Rev Esp Med Legal. 2013;39(2):54---62 REVISTA ESPAÑOLA DE MEDICINA LEGAL www.elsevier.es/mlegal REVISIÓN Revisión de métodos de extracción de ADN a partir de restos óseos en el laboratorio forense Pedro A. Barrio-Caballero ∗ Servicio de Biología, Departamento de Barcelona, Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses, Barcelona, España Recibido el 5 de septiembre de 2012; aceptado el 5 de noviembre de 2012 Disponible en Internet el 29 de diciembre de 2012 PALABRAS CLAVE ADN; ADN antiguo; Restos humanos; Huesos; Dientes; Extracción ADN; Identificación KEYWORDS DNA; Ancient DNA; Human remains; Bones; Teeth; DNA extraction; Identification ∗ Resumen En el campo de la identificación humana, la genética forense está teniendo un papel relevante en los últimos años. Sin embargo, existen circunstancias en las que su labor puede verse dificultada. Tal es el caso del hallazgo de restos humanos esqueletizados, en los que las condiciones tafonómicas de dicho hallazgo pueden suponer una limitación en la obtención de ADN a partir de ellos en cantidad y calidad suficiente para su identificación. En estos casos se han de aplicar estrategias especiales y diferentes a las habitualmente empleadas en los laboratorios forenses. En la presente revisión, en primer lugar, se valora la idoneidad del uso de restos óseos para la obtención de ADN, que será empleado en los subsiguientes estudios genéticos de identificación. En segundo lugar, se comentan los problemas de preservación del ADN obtenido a partir de este tipo de muestras. Igualmente se exponen las complicaciones metodológicas que implica la obtención de este ADN. Aunque no debe olvidarse la degradación y las modificaciones moleculares de este tipo de ADN, la presente revisión se centra en su coextracción junto con inhibidores de la PCR. Finalmente, se valoran los principales protocolos de extracción de ADN a partir de restos óseos, encaminados precisamente a la eliminación de dichos inhibidores. © 2012 AsociaciÓn Nacional de Médicos Forenses. Publicado por Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados. Revision of DNA extraction methods from bone fragments in forensic laboratories Abstract In the human identification field, Forensic Genetics serves an outstanding role every time. However, there are circumstances where its task could be obstructed. This is the case of human dried bones discovery. The taphonomic conditions of this finding could imply a limitation on adequate quantity and quality of obtaining DNA for bone identification. In these cases, special and different strategies to the usual ones must be executed on forensic laboratories. In the present revision, firstly, the adequacy of using bone fragments to obtain DNA is assessed. This extracted DNA will be employed on subsequent identification genetic studies. Secondly, preservation problems of DNA obtained from this type of samples will be presented. Likewise, methodological complications to obtain this DNA will be set out. In particular, the co-extraction Autor para correspondencia. Correo electrónico: [email protected] 0377-4732/$ – see front matter © 2012 AsociaciÓn Nacional de Médicos Forenses. Publicado por Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados. http://dx.doi.org/10.1016/j.reml.2012.11.002 Revisión de métodos de extracción de ADN a partir de restos óseos en el laboratorio forense 55 with PCR inhibitors will be considered, although degradation and molecular modification of DNA must not be forgotten. Finally, principal DNA extraction protocols of bone fragments will be evaluated. The protocols, which are designed to eliminate those PCR inhibitors, will be especially considered. © 2012 AsociaciÓn Nacional de Médicos Forenses. Published by Elsevier España, S.L. All rights reserved. Introducción En la actualidad, frecuentemente se producen circunstancias en las que aparecen restos humanos y/o cadáveres, que deben ser identificados y en los que es necesaria la exhumación de los restos óseos (RO). Tal es el caso de personas desaparecidas, de restos de víctimas de atentados terroristas o grandes catástrofes, restos procedentes de fosas comunes de conflicto bélicos y casos de litigios de filiación o de adopciones irregulares. En todos ellos, se trata de asignar a los restos humanos una «identidad», entendida como el conjunto de elementos que individualizan a una persona y la diferencian de las demás1 . La identificación de un cadáver constituye una prioridad por razón propiamente humanitaria y social2,3 , por el hecho en sí mismo de perder a un ser querido y la necesidad netamente humana de tener conocimiento de dicho fallecimiento, saber dónde se encuentran los restos y poder despedirlos en las condiciones que se crean necesarias. Pero además, dentro de nuestro ámbito, son fundamentales las implicaciones legales que tiene el fallecimiento de toda persona. En todos los Estados de Derecho, las distintas regulaciones legales atribuyen una relevancia jurídica esencial al hecho del fallecimiento, y nuestro ordenamiento lo regula tanto en el ámbito civil4 como en el penal5 . El proceso de identificación suele tener una complejidad variable, que a menudo requiere de la intervención de equipos multidisciplinares, integrados por especialistas en medicina forense, antropología forense, odontología forense, dactiloscopia y genética forense6 . En algunas situaciones, como en excavaciones de fosas comunes de conflictos bélicos, también se puede requerir la participación de especialistas en arqueología e historia7 , cuyas técnicas de excavación arrojan información adicional que contribuye al proceso de identificación. Cuando nos enfrentamos a cadáveres bien conservados, existen multitud de herramientas que permiten resolver el proceso de identificación de forma rápida. Estas van desde los datos fisonómicos (peso, talla, defectos físicos aparentes, marcas, tatuajes, etc.), pasando por la propia documentación personal encontrada con el cadáver, hasta la identificación necrodactilar, principal método empleado en las identificaciones8---10 . Sin embargo, en muchos casos, estos métodos no pueden ser aplicados o se han de complementar y/o confirmar mediante el estudio comparativo del perfil de ADN obtenido a partir del cadáver, con el de familiares, muestras biológicas antemortem del difunto (muestras hospitalarias) o con el de restos biológicos encontrados en objetos atribuidos al fallecido11---13 . Pero incluso en estos casos existe un tipo de muestras (huesos y dientes) que presentará dificultades añadidas. Estos obstáculos adicionales habitualmente serán resultado de las propias condiciones en las cuales se encontraron los restos (condiciones tafonómicas), que llevarán aparejada, aparte de la degradación y/o modificación del material genético que pueda ser obtenido de los mismos, la presencia de sustancias inhibidoras, que interferirán en las subsiguientes etapas de la identificación genética. La variabilidad en la preservación de las muestras que lleguen al laboratorio obliga a la aplicación de distintas estrategias para la extracción del material genético presente en dichas muestras. De este modo, la presente revisión se centra en la valoración de los principales métodos de extracción de ADN a partir de las muestras de restos cadavéricos esqueletizados. Muestras más adecuadas para la obtención de ADN a partir de estructuras esqueléticas Numerosos estudios14---17 señalan que el material genético se degrada más rápidamente en tejidos blandos que en huesos, debido a la estructura más resistente del hueso que actúa como barrera física frente a las influencias tafonómicas. La densidad del hueso también es un factor importante que influye en su preservación18 . De este modo, el ADN está normalmente menos degradado en las porciones más densas del esqueleto, como el fémur y la tibia11,19,20 . Pese a todo, existen pocos estudios que hayan valorado las diferencias de las tasas de éxito en obtener un perfil genético entre los diferentes elementos esqueléticos21,22 . Algunas publicaciones sugieren que el ADN está mejor preservado en clavículas que en costillas19 , en huesos largos más densos que en elementos menos densos23,24 , y en hueso compacto que en hueso esponjoso o trabecular25 . En un interesante estudio de Milós et al.24 se registraron las tasas de éxito para obtener un perfil genético a partir de 25.361 huesos y dientes de restos recuperados de víctimas de fosas comunes en la antigua Yugoslavia, enterrados en un intervalo de 4-11 años. Sus resultados indicaron que el ADN está mejor preservado en fémures y dientes, seguido por tibias, peronés, húmeros, cráneos, radios y cúbitos. Estos hallazgos son acordes con la literatura tafonómica que muestra una robusta relación entre la densidad del hueso y la preservación esquelética26 . Está claro que las tasas de éxito para obtener un perfil genético varían entre estructuras esqueléticas, aunque la razón de este hecho no es del todo bien conocida22 . Leney27 ha argumentado que las áreas bajo una carga mecánica alta, tales como la mandíbula y las estructuras poscraneales densas, tienen una cortical más gruesa que podría actuar como una barrera protectora frente a la degradación del ADN. En cambio, en el caso de los dientes, es el esmalte dental el que protege al ADN de la degradación y la contaminación24 . 56 De este modo, y siendo sensible a dichas peculiaridades, la legislación española, cuando detalla las muestras que se han de enviar para su identificación genética en el caso de cadáveres en avanzado estado de descomposición o esqueletizados, recomienda específicamente el envío de piezas dentales y/o un hueso largo, preferiblemente el fémur28 . Factores que influyen en la preservación del ADN En el momento en que un organismo muere, comienzan los procesos de degradación de sus biomoléculas, entre ellas el ADN. Los agentes causantes de esa degradación serán las propias enzimas del organismo (autolisis29 ), la posterior invasión de los restos por bacterias, hongos e insectos, y, finalmente, procesos químicos, principalmente hidrólisis y oxidación, que completarán la degradación del material genético30 . Sin entrar en el proceso químico que lleva a esa degradación del ADN, ampliamente descrito en la bibliografía29---34 , cabe destacar que estos procesos llevarán tanto a la propia fragmentación del ADN (proceso de hidrólisis) como a la modificación del mismo (daño oxidativo). La velocidad y el grado de descomposición del material genético de un resto va a depender de diversos factores endógenos y exógenos35 . El éxito en la obtención de información genética a partir de estructuras óseas está condicionado, aparte de por el tipo de estructura, por la condiciones del enterramiento. Las características del ambiente en el que se encuentra depositado un resto pueden ralentizar o incluso detener el proceso de degradación. Así las condiciones que más afectarán a la degradación del ADN serán la temperatura, la humedad, el pH o la presencia de ciertos compuestos en el suelo: - La temperatura es el factor que más condiciona la preservación del material genético. Las temperaturas bajas durante el período de deposición de un resto favorecen su conservación óptima30,36 , debido a que, a bajas temperaturas, se produce una ralentización de las reacciones químicas responsables de la degradación orgánica32 . En el lado opuesto, la presencia de elevadas temperaturas puede favorecer la deshidratación parcial del ADN, deteniendo los procesos de hidrólisis30 . - La humedad ejerce un efecto adverso sobre la preservación del material genético. Debido a la porosidad propia del hueso y a la acción disolvente de la humedad, se favorece la penetración de las sustancias orgánicas del sedimento en el interior del resto. Esto incrementa la posibilidad de que el extracto de ADN presente moléculas inhibidoras, además de favorecer la degradación hidrolítica y oxidativa36 . - Un pH neutro o ligeramente alcalino en el enterramiento favorece la preservación del ADN30 . Sin embargo, Herrmann y Newesely37 , demostraron que una disminución paulatina del pH provocaba la degradación de la hidroxiapatita de los huesos o dientes. - Los compuestos del suelo. Se ha apuntado la posibilidad de que ciertos compuestos minerales del suelo, como la montmorilonita, la kaolinita, el feldespato o el cuarzo, podrían asociarse al ADN protegiéndolo frente a la acción P.A. Barrio-Caballero endonucleásica38---40 . También se ha documentado la posibilidad de que la unión del ADN con los ácidos húmicos del suelo causaría el mismo efecto protector41 . Sin embargo, otros componentes propios del suelo pueden ejercer el efecto contrario, como se detallará a continuación. Problemas metodológicos en la obtención de ADN a partir de restos óseos La obtención de material genético endógeno a partir de restos óseos se enfrenta con una serie de dificultades de tipo técnico, relacionadas la mayor parte de las veces con el estado de preservación del ADN. Este tipo de ADN presenta un conjunto de características físico-químicas, similares al ADN antiguo, que lo diferencian del procedente de organismos vivos, también denominado «ADN fresco»35 . Se podrían resumir fundamentalmente en 4: escasez, fragmentación de las cadenas, modificaciones moleculares y la presencia de inhibidores de la PCR en los extractos. Escasez y fragmentación de las cadenas de ADN: son manifestaciones de un mismo fenómeno, la degradación posmortem del material genético35 . Así, la longitud de los fragmentos amplificables depende de las condiciones de preservación de los restos óseos36 . Además, las modificaciones moleculares del ADN, consecuencia también de dicha degradación posmortem, provocan sobre el ADN lesiones que bloquearán la polimerasa, como las modificaciones oxidativas de las bases nitrogenadas y los residuos de azúcar32 , o la creación de puentes cruzados (cross-links) entre las propias cadenas de ADN o entre el ADN y las proteínas del medio (reacción de Maillard)42---44 . Estas modificaciones también provocan lesiones que causarán la incorporación incorrecta de bases, «miscoding lesions»45---48 . La presencia de inhibidores de la PCR en los extractos está íntimamente relacionada con el resto de características. La naturaleza y mecanismos de acción de muchos de dichos inhibidores resultan todavía hoy desconocidos35,44 , y lo que queda claro es que el protocolo de extracción convencional de ADN (método de extracción «orgánica»), no consigue eliminar gran parte de las moléculas inhibidoras, pues aparecen en los extractos finales. Así pues, se pueden enumerar dichos posibles inhibidores, según la naturaleza de los mismos y que básicamente serán compuestos del suelo, o subproductos de la degradación orgánica. Respecto a los componentes del suelo, se suele hablar de la posible acción inhibidora de los ácidos húmicos y fúlvicos sobre las enzimas biológicas43,49 . Estos compuestos, muy abundantes en el suelo, pueden acompañar al ADN en el proceso de extracción y son inhibidores muy potentes de la reacción de PCR34,35,50 . Por otro lado, los residuos derivados de la porfirina o sus productos de degradación podrían ser responsables de la actividad inhibidora de la PCR51,52 , por su capacidad para secuestrar iones metálicos, necesarios para el funcionamiento de la polimerasa53 . Las porfirinas se encuentran presentes en algunas hojas vegetales, además de en la sangre y en los tejidos blandos34,35 . Asimismo, muchos autores29,30,43,44,54---56 han relacionado los productos de la reacción de Maillard con la capacidad inhibidora de algunos extractos de ADN de muestras antiguas. Esta reacción es muy conocida en el campo de la tecnología de los alimentos, y sus productos son muchos y Revisión de métodos de extracción de ADN a partir de restos óseos en el laboratorio forense variados, pudiendo tener numerosos grupos reactivos, entre los que se cuentan los grupos hidroxilo, carbonilo y metilo, que pueden reaccionar con el ADN34,44 . Y por último, los propios productos de degradación del material genético, sea por rotura de sus enlaces o por modificaciones químicas tales como la reducción de azúcares, generan ciertos productos capaces de inducir la inhibición directa de su propia amplifiación44,57,58 . Proceso de extracción de ADN a partir de estructuras óseas Un alto porcentaje de los problemas que afectan al éxito en la obtención de ADN a partir de RO son debidos a la acción de los inhibidores. Independientemente de la naturaleza o de sus mecanismos de acción, constituye una prioridad la eliminación o atenuación del efecto inhibidor. Aunque se podrían tomar medidas para minimizar su efecto durante la propia amplificación del ADN (PCR)29,51,52,59 , es mejor eliminar el problema en su inicio. Por ello, todo el proceso de extracción de ADN se convierte en un paso primordial a la hora de obtener resultados positivos. Esto ha obligado, en muchos casos, a la implementación de protocolos específicos. Antes de valorar el proceso de extracción, conviene comentar por su importancia la necesidad de aplicación de una serie de medidas de seguridad para evitar y/o controlar posibles problemas de contaminación. Van desde la propia infraestructura del laboratorio (separación física de áreas), pasando por las recomendaciones específicas de limpieza del propio laboratorio y material empleado, preparación aséptica de reactivos, hasta llegar a la inclusión de controles a lo largo de todas las etapas del proceso y la aplicación de criterios de autentificación. No obstante, sobre estas normas se ha escrito ampliamente25,34,35,43,45,60,61 y no es la finalidad de esta revisión. Pretratamiento (descontaminación) Uno de los primeros pasos, previos a la propia etapa de extracción, suele consistir en un pretratamiento de los RO, encaminado a acondicionar y/o mejorar el rendimiento en la posterior extracción de ADN. La mayor parte de los protocolos recomiendan una limpieza superficial de los RO o dientes, para la eliminación de los posibles contaminantes (material exógeno y/o bacterias). Esta limpieza puede basarse en lavados con lejía diluida y/o agua destilada62 . Sin embargo, algunos estudios63 han demostrado que se trata de un procedimiento demasiado agresivo y que puede ser contraproducente para el posterior éxito en la obtención de ADN60 , proponiéndose métodos químicos alternativos64 . La mayor parte de los protocolos propone la eliminación de dicha capa superficial mediante abrasión mecánica o lijado. Algunos emplean dispositivos («arenadora») que inyectan un material abrasivo (óxido de aluminio) a presión sobre la superficie de la pieza, provocando la eliminación de la capa más externa35 . Otro método alternativo, aunque la mayoría de los protocolos lo recogen como complementario a los otros 2, suele consistir en la irradiación de las piezas a analizar con luz ultravioleta35,60 . Existen protocolos que combinan los 57 3 métodos para asegurar la eliminación de cualquier posible contaminación exógena61,62 o aplican tratamientos aún más elaborados de descontaminación65 . Una vez limpiadas las muestras (descontaminadas), si se trata de huesos largos se cortan en fragmentos35,61,62 . Y sean huesos largos o dientes, siempre se pulverizan mediante un molino de impactación electromagnética refrigerado con nitrógeno líquido, para así aumentar la superficie disponible para los tratamientos químicos posteriores60 . El nitrógeno líquido congela la muestra, facilitando así su pulverización y evita la posible degradación del material genético del hueso por el exceso de calor generado con la trituración mecánica35 . Para Rohland y Hofreiter66 este paso es crucial, pues han detectado diferencias estadísticamente significativas entre pulverizar los huesos o tan solo pasar las muestras por un mortero manual. Antes del propio proceso de extracción, algunos protocolos recogen un paso previo de descalcificación del polvo de hueso mediante lavados con EDTA, que es un quelante iónico que actúa secuestrando las sales iónicas contenidas en la muestra, incluyendo el calcio de los huesos35,56,67---69 . Aunque en la actualidad, la mayor parte de los protocolos prescinden de este paso, pues dichos lavados previos podrían eliminar el posible ADN libre en suspensión existente, no obstante, incluyen el EDTA en la propia solución de digestión62,70,71 . Extracción Finalmente, el último paso consistirá en la propia digestión de la muestra, mediante proteinasa K, y purificación del extracto resultante. De este modo, como métodos más ampliamente extendidos se pueden destacar el basado en la extracción mediante disolventes orgánicos (fenol:cloroformo)56,67 o mediante resinas quelantes (método de unión a «glass-milk» o suspensión de silica)32,69,72 . También han sido sugeridos otros como el uso de otro tipo de resinas, tipo Chelex73 , poco eficaz y que actualmente no se emplea debido a la escasa o nula eliminación de sustancias inhibitorias74 , o el empleo de dispositivos de ultrafiltración (filtros de distinto tamaño de poro)54,69,75 . Por otro lado, algunos protocolos incluyen sustancias reductoras. Se sospecha que el ADN de calidad suficiente presente en las muestras pueda fallar cuando se analiza. Poinar et al.76 registran que una de las potenciales razones de esto es la masiva unión cruzada de macromoléculas (cross-linking) que ocurre posmortem. Estos investigadores sugieren que el ADN puede quedar atrapado con productos entrecruzados, impidiendo su amplificación. Para liberar el ADN de tales matrices, Poinar et al.76 emplean N-fenacil tiazolio bromido (PTB) para romper los entrecruzamientos, y registran tanto un incremento en la tasa de éxito por muestra, como un incremento en la fuerza de la señal obtenida. Algunos autores66 sugieren el uso de otras sustancias reductoras, como el DTT, y señalan la inefectividad del PTB. En la actualidad, uno de los métodos más comúnmente usados es el basado en la combinación de descalcificación con EDTA y purificación con silica69,77,78 . Sin embargo, existen otras muchas variaciones, por lo que a continuación se detallan aquellos más ampliamente empleados y establecidos en la mayoría de los laboratorios, y que han demostrado 58 sobradamente su rendimiento en determinado tipo de muestras. Protocolo «Fenol:cloroformo» Este protocolo es una adaptación del procedimiento estándar de extracción de ADN por fenol:cloroformo79 , en el cual las muestras son digeridas con proteinasa K y un detergente como Triton X-100 o SDS, que rompe las membranas celulares. El digerido es mezclado con una solución de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:25:1), paso que es repetido hasta eliminar la coloración. Se ha escrito mucho sobre esta coloración «marronácea» del extracto29,35,60,76 , pero no siempre existe coloración y, si existe, no siempre se consigue eliminar. De la fase anterior de fenolización se descarta la fase orgánica. Dependiendo del protocolo aplicado, para eliminar las trazas de fenol, se puede añadir una solución de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1). La fase acuosa, que contiene el ADN se trasvasa a un tubo limpio. A partir de este punto, el protocolo estándar incluía una fase de precipitación con acetato amónico y etanol absoluto frío, pero los últimos protocolos desarrollados introducen la concentración en pequeños volúmenes usando sistemas de filtración por centrifugación54,69,74 . Dicha concentración se realiza mediante dispositivos de ultrafiltración80,81 , que permiten la retención selectiva del ADN extraído. Aunque la fase acuosa normalmente se encuentra por encima de la fase orgánica durante la extracción de fenol:cloroformo, es importante indicar que, en ocasiones, altas concentraciones de sales pueden causar inversión de fase82 . Este hecho podría darse en el caso de extractos a partir de RO, debido a la composición de la propia matriz ósea y, en ocasiones, a las condiciones de preservación. No obstante, suele ser bastante marginal. Protocolo «Silica-sal» Aunque este protocolo fue inicialmente descrito por Höss y Pääbo83 , adaptado de Boom et al.84 , ha sufrido muchas modificaciones a lo largo de los años85 . La última y mejorada versión es de Rohland y Hofreiter70 ; ha sido ampliamente testada en comparación con otros métodos66 y finalmente adaptada para estudios a gran escala86 . Este protocolo se fundamenta en la adición al polvo de hueso/diente de una solución de extracción (extraction buffer), consistente en EDTA y proteinasa K, y su incubación toda la noche. Al sobrenadante obtenido se le añade una solución de unión (binding buffer) de base de tiocianato de guanidinio (GuSCN) concentrado y cloruro o acetato sódico (NaCl/Ac), y la suspensión de silica, todo lo cual se incuba en oscuridad. Para muestras que no contienen inhibidores de la PCR, se pueden usar otras sales diferentes al GuSCN, como por ejemplo el cloruro sódico66 . Estas sales no caotrópicas son mucho más baratas y actúan igual de bien o incluso mejor en términos de recuperación de ADN. Sin embargo, tienden a copurificar inhibidores de la PCR y, por tanto, no deben ser usadas con muestras que probablemente contengan inhibidores70 . El siguiente paso es el de purificación y elución, en el que, una vez descartado o almacenado el sobrenadante (el cual puede pasar por un nuevo proceso de binding), al precipitado de silica se le somete a lavados sucesivos con solución P.A. Barrio-Caballero de lavado (washing buffer) de base etanólica (EtOH 50%, NaCl y EDTA). Y finalmente se le añade la cantidad requerida de tampón TE para eluir el ADN retenido en la silica. Aunque se trate de un método largo y, en algunos puntos complejo, se ha demostrado su rendimiento en la obtención de ADN66 , sobre todo en la obtención de un ADN libre de inhibidores. En la actualidad, hay disponibles columnas comerciales en las cuales se introduce la suspensión de silica o «glass-milk», a través de los cuales se hace pasar el digerido60,86 , que permiten simplificar y estandarizar este método, automatizándolo y miniaturizándolo. Protocolo «Desmineralización-silica» (International Commission on Missing Persons) Este protocolo podría ser considerado como una variación del anterior, pues se basa también en la retención en silica (comercial), aunque no incluye la sal GuSCN. Se valora de forma independiente, pues es el procedimiento operativo estándar de la Comisión Internacional de Personas Desaparecida (International Commission on Missing Persons [ICMP])61,87 . Es similar a otros recientemente publicados88,89 , y ha sido perfeccionado gracias al desarrollo de multitud de proyectos de identificación de personas desaparecidas en todo el mundo61,90,91 . Presenta 2 claves fundamentales: la digestión completa, aumentando la proporción de tampón de digestión y polvo de hueso; y la eliminación de inhibidores, mediante la purificación con resina. Una vez pretratada la muestra, el método consiste en una digestión inicial de toda la matriz ósea, lo que supone una desmineralización total de la misma. Es decir, no se pasa a la siguiente fase hasta que casi no quede ningún resto de matriz ósea61 . El tampón de desmineralización consiste básicamente en EDTA (0,5 M), N-laurilsacnosinato sódico (1%) y proteinasa K. Una vez digerido, el sobrenadante es filtrado en dispositivos de ultrafiltración92 , y el volumen recuperado pasa a ser procesado siguiendo las especificaciones de la casa comercial del kit QIAquick® 92 , con algunas modificaciones introducidas por la ICMP61 . Aunque este kit comercial ha sido diseñado para la purificación de productos de PCR, según los autores61 parece ofrecer un buen rendimiento en la purificación de ADN total. Además, proponen un proceso de «repurificación»61 , en aquellos casos extremos en los que se detecte la copurificación de inhibidores durante el proceso de extracción (a través de algunos métodos de cuantificación de ADN humano o en la posterior obtención de perfiles). Este proceso puede ser aplicado tanto en este protocolo de extracción como en extractos obtenidos a partir de otros protocolos. El proceso de «repurificación» consiste en procesar de nuevo el extracto con el kit QIAquick® 81 , siguiendo prácticamente las especificaciones de la casa comercial. Protocolo «Fishing» (purificación) Este método de extracción está basado en la hibridación y separación magnética que proporciona ADN puro sin ningún inhibidor detectable71,93 . Previo al propio proceso de «captura de ADN», la muestra (polvo de hueso/diente) es sometida inicialmente a una extracción con el tampón estándar ampliamente descrito (EDTA, SDS y proteinasa K). El sobrenadante obtenido se somete de forma repetitiva a una solución de unión y lavado (binding/washing buffer) y Revisión de métodos de extracción de ADN a partir de restos óseos en el laboratorio forense 59 Tabla 1 Tabla resumen con las ventajas e inconvenientes de cada uno de los protocolos de extracción de ADN a partir de muestras de restos humanos esqueletizados Protocolo «Fenol:cloroformo» Protocolo «Silica-sal» (GuSCN) Protocolo «Desmineralización-silica» (ICMP) Protocolo «Fishing» (purificación) Ventajas Mayor cantidad de ADN (rendimiento) Pureza (eliminación de compuestos orgánicos) Mayor posibilidad de obtener un perfil genético Eliminación eficiente de inhibidores de la PCR Mayor posibilidad de obtener un perfil genético Eliminación eficiente de inhibidores de la PCR Posibilidad de automatización Permite procesado a gran escala Eliminación eficiente de inhibidores de la PCR Protocolo rápido (todo el procesamiento se puede realizar en un día) y sencillo Procesado de elevado número de muestras (hasta 16 muestras en una única tanda) Automatización Procedimiento largo Posibilidad de contaminación cruzada Aún no ha sido validado para su automatización Procedimiento habitual en la mayoría de los laboratorios (simplifica su uso) Inconvenientes No eliminación completa de inhibidores de la PCR Uso de disolvente orgánicos (muy tóxicos) Procedimiento complejo (aunque se han conseguido estrategias de simplificación) Menor cantidad de ADN recuperado Elevado coste, fundamentalmente por el uso de sistemas automatizados Procedimiento largo posterior filtrado, manteniéndolo finalmente en dicha solución. El siguiente paso consiste en la incubación de la muestra con iniciadores (primers) marcados con biotina, para posteriormente inmovilizar el ADN en partículas magnéticas recubiertas de estreptavidina, usando un concentrador de partículas magnéticas. El ADN inmovilizado es lavado con la solución anterior y con otras soluciones que contienen KCl. Finalmente, el ADN es resuspendido en agua ultrapura u otro tampón (como TE), para así poder almacenar el extracto de ADN que vaya a ser utilizado en los siguientes pasos de amplificación por PCR. En la actualidad, existen multitud de kits comerciales basados más o menos en este método, y que permiten una agilización, estandarización y automatización del procedimiento. De este modo, se pueden destacar los siguientes kits comerciales orientados a su uso forense: - El PrepFilerTM Forensic DNA Extraction Kit (Applied Biosystem Inc.94 ) es un sistema con una química que permite una unión específica del ADN a partículas magnéticas y la posterior elución del mismo altamente eficiente, con la capacidad de eliminar inhibidores y adaptarlo a sistemas automáticos. Un punto interesante es precisamente la posibilidad de automatización con su propio sistema AutoMate ExpressTM Forensic DNA Extraction System (Applied Biosystem Inc.95 ), en el que todos los reactivos del kit vienen en cartuchos individuales (Applied Biosystem Inc.96 ), y que permite procesar hasta 13 muestras en una única tanda, sin apenas intervención manual. - El DNeasy® Tissue Kit (QIAGEN Inc.97 ) tiene un protocolo ajustado a muestras de hueso98 . De este surgió la aplicación directa al campo forense, QIAamp® DNA Investigator (QIAGEN Inc.99 ), asimismo con su protocolo específico para huesos y dientes. Este kit también posee una adaptación para su automatización con su propio sistema, el BioRobot® EZ1 (QIAGEN Inc.100 ), con los reactivos en cartuchos individuales101 , y que permite procesar en una única tanda desde 6 muestras (EZ1 y EZ1 Advanced) hasta 14 (EZ1 Advanced XL), según el modelo de equipo empleado. - Por último, el DNA IQTM System (Promega102,103 ), que usa una resina paramagnética patentada para purificar el ADN. Posee también su propio sistema de automatización, el Maxwell® 16 Forensic Instrument (Promega104 ), que con cartuchos individuales105 puede procesar en una única tanda hasta 16 muestras. Pero, además, este sistema ha sido probado con estaciones de trabajo de otras casas comerciales, como: Beckman Coulter Biomek® NXP106 , Tecan Freedom EVO® 100107 , Biomek® 3000108 , o el sistema en soporte sólido SlicprepTM 96 Device109 . Para el caso específico de huesos, es interesante señalar que tanto los kits PrepFilerTM (Applied Biosystem Inc.94 ) como el DNA IQTM System (Promega103 ), aparte de sus propios reactivos, en la fase de lisis señalan la necesidad de incluir DTT (agente reductor). No queda claro la justificación de su empleo y si el mismo ofrece un rendimiento significativamente mejor en la obtención de cantidad y calidad de ADN. No obstante, es interesante reseñar el estudio comparativo realizado por Rohland y Hofreiter66 , en el que, aunque no detectaban diferencias estadísticamente significativas, sí hallaban que la adición de DTT parecía mostrar un ligero efecto positivo sobre la cantidad de ADN recuperado. Valoración final de los métodos de extracción de ADN considerados En el caso de la identificación genética de restos humanos esqueletizados, uno de los principales factores limitantes, 60 además de la degradación y modificación del ADN, es la presencia de inhibidores de la PCR. Por ello, el proceso de extracción de ADN constituye un paso primordial, igual que en el mismo sean eliminados en la medida de lo posible dichos inhibidores. Algunos estudios60,66 han señalado al método de extracción de ADN basado en silica-sal como el más ventajoso frente al método de fenol:cloroformo, porque todo aquello que no se une a la silica es eliminado mediante lavados. Similares ventajas ofrece el protocolo desarrollado por la ICMP61 , basado también en la purificación con silica, el cual viene avalado por años de aplicación y perfeccionamiento, y miles de identificaciones en todo el mundo61,88,89 . Sin embargo, algunos investigadores60 han encontrado que este tipo de ADN no se une a la silica tan eficientemente como el «ADN fresco», probablemente porque el ADN en este tipo de muestras puede estar dañado. Por ello, el método de fenol:cloroformo podría extraer mayor cantidad de ADN (tabla 1). No obstante, según diversos estudios, el método silica-sal66,70 o el de «desmineralización-silica» de la ICMP61 ofrecen un mayor porcentaje de muestras extraídas y amplificadas exitosamente. Este mayor rendimiento en relación cantidad/calidad del ADN recuperado, hacen a estos protocolos especialmente indicados en la casuística forense. Además, como ventaja adicional, estos métodos eliminan el uso de disolventes orgánicos (fenol:cloroformo) propios del método estándar de extracción y que son perniciosos para la salud del investigador (tabla 1). No obstante, debido a la alta cantidad de ADN recuperado con el método fenol:cloroformo, y a la limpieza en inhibidores de la PCR de los métodos comerciales (automatizados o no), se podría plantear una estrategia combinada de métodos, en función de las peculiaridades de cada muestra analizada. De este modo, en aquellas muestras que se presupusiera una alta cantidad de inhibidores, se podría aplicar el método de fenol:cloroformo, para la obtención de la mayor cantidad de ADN posible. Y una vez extraído, junto con los posibles inhibidores que no hubieran sido eliminados, el extracto resultante, se podría purificar mediante un sistema automatizado de «captura de ADN», o mediante la «repurificación» planteada en el protocolo de la ICMP61 . Mediante dichos métodos se lavarían los restos de posibles inhibidores existentes. En cualquier caso, si se sospecha que serán mínimas las cantidades de ADN existentes en la muestra, se hace recomendable la aplicación directa del método silica-sal66,70 o el de «desmineralización-silica» de la ICMP61 . En definitiva, el analista deberá valorar el método de extracción de ADN a partir de restos esqueletizados más apropiado a emplear, en función de las características y condiciones de la muestra que llegue al laboratorio. Conflicto de intereses El autor declara no tener ningún conflicto de interés. Agradecimientos El autor quiere mostrar su agradecimiento a M. José Escudero por sus aportaciones en los aspectos jurídicos, así como a Eva Fernández por sus comentarios y perspectiva desde el estudio del ADN antiguo. Además, quiere mostrar su más sincero agradecimiento a Manuel Crespillo y Miguel Paredes, P.A. Barrio-Caballero por su profunda revisión y aportaciones, que indudablemente han completado y mejorado el texto. Y por último, agradecer también a los revisores anónimos y editores sus comentarios y sugerencias para mejorar este manuscrito. Bibliografía 1. Mate R. Memoria de Auschwitz. Madrid: Editorial Trotta; 2003. 2. Vallejo G, Alonso A. La identificación genética en grandes catástrofes: avances científicos y normativos en España. Rev Esp Med Legal. 2009;35:19---27. 3. Crespillo M, Bañón R, Valverde JL. Aprendizaje y reflexiones de la identificación de cadáveres mediante marcadores genéticos monoparentales (ADN mitocondrial, cromosoma Y). A propósito de un caso. Rev Esp Med Legal. 2011;37:17---21. 4. Real Decreto de 24 de julio de 1889, por el que se publica el Código Civil. Boletín Oficial del Estado (Gaceta de Madrid), 25 de julio de 1889, núm. 206, p. 249---312. 5. Ley Orgánica 10/1995, de 23 de noviembre, del Código Penal. Boletín Oficial del Estado, 24 de noviembre de 1995, núm. 281, p. 33987---34058. 6. 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