio acremonio cromobacteria violaceo Amplio espectro Síntesis de pared Bacterias Gram-negativo Síntesis de pared Bacillus subtilis Paenibacillus polymyxa bacterias grampositivas Síntesis de pared Bacterias Gram-negativo Membrana celular Saccharapolyopora eritrea(antes bacterias grampositivas Síntesis de proteínas bacterias grampositivas Síntesis de proteínas antibióticos polipeptídicos Bacitracina Polimixina B macrólidos Eritromicina tilosina Streptomyces erythraeus) Streptomyces fradiae Aminoglicidos Micromonospora purpúrea Streptomyces fradiae Amplio espectro Síntesis de proteínas Neomicina Amplio espectro Síntesis de proteínas Estreptomicina Streptomyces griseus Bacterias Gram-negativo Síntesis de proteínas tetraciclinas Streptomycesespecies Amplio espectro Síntesis de proteínas vancomicina Streptomyces orientalis bacterias grampositivas peptidoglicano rifamicinas Amycolatopsis mediterranei (antesStreptomyces Tuberculosis síntesis de ARN Streptomyces nodosus Streptomyces noursei hongos Membrana celular hongos Membrana celular Penicillium griseofulvum Hongos dermatofitos microtúbulos gentamicina mediterraneo) antibióticos antimicóticos Polienos Anfotericina B nistatina griseofulvina Productos para el cuidado de la salud tanto en medicina como en tecnología de fermentación. La velocidad de síntesis de penicilina y la regulación del metabolismo estos desarrollos estuvo muy influenciada por la urgente necesidad de secundario en cepas superproductoras. suministrar penicilina durante la Segunda Guerra Mundial. La penicilina exhibe las propiedades de un metabolito secundario 167 La estructura básica de las penicilinas esÁcido 6aminopenicilánico (6-APA), compuesto por unanillo de típico y se forma al final o cerca del final del crecimiento exponencial. tiazolidina fusionado con unb-anillo lactámicocuya posición 6- Su formación depende de la composición del medio y es posible la amino lleva una variedad deacilosustituyentes (Fig. 2.8). Esteb- sobreproducción dramática. Sin embargo,P. notatum, el organismo estructura de lactama-tiazolidina, sintetizada a partir deL-a- que se descubrió originalmente que producía el antibiótico, generó aminoadipato,L-cistinayL-valina, es común a las penicilinas, poco más de 1 mg/l a partir de los cultivos de superficie utilizados cefalosporinas y cefamicinas. En ausencia de precursores de inicialmente para la producción de penicilina. Se logró un aumento cadena lateral añadidos al medio de fermentación deP. notatum de 20 a 25 veces en el rendimiento cuando se incorporó licor oP. chrysogenum, se obtiene una mezcla de penicilinas macerado de maíz en el medio de fermentación (consulte el Capítulo naturales a partir de filtrados de cultivo, en particular la 5, Materias primas de fermentación). Este subproducto del penicilina G (bencil penicilina) y la penicilina V más resistente a procesamiento del maíz contiene varias fuentes de nitrógeno, junto los ácidos (fenoximetil penicilina). Estas penicilinas son más con factores de crecimiento y precursores de cadena lateral, y sigue activas contra las bacterias Grampositivas. Sin embargo, un siendo un ingrediente principal de la mayoría de los medios de papel ampliado para las penicilinas provino del descubrimiento producción de penicilina. Se obtuvieron rendimientos aún mayores de que se pueden formar diferentes penicilinas biosintéticas de penicilina de una especie estrechamente relacionada,Penicillium mediante la adición de precursores de cadena lateral al medio chrysogenum, que originalmente se aisló de un melón cantalupo de fermentación y que las penicilinas naturales se pueden mohoso. Se lograron mayores aumentos en el rendimiento cuando modificar químicamente para producir compuestos con la producción pasó a la fermentación sumergida. Los requisitos de características mejoradas. La mayoría de las penicilinas ahora penicilina durante la guerra estimularon el rápido desarrollo de un son semisintéticas (ver más abajo), producidas por la sistema de cultivo sumergido a gran escala utilizando reactores de modificación química de las penicilinas naturales, obtenidas por tanque agitado (STR). Cada recipiente se agitó continuamente a fermentación usando cepas deP. chrysogenum.La modificación través de impulsores de turbina accionados por eje vertical y se se consigue eliminando su grupo acilo natural, dejando 6-APA, incorporó un rociado de aire. Estos desarrollos tecnológicos tuvieron al que se pueden añadir otros grupos acilo para conferir nuevas un gran impacto en el avance de todo el campo de la tecnología de propiedades. Estas penicilinas semisintéticas, como la fermentación. meticilina, la carbenicilina y la ampicilina (ver Tabla 11.1), muestran varias mejoras, incluida la resistencia a los ácidos Desde la década de 1940, el rendimiento de la penicilina y la estomacales para permitir la administración oral, un grado de productividad de la fermentación se han mejorado enormemente resistencia a la penicilinasa y un rango extendido de actividad mediante una extensa mutación y selección de cepas productoras. El contra algunas bacterias Gram-negativas. enfoque tradicional para mejorar los rendimientos de la penicilina implicaba la mutación aleatoria y la selección de cepas de mayor producción. Los mutantes resultantes se cultivaron en medio líquido y los filtrados de cultivo se ensayaron para penicilina. Esto fue lento y Producción comercial de penicilina(Figura 11.1) laborioso ya que se tuvo que probar un gran número de cepas. Sin La producción de penicilina generalmente se realiza a través de embargo, tales métodos fueron la clave para el aumento un proceso de lote alimentado que se lleva a cabo espectacular de los rendimientos logrados desde el descubrimiento asépticamente en fermentadores de tanque agitado de 40 000 a de la penicilina. Las fermentaciones de penicilina ahora producen 200 000 l de capacidad, aunque a veces se usan sistemas de rendimientos superiores a 50 g/L, un aumento de 50000 veces desde transporte por aire. La fermentación implica una fase inicial de los niveles producidos por primera vez por el aislado original de crecimiento vegetativo seguida de la fase de producción de Fleming. antibióticos. Durante todo el proceso, el nivel de oxígeno es La contribución de los métodos clásicos de mejora de cepas muy importante y debe mantenerse entre 25 y 60 mmol/L/h. Sin ha superado hasta ahora todos los demás enfoques, incluidas embargo, esto no es sencillo, porque la tasa de transferencia de las técnicas de manipulación genética disponibles más oxígeno se ve afectada por la viscosidad, que aumenta a medida recientemente. Estos últimos han contribuido más a nuestra que avanza la fermentación. Estos procesos se mantienen a 25– comprensión de los complejos mecanismos de biosíntesis de la 27°C y pH 6,5–7,7, dependiendo las condiciones específicas de la penicilina, en particular la disposición genética de cepas P. chrysogenumcepa utilizada. mejoradas, la identificación de cuellos de botella en Se han adoptado varias fuentes de carbono para la peni- 168 Capítulo 11 Medio de producción Desarrollo de inóculo El desarrollo del inóculo generalmente se inicia agregando esporas liofilizadas a un pequeño fermentador a una Fermentación de producción concentración de 5¥103esporas/ml. A continuación, el micelio (un proceso de alimentación por lotes) fúngico se puede cultivar en una o dos etapas más hasta que haya suficiente para inocular el fermentador de producción. Clarificación del caldo Inicialmente hay una fase de crecimiento vegetativo dedicada al por ejemplo, filtración rotativa al vacío micelio lavado Extracción con solvente de caldo libre de células por ejemplo, acetato de amilo desarrollo de biomasa, que se duplica cada 6h. Esta alta tasa de crecimiento se mantiene durante los primeros 2 días. Para asegurar un rendimiento óptimo de penicilina en la siguiente fase de producción, el micelio debe desarrollarse como Extracto de purificación por ejemplo, tratamiento y filtración de carbón activado Cristalización de antibiótico por ejemplo, adición de acetato de sodio gránulos sueltos, en lugar de formas compactas. Durante la siguiente fase de producción, la fuente de carbono se alimenta a un ritmo bajo y aumenta la producción de penicilina. Esto continúa durante otros 6 a 8 días, siempre que se mantengan los sustratos adecuados. Recuperación de cristales de penicilina por ejemplo, filtración Lavado de cristales por ejemplo, lavado y filtración con etanol anhidro Secado de cristales por ejemplo, secador de bandeja al vacío Tratamiento con penicilina acilasa y adición de una 'nueva' cadena lateral penicilina natural Penicilina semisintética La penicilina se excreta en el medio y se recupera al final de la fermentación. Se puede realizar la extracción de caldo completo, pero puede dar lugar a problemas de procesamiento aguas abajo, ya que se filtran materiales adicionales del micelio. Por lo general, la recuperación de la penicilina sigue a la eliminación del micelio utilizando filtros de vacío rotatorios, cuya eficacia puede verse afectada por la composición del medio de cultivo, en particular sus componentes proteicos. Luego, el micelio recuperado se lava para eliminar la penicilina residual, antes de su uso como alimento para animales o fertilizante. La recuperación de antibióticos se realiza a menudo mediante extracción con Figura 11.1Producción de penicilina. disolvente del medio libre de células, lo que da rendimientos de hasta el 90 %. Esto implica reducir el pH del medio filtrado a 2,0–2,5 mediante la adición de ácido sulfúrico o fosfórico, seguido de una extracción rápida continua en dos producción de cilina, incluyendo glucosa, lactosa, sacarosa, etapas a contracorriente a 0–3 °C utilizando acetato de amilo, acetato de butilo o etanol y aceites vegetales. Alrededor del 65 % de la fuente de metilisobutilcetona. La baja temperatura es necesaria para reducir el daño a la carbono se metaboliza para el mantenimiento celular, el 25 % penicilina debido al bajo pH. Como alternativa, se puede utilizar la extracción de para el crecimiento y el 10 % para la producción de penicilina. pares iónicos a un pH de 5 a 7, en cuyo rango la penicilina es estable. Todos los En el pasado, se usaba una mezcla de glucosa y lactosa, la pigmentos y trazas de impurezas se eliminan mediante el tratamiento con carbón primera producía un buen crecimiento, pero poca penicilina, activado. Luego, la penicilina se recupera del solvente mediante la adición de mientras que la segunda tenía el efecto contrario. El modo de acetato de sodio o potasio. Esto reduce la solubilidad de la penicilina y precipita 'alimentación' de una fuente de carbono en particular es de vital como una sal de sodio o potasio. Los cristales de penicilina resultantes se importancia, ya que puede influir en la producción de este separan mediante filtración rotatoria al vacío. El solvente se recupera del licor metabolito secundario (consulte el Capítulo 3, Metabolismo separado y de cualquier otro material utilizado, como el carbón vegetal, que es secundario). El licor de maceración de maíz todavía se usa como muy importante en términos de la economía general del proceso. Los cristales de fuente de nitrógeno, nutrientes adicionales y precursores de penicilina se mezclan con un solvente volátil, generalmente etanol anhidro, cadena lateral. Su naturaleza ácida crea un requerimiento de butanol o isopropanol, para eliminar más impurezas. Los cristales se recogen por carbonato de calcio (1%, p/v) y un tampón de fosfato para filtración y se secan al aire. En esta etapa, la penicilina tiene una pureza del 99,5 neutralizar el medio, optimizando así su pH para la producción %. Este producto puede ser más Los cristales se recogen por filtración y se secan de penicilina. Amoníaco, También se pueden añadir sales al aire. En esta etapa, la penicilina tiene una pureza del 99,5 %. Este producto minerales y precursores de cadena lateral específicos, por puede ser más Los cristales se recogen por filtración y se secan al aire. En esta ejemplo, ácido fenilacético o ácido fenoxiacético. Sin embargo, etapa, la penicilina tiene una pureza del 99,5 %. Este producto puede ser más como algunos precursores son tóxicos, deben administrarse continuamente en concentraciones no inhibitorias. Productos para el cuidado de la salud 169 procesado para formar un producto de calidad farmacéutica o ejemplos es el desarrollo de cepas multirresistentes deS. se utiliza en la producción de penicilinas semisintéticas. aureus. Ciertas cepas, particularmente resistentes a la meticilinaS. aureus(MRSA) causan infecciones nosocomiales (adquiridas en el hospital) graves. Son resistentes a prácticamente todos los antibióticos utilizados en la quimioterapia antimicrobiana, incluida la meticilina, las cefalosporinas y otrosb-lactámicos, el macrólido eritromicina y los antibióticos aminoglucósidos estreptomicina y neomicina. El único compuesto que se puede usar de manera efectiva contra estos estafilococos es un antibiótico más antiguo y potencialmente más tóxico, la vancomicina. Incluso se ha detectado resistencia a este antibiótico en algunas cepas. Producción de penicilinas y cefalosporinas semisintéticas Como se mencionó anteriormente, el objetivo de la producción de penicilina semisintética es generar compuestos con propiedades mejoradas, por ejemplo, estabilidad ácida, resistencia a la degradación enzimática, espectro de actividad más amplio, etc. (Tabla 11.1). Implica la eliminación de la cadena lateral de la penicilina base para formar 6-APA. Esto se logra mediante el paso a través de una columna de inmovilizados penicilina acilasa, generalmente obtenido deEscherichia coli,a pH neutro. La penicilina G, por ejemplo, se convierte en 6-APA y Muchos de los genes de resistencia a los antibióticos de los estafilococos se transportan en plásmidos que pueden ácido fenilacético. Luego, el 6-APA se acila químicamente con intercambiarse con especies deBaciloyEstreptococo, una cadena lateral apropiada para producir una penicilina proporcionando los medios para adquirir genes y semisintética. combinaciones de genes adicionales. Algunos genes de Los rendimientos de las cefalosporinas de las fermentaciones directas son mucho más bajos que los de las penicilinas. En resistencia se transportan en transposones, segmentos de ADN que pueden existir en el cromosoma o dentro de los plásmidos. consecuencia, como el 6-APA también puede servir como precursor de las cefalosporinas, a menudo se utiliza como material de partida para su producción semisintética. Una penicilina natural base se Alcaloides del cornezuelo de centeno convierte en 6-APA, como se describe anteriormente, seguido de su Los alcaloides son un grupo diverso de pequeños compuestos conversión en el precursor preferido, ácido 7-amino orgánicos que contienen nitrógeno producidos por ciertas deacetoxicefalospórico (7-ADCA), mediante expansión del anillo. plantas y microorganismos. Muchos son tóxicos, pero algunos Entonces se puede unir fácilmente una cadena lateral adecuada. tienen varias propiedades terapéuticas. Especies del hongo filamentosoClaviceps, que son patógenos de las gramíneas, La aparición de resistencia a los antibióticos. producen una variedad de alcaloides (Cuadro 11.2). Algunos de los más conocidos son los alcaloides del cornezuelo. Estos El éxito de la penicilina a mediados de la década de 1940 condujo a la compuestos se producen dentro de los esclerocios (cuerpos búsqueda de otros microorganismos productores de antibióticos. fructíferos) deClaviceps purpúreaque se desarrollan Uno de los primeros éxitos más notables fue el descubrimiento de la naturalmente cuando este organismo infecta granos de estreptomicina a partir de un actinomiceto del suelo,Streptomyces cereales en desarrollo. Los granos infectados se vuelven negros griseus. Posteriormente, los actinomicetos, especialmente y se denominan cornezuelos. Estas estructuras contienen Streptomycesespecies, han producido la mayoría de los antibióticos alcaloides de indol, derivados de un sistema de anillos utilizados en la medicina clínica en la actualidad (ver Tabla 11.1). Sin tetracíclicos de ergolina (fig. 11.2), que se clasifican en dos embargo, el creciente desarrollo de cepas bacterianas que presentan grupos. Los miembros del primer grupo se basan en clavina y resistencia a los antibióticos exige la búsqueda continua de nuevos no contienen ningún componente peptídico. Los alcaloides a antibióticos y agentes alternativos para el tratamiento de base de clavina también son producidos por otros grupos de enfermedades microbianas. hongos, incluidas especies deAspergiloy Penicillium.Algunos La resistencia a los antibióticos no es un fenómeno reciente, poseen actividad antibiótica y antitumoral, pero pocos se se reconoció poco después de que se introdujeran las producen comercialmente. El segundo grupo, a base de ácido penicilinas naturales. El uso de antibióticos crea una presión de lisérgico (LSA) y que contiene un tripéptido o un amino alcohol, selección que favorece el crecimiento de mutantes resistentes a se encuentra únicamente en Clavicepsespecies. Los ejemplos los antibióticos, lo que es promovido por el mal uso y abuso de incluyen ergometrina, ergocristina, ergosina y ergotamina. La estos fármacos. En los últimos 10 años la situación se ha vuelto ergotamina, por ejemplo, es un análogo estructural de la alarmante, debido a la aparición de cepas bacterianas serotonina (un neurotransmisor) y se forma a partir de LSA por patógenas que muestran resistencia múltiple a una amplia la acción de una péptido sintetasa que agrega alanina, prolina y gama de antibióticos. Uno de los mas importantes fenilalanina. 170 Capítulo 11 Clase de compuesto metabolito organismo productor alcaloides Agroclavina* ergometrina Claviceps fusiformis actividad terapéutica `` `` Claviceps paspalí Claviceps purpúrea ácido lisérgico Ergocristina Ergosina Ergotamina `` `` `` `` acremonio(cefalosporio) especies Fusidium coccineum cefalosporinas antibióticos Tabla 11.2Metabolitos fúngicos con fusidano penicilinas Penicillium griseofulvum Penicilliumespecies agente antitumoral Lentinan Lentino edodes agente antiviral funiculosina Penicillium funiculosum inhibidor de colesterol ácido zaragozico Sporomiella intermedia Enzimas lactasa Kluyveromycesespecies hipotenso Ácido fusárico fusariumespecies inmunorreguladores ciclosporina Cilindrocarpon lucidum griseofulvina Tolypocladium inflatum Trichoderma polisporum Aspergillus fumigatus Gliotoxina * Grupo 1, todos los demás alcaloides enumerados pertenecen al grupo 2. 8 ciclo del ácido (TCA) y un carbohidrato, como el citrato y la 7 9 12 13 11 A 14 D 10 NUEVA HAMPSHIRE 5 C dieciséis 15 hn B 1 6 4 3 2 Figura 11.2La estructura de la ergolina. sacarosa, dependiendo la combinación específica del alcaloide objetivo. En etapas posteriores, el ácido orgánico estimula el cambio metabólico necesario del ciclo TCA al ciclo del glioxilato. La producción de alcaloides, como la de muchos metabolitos secundarios, exhibe regulación de fosfato. La síntesis se retrasa hasta que se ha utilizado el fosfato medio durante la trofofase y el cultivo entra en la idiofase. Sin embargo, la inhibición de fosfato se puede superar mediante la adición de triptófano o un análogo de triptófano, que actúan como inductores y precursores. Estos alcaloides a base de LSA tienen funciones médicas como analgésicos en la terapia de la migraña, como alucinógenos y para tratar problemas de circulación. Otros tienen usos particulares en Biotransformaciones de esteroides obstetricia, para inducir la contracción del músculo liso del útero El uso de microorganismos en la biotransformación de durante el trabajo de parto y después del parto. compuestos ha sido particularmente exitoso en la fabricación Anteriormente, los alcaloides se extraían de los cornezuelos que de esteroides terapéuticos que se usan para el tratamiento de se desarrollaban en cultivos de cereales infectados, generalmente alergias, inflamaciones, enfermedades de la piel y como centeno, o mediante síntesis química. La mayoría ahora se producen anticonceptivos orales (Tabla 11.3). Inicialmente, se preparaban por fermentación deClaviceps fusiformis,C.paspalioC. purpúreaen por extracción de tejidos animales o mediante síntesis química cultivo celular de superficie, sumergido o inmovilizado. El inóculo compleja, ambas extremadamente costosas. Muchos esteroides para el fermentador de producción se puede desarrollar a partir de ahora se fabrican mediante una combinación de pasos de micelio o conidiosporas. El medio de producción contiene un ácido transformación química y microbiana. Estos procesos emplean orgánico del tricarboxílico esteroles relativamente baratos como