EFECTOS DE LA RESPUESTA INMUNE A LA VACUNA TERAPÉUTICA NASVAC SOBRE LA ESTRUCTURA HISTOLÓGICA DEL H ÍGAOD DE RATONES TRANSGÉNICOS HBSAG

Tercer Congreso virtual de Ciencias Morfológicas.
Tercera Jornada Científica de la Cátedra Santiago Ramón y
Cajal.
EFECTOS DE LA RESPUESTA INMUNE A LA VACUNA TERAPÉUTICA
NASVAC SOBRE LA ESTRUCTURA HISTOLÓGICA DEL HÍGADO DE
RATONES TRANSGÉNICOS HBSAG (+).
Autores: *Dra. Janet Cueto González, **Dr. Julio César Aguilar Rubido, ***Dr.
Andrés Dovale Borjas, ****MSc. Sonia Rafaela Sánchez González.
[email protected]
* Dra. en Medicina. Especialista de 1er grado en Histología, instructora del
Departamento de Histología, Facultad de Ciencias Médicas Victoria de Girón,
Universidad Médica de La Habana, Cuba.
** LIc. Julio César Aguilar Rubido. Lic. en Bioquímica. Dr.C. Investigador Titular
Centro
de
Ingeniería
Genética
y
Biotecnología.
La
Habana,
Cuba.
[email protected]
*** Dr. Andrés Dovale Borjas. Ave 17 Núm 19402 entre 194 y 198, Siboney, Playa.
La Habana, Cuba. [email protected]
Dr. en Medicina. Profesor consultante y Titular. Departamento de Histología,
Facultad de Ciencias Médicas Victoria de Girón, Universidad Médica de la Habana,
Cuba.
**** Lic. Sonia Rafaela Sánchez González. Calle Línea núm.602, entre calle C y
calle B. apto. 2. Vedado, Plaza de la Revolución, La Habana, Cuba. Teléfono
78362298. [email protected]
1
Licenciada en Ciencias Biológicas. MSc. Profesora Auxiliar, Departamento de
Histología, Facultad de Ciencias Médicas Victoria de Girón, Universidad Médica de la
Habana, Cuba.
RESUMEN
La infección por el virus de la hepatitis B (VHB) constituye un problema de salud
pública mundial. Es necesaria la búsqueda de nuevas alternativas terapéuticas y
entre ellas está la inmunoterapia. Se desarrolló un candidato vacunal terapéutico
(NASVAC)basado en una formulación de los antígenos recombinantes de la
superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) y de la cápsida del virus (HBcAg) que
se administra por vía nasal (IN) y subcutánea (SC).
En el presente trabajo se caracterizó el efecto de la respuesta inmune inducida por
este candidato vacunal sobre la estructura histológica del hígado de ratones BALB/c
transgénicos al HBsAg. Se emplearon 23 animales de seis a ocho meses y de
ambos sexos, organizados en tres grupos: un grupo experimental, que recibió una
transferencia de células del bazo de ratones Balb/C previamente tratados con el
candidato vacunal, el control tratado con células del bazo de ratones no
inmunizados y un grupo control de ratones no tratados.
En el hígado se observaron signos leves de inflamación en las zonas periportales,
no se detectaron cambios necróticos, ni fibróticos. La morfometría mostró
diferencias significativas para el grupo experimental con respecto al grupo no
tratado en las variables área nuclear y área celular como resultado del efecto de la
transferencia adoptiva de células estimuladas. Los resultados del presente estudio
permiten concluir que la transferencia adoptiva de células inmunes a los antígenos
del Virus de la hepatitis B no produjo daños hepáticos de ratones transgénicos en
las condiciones estudiadas.
Palabras claves: Virus de la hepatitis B (VHB),Cirrosis Hepática (CH), Candidato
vacunal terapéutico (CVT), Antígeno de superficie del virus de la hepatitis B
(HBsAg), Antígeno de la nucleocápsida (HBcAg).
2
INTRODUCCIÓN
La hepatitis viral es la infección del hígado por virus hepatotropos 1,2.Cada año
mueren alrededor de 780,000 personas debido a la hepatitis B (HB) con mayor
prevalencia de la enfermedad en África subsahariana y Asia oriental3y alrededor de
350 millones son portadores crónicos4-7lo que estáasociado al desarrollo de cirrosis
(CH) y cáncer hepático2,3, 6-8.
El conocimiento de la historia natural de la infección por el VHB es fundamental
para establecer estrategias de prevención y tratamiento eficaces
5
.El objetivo
principal de todo tratamiento en una enfermedad infecciosa es la erradicación del
agente causal para evitar el daño
y las complicaciones
que éste produce en el
organismo. En la actualidad con las terapias existentes este objetivo solo se logra
en una pequeña proporción de pacientes9.
En Cuba, en las últimas décadas, después de un programa masivo de vacunación a
los menores de 5 años y a la población de riesgo, no se han reportado casos de HB
aguda en menores de 5 años y la incidencia de Hepatitis B fue de 3,5 por 100000
habitantes en el 201410. Las vacunas salvan alrededor de 10 millones de vidas cada
año4. La vacuna específica anti-hepatitis B ofrece posibilidades de ser utilizada para
prevenir la enfermedad11.
El Centro de Investigaciones Genéticas y Biotecnología (CIGB) obtuvo la proteína
recombinante Antígeno de superficie de la Hepatitis B (HBsAg), este antígeno forma
parte de la vacuna cubana anti-Hepatitis B que se utiliza desde la década del 9012.
En este centro, a partir de los antígenos recombinantes de la superficie y de la
nucleocápsida del virus se obtuvo un CVT que se administra por las vías nasal y
subcutánea6,13. Esta formulación presenta características inmunológicas favorables,
entre ellas podemos mencionar su capacidad para inducir una fuerte respuesta
inmune humoral y celular contra el virus de la Hepatitis B13.
El objetivo del presente trabajo es caracterizarel efecto de la respuesta inmune
inducida por elcandidato vacunal terapéutico (CVT) NASVAC sobre la estructura
histológica del hígado de ratones BALB/c transgénicos al HBsAg.
3
MATERIAL Y MÉTODOS
Se realizó un estudio prospectivo y descriptivo utilizando como biomodelo ratones
BALB/c transgénicos en el CIGB y el Instituto de Ciencias Básicas y Preclínicas
“Victoria de Girón”, en el periodo comprendido entre el año 2008 y 2012.
Se emplearon 23 animales de ambos sexos y de 6 a8 meses de edad procedentes
del bioterio del CIGB, caracterizados por la expresión estable del HBsAg en sangre y
en diferentes tejidos como el hígado14,15. El grupo experimental fue tratado con
células de bazo obtenidas de ratones BALB/c no transgénicos, previamente
inmunizados con el candidato vacunal terapéutico NASVAC en experimentos de
transferencia adoptiva de inmunidad celular. El grupo control tratado con células
del bazo de ratones no inmunizados y un grupo control de ratones no tratados.
Como animales donantes se emplearon los ratones Balb/c no transgénicos de 8 a
10 semanas de vida, con un fondo genético idéntico respecto a los animales
receptores. Durante el tratamiento, todos los animales se mantuvieron en iguales
condiciones ambientales e higiénicas.
Inmunógenos
La formulación del NASVAC se produjo en el CIGB. Esta formulación posee una
concentración
de
0.1
mg/mil
del
HBsAg
y
HBcAg,
respectivamente.
Esta
formulación es estéril y apirogénica. Se administró a los ratones por las vías IN y
SC de forma simultánea. Cada bulbo contiene 50 microgramos de cada antígeno en
500 microlitros13, 16.
Para la transferencia adoptiva se emplearon células del bazo obtenidas de los
ratones BALB/c previamente inmunizados con el CVT. Estos ratones fueron
inoculados con una dosis de 5 microgramos de HBsAg y 5 microgramos de HBcAg
que están formulados en una preparación que contiene igual cantidad de ambos
antígenos en PBS a una concentración de 0.1 mg/ml de cada antígeno. Se
administraron 50 micro litros de la formulación por las vías ya descritas.
Las dosis se administraron en las semanas 0 y 2 en una sola ocasión
Adicionalmente se administró una dosis de refuerzo. A las dos semanas de la última
inoculación se practicó la eutanasia y se extrajeron los órganos objeto de estudio
para su posterior procesamiento.
Esquema de inmunización
4
Grupo experimental: Los ratones fueron inoculados en una sola ocasión por vía IP
con una dosis única de 50x106 células de bazo inmune obtenidas por el
procedimiento ya descrito.
Grupo control tratado: Los animales fueron inoculados con células de bazo de
ratones BALB/c no transgénicos y no inmunizados con el CVT. Se les administró
igual esquema de tratamiento que a los animales del grupo experimental.
Grupo control no tratado: Animales a los que no se les inoculó ningún fármaco.
Obtención de la muestra
A las 8 semanas de la transferencia adoptiva, a todos los ratones se les practicó la
eutanasia por dislocación cervical. Se les extrajo el hígado para ser procesado y
obtener los cortes histológicos que se colorearon con la técnica de Hematoxilina y
Eosina. Las láminas histológicas fueron estudiadas en un microscopio Optech con
objetivos de 10x, 40x y 100x y se tomaron fotomicrografías digitales con el objetivo
de 10x y 40x.
Estudio microscópico
Para el estudio histológico del hígado se valoraron los parámetros histopatológicos
de inflamación y fibrosis.
Operacionalización de variables17.
Inflamación: Se valoró de acuerdo a la presencia de leucocitos en el tejido
hepático:
Ausente (0): Ninguna célula de la inflamación
Escasa (X): Aisladas células de la inflamación
Focal (XX): Numerosas células inflamatorias localizadas en un área determinada
Inflamación difusa (XXX): Presencia de células de la inflamación en un área extensa
del parénquima.
Fibrosis: Se evaluaron por la presencia de tejido conectivo fibroso y se estableció
la siguiente escala convencional:
Ausente (0): Ningún signo de fibrosis
Escasa (X): Aumento del tejido conectivo de los tractos portales
Moderada (XX): Fibrosis focal del parénquima y/o aumento marcado del tejido
conectivo de los tractos portales
5
Intensa (XXX): Formación de los extensos septos fibrosos con desorganización de
su arquitectura lobulillar.
Estudio morfométrico microscópico
Se midieron 50 o más hepatocitos en cada zona del lobulillo hepático la periportal,
intermedia y centrolobulillar, para determinar el área de los núcleos y el área
citoplasmática correspondientes y la relación entre ellas. Se digitalizaron las
imágenes
en un equipo óptico y digital combinado: microscopio OPTECH con
objetivos 40x tubo de proyección Canon B-52 y una cámara digital modelo Canon
PowerChot G11 con lente 10x. Se digitalizó una imagen con objetivo 40x que
abarcó toda el área a medir, consideramos una línea recta imaginaria entre la zona
portal y la vena centro lobulillar se dividió en tres partes iguales, la zona periportal
(PP), intermedia (IM) y centro lobulillar (CL).
El diámetro mayor y menor de los núcleos y la altura y ancho de las células se
midieron según el programa ImageTool 3 (IT3)18, datos que fueron utilizados para
calcular el área.
Presupuestos matemáticos
El núcleo tiene forma ovalada.
Los hepatocitos tienen aspecto elíptico según el plano de corte por lo que se le
aplicó la misma fórmula.
El área se calculó aplicando la fórmula matemática:
A =(a/4+b/4)2 π
a = diámetro mayor
b = diámetro menor.
La relación núcleo/citoplasma se obtuvo aplicando la fórmula de relación o índice
nucleoplasmático descrita por De Robertis modificándola para el área:
Relación= área nuclear/ área celular –área nuclear
Análisis de los Datos
Utilizamos el paquete estadístico Statistica 8.Los datos fueron
forma
aleatoria
de
los
diferentes
grupos
de
seleccionados de
ratones.
Se
confeccionarondistribuciones de frecuencias absolutas y porcentuales univariadas y
sus representaciones gráficas. Se utilizó test no paramétricos como resultado del
análisis de normalidad específico en las muestras evaluadas
6
RESULTADOS
Evaluación
de
los
signos
de
inflamación:El
histopatológicos de inflamación y fibrosis en
estudio
de
los
parámetros
el hígado mostraron que la
transferencia de células de bazo de ratones Balb/c previamente inmunizados con el
CVT NASVAC no produjo inflamación en las zonas intermedia, ni centro lobulillar del
lobulillo hepático, no así en la zona peri portal donde se observaron células
inflamatorias que infiltran el parénquima del órgano de los animales del grupo
experimental esto queda resumido en la tabla 1.
Tabla 1: Evaluación de signos de inflamación
Grupos
Zonaperiportal Zonaintermedia Zonacentrolobulillar
Experimental
Focal
ausente
Ausente
Control tratado
Escasa
ausente
Ausente
Control no tratado
Ausente
ausente
Ausente
Evaluación de la fibrosis y necrosis: Al evaluar el índice de fibrosis y necrosis
referido en la tabla 2, no se encontró la presencia de tejido a cicatrizar ni signos de
necrosis en ninguna de las zonas estudiadas, esto se puede corroborar en las
fotomicrografías (figura 1), donde pudimos comparar cada uno de los grupos
estudiados.
Tabla 2. Evaluación de la fibrosis y la necrosis
Zona
Zona
Zona
periportal
intermedia
centrolobulillar
Experimental
Ausente
ausente
Ausente
Control tratado
Ausente
ausente
Ausente
Control no tratado
Ausente
ausente
Ausente
Grupos
7
Figura 1: Fotomicrografías de la zona PP del lobulillo hepático. Coloración H/E 400X.
Grupo control no tratado
Control tratado Grupo experimental
Alteraciones de la estructura lobulillar: Tampoco se constató congestión, dilatación
de los sinusoides, ni alteraciones de la estructura lobulillar del órgano (figura 2).
Figura 2: Fotomicrografía del tejido hepático.Coloración H/E 100X
Evaluación de la homogeneidad citoplasmática: Observamos la presencia
de
vacuolas claras e irregulares en el citoplasma de las células de las tres zonas del
lobulillo hepático. Los hepatocitos mostraron un citoplasma con basófilia moderada
y aspecto vacuolado de forma irregular (figura 3).
8
Figura 3: Fotomicrografía del parénquima hepático. Grupo experimental. Coloración
H/E 400X.
DISCUSIÓN
La erradicación del virus es imposible con las drogas aprobadas en la actualidad
debido a la existencia de reservorios extra hepáticos del VHB19, 20. La integración del
ADN viral al ADN del hospedero y la presencia de ADN circular cerrado
covalentemente (cccDNA) en los núcleos de los hepatocitos
forma
templetes
transcripcionales durante la replicación del VHB sin necesidad de que ocurra la
reinfección. Los agentes antivirales actuales poseen poco efecto inhibitorio sobre el
cccDNA, lo cual conduce a una alta tasa de recaída virológica al descontinuar el
tratamiento19.
Los antígenos recombinantes HBsAg y HBcAg empleados en el desarrollo de la
formulaciónvacunal en estudio inducen una fuerte respuesta inmune humoral y
celular contra el virus de la Hepatitis B 20,21. El conocimiento actual en el campo de
la vacunación terapéutica para la HVC sugiera la inclusión de otros antígenos
además del HBsAg y del uso de nuevas vías de administración20.
En los pacientes infectados por el VHB se observan cambios morfológicos en el
hígado descritos como inflamación, necrosis, degeneración y fibrosis22-24. Se
interpreta la inflamación como un mecanismo de defensa aunque en la zona
periportal la respuesta inflamatoria puede ser mayor, a la degeneración como la
tumefacción y el edema en los hepatocitos. La fibrosis es la transformación del
tejido parenquimatoso del órgano que conlleva un aumento del tejido conectivo y a
9
la perdida de la compleja cito arquitectura del hígado como ocurre en la CH en
respuesta a agresiones tóxicas22,23.
La inflamación observada no está asociada a manifestaciones de necrosis a
diferencia de lo reportado por otros investigadores 25. Esto sugiere que el infiltrado
inflamatorio puede deberse a la respuesta local que provocó el inmunógeno. No se
encontró signos de necrosis ni fibrosis, esto corresponde al 100% de los ratones
estudiados. El CVT NASVAC no produjo inflamación en las zonas intermedia, ni
centro lobulillar del lobulillo hepático, no así en la zona peri portal donde se
observaron células inflamatorias que infiltran el parénquima del órgano de los
animales del grupo experimental, es posible considerar que está zona recibe una
gran irrigación sanguínea y es la primera que
se pone
en contacto con los
medicamentos que circulan por la sangre, en cada área los hepatocitos presentan
una batería enzimática diferente.
Un factor importante a evaluar es la presencia de lesiones no específicas como los
cuerpos acidófilos o células apoptóticas cuya aparición puede deberse a causas
tóxicas o inmunitarias y la degeneración balonizante (necrosis lítica) provocada por
casi cualquier tipo de agresión. Estas lesiones pueden ser focales (diseminadas por
todo el parénquima), zonales, submasivas o masivas25,26. Otro signo a evaluar es la
presencia de lesiones necro inflamatorias en los conductillos biliares. Estos cambios
pueden ser utilizados para la evaluación de la efectividad de los diferentes
tratamientos y de la enfermedad25.
El
interferón
alfa
y
los
antivirales
producen
disminución
de
la
actividad
necroinflamatoria pero no existen evidencias de que estos controlen la evolución de
la fibrosis, por tanto no reducen el riesgo de cirrosis hepática 27. En este trabajo se
constató la ausencia de fibrosis después del tratamiento aplicado, siendo un factor
importante para el control de la progresión hacia la cirrosis hepática en estos
pacientes. Se observó un aspecto normal en los componentes estructurales
histológicos de los hígados de la totalidad de los animales estudiados, no se
encontró degeneración de los hepatocitos, puesto que no se evidenció retención de
material acidófilo en las células.
La presencia de vacuolas claras e irregulares en el citoplasma de las células de las
tres zonas del lobulillo hepático se interpreta que está en correspondencia con
10
depósitos de glucógeno. Después de una ingestión de alimentos se puede observar
glucógeno depositado en los hepatocitos fundamentalmente en la zona PP y a
medida que aumenta la digestión las inclusiones se distribuyen en las restantes
zonas del lobulillo hepático hasta quedar todas cargadas de estos gránulos. Se
considera que de cuatro a cinco horas después de la toma del alimento la cantidad
de glucógeno en los hepatocitos aumenta y su máximo lo alcanza al cabo de 10- 12
horas
28
Se constató la presencia de núcleos grandes y eucromáticos en la mayoría de las
células, algunas binucleadas y abundantes con núcleos poliploides en todas las
áreas del lobulillo hepático, lo que se corresponde al aumento de la actividad
metabólica del órgano. En condiciones normales el 25% de las células son
binucleadas y entre el 40 y el 60 % son poliploides29. Se conoce que los hepatocitos
en su ciclo de vida se desplazan hacia la vena central que es la zona menos irrigada
y a medida que esto ocurre los signos de muerte celular se van haciendo más
evidentes hasta que mueren30. Esto se corresponde con los resultados encontrados
de aisladas y escasas células con signos de apoptosis, localizadas en su mayoría
hacia la zona centro-lobulillar.
Se realizó un estudio morfométrico del órgano donde se encontró diferencia
significativa
en
el
área
nuclear,
el
área
citoplasmática
y
la
relación
núcleo/citoplasma en las tres zonas del lobulillo hepático. Los valores medios de las
áreas son mayores
en el grupo experimental y en la zona periportal, estos van
disminuyendo hacia la zona centro lobulillar, lo que se explica por la diferencia de
irrigación y función de cada una.
CONCLUSIONES
La transferencia a ratones transgénicos HBsAg(+) de células de bazo de ratones
Balb/c previamente inmunizados con el candidato vacunal terapéutico NASVAC no
produjo inflamación en las zonas intermedia, ni centrolobulillar del lobulillo
hepático.
La transferencia de células inmunes provocó un infiltrado focal de células
inflamatorias en la zona periportal del parénquima hepático en los ratones
11
transgénicos, sin embargo, este infiltrado no estuvo asociado a signos de necrosis,
fibrosis ni degeneración celular.
El estudio de las variables morfométricas del hígado demuestra el aumento del área
nuclear y celular de los hepatocitos de las tres zonas del lobulillo hepático del grupo
que recibió células inmunes con respecto al grupo no tratado sin afectar la relación
área núcleo /área citoplasma. Los resultados obtenidos con el CVT NASVAC
permiten considerarlo una posible alternativa terapéutica.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1- Krugman S, Giles JP, Hammond J. Infectious hepatitis. Evidence for two
distinctive clinical, epidemiological and immunological types of infection.
JAMA 1967; 200: 365-73.
2- Cirión Martínez GR; Herrera Pérez MA. Hepatitis viral. Editorial Ciencias
Médicas (Ecimed), La Habana 2012.ISBN978-959-212-769-2.cap 3 pp 36-61
3- OMS/ Hepatitis B. nota descriptiva No. 204, Julio 2015. Disponible en:
http://www.who.int. Revisado septiembre de 2015.
4- Organización
Mundial
de
la
Salud
(OMS),
vacunas.
Enfermedades,
Enfermedades infecciosas, Enfermedades transmisibles, Gastroenterología |
Etiquetas: cáncer de hígado, cinco virus principales: hepatitis A-B-C-D-E,
Tomado del Boletín de Prensa Latina Copyright 2015; Agencia Informativa
Latinoamericana Prensa Latina S.A. julio 23 / 2015.
5- Cortés L.; Domínguez M.; Simón M.A. Hepatitis B. Asociación Española de
Gastroenterología.
.cap
53
pp
769-786.
Disponible
en:
www.aegastro.es/sites/default/files/archivos/ayudas.../53_Hepatitis_B.pd
6- Aguilar JC, Aguiar J, Pentón E, Guillen G, Muzio V, et al. Demostración de la
seguridad, inmunogenicidad y eficacia del candidato vacunal terapéutico
HeberNasvac y nuevos aportes a la caracterización de las poblaciones de
pacientes
con
Hepatitis
B
Crónica.
CIGB
2015.
www.revistaccuba.cu/index.php/acc/article/view/451/37.
Disponible
Revisado
12
en:
de
junio 2016.
12
7- Uberos Fernández J. Nuevas vacunas terapéuticas en hepatitis B crónica.
2013.
Disponible
en:
http://www.spao.es/documentos/novedades/pdf-
novedad-11.pdf. Revisado enero de 2014
8- Ministerio de Sanidad, Servicios Sociales e Igualdad. Informe de utilidad
terapéutica de las vacunas frente al virus de la hepatitis B. fecha de
elaboración
del
informe
10
de
diciembre
de
2013.
Disponible
en:
www.aemps.gob.es/medicamentosUsoHumano/vacunas/infoUtilTerapeutica/
docs/info-util-terap-hepatitis-B.pdf
9- Yuen MF, Lai CL. Treatment of chronic hepatitis B: Evolution over two
decades. J Gastroenterol Hepatol 2011;26 (Suppl 1):138-43
10-
Anuario
Estadístico
de
Salud
2015.
Disponible
en
http://www.infomed.sld.cu). Revisado el 18 de marzo de 2016.
11-
Begué RE. Uso de plantas para la producción de vacunas y otros
productos
inmunobiológicos.
2006
Disponible
en
www.sisbib.unmsm.edu.pe/bvrevistas/speit/2006_n2/pdf/a02.pdf. Revisado
el 14 de marzo de 2011.
12-
Porras Delia N. y cols. Determinación del potencial irritante de un
candidato vacunal nasal que combina al antígeno de superficie del virus de la
hepatitis B con el antígeno de la nucleocápsida. Biotecnología Aplicada 2004;
21: 143-147.
13-
Aguilar JC. Efecto adyuvante de los antígenos de la superficie y la
nucleocápsida del virus de la hepatitis B y su utilidad en el desarrollo de
candidatos vacunales. Tesis de opción al grado científico Doctor en Ciencias
Biológicas. Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología. Ciudad de la
Habana 2007.
14-
Castro FO. Expresión del gen del antígeno de superficie del virus de la
hepatitis B en órganos de ratones transgénicos. Interferón Biotecnol 1989;
6:251-257.
15-
García Catillo E, González Ramírez VE, González Griego A, Salgado
Borges A, Fernández A, et al. Correlación del ADN y del antígeno de
superficie del virus de la hepatitis B en tejidos de animales transgénicos. Rev
Cubana Invest Biomed 2000; 19 (1): 8-9.
13
16-
Aguilar Rubido JC, Lobaina Mato Y, Hernández Inguanzo D, Trujillo
Pérez H, Freyre Almeida FM, et al. Formulation of hepatitis b virus antigens
for cellular stimulation followed by therapeutic immunization. Fecha de la
publicación 6 de diciembre de 2012. No. 20120308615. Disponible en:
scielo.sld.cu/pdf/aci/v23n2/aci07212.pd. Revisado marzo 2014.
17-
Malherbe Pérez JT. Efectos del consumo de etanol e inoculación de
vacuna Heberbiovac-Hb sobre el sistema inmune y el hígado de ratas
adolescentes machos. Trabajo para optar por el título de especialista de
primer grado en Histología. Universidad de Ciencias Médicas de La Habana.
2003.
18-
Wilcor CD. and col. UTHSCA. Image Tool for Windows. Version 3.00
(IT3). University of Texas, Health Science Center in San Antonio. Copyright
1996-2002.
Disponible
en:
http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html.
Revisado el 14 de marzo de 2010.
19-
Romero Gisela. Hepatitis B. Revista de la Sociedad Venezolana de
Gastroenterología. 2008; 62 (1).
20-
Lobaina Mato Y. Co- administración intranasal-parenteral de un
candidato
vacunal,
que
combina
a
los
antígenos
de
superficie
y
nucleocápsida del virus de hepatitis B, como estrategia terapéutica para el
tratamiento de la hepatitis B crónica. Tesis presentada en opción al grado de
Doctor en ciencia Biológicas. Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología,
División de Vacunas, La Habana, 2015.
21-
Aguilar JC and col. Immunotherapy for chronic hepatitis B using
HBsAg-based vaccine formulations: from commercial vaccines to NASVAC
(Review). Hepatitis B Department, Biomedical Research Unit, Center for
Genetic Engineering and Biotechnology. Havana, Cuba, 2011. Disponible en
: https://www.researchgate.net/.../272379135
22-
Alexander J. et al. Enfermedades Infecciosas. Patología estructural y
funcional de Robbins y Cotran. 7ma ed. Madrid: Elsevier: 2007. Cap. 8, p.
347-348.
14
23-
Cirión Martínez GR; Herrera Pérez MA. Hepatitis viral. Editorial Ciencias
Médicas (Ecimed), La Habana 2012.ISBN978-959-212-769-2. Cap 2pp 1035.
24-
Serra
Desfilis
MA.
Virus
de
la
hepatitis
B.
disponible
en
:
https://www.seimc.org/contenidos/ccs/revisionestematicas/viromicromol/VH
Brev.pdf
25-
Gra. B. y col. Utilidad de nuevas variables histológicas en la valoración
de la actividad necroinflamatoria y en el pronóstico de las hepatitis crónicas
por virus B y C. Hepatología 2006. Sociedad Cubana de Patología. Editorial
CIMEQ: 89 – 112.
26-
Keeffe EB, Dieterich DT, Han SB. A treatment algorithm for the
management of chronic hepatitis B virus infection in the United States: 2008
update. Clin Gastroenterol Hepatol. In preparation.
27-
Vilar Gómez E. Tratamiento de la hepatitis Crónica B. Monoterapia o
tratamiento combinado. Hepatología 2006. Sociedad Cubana de Patología.
Editorial CIMEQ: 45 – 56
28-
Metabolismo de los glúcidos. Cap IV pp 31-48. Disponible en :
www.smu.org.uy/publicaciones/libros/historicos/dm/cap4.pd
29-
Junqueira LC. Carneiro J. Histología Básica. 6ta edición. Editorial
MASSON,S.A. Barcelona. Cap. 15. 2005.
30-
Leyva
Elizabeth,
Rios
Nancy,
Rodríguez
Lourdes,
Díaz
P.
Comportamiento del volumen nuclear y del infiltrado inflamatorio en las
hepatitis virales y crónicas. Hospital “V.I. Lenin” Holguín. 2001. Correos
Científicos
Médicos
de
Holguín
2003;
7
(3).
Disponible
en
www.cocmed.sld.cu/no73/n73ori4.htm Revisado el 6 de junio de 2011
15