CONTEO DE LEVADURAS CON CAMARA DE NEUBAUER YEAST COUNTING WITH NEUBAUER CHAMBER Santiago Díaz Vides Resumen En el presente informe, se realizó la práctica de conteo de levaduras en la cámara de Neubauer con el fin de que los estudiantes adquieran habilidades en microscopia básica, las cuales sean capaces de aplicar en futuras prácticas. La metodología que se aplicó consistió en la dilución de levaduras adquiridas comercialmente, para posteriormente realizar el montaje de la solución en la cámara de Neubauer y su observación en el microscopio. Introducción El recuento en cámara de Neubauer es una técnica utilizada en medicina y biología para conocer el número de células presentes en una muestra. Actualmente esta técnica es utilizada en menor medida con respecto a otras técnicas de conteo de células que son más precisas y exactas, como la es la turbidimetría, la citometría, el cálculo de la biomasa, entre otras. La cámara de Neubauer consiste en una placa de cuarzo gruesa con forma de portaobjetos, de aproximadamente 30x70 mm y 4 mm de grosor. En una cámara simple, la parte central es donde se realiza el conteo de células y esta posee grabada una retícula cuadrangular, esta retícula mide 3 mm x 3 mm de lado, y se subdivide en 9 cuadros de 1 mm de lado cada uno. El cuadrado central es el destinado al recuento de hematíes y plaquetas. Se divide en 25 cuadrados medianos de 0,2 mm de lado y cada uno de estos cuadros se subdivide a su vez en 16 cuadrados pequeños. Esto quiere decir que el cuadrado central está compuesto por 400 cuadrados más pequeños. El cubreobjeto es un cuadrado de cuarzo de aproximadamente 22 mm x 22 mm. Al momento de realizar el conteo, se debe ubicar la cámara en el centro de la placa, de tal manera que cubra la parte central de la cámara, y así se crea un espacio de 0,1 mm entre la cámara y el cubreobjeto. Dependiendo del tipo de muestra a medir, se ha de habrá de preparar una muestra con una concentración apta para su recuento. Típicamente, el rango de concentraciones que permite contar el hematocitómetro está entre 250.000 células y 2,5 millones de células por ml. Por debajo de 250.000 células / ml (2,5 * 105) la cantidad de células contadas no es suficiente para poder dar una estimación lo suficientemente fiable de la concentración celular y por encima de 2,5 millones (2,5 * 106) la probabilidad de cometer errores de conteo crece demasiado, y también el tiempo y esfuerzo necesario para realizar un recuento con fiabilidad. Por encima de esta concentración es conveniente diluir la muestra para acercar la concentración al rango óptimo. Metodología Se realiza una solución madre con la levadura, y luego se toman 10 µL y se diluyen en 1ml, para obtener una solución de 10-2. Se toman 10 µL de la mezcla preparada anteriormente con la micropipeta, se coloca un cubreobjetos sobre la cámara de Neubauer, y se coloca en posición horizontal sobre la mesa, en un lugar donde sea cómodo pipetear. Se saca la punta de la pipeta de la muestra, y siempre manteniéndola en posición vertical se lleva hasta la cámara de Neubauer. Se coloca la punta de la pipeta en el borde del cubreobjetos, en el extremo de la cámara de Neubauer. Se trata de dejar que el líquido penetre entre la cámara y el cubreobjetos desde el lateral, por capilaridad. Se suelta el pistón suavemente mientras se supervisa que el líquido está entrando correctamente y de forma uniforme en la cámara. En caso de que aparezcan burbujas, el cubreobjetos se haya movido o algo no haya salido bien, repetir la operación. Una vez cargada la cámara de Neubauer para el recuento celular, se lleva al microscopio donde se colocó la cámara de Neubauer en la bandeja del mismo. Buscar el primer cuadro donde vaya a realizarse el recuento. Para este informe se contaron 5 cuadros grandes de una cámara de Neubauer de 0,1 mm de profundidad. Realizar el recuento celular por cuadros seleccionados previamente y anotar en una hoja de resultados la cantidad de células contadas en el primer cuadro. Repetir el procedimiento con el numero de cuadros seleccionados, en este caso 5 cuadros. Mientras mayor sea el número de cuadros a contabilizar, mayor será la precisión de la medida. Posterior al conteo de células se debe aplicar la formula del calculo para la concentración celular la cual está definida a continuación por la ecuación 1: 𝑪𝒆𝒍 # 𝒄𝒆𝒍 𝒙 𝑭𝑫 = 𝒎𝒍 # 𝒄𝒖𝒂𝒅𝒓𝒐𝒔 ∗ 𝑽 Ecuación 1. Cel/ml = Concentración celular en un mililitro, # cel = Numero de células, FD = Factor de dilución, # cuadros = Numero de cuadros, V = Volumen de la cámara El número de células es la suma de todas las células contadas en todos los cuadros. El volumen es el volumen total de todos los cuadros donde hemos hecho el recuento. Como el volumen de 1 cuadro grande es: 0,1 cm x 0,1 cm = 0,01 cm2 de superficie 0,01 cm2 * 0,1 mm (profundidad) = 0,01 cm2 * 0,01 cm = 0,0001 cm3 = 0,0001 ml Resultados Anteriormente se dijo que contaron 5 cuadros, sin embargo, no se especificaron, estos cuadros fueron los cuadros de las esquinas y el cuadro central, como se muestra en la figura 1. Figura 1. La observación y conteo de levaduras bajo el microscopio óptico se vio de la siguiente manera: En el cuadrado superior izquierdo se contaron 25 levaduras, en el derecho se contaron 19, en el extremo inferior izquierdo el conteo de células fue de 22 levaduras y en derecho del mismo lado fue de 27 levaduras y finalmente el cuadrado central tuvo un total de 44 levaduras. Una vez hecho el conteo de células, se procede a reportar la concentración de células por mililitro, para ello se empleó la Ecuación 1, y se reemplazaron las variables por los respectivos valores que se tienen, de tal manera que: # cel, son las células que se contaron anteriormente, pero deben calcularse individualmente por cuadrante. FD, es el factor de dilución, en este caso, la muestra se diluyó hasta 10 -2 por lo tanto, el factor de dilución es el inverso, es decir, 100. # cuadros, esto se refiere a los cuadros en los cuales se realizó el conteo, como se realizo en el cuadro central, este está compuesto de 25 cuadrados grandes y 16 cuadrados más pequeños, por lo tanto, el área total seria de 25x16=400 cuadros. V, es el volumen de la cubeta es de 0,0001 ml debido a que cada el área es de 0,01 mm2, multiplicado por el espacio que hay entra el cubreobjeto y la placa que es de 0,1 mm. Por lo tanto, al reemplazar quedaría de la siguiente manera: 𝑪𝒆𝒍 𝟐𝟓 𝒄𝒆𝒍𝒖𝒍𝒂𝒔 ∗ 𝒄𝒖𝒂𝒅𝒓𝒐 𝒙 𝟏𝟎𝟎 = 𝒎𝒍 𝟒𝟎𝟎 𝒄𝒖𝒂𝒅𝒓𝒐𝒔 ∗ 𝟎, 𝟎𝟎𝟎𝟏 𝒎𝒍 = 6,25x104 cel/ml 𝑪𝒆𝒍 𝟏𝟗 𝒄𝒆𝒍𝒖𝒍𝒂𝒔 ∗ 𝒄𝒖𝒂𝒅𝒓𝒐 𝒙 𝟏𝟎𝟎 = 𝒎𝒍 𝟒𝟎𝟎 𝒄𝒖𝒂𝒅𝒓𝒐𝒔 ∗ 𝟎, 𝟎𝟎𝟎𝟏 𝒎𝒍 = 4,75x104 cel/ml 𝑪𝒆𝒍 𝟒𝟒 𝒄𝒆𝒍𝒖𝒍𝒂𝒔 ∗ 𝒄𝒖𝒂𝒅𝒓𝒐 𝒙 𝟏𝟎𝟎 = 𝒎𝒍 𝟒𝟎𝟎 𝒄𝒖𝒂𝒅𝒓𝒐𝒔 ∗ 𝟎, 𝟎𝟎𝟎𝟏 𝒎𝒍 = 1,1x105 cel/ml 𝑪𝒆𝒍 𝟐𝟐 𝒄𝒆𝒍𝒖𝒍𝒂𝒔 ∗ 𝒄𝒖𝒂𝒅𝒓𝒐 𝒙 𝟏𝟎𝟎 = 𝒎𝒍 𝟒𝟎𝟎 𝒄𝒖𝒂𝒅𝒓𝒐𝒔 ∗ 𝟎, 𝟎𝟎𝟎𝟏 𝒎𝒍 = 5,5x104 cel/ml 𝑪𝒆𝒍 𝟐𝟕 𝒄𝒆𝒍𝒖𝒍𝒂𝒔 ∗ 𝒄𝒖𝒂𝒅𝒓𝒐 𝒙 𝟏𝟎𝟎 = 𝒎𝒍 𝟒𝟎𝟎 𝒄𝒖𝒂𝒅𝒓𝒐𝒔 ∗ 𝟎, 𝟎𝟎𝟎𝟏 𝒎𝒍 = 6,75x104 cel/ml Finalmente, para obtener la concentración total de células levaduriformes, se realiza una sumatoria de totas las concentraciones cel/ml: ∑(cel/ml) = (6,25x104 + 4,75x104 + 1,1x105 + 5,5x104 + 6,75x104) cel/ml ∑(cel/ml) = 3,42x105 cel/ml Análisis de resultados El análisis con respecto al resultado final, el cual se compone de la sumatoria de las concentraciones por cuadrante, es una medición precisa si se habla del intervalo de medición con respecto a la cámara de Neubauer, debido a que para células sanguíneas como los glóbulos rojos, la cámara está diseñada para un recuento de 250000 y 2500000 células, por lo tanto 342000 células, se encuentra dentro de ese rango, cercano al extremo inferior del intervalo, de lo cual se puede afirmar que la concentración celular es menor al promedio de células contables, el cual es de aproximadamente 1,375x10 106 células por mililitro. Sin embargo, la técnica de recuento en cámara de Neubauer tiene un intervalo sesgado que es el que esta comprendido por los valores que se anunciaron previamente, por lo tanto si hay mayor o menor cantidad se incurriría en un error de estimación, por lo tanto esta técnica debe ser empleada para el conteo de esporas en fluidos humanos (en medicina) pero también se puede aplicar para el campo alimentario y agropecuario. En caso de tener en poder un equipo con mayor poder de precisión y exactitud como el espectrofotómetro se puede usar una técnica de turbidimetría para medir la turbidez en una muestra y encontrar la concentración de células estimada por una curva de calibración establecida por la escala de McFarland. Conclusión El recuento en cámara de Neubauer es una técnica para el conteo de células y esporas que se ha establecido como una de las más populares debido a que fue una de las primeras técnicas para la detección de enfermedades ya que si se encontraba un numero celular superior al promedio, se reporta que la microbiota está afectada y que ha sido contaminada por una mayor población, la cual es la célula del conteo. Actualmente, con el avance tecnológico de la sociedad y en este caso la ciencia, existen nuevas técnicas que permiten estimar que la concentración de células en una muestra sea mucho más precisa, no obstante, la cámara de Neubauer no ha sido dejada de utilizar por laboratorios y estudios que la prefieren o por que no tienen los recursos necesarios para pagar un estudio más costoso. Referencias bibliográficas - O. Bastidas. "Conteo Celular con Hematocitómetro". Celeromics. https://mural.uv.es/basgaros/Conteo-Camara-Neubauer.pdf (accedido el 23 de mayo de 2022).
