CÓDIGO: FO-DOC-112
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FECHA: 02/09/2016
VIGENCIA: 2016
UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS
PROCESO GESTION DE APOYO A LA ACADEMIA
FORMATO GUÍA PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO
LABORATORIO DE QUIMICA
UNIDAD ACADEMICA:
Departamento de Biología y Química
CURSO:
Bioquímica
PRACTICA Nº 020:
EFECTO DEL TIEMPO DE REACCION Y CONCENTRACCION DE ENZIMA.
1. OBJETIVOS
Determinar la actividad enzimática de la catalasa sobre el peróxido de hidrogeno.
Observar el efecto del tiempo de reacción en la actividad catalítica.
Observar el efecto de la concentración de enzima sobre la actividad catalítica.
2. CONSULTA PREVIA
Consulte y describa con el mayor detalle posible como es la estructura de la catalasa (puede incluir una imagen
impresa)
Cuál es el código y a que grupo de enzimas pertenece la catalasa.
Consulte para la catalasa, proveniente de cualquier especie que usted desee, cuáles son las condiciones
óptimas (pH, temperatura, etc.) para la acción catalítica de esta. A su vez debe de indicar como realizo la
consulta.
Balance la siguiente reacción: H2O2 + KMnO4 + H2SO4------- > K2SO4 + MnSO4 + H2O + O2
¿Qué papel juega el ácido sulfúrico en esta práctica?
3. FUNDAMENTO TEORICO
Catalasa: Estructura y función
La enzima catalasa hace parte de la mayoría de organismos actuando como un mecanismo de defensa frente el
anión radical de superoxido dismutasa es la primera línea de defensa en contra del O2. Esta convierte el ion
superoxido a peróxido de hidrogeno, el cual también es una sustancia bastante toxica para las células. Luego
actúa catalasa, siendo esta responsable de convertir el peróxido de hidrógeno en agua y oxigeno:
En la segunda reacción, representada arriba, el peróxido de hidrogeno sufre tanto una oxidación como una
reducción. Se piensa que es un proceso que ocurre en dos pasos y la catalasa está involucrada en ambos.
En el primer paso una molécula de peróxido de hidrogeno se reduce a agua y la catalasa es oxidada al
complejo l. la segunda molécula de peróxido de hidrogeno es oxidada en el segundo paso y el complejo l es
reducido regenerándose así la catalasa:
La reacción de descomposición sigue una cinética de primer orden dentro de tiempos de reacción cortos (<3
min) y a altas concentraciones de enzima. Además del mecanismo descrito anteriormente, la catalasa es
gradualmente oxidada por el peróxido de hidrogeno de manera irreversible, así de grandes periodos de
reacción o soluciones diluida de enzima resulta en desviaciones del comportamiento de primer orden.
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En esta práctica constara de dos partes, en la primera se obtendrán la enzima a partir de la sangre y se
determinara la cantidad óptima de enzima a utilizar así como la determinación del tiempo de reacción adecuado
para los análisis. Luego de estudiados estos parámetros, la segunda parte de la práctica consistirá en estudiar
la actividad catalítica en función de la concentración de sustrato y determinación las condiciones óptimas de
trabajo de esta enzima (pH y T) junto con la evaluación del efecto de un inhibidor sobre la actividad catalítica de
la catalasa.
4. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS
Equipos y/o montajes
Nevera de icopor o tina
Materiales
lanceta esterilizada (1)
Reactivos
Buffer fosfatos 0.02 M, pH 7.0 (100 mL)
Vasos de 50 mL (1)
Peróxido de hidrogeno (H2O2) 0.05 M recién
preparada en el buffer de pH 7.0 (30 mL)
Vasos de 250 mL (1)
Vasos de 400 mL (2)
H2SO4 6N (20 mL)
KMnO4 0.005 M (valorado; 30 mL)
Agitador de vidrio (1)
Agua destilada (20 mL)
Gradilla (1)
Tubos de ensayo 25x200 (5)
Pipeta de 1 mL graduada (1)
Pipeta de 2 mL aforada (1)
Pipeta de 10 mL graduada (1)
Pipetiador (1)
Erlenmeyer de 100 mL (5)
Bureta de 25 mL (1)
Pinza para bureta (1)
Soporte universal (1)
Sangre
Cronometro
Papel milimetrado o computador
con Excel
Bolsa para congelar agua
(deben traerlas el día anterior)
Los reactivos se deben encontrar refrigerados (a excepción del H2SO4 6N) y son entregados a cada grupo las
cantidades recomendadas en la tabla.
Deben encontrarse previamente refrigerados.
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5. PROCEDIMIENTO O METODOLOGÍA
Nota aclaratoria:
a. Todo el material, en especial los tubos de ensayo, deben estar muy bien lavados para evitar
interferencias.
b. La práctica debe realizarse a una temperatura de 4°C (baño de hielo), por lo tanto los reactivos que
se van utilizar y los tubos deben de estar a esta temperatura.
c.
Deben mezclar los reactivos COMPLETAMENTE cuando se le indique.
d. Los tiempos de medida deben ser exactos y registrados.
e. Todas las medidas deben ser hechas de la mejor forma posible utilizando el material adecuado.
f. Recuerde este laboratorio es cuantitativo y no cualitativo.
5.1 Preparación del extracto de catalasa
a. A 20 mL de agua destilada enfriada agregue 3 gotas de sangre fresca, obtenida mediante punciones en
un dedo con una lanceta esterilizada.
b. Agitar suavemente y colocar en un baño de hielo.
Este extracto contiene la enzima a ensayar y esta se debe conservar durante la práctica en el baño de hielo y
utilizarla lo más rápido posible.
5.2 Detección de la actividad enzimática
Se detectará la actividad enzimática de la catalasa (luego de agregarle ácido sulfúrico) mediante titulación del
peróxido de hidrogeno remanente en cada tubo de ensayo, empleando permanganato de potasio (0.005 M). La
ecuación que describe el método de detención es la siguiente:
O escrita en su forma iónica neta
Esta ecuación correctamente balanceada permitirá realizar los cálculos necesarios para el desarrollo de la
práctica.
5.2.1 Determinación del volumen de enzima
Rotule adecuadamente los tubos de ensayo
Siga el esquema de trabajo mostrado en la tabla 1, adicionando los reactivos en cada tubo de acuerdo al orden
propuesto. MEZCLE MUY BIEN.
Esperare el tiempo indicado (1 min) para añadir el ácido. MEZCLE MUY BIEN
TITULACION CON LA SOLUCION DE PERMANGANATO
1. Para la titulación debe transferir el contenido de cada tubo a un Erlenmeyer debidamente rotulado (utilice
uno para cada tubo)
2. Agregue gota a gota el permanganato de potasio de la bureta al Erlenmeyer para titular el peróxido de
hidrogeno remanente hasta el punto final.
3. El punto final de la titulación se alcanza cuando aparezca un color rosado permanente (30s).
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4. Registre el volumen utilizado de KMnO4 para cada tubo y realice los cálculos indicados para completar la
tabla 2.
5. Realice una gráfica de concentración de enzima versus actividad enzimática (micromoles de H2O
descompuestas/min/mL de enzima).
6. A partir de esta grafica determine cuál es el volumen de enzima óptimo. Este será el valor de volumen de
enzima que se empleara a lo largo de la práctica.
Nota: Se recomienda que realice medidas tubo por tubo, es decir solo debe empezar con el siguiente tubo
cuando ya haya terminado con el análisis completo anterior.
Tabla 1. Evaluación del efecto de la concentración de enzima
Reactivo (mL)
Tubo
Tubo A
Tubo B
Tubo C
Tubo D
Buffer fosfato
10,2
10
9,5
8,5
H2O2 en buffer
2
2
2
2
Enzima
0,3
0,5
1
2
Tiempo (min)
1
1
1
1
H2SO4 6N
2
2
2
2
Vol KMnO4 gastado
mol H2O2 iniciales
mol H2O2 residuales
mol H2O2 descompuestas
mol H2O2 descompuestas/ min/mL de
enzima
5.2.2 Determinación del tiempo óptimo de reacción
Rotule adecuadamente los tubos de ensayo
Siga el esquema de trabajo mostrado en la tabla 2, adicionando los reactivos en cada tubo de acuerdo al orden
propuesto. MEZCLE MUY BIEN
Espere el tiempo indicado para añadir el ácido (en este caso varia según el tubo). MEZCLE MUY BIEN
TITULACION CON LA SOLUCION DE PERMANGANATO
Para la titulación debe transferir el contenido de cada tubo a un Erlenmeyer debidamente rotulado (utilice uno
para cada tubo)
Agregue gota a gota el permanganato de potasio de la bureta al Erlenmeyer para titular el peróxido de
hidrogeno remanente hasta el punto final.
El punto final de la titulación se alcanza cuando aparezca un color rosado permanente (30s).
Registre el volumen utilizado d KMnO4 para cada tubo y realice los cálculos indicados para completar la tabla 2.
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Realice
una
gráfica
de
tiempo de reacción
versus
actividad
enzimática (micromoles
de
H2O2
descompuestas/min/mL de enzima).
A partir de esta grafica determine cuál es el tiempo de reacción óptimo. Este será el tiempo que se empelara a
lo largo de la próxima práctica.
Nota: Se recomienda que se realice medidas tubo por tubo, es decir solo debe empezar con el siguiente tubo
cuando ya haya terminado el análisis completo anterior.
Tabla 2. Evaluación del tiempo de reacción
Reactivo (mL)
Tubo A
Tubo B
Tubo C
Tubo D
Tubo E
Buffer fosfato
10
10
10
10
10
H2O2 en buffer
2
2
2
2
2
Enzima
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
Tiempo (min)
0
1
2
4
6
H2SO4 6N
2
2
2
2
2
Vol KMnO4 gastado
mol H2O2 iniciales
mol H2O2 residuales
mol H2O2 descompuestas
mol H2O2 descompuestas/
min/mL de enzima
7. RESULTADOS
Serán entregados, de la forma en que el docente expuso la metodología de presentación de informes de
laboratorio.
8. CUESTIONARIO PARA EL INFORME
Diseñe un protocolo de laboratorio que le permitan determinar los siguientes parámetros para la catalasa: a.
Temperatura b. pH optimo, c. Constante de Michaelis (Km) y velocidad máxima (Vmax), d. Efecto de un
inhibidor sobre la actividad enzimática.
9. BIBLOGRAFIA
Kimbrough, D.R.; Magoun, M.A.; Langfur M.A Laboratory Experiment Investigating Differente Aspects of
catalase Activity in an Inquiry- Based Approach, J. Chem. Educ. 1997, 74 (2), 210.
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