Artículo2 - A natural knockout of theMYO7Agene leads to pre-weaningmortality in pigs (1) (1).en.es

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COMUNICACIÓN CORTA
doi: 10.1111/edad.13068
Un nocaut natural de laMYO7Agen conduce a la mortalidad antes del
destete en cerdos
Derks de la MFL*,†
, H.-J. Megens*, WL Giacomini‡, MAM Groenen* y MS Lopes†,‡
* Cría de animales y genómica, Universidad e investigación de Wageningen, Wageningen, Países Bajos.†Centro de Investigación Topigs
Norsvin, Beuningen, Países Bajos.‡Topigs Norsvin, Curitiba, Brasil.
Resumen
El sistema de cría de cerdos proporciona un marco único para estudiar los defectos recesivos y las
consecuencias sobre el fenotipo. Examinamos una población Duroc sintética comercial en busca
de defectos recesivos e identificamos un haplotipo en el cromosoma 9 que afecta
significativamente la mortalidad antes del destete. Para identificar la variante causal subyacente a
la mortalidad, examinamos los datos de secuencia de cuatro animales portadores y 21 animales
no portadores de la misma población. Los resultados arrojan una fuerte variante causal stop-gain
candidata (NM_001099928.1:c.541C>T) que afecta elMYO7Agen en completo desequilibrio de
ligamiento con el haplotipo letal. La variante conduce a una proteína MYO7A alterada (p.Gln181*)
que trunca 2032 aminoácidos de la proteína. Examinamos una camada de una cerda portadora
inseminada por un verraco portador. De los lechones resultantes, dos lechones homocigotos
confirmados sufrieron graves dificultades de equilibrio y la incapacidad de caminar correctamente.
La variante se segrega con una frecuencia de portadores del 8,2 % en la población evaluada y se
eliminará gradualmente de la población, mejorando el bienestar animal. Finalmente, este 'golpe
de gracia natural' aumentará nuestra comprensión del funcionamiento delMYO7Agen y
proporciona un modelo potencial para el síndrome de Usher en humanos.
Palabras clavereproducción animal, bienestar animal, pérdida de función, mortalidad,MYO7A,síndrome
de ujier
En la cría de cerdos, los defectos recesivos a menudo pasan
parámetro de tamaño se estableció en 150 (Browninget al.2018).
desapercibidos ya que la frecuencia de la variante asociada suele ser
Posteriormente, aplicamos un enfoque de ventana deslizante para
baja y el efecto sobre la población es marginal (Harliziuset al.2020).
identificar haplotipos con un déficit en homocigosidad de manera
No obstante, con la creciente disponibilidad de datos de secuencias y
similar a la aplicada en Derks.et al. (2019). Específicamente, nos
genotipos, incluso los defectos de frecuencia relativamente baja
movimos a lo largo del genoma en pasos de 500 kb, 1 Mb y 1.5 Mb
pueden identificarse y mapearse la variante causal (Derkset al. 2019).
para probar los haplotipos que mostraban un déficit en
homocigosidad aplicando una prueba binomial exacta (pag <0,05).
En este estudio, examinamos 14 160 (10 402 verracos, 3758
Se descubrió una región candidata fuerte al comienzo del
cerdas) animales genotipados (chip Porcine 50K SNP) de una
cromosoma 9 (6–15 Mb, Tabla S1). Un haplotipo (11,0–12,0 Mb,
población Duroc sintética. La posición de los SNP se basó en la
frecuencia: 4,1 %) mostró el déficit más significativo en
Sus scrofa11.1 genoma de referencia (Warret al. 2020).
homocigosidad, ya que se esperaban 24 homocigotos pero solo se
Retuvimos 43 026 SNP con una tasa de llamadas > 0,90, una
observó uno (Tabla 1). Para proporcionar más evidencia de una
frecuencia de alelo menor > 0,01 y sin una fuerte desviación del
variante letal recesiva que se segrega en este haplotipo, examinamos
equilibrio de Hardy-Weinberg (PAG >1910-6) usando
31 camadas anteriores de portador por portador y observamos una
ENLACEsoftware
disminución significativa del 23% en la supervivencia antes del
v1.90b6.5 (Purcellet al.2007). Luego, escalonamos e
imputamos los genotipos usandoBEAGLESoftware 5.0 que utiliza la
destete (Tabla 2). Las 31 camadas produjeron un total de 316
configuración predeterminada, excepto que la población efectiva
lechones (281 nacidos vivos, Tabla S2). De los 281 lechones nacidos
vivos, 81 no sobrevivieron al período de lactancia (29%, Tabla S3).
Sesenta y seis de 81 murieron dentro de los primeros 5 días,
Dirección para la correspondencia
mientras que algunos vivieron hasta el final del período de lactancia.
MFL Derks, Animal Breeding and Genomics, Wageningen University &
Sin embargo, no está claro si los animales que vivieron hasta el final
Research, PO 338, 6700AH, Wageningen, Países Bajos. Correo electrónico:
del período de lactancia (23 días) eran homocigotos para el
[email protected]
haplotipo. Además, de 38 lechones (que murieron
Aceptado para publicación el 2 de abril de 2021
514
©2021 Los Autores.genética animalpublicado por
John Wiley & Sons Ltd en nombre de la Fundación Internacional Stichting para la Genética Animal,52,514–517 Este es un
artículo de acceso abierto bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso,
distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que se cite debidamente la obra original.
MYO7A knockout natural en cerdos
tabla 1Características del haplotipo SSC9.
secuencia de codificación de genes, tres eran sinónimos (se predijo
que tendrían un impacto bajo) y se predijo que uno tendría un
SSC9: 11,0–12,0
Posición, MB
34
1156
23.6
1
Número de marcadores
Nº de portadores de haplotipos
Homocigotos esperados (HWE)
Homocigotos observados
impacto alto (Tabla S6). La variante de alto impacto es una variante
stopgained (g.11280403C>T) en elMYO7Agene. Los cuatro animales
portadores eran heterocigotos para la variante con ganancia de
parada, mientras que los no portadores de la misma raza eran
5.83e-11
Prueba binomial exacta
Frecuencia de carga %
C9Apareamientos C
Genes en la región
8,2%
31
homocigotos para el alelo de referencia. La variante
ACER3, B3GNT6, CAPN5,
MYO7A, PAK1
en la posición p.Gln181* en la proteína (Fig. 1a,b), lo que da como
(NM_001099928.1:c.541C>T) da como resultado un codón de parada
resultado una proteína MYO7A alterada y truncada (Fig. 1c). La
Homocigotos esperados y observados para el haplotipo en SSC9, también se
proteína MYO7A mutante carece de los 2032 aminoácidos finales y es
muestran los genes en la ventana.
probable que perjudique completamente la función de la proteína.
También examinamos la presencia de variaciones estructurales, pero
Tabla 2Las camadas portadoras por portadoras muestran una disminución del 23 % en la supervivencia antes del
destete en comparación con las camadas portadoras por no portadoras.
Estado
norte9norte
C9norte
C9C
no se descubrieron variantes estructurales causales candidatas en la
región del haplotipo.
Para evaluar más a fondo la consecuencia del haplotipo (y el
Promedio
Promedio
Parto
Destete
Nº camadas
nacido total
nacido vivo
% de supervivencia
% de supervivencia
portadora por portadora que parió el 1 de septiembre de 2020 en el
4556
777
31
10.29
10.31
10.19
9.36
9.28
9.06
90.61
89.28
87.90
89.55
90.41
69.99*
estado de Paraná, Brasil. La camada resultó en 11 lechones nacidos
candidatoMYO7Avariante stop-gained), examinamos una camada
vivos y uno muerto. Dos lechones murieron 2 días después, el 3 de
septiembre, y ambos lechones mostraron problemas del sistema
El período de destete corresponde a 21 días.
nervioso, es decir, temblores, dificultades para mantener el equilibrio
* PAG <0.01.
y dificultad para caminar (Video S1). Toda la camada se genotipó en
Los resultados significativos se indican en negrita.
el chip SNP de 25K y se imputó al Beadchip porcino de 50K. Ambos
lechones 'temblores' eran homocigotos para el haplotipo en el
durante el período de lactancia), se envió una causa de muerte al sistema.
cromosoma 9. De los nueve compañeros de camada restantes, cinco
Para 24 de los 38 lechones que murieron prematuramente a causa de los
eran heterocigotos para el haplotipo y cuatro no eran portadores
cruces de portador por portador, se marcó la "enfermedad nerviosa"
(incluido el lechón nacido muerto; Tabla S7).
como causa de muerte (Tabla S4). La enfermedad nerviosa generalmente
está indicada cuando los lechones tienen dificultad para mantener el
equilibrio y muestran un comportamiento 'inestable'.
A continuación, examinamos los datos de secuencia de cuatro
MYO7A es un miembro de la superfamilia de proteínas miosina (Li
et al.2020). Las miosinas son moléculas motoras basadas en actina
que exhiben actividad ATPasa y, por lo tanto, están involucradas en
animales portadores y 21 no portadores de la raza en estudio
los movimientos intracelulares. Las miosinas exhiben colas
para identificar la supuesta variante causal. Aplicamos un
divergentes que se unen a los compartimentos de la membrana, que
análisis similar al descrito en Derkset al. (2019). En resumen,
luego se mueven en relación con los filamentos de actina (Liet al.
eliminamos el adaptador y las secuencias de baja calidad con
2020).
Trimmomatic 0.39 (Bolgeret al.2014), mapeó las lecturas usando
BWA-MEM0.7.15
(Li & Durbin 2009), y usóSAMTOOLS1.9 para ordenar,
variantes enMYO7Aestán asociados con el síndrome de Usher
(sordoceguera) y otros tipos de sordera en humanos (OMIM: 276903;
fusionar e indexar los archivos bam (Liet al.2009). Realizamos
Koenekoopet al.1993). variantes en el MYO7Agen causante del
llamadas variantes usandoGRATISBAYESv1.3.1 con la siguiente
síndrome de Usher tipo 1B. Los individuos afectados suelen ser
configuración --min-base-quality 10, --min-alternate-fraction 0.2,
sordos al nacer y sufren una degeneración progresiva de la retina
- - haplotype-length 0, --min-alternate-count 2 (Garrison & Marth
durante la vida. Además, los pacientes suelen presentar una
2012). Descartamos variantes con calidad PHRED <20. Las
disfunción vestibular constante que conduce a dificultades de
variantes de secuencia resultantes se anotaron funcionalmente
equilibrio y experimentan problemas para caminar (Mathur & Yang
utilizando la tubería Ensembl Variant Effect Predictor
2015). Tenga en cuenta que el síndrome de Usher no es letal en
(compilación 99) (McLarenet al.2016). Además, llamamos
humanos. Sin embargo, en los cerdos, los lechones afectados serán
variantes estructurales usando elSUAVEcanalización v0.2.2 dentro
'seleccionados' o sacrificados (posiblemente debido principalmente a
de la región del haplotipo (-2 Mb; Pedersen 2020). Las
dificultades de equilibrio), lo que explica la ausencia de animales
estadísticas de secuencia para las 25 muestras en estudio se
homocigóticos en una población 'madura'. En ratones,MYO7A los
presentan en la Tabla S5.
nocauts muestran sacudidas de cabeza, sordera, defectos en la
Para identificar variantes causales putativas, realizamos un
retina y fertilidad masculina reducida (Williams 2008). Además, se
análisis LD entre las variantes de secuencia y el haplotipo
describió una mutación sin sentido en la raza de perro Doberman
utilizando Plink con la siguiente configuración --chr-set 18, --r2, --
pinscher asociada con sordera bilateral y disfunción vestibular (Webb
ld-window-r2 0.8 (Purcellet al.2007). El análisis arrojó 172
et al.2019). En la retina,MYO7Ajuega un papel importante en la
variantes causales candidatas. Cuatro variantes afectaron a la
renovación del fotorreceptor externo
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Derkset al.
Figura 1 (a)MYO7Amodelo de gen La ubicación del
sexto exón afectado se indica en rojo, las UTR se
indican en verde oscuro. (b) Ilustración de la variante
stop-gain. La figura muestra la alineación del exón
(c) de tipo salvaje y mutante de la secuencia de
proteína MYO7A mutante (Mt) y de tipo salvaje (Wt).
La variante induce un codón de parada prematuro
que conduce a una proteína MYO7A truncada.
discos, esenciales para la distribución y migración de los
rara en humanos, por lo que esta variante en cerdos podría ser
melanosomas y fagosomas del epitelio pigmentario de la retina, y en
de gran interés.
la regulación del transporte de opsina en los fotorreceptores de la
En conclusión, reportamos un nocaut natural del MYO7Agen,
retina (Mathur & Yang 2015). En el oído interno,MYO7Aes importante
proporcionando un modelo interesante para estudiar el síndrome de
para la diferenciación, morfogénesis y organización de los haces de
Usher. Mostramos que los lechones homocigotos para una variante
células ciliadas cocleares (Mathur & Yang 2015). Además,MYO7Aestá
stop-gain en elMYO7AEl gen sufre de dificultades de equilibrio que
involucrado en el tráfico de vesículas de células ciliadas de la
generalmente resultan en la muerte dentro de los primeros 10 días
ototoxicidad de los aminoglucósidos (Richardsonet al. 1997). En
después del nacimiento durante el período de destete. Además,
conjunto, esta evidencia indica al menos una copia funcional de
tenemos indicaciones de que la variante podría provocar sordera en
MYO7ASe requiere para una audición normal. Sin embargo, los
animales portadores heterocigotos (mayores), pero esto necesita
ratones knockout para shaker-1 no mostraron degradación de la
más investigación. Nuestro estudio muestra nuevamente que los
retina, pero sí hiperactividad, movimientos de cabeza y movimientos
crecientes recursos genómicos obtenidos en la industria de la
circulares debido a la disfunción vestibular (Gibsonet al.1995). Por lo
reproducción brindan un excelente conjunto de datos para estudiar
tanto, la inactivación de este gen conduce a una amplia gama de
variantes nocivas y sus consecuencias en el fenotipo.
síndromes que afectan principalmente a las disfunciones auditivas,
visuales y vestibulares.
En humanos y ratones, las variantes dominantes de pérdida de
función enMYO7Ase han descrito que causan sordera (Liu et al.1997).
Agradecimientos
El síndrome conduce a una forma de pérdida auditiva neurosensorial
Los autores agradecen a los empleados de Topigs Norsvin en Brasil
progresiva con inicio poslingual y algunas personas afectadas
por su ayuda en la recopilación de datos para validar nuestros
presentan síntomas vestibulares leves. Probamos si el portador
hallazgos.
siembre (desde el C9C camada arriba) reaccionó al ruido y observó
que la cerda no reaccionaba en absoluto al sonido, pero
definitivamente no estaba ciega (respondía a los estímulos visuales).
Conflicto de intereses
No se pudo determinar el inicio de la sordera y necesita más
MFLD, WLG y MSL son empleados del Centro de Investigación Topigs
investigación. Sin embargo, la pérdida de audición podría ser un
Norsvin, un instituto de investigación estrechamente relacionado con
fenotipo interesante en los cerdos y es de gran interés para la
uno de los patrocinadores (Topigs Norsvin). Todos los autores
industria de la cría de cerdos porque también puede estar asociada
declaran que los resultados se presentan en su totalidad y por lo
con un comportamiento anormal en los animales domésticos (Strain
tanto no presentan conflicto de intereses. Los otros socios de
2015).
Breed4Food, Cobb Europe, CRV, Hendrix Genetics, declaran no tener
El síndrome de Usher en humanos es causado principalmente por
intereses en competencia para este estudio.
variantes sin sentido y deleciones en el marco que afectan a varios
aminoácidos esenciales en la proteína MYO7A (Ronget al. 2014).
Además, las formas de sordera dominante y recesiva también son
causadas principalmente por variantes sin sentido, pero que afectan
a diferentes aminoácidos en comparación con el tipo de síndrome de
Usher (Liuet al.1997). Juntos, esto muestra una interacción compleja
entre las variantes genómicas y el fenotipo resultante. Las variantes
que causan una proteína MYO7A extremadamente truncada (como
se observa en este estudio) son
Fondos
Esta investigación fue financiada por STW-Breed4Food
Partnership, proyecto número 14283: De la secuencia al
fenotipo: detección de la variación perjudicial mediante la
predicción de la funcionalidad Este estudio fue financiado
por NWO-TTW y los socios de Breed4Food Cobb Europe,
CRV, Hendrix Genetics y Topigs Norsvin . el uso de la
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MYO7A knockout natural en cerdos
El clúster HPC fue posible gracias a CATAgroFood (Instalaciones de
Investigación Compartidas Wageningen UR).
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Acta-Bases moleculares de la enfermedad1852,406–20. McLaren
W., Gil L., Hunt SE, Riat HS, Ritchie GR, Thormann
Descargo de responsabilidad
Los datos utilizados en este estudio se han obtenido como parte de
la recopilación de datos de rutina de los programas de mejoramiento
de Topigs Norsvin, y no específicamente para el propósito de este
proyecto. Por lo tanto, la aprobación de un comité de ética no era
obligatoria. La recolección de muestras y el registro de datos se
realizaron estrictamente de acuerdo con la ley holandesa sobre
protección y bienestar animal (Gezondheids-en welzijnswet voor
dieren).
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Liu XZ, Walsh J., Tamagawa Y., Kitamura K., Nishizawa M., Acero
Información de soporte
Se puede encontrar información de apoyo adicional en línea
en la sección Información de apoyo al final del artículo.
Tabla S1.Haplotipos que muestran déficit en homocigosidad. Tabla
S2.Descripción general de 31 C9camadas C.
Tabla S3.Supervivencia de 281 lechones nacidos vivos de 31 C9
apareamientos C.
Tabla S4.Descripción de la causa de muerte de los lechones de C9
camadas C.
Tabla S5.Mapeo y estadísticas de cobertura a partir de
muestras WGS de la población Duroc sintética en estudio
(incluido el estado de portador).
Tabla S6.Variación genómica en LD alta con el
haplotipo SSC9.
Tabla S7.MYO7Ahaplotipo de la C9Camada con dos
individuos afectados (fecha de parto: 1 de septiembre de
2020).
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Vídeo S1.Video que muestra a ambos afectados después del
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©2021 Los Autores.genética animalpublicado por
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517