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Revista de materiales peligrosos 432 (2022) 128673
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La exposición a los microplásticos de poliestireno reduce la regeneración y el crecimiento
de las planarias
a
Tianyu Gao a, d, 1, Bingbing Sol b,e,g,1, Zhenbiao Xu c,1, Qiaoyun Chen , Meng Yang
qinli-wan
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b
C
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F
a
,
Canción de Linxia
C
a
,
ser,*
, Guo Chen , a,e,** Chunxiad,e
Jing, Eddy Y. Zeng,
Guang Yang
F
Departamento de Biología de Patógenos, Facultad de Medicina, Universidad de Jinan, Guangzhou 510632, China
Escuela de Medio Ambiente, Universidad de Jinan, Guangzhou 510632, China
Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad Tecnológica de Shandong, Zibo 255049, China
Departamento de Epidemiología, Facultad de Medicina, Universidad de Jinan, Guangzhou 510632, China
Laboratorio clave de salud y contaminación ambiental de Guangdong, Universidad de Jinan, Guangzhou 510632, China
Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular, Facultad de Medicina, Laboratorio Clave de Biología Molecular Tumoral del MOE, Universidad de Jinan, Guangzhou
510632, China g
Laboratorio Estatal de Protección Ambiental Clave de Evaluación de Riesgos para la Salud de la Contaminación Ambiental, Instituto de Ciencias Ambientales del Sur de China, Ministerio de
Ecología y Medio Ambiente, Guangzhou 510655, China
DESTACAR
GRÁFICAMENTE ABSTRACTO
• Los microplásticos ingeridos se distribuyeron
principalmente en los intestinos de las planarias.
• La exposición a microplásticos retrasó el
crecimiento y la regeneración de las planarias. •
Se inhibieron la proliferación y diferenciación de
células madre y la apoptosis. • La exposición a
los microplásticos indujo la respuesta al estrés
oxidativo de las planarias.
INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO
RESUMEN
Editora: Teresa AP Rocha-Santos
Los posibles efectos adversos de los microplásticos (MP) en los ecosistemas y la salud humana han recibido mucha atención en los
Palabras clave:
organismos de agua dulce, especialmente con respecto a la reparación y regeneración de tejidos y el deterioro de las funciones de las
últimos años. Sin embargo, solo se dispone de datos limitados sobre los mecanismos de captación, distribución y efectos de las MP en
planaria
Microplástico
Célula madre
Toxicidad
Regeneración
células madre. Para abordar esta brecha de conocimiento, llevamos a cabo experimentos de exposición en los que las planarias
(Dugesia japonica) se expusieron a poliestireno (PS)-MP mezclado en homogeneizado de hígado y examinaron el crecimiento y la
regeneración de tejidos, las funciones de las células madre y el estrés oxidativo. Las áreas del cuerpo y del blastema disminuyeron tras
la exposición a PS-MP, lo que indica que el crecimiento y la regeneración de las planarias se retrasaron. Se inhibieron los procesos de
proliferación y diferenciación de células madre y disminuyó la proporción de células madre mitóticas, lo que puede estar relacionado
con la activación de las vías de señalización TGFÿ/SMAD4 y Notch. La mejora de las actividades de las enzimas antioxidantes y el
malondialdehído en el primer día de exposición a las PS-MP confirmó la respuesta al estrés oxidativo de las planarias a las PS-MP. El
presente estudio demostró la
* Autor para correspondencia en: Escuela de Medio Ambiente, Universidad de Jinan, Guangzhou 510632, China.
** Autor para correspondencia en: Departamento de Biología de Patógenos, Facultad de Medicina, Universidad de Jinan, Guangzhou 510632, China.
Direcciones de correo electrónico: [email protected] (EY Zeng), [email protected] (G.Yang).
1
Estos autores han contribuido igualmente a este trabajo y comparten la primera autoría.
https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2022.128673 Recibido el
14 de enero de 2022; Recibido en forma revisada el 23 de febrero de 2022; Aceptado el 9 de marzo de 2022 Disponible
en línea el 15 de marzo de 2022
0304-3894/© 2022 Elsevier BV Todos los derechos reservados.
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probabilidad de biotoxicidad inducida por PS-MP. Estos resultados proporcionarán pistas para futuras investigaciones sobre los riesgos
potenciales de las PS-MP para las células madre humanas.
1. Introducción
regeneración y crecimiento de planarias. La expresión génica relacionada con las
células madre, la apoptosis y el estrés oxidativo se pueden utilizar para explorar
La invención de los plásticos ha proporcionado comodidad a la vida diaria. Con
los daños y las causas de las células madre (Khan y Panda, 2007). Se evaluaron
la creciente demanda de productos plásticos, aproximadamente entre 57 000 y 265
los niveles de expresión de los genes relacionados con la mancha ocular, la fibra
000 toneladas métricas de plástico terminaron en los océanos en 2018 (Mai et al.,
muscular y el sistema nervioso para identificar qué células madre estaban
2020). Con el tiempo, estos plásticos se fragmentan en piezas pequeñas a través
relacionadas con la biotoxicidad de las PS-MP. Se examinaron el malondialdehído
de varios mecanismos, como la abrasión mecánica, la biodegradación y la radiación
solar (Lambert y Wagner, 2016; Weinstein et al., 2016). Los desechos plásticos
(MDA), la catalasa (CAT), la glutatión peroxidasa (GPx) y la superóxido dismutasa
(SOD) para determinar si las PS-MP pueden inducir estrés oxidativo (Chen et al.,
con diámetros aerodinámicos inferiores a 5 mm se definen comúnmente como
2018; Khan y Panda, 2007). .
microplásticos (MP), que pueden ser ingeridos por organismos marinos como
2. Métodos y materiales
peces, tortugas, crustáceos, anfípodos, organismos bentónicos y aves marinas. Se
han observado una serie de efectos adversos, como lesión gastrointestinal,
2.1. Materiales
trastorno del sistema nervioso, alteración del metabolismo energético,
comportamiento anormal, trastornos endocrinos, estrés oxidativo y daño del ADN,
en tejidos u órganos animales tras la exposición a MP (Barboza et al. , 2018; de Sa
et al., 2018; Matthews et al., 2021; Pannetier et al., 2020). También se ha
al., 2020). Las planarias se mantuvieron a 20 ÿC en agua de Montjuïc que contenía
confirmado la presencia de MP en aguas dulces, pero los datos sobre la distribución
NaCl 1,6 mM, CaCl2 1,0 mM, MgSO4 1,0 mM, MgCl2 0,1 mM, KCl 0,1 mM y
Las planarias, cepa ZB-1, fueron obsequiadas por el Dr. Xu Zhenbiao (Xu et
y los efectos biotóxicos de las MP en los sistemas de agua dulce siguen siendo
NaHCO3 1,2 mM en un incubador a temperatura constante en la oscuridad. Se
limitados.
seleccionaron planarias de 4–5 mm de longitud y se privaron de alimento durante
Debido a que se supone que los organismos lesionados son más susceptibles
7 días para experimentos de exposición. El hígado de res sin la fascia se cortó en
a los efectos de la contaminación ambiental, la capacidad de restaurar las funciones
trozos de aproximadamente 1 × 1 cm y se molió para homogeneizar con una
y la morfología de los tejidos es fundamental. El daño físico y fisiológico a los
trituradora de alta velocidad (Merryman et al., 2018).
organismos destaca la necesidad de explorar los efectos de los MP en la capacidad
El estándar de PS-MP (1,05 g mL-1) con tamaños de 10 µm (PS10), 1 µm
de crecimiento y regeneración de los organismos acuáticos lesionados. A lo largo
(PS1) y 0,1 µm (PS0.1) suspendido en agua desionizada se compró a Huge
de la vida de un animal, las células madre desempeñan un papel importante en el
Biotechnology, China. Los microplásticos de PS10 y PS1 se centrifugaron durante
crecimiento y la regeneración de los tejidos (Li y Hua, 2017; Li et al., 2017). Los
5 min a 8000 rpm, y PS0.1 se centrifugó durante 1,5 h a 15 000 rpm para garantizar
ensayos preclínicos han demostrado que las células madre mesenquimales, que
que todas las PS-MP permanecieran en el fondo del tubo de centrífuga. El
son progenitores no hematopoyéticos con capacidad de autorrenovación, tienen la
sobrenadante se eliminó después de la centrifugación y se recogieron las PS-MP
capacidad de regeneración para curar lesiones tisulares y reparar funciones
del fondo del tubo de centrífuga. El patrón de PS-MP fluorescente con un tamaño
orgánicas a través de una variedad de mecanismos (Golpanian et al., 2016; Lu et
de 1 µm disperso en agua desionizada/etanol (1:1, v/v) se adquirió de Aladdin,
al., 2021). ; Qin y Zhao, 2020). Las células madre mesenquimales pueden promover
China.
la reparación de tejidos y la recuperación funcional mediante la liberación de una
variedad de factores de crecimiento, factores antiinflamatorios, factores
2.2. Exposición a microplásticos
inmunomoduladores y vesículas extracelulares que contienen proteínas y ARN en
los órganos lesionados (Golpanian et al., 2016; Paliwal et al. ., 2018; Ullah et al.,
Los PS-MP pesados con precisión de 10, 50 o 100 ÿg se mezclaron con 1 mg
2019). Además, las células madre mesenquimales pueden autorrenovarse
de homogeneizado de hígado para preparar mezclas de alimentos que contenían
constantemente y generar descendencia. Estas progenies pueden experimentar
PS-MP a 10, 50 y 100 ÿg mg-1. Siguiendo el método de Gambino et al.
una diferenciación terminal para participar en el desarrollo corporal (Xu et al., 2017).
(Gambino et al., 2020), las planarias se alimentaban regularmente con las mezclas
Hasta la fecha, pocos estudios han examinado la posible interferencia de los MP
de alimentos en placas de Petri que contenían planarias y agua de Montjuïc. Las
con el crecimiento y la regeneración de tejidos y las funciones de las células madre.
cajas de Petri se mantuvieron en cámara oscura a 25 ÿC. El agua de Montjuïc de
La planaria (Dugesia japonica), un organismo bentónico de agua dulce, es fácil
las cajas de Petri se sustituyó por agua limpia a las 1, 6 y 24 h para evitar que las
de cultivar en grandes cantidades, está ampliamente distribuida en el medio
ambiente, tiene una gran cantidad de células madre (20–30 %) y es sensible a la
PS-MP excretadas volvieran a ingerirse. Las concentraciones de PS-MP utilizadas
en el presente estudio fueron 10, 50 y 100 ÿg mg-1 para permitir que las PS-MP
contaminación ambiental (Aboobaker, 2011). ; Pista, 2013). Debido a estos
ingresen a las planarias sin afectar la consistencia de los homogeneizados de
atributos, el modelo de regeneración de planarias ha sido reconocido como un
hígado (Gambino et al., 2020). Aunque estas concentraciones no eran
modelo excelente para la investigación con células madre durante las últimas dos
ambientalmente plausibles, se requerían para producir efectos adversos. Por
décadas (Zeng et al., 2018). Los efectos de diversos productos químicos, como los
ejemplo, Asmonaite et al. (2018) informaron efectos insignificantes de la exposición
hidrocarburos aromáticos policíclicos
(Ribeiro
(Simao
y Gisela
˜ et al.,
de Aragao
2020), colorantes
˜ Umbuzeiro,
azoicos
2014) y
a MP en el transporte intestinal y las funciones de barrera de la trucha arcoíris
cobre regeneración
(Knakievicz yde
Ferreira,
las planarias
2008), (Pra
sobreetlaal.,
reparación
2005). Enyeste
Se ha
documento,
estudiado utilizamos
la
´
el modelo de regeneración planaria para evaluar los efectos de los PS-MP en el
(Oncorhynchus mykiss), incluso a una concentración irrealmente alta de 50 ÿg
mg-1. Con base en los resultados informados por Asmonaite et al. (2018), Hu et al.
crecimiento y la regeneración de tejidos y las funciones de las células madre.
(2021) emplearon concentraciones de 48, 91 y 167 ÿg mg-1 para inducir efectos
adversos sobre el crecimiento y el microbioma intestinal del crucian (Carassius
carassius). Las concentraciones de PS-MP utilizadas en el presente estudio fueron
Los objetivos del presente estudio fueron documentar los efectos biotóxicos de
comparables a las empleadas por Hu et al. (2021), que fue necesario para inducir
las PS-MP, incluidos el crecimiento y la regeneración de tejidos, las funciones de
efectos observables de PS-MP en planarias.
las células madre y el estrés oxidativo, en planarias. Para examinar mejor la
biotoxicidad de las PS-MP para las planarias, alimentamos a las planarias con PS-
Para evitar la regeneración retrasada de la cabeza de las planarias, como
MP mezcladas en homogeneizado de hígado en lugar de las que se encuentran en
ocurrió en Schmidtea mediterranea después de la exposición al etanol (Lowe et al.,
el entorno natural. Se incluyeron múltiples rangos de tamaño para analizar los
2015), los PS-MP fluorescentes se lavaron con agua destilada a 8000 rpm durante
efectos potenciales de la descomposición adicional de los PS-MP. Se evaluaron
5 minutos para eliminar el etanol residual. Se prepararon mezclas de alimentos que
las áreas del cuerpo y del blastema para examinar los efectos de las PS-MP en el tejido.
contenían 100 ÿg mg-1 de PS-MP fluorescentes agregando 100 ÿg de
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PS-MP a 1 mg de homogeneizado de hígado y se alimentaron a las planarias de la misma manera
semanas. La tasa de apoptosis fue la proporción de la suma de células apoptóticas/necróticas
que con PS-MP sin fluorescencia. Para evitar la extinción de la fluorescencia, se observó la
tardías y células viables a la suma de células necróticas, células apoptóticas/necróticas tardías,
distribución de MP en un microscopio de fluorescencia (Leica, Alemania) mediante cortes
células viables y células apoptóticas tempranas. Se adquirieron al menos 1 × 106 eventos para
congelados. Las planarias del grupo de control no estuvieron expuestas a PS-MP y no se detectó
cada muestra y el experimento se realizó por triplicado.
señal de fluorescencia.
2.7. Extracción de ácido ribonucleico y reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en
tiempo real
2.3. Medición del cuerpo y áreas de blastema de planarias
El ácido ribonucleico (ARN) en planarias alimentadas con PS-MP a 100 ÿg mg-1 se extrajo
Debido a la pérdida de tejido en las planarias, se pueden formar masas de células no
pigmentadas e indiferenciadas en los sitios de las heridas, lo que desencadena la regeneración
con un kit de extracción de ARN (Takara, Japón) y se retrotranscribió con Prime Script RT Master
del blasma. La formación de nuevos tejidos en planarias se deriva de la diferenciación de células
Mix (Takara, Japón) (Liu et al., 2013). La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en
de blastema. Por lo tanto, la regeneración de tejidos en las planarias depende principalmente de
tiempo real se llevó a cabo en un Bio-Rad CFX Connect (Bio-Rad, EE. UU.) con SYBR® Green
la progenie de neoblastos y la formación de blastemas (Tanaka y Reddien, 2011). Como resultado,
Master Mix (Takara, Japón), y el experimento se realizó por triplicado.
un área más pequeña del blastema debajo de la herida en una planaria puede reflejar su
capacidad de regeneración (Reddien, 2018). Las planarias fueron expuestas a PS-MP una vez a
la semana. Planarias con un cuerpo completo o con la cabeza cortada se fijaron a bajas
2.8. Análisis bioquímico
temperaturas (8 a 10 ÿ) utilizando una placa de enfriamiento de semiconductores para observar
el cuerpo o el área del blastema de las planarias. Todas las planarias fueron fotografiadas y
Se midió la actividad enzimática antioxidante y el contenido de peróxido de las planarias tras
analizadas durante tres semanas de exposición. Las imágenes se analizaron utilizando ImageJ
la exposición a PS-MP para examinar la respuesta bioquímica de las planarias al estrés por PS-
(Institutos Nacionales de Salud; Bethesda, MD, EE. UU.).
MP en 10 días. Se homogeneizaron diez planarias en 150 ÿL de lisado celular para el análisis de
MDA y CAT, y 15 planarias se homogeneizaron en 200 ÿL de PBS para el análisis de SOD y GPx.
Cada homogeneizado se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 min a 4 ÿC. El sobrenadante se
probó con kits de prueba (Beyotime; Shanghai, China) siguiendo las instrucciones del fabricante.
2.4. Análisis de células madre
El experimento se realizó por triplicado. El análisis final se realizó con un lector de microplacas.
Las planarias alimentadas con mezclas de alimentos que contenían PS-MP a 100 ÿg mg-1
se incubaron con 0,25 % de tripsina para preparar una suspensión celular. Los análisis de células
madre se realizaron siguiendo un procedimiento descrito previamente (Peiris et al., 2016). Las
células se tiñeron con Calcein AM (Macklin; Shanghai, China) y DRAQ5 (eBioscience; San Diego,
2.9. Análisis de los datos
CA, EE. UU.). Las subpoblaciones de células planarias se seleccionaron trazando la relación
entre su contenido de ADN y el número de células vivas. La suspensión de células teñidas se
El análisis estadístico se realizó con SPSS 24.0. Las áreas del cuerpo y del blasma, la
analizó con un citómetro de flujo ACEA NovoCyte (Agilent; Palo Alto, CA, EE. UU.). Se adquirieron
expresión génica, las poblaciones de células madre y las tasas de apoptosis se presentan como
al menos 1 × 107 eventos para cada muestra y el experimento se realizó por triplicado.
la media ± DE. Se utilizó ANOVA de una vía para comparar las medias entre los grupos después
de la prueba de homogeneidad de la varianza.
Se utilizó la prueba post hoc de Tukey para comparar todos los grupos cuando se asumieron
varianzas iguales. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05.
2.5. Análisis proteómico de marcado masivo en tándem
3. Resultados y discusión
El análisis proteómico de etiquetado de masas en tándem (TMT) se realizó por triplicado en
planarias alimentadas con 100 ÿg mg-1 PS0.1 y el grupo de control (50 planarias en cada grupo)
3.1. Ingestión de microplásticos por planarias
por Jingjie PTM BioLabs (Zhejiang, China). Los pasos principales para el análisis proteómico de
TMT incluyen la preparación de proteínas, la digestión con tripsina, el etiquetado de TMT, el
Las partículas fluorescentes verdes eran claramente visibles en el intestino de las planarias
análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas/espectrometría de masas (LC-MS/MS)
alimentadas con PS-MP fluorescentes (Fig. 1a-b), lo que indica que las PS-MP se distribuyeron
y el análisis de datos (Yu et al., 2020) (Textos S1) . La información sobre los transcriptomas de
referencia se derivó de la base de datos PlanMine (https://planmine.mpibpc.mpg.de/planmine/
en la planaria. Esto es consistente con hallazgos previos de que las PS-MP mezcladas en
begin.do).
homogeneizado de hígado de pollo se ingirieron y luego se distribuyeron en el intestino de las
planarias (Gambino et al., 2020). Los microplásticos pueden permanecer en el cuerpo de las
planarias durante más de una semana, lo que nos proporciona una base para explorar los efectos
de la exposición a largo plazo a los PS-MP. Se observaron PS-MP fluorescentes en planarias
2.6. Análisis de células apoptóticas
dentro de una semana de exposición. Estos resultados sugieren que las planarias se pueden
utilizar como un modelo biológico apropiado para evaluar la toxicidad específica de órganos de
Se adquirió un kit de detección de apoptosis de Anexina V-FITC de Beyotime (Shanghai,
China). La suspensión de células planarias se tiñó con anexina V-FITC y yoduro de propidio
las PS-MP en los intestinos, los riñones, los ovarios, los testículos y el cerebro, lo que sienta las
durante 15 min según las instrucciones del fabricante (Chen et al., 2010). La suspensión de
bases para futuras investigaciones sobre los mecanismos toxicológicos in vivo. .
células teñidas se analizó con un citómetro de flujo ACEA NovoCyte (Agilent; Palo Alto, CA, EE.
UU.). Las células apoptóticas se dividieron mediante selección cruzada según las muestras
teñidas y no teñidas. Las células necróticas en la esquina superior izquierda del cuadrante fueron
3.2. Efectos de los microplásticos en la regeneración de las planarias
positivas para la tinción de PI (Q1). Las células apoptóticas/necróticas tardías en la esquina
superior derecha del cuadrante fueron positivas tanto para la tinción con anexina V como con PI
Todas las planarias tenían un tamaño similar antes de la exposición a PS-MP. Las áreas
(Q2). Las células viables en la esquina inferior derecha del cuadrante fueron negativas tanto para
anexina V como para PI (Q3). Las células apoptóticas tempranas en la esquina inferior izquierda
medidas del cuerpo y del blastema se usaron como valores de referencia para examinar los
del cuadrante fueron positivas para la tinción de anexina V (Q4). El séptimo día de cada semana,
impactos de los PS-MP en la regeneración de las planarias (Gambino et al., 2020). El área de
se detectó la apoptosis de las células planarias mediante citometría de flujo. Las planarias fueron
blastema disminuyó con el aumento de las concentraciones de PS-MP (Fig. 2 y S2), lo que indica
expuestas a PS-MP una vez a la semana durante tres
que la regeneración de las planarias se reprimiría con una mayor ingestión de PS-MP por parte
de las planarias. El área de blastema también disminuyó con dosis crecientes de
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Fig. 1. Distribución de PS-MP en planarias después de la
exposición a PS-MP. (a) La distribución de una dosis de 100
ÿg mg-1 (10 %) de PS MP fluorescentes de 1 ÿm en planarias
se observó mediante microscopía de fluorescencia después
de 24 h (16 ×). Se muestran imágenes de fluorescencia y de
campo claro. Barra de escala = 5 mm. (b) Distribución de una
dosis de 100 ÿg mg-1 (10 %) de PS-MP fluorescentes de 1
ÿm en la región planaria posterior. Las planarias expuestas a
PS-MP se prepararon para el corte congelado después de 24
h. Los PS-MP marcados con fluorescencia podrían visualizarse
bajo un microscopio de fluorescencia invertido. Se muestran
imágenes de fluorescencia, campo brillante y campo brillante
combinado (50×).
Barra de escala = 500 µm.
PS-MP (0,1, 1 y 10 µm) en la mezcla de alimentos (Fig. S3). En comparación con las
regeneración y reparación de órganos colonizados.
planarias sin exposición a PS-MP, el área de blastema de las planarias alimentadas
Sobre la base de los resultados relacionados con el fenotipo de retraso de la
con 100 ÿg mg-1 de PS10, PS1 y PS0.1 disminuyó en un 18 %, 17 % y 21 %,
regeneración, se examinaron los genes relacionados con las células madre para
respectivamente, después de 7 días de exposición. El área de blastema disminuyó
determinar si estaban involucrados en el proceso. Los genes relacionados con las
en un 15 %, 17 % y 22 % tras una exposición de 14 días y en un 17 %, 22 % y 24 %
células madre de las planarias incluyen Dj-piwiA, Dj-piwiB y Dj-PCNA (Lapan y Reddien, 2012).
tras una exposición de 21 días. El área del blastema disminuyó con la disminución
La expresión de Dj-piwiA en planarias tras la exposición a PS10 o PS0.1 se reguló a
del tamaño de las PS-MP, es decir, la toxicidad de regeneración de las PS-MP para
la baja en comparación con la del grupo de control sin exposición a PS-MP en la
las planarias se acelera con una mayor fragmentación de las PS-MP ingeridas por las
primera semana y fue similar a la del grupo de control en la tercera semana. En la
planarias (Fig. S4). La inhibición de la regeneración por parte de los PS-MP no
tercera semana, hubo una regulación a la baja significativa en todos los grupos. La
aumentó significativamente con el tiempo (Fig. S5). Por lo tanto, la exposición
expresión de Dj-PCNA, un gen marcador de proliferación celular, se reguló a la baja
prolongada a PS-MP agravaría los efectos adversos. Al mismo tiempo, es necesario
durante la primera semana en planarias tras la exposición a PS10, pero se reguló a
seguir investigando los PS-MP más pequeños, como los nanoplásticos, que son
la baja en cada grupo en la tercera semana (Fig. 2d-f). Se ha informado que Dj-piwiA
difíciles de detectar.
está presente en células en división y mantiene la proliferación celular, mientras que
Un estudio anterior también informó una disminución de la capacidad de
Dj-piwiB participa en la regulación de la diferenciación de neoblastos (Orii et al., 2005;
regeneración de las aletas del pez cebra tras la exposición a PS-MP (Gu et al., 2020).
Reddien et al., 2005; Shibata et al., 2016). ; Tharp y Bortvin, 2016). Estos resultados
Los microplásticos pueden inducir especies reactivas de oxígeno, respuesta inmune
proporcionan pistas sobre si el número de células madre de planarias disminuye
después de la exposición a PS-MP.
y regulación de la red de señales de regeneración de aletas en el pez cebra (Gu et al., 2020).
Además, la toxicidad de regeneración de las MP aumentó con la disminución del
La proporción de células madre mitóticas después de la exposición a PS1 y
tamaño de las partículas y fue específica del tipo de tejido (Wang et al., 2021). Las
especies reactivas de oxígeno inducidas por MP pueden regenerar músculos dañados
PS0.1 se redujo significativamente los días 3, 5 y 7 (Fig. 2 g). La proporción de
en ratones, lo que está directamente relacionado con la expresión anormal de p38
células madre mitóticas después de la exposición a PS10 aumentó el tercer día y
MAPK y NF-ÿB (Wang et al., 2021). Por lo tanto, es probable que la inhibición de la
luego disminuyó el quinto y el séptimo día (Fig. 2 g). Por el contrario, las proporciones
regeneración por parte de los PS-MP sea específica de la especie. No se ha informado
de células diferenciadas y células madre no proliferativas aumentaron cuando las
sobre la toxicidad regenerativa de las PS-MP en humanos y ratones, pero los
planarias se expusieron a PS-MP de los tres tamaños, especialmente PS1, en
resultados del presente estudio pueden estimular investigaciones significativas. Se
comparación con las del grupo de control (Fig. 2 g). Al mismo tiempo, las proporciones
espera que la regeneración desempeñe un papel importante en el crecimiento y
de células diferenciadas tras la exposición a PS1 aumentaron el primer y séptimo
desarrollo de poblaciones de alto riesgo, como los embriones. El desarrollo de los
día, pero disminuyeron el primer día después de la exposición a PS0.1 (Fig. 2g-i y
órganos en las diferentes etapas del embarazo es secuencial porque la regeneración
S6). Estos resultados sugieren que la exposición a PS MP puede disminuir la
está estrechamente relacionada con el desarrollo. Existe evidencia de que la
proporción de células madre mitóticas en las planarias y, en consecuencia, retrasar
acumulación visceral de PS-MP en bebés es mayor que en adultos (Zhang et al.,
su capacidad de regeneración.
2021). Como resultado, la exposición y la acumulación de PS-MP por parte de
Para aclarar aún más el mecanismo del impacto de los PS-MP en la regeneración,
mujeres embarazadas son preocupantes (Ragusa et al., 2021). La regeneración
realizamos análisis proteómicos. El mapa de calor mostró que había una diferencia
también es importante en el trasplante de órganos y la reparación de heridas, y es
significativa en las proteínas diferenciales entre PS0.1 y el control (Fig. 3a). Había 67
probable que la exposición a PS-MP afecte estos procesos. La localización tisular de
proteínas expresadas diferencialmente en > 1,5 veces (p < 0,05), de las cuales 46
PS-MP puede producir ocupación del espacio local, probablemente afectando la
eran
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Fig. 2. Los efectos de los PS-MP en el área del blastema y las poblaciones de células madre de las planarias. Las áreas del blastema de la cabeza en (a) el séptimo, (b) el cuarto
y (c) el vigésimo primer día después de que las planarias fueran alimentadas con mezclas de alimentos que contenían PS-MP con tamaños de 10 µm (PS10), 1 µm (PS1) y 0,1 µm
(PS0.1) a 10, 50 y 100 µg mg-1 una vez a la semana durante 21 días. El área de blastema en el séptimo día de las semanas 1, 2 y 3 se muestra por separado. (df) Mediciones qRTPCR de la expresión Dj-piwiA, Dj piwiB y Dj-PCNA. Los datos mostrados son los resultados de 20 réplicas biológicas por tratamiento. (gi) El histograma se basa en los datos de la
**
* **
Fig. S2. El experimento se realizó por triplicado (n = 20). * p < 0,05;
p < 0,01;
p < 0,001. Las barras de error representan desviaciones estándar.
regulado a la baja y 21 estaban regulados al alza (Fig. 3b y Tabla S2).
activando las vías TGFÿ/SMAD4 y Notch.
De acuerdo con los niveles de transcripción, la expresión de proteínas de SMAD4 y NCSTN
La toxicidad para las células madre inducida por PS-MP merece atención. Hay 12
aumentó significativamente en las planarias tras la exposición a PS-MP, mientras que la
tipos de células madre en las planarias que son responsables de diferenciar órganos y
de CTSL1 se redujo (Fig. 3b y S7).
tejidos, incluidos el intestino, los nervios, la faringe y los músculos (Zeng et al., 2018). El
La disminución de SMAD4, una proteína supresora de tumores clásica, puede promover la
presente estudio ilustró que los PS-MP redujeron la cantidad de células madre, pero no
proliferación de células cancerosas (Saha et al., 2001). También se ha aclarado la
quedó claro qué tipos específicos de células madre se agotaron. Identificar los genes clave
importancia de SMAD4 para la autorrenovación de las células madre hematopoyéticas
de las planarias objetivo de las PS-MP sigue siendo un desafío, pero es de gran importancia
(Karlsson et al., 2007). Además, la NCSTN es el componente principal de las placas de
para la evaluación rápida y sencilla de la toxicidad de las PS-MP en diferentes tipos de
neuritis y las lesiones características en el cerebro de los pacientes con enfermedad de
células madre. Aunque las planarias son organismos simples, pueden ayudar a identificar
Alzheimer (Sesele et al., 2013). Este gen puede promover la migración de células
los genes candidatos que afectan a las células madre humanas, ya que comparten genes
cancerosas e inhibir la apoptosis de las células cancerosas, promoviendo así el deterioro
homólogos con los humanos (Labbe et al., 2012).
del cáncer (C. Wang, X. et al., 2020; X. Wang, X. et al., 2020). CTSL1, una proteasa
importante en células animales, participa en la regulación de la proliferación y diferenciación
de células madre embrionarias (Tamhane et al., 2016). Hasta donde sabemos, SMAD4 y
3.3. Efectos de los microplásticos en el crecimiento
NCSTN son moléculas clave en la vía TGFÿ/SMAD4 y la vía Notch, respectivamente, que
están estrechamente relacionadas con la proliferación, diferenciación y destino celular (Li
Las áreas del cuerpo de todas las planarias continuaron aumentando tras la exposición
et al., 2020; Saha et al., 2001). ). Por lo tanto, es plausible que los PS-MP puedan reducir
a PS-MP, pero la tasa disminuyó con el aumento de las concentraciones de PS MP en las
la cantidad de células madre de las planarias e inhibir la apoptosis al promover la expresión
mezclas de alimentos (Fig. S8). Las tasas de crecimiento de las planarias alimentadas con
de SMAD4 y NCSTN y
mezclas de alimentos que contenían PS0.1 a 50 y 100 ÿg mg-1 disminuyeron
significativamente en comparación con las de las planarias alimentadas con la mezcla de alimentos .
5
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Fig. 3. Análisis proteómico de PS-MP que afectan la expresión proteica de las planarias. ( a ) El mapa de calor de tres análisis proteómicos independientes de testículos de los
grupos PS0.1 y control. Las proteínas reguladas al alza están marcadas en amarillo y las proteínas reguladas a la baja están marcadas en verde. (b) El gráfico del volcán muestra
todas las proteínas diferenciales, de las cuales NCSTN, SMAD4 y CTSL1 están marcadas con círculos. La figura verde indica el número de proteínas reguladas a la baja y la figura
amarilla indica el número de proteínas reguladas al alza. El valor de corte y p de las proteínas diferenciales se establecieron en > 1,5 veces y < 0,05, respectivamente.
La apoptosis es de gran importancia para la regeneración, el crecimiento, el
que contenía PS0.1 a 10 ÿg mg-1 durante 21 días, pero el área corporal aumentó
ligeramente. Este hallazgo indicó que el crecimiento de las planarias puede continuar, pero
mantenimiento de la homeostasis tisular y la eliminación de células dañadas para los
puede retrasarse con la exposición a PS-MP (Fig. 4a-c y S9). La tasa de crecimiento de las
organismos (Tang et al., 2019). Es un mecanismo clave para mantener las funciones
planarias se reduciría en gran medida si las planarias fueran alimentadas con mezclas de
fisiológicas normales y prevenir enfermedades. Cuando se enfrentan a un trauma severo,
alimentos que contengan PS-MP de tamaños más pequeños y en concentraciones más
las planarias necesitan activar la proliferación celular para regenerar el tejido faltante. En
altas. El daño resultante de la exposición a PS-MP aumentó cuando se prolongó el tiempo
este proceso, los tejidos corporales originales se remodelarían e integrarían para adaptarse
de exposición (Figs. S10 y S11).
a los nuevos tejidos de acuerdo con las funciones de la apoptosis. Las planarias producen
una señal de apoptosis después del corte, y esta señal se activa continuamente durante la
Estos resultados han ampliado nuestro conocimiento sobre los efectos adversos de los
regeneración de las planarias durante más de 7 días (Pellettieri et al., 2010; Wang, C. et al.,
PS-MP en el crecimiento de las planarias. La regulación y el control del crecimiento corporal
2020). Por otro lado, existe un equilibrio importante entre la apoptosis y la proliferación
durante el desarrollo son extremadamente importantes y son clave para mantener la
celular para mantener la regeneración y reparación de tejidos, por ejemplo, las señales de
reproducción y la supervivencia. El crecimiento celular y el tamaño corporal están
apoptosis podrían promover la proliferación de células madre en las planarias (Pellettieri et
relacionados con muchos factores, incluido el ciclo celular, el nivel de nutrición y el nivel
al., 2010). Este equilibrio indica que la supresión de la apoptosis puede ser una de las
hormonal, entre otros. Una variedad de vías están involucradas en la regulación y el control
razones de la inhibición de la proliferación de células madre de planarias por parte de las
del crecimiento del cuerpo y los órganos, por ejemplo, las vías de señalización Hippo, TOR
PS-MP.
e insulina (Texada et al., 2020). Algunas vías conservadas, como la vía TOR, existen
simultáneamente en planarias y humanos, lo que puede arrojar luz sobre los mecanismos
que gobiernan los efectos adversos de las PS-MP en el crecimiento del cuerpo y los órganos
3.5. Efectos de los microplásticos sobre el estrés oxidativo
en humanos y animales superiores (Peiris et al., 2012). ). El hecho de que los PS-MP
puedan inhibir el crecimiento de las planarias debería inspirar exámenes sobre si la
Las actividades de CAT, GPx y SOD, así como el contenido de MDA, se detectaron en
exposición a los PS-MP afectaría el crecimiento humano a través de estudios epidemiológicos
planarias dentro de los 10 días posteriores a la exposición a PS-MP. La actividad de CAT
de la altura de los niños bajo la influencia de abundantes PS-MP.
en las planarias aumentó después de la exposición a PS10, lo que indica que las planarias
tuvieron una respuesta de estrés a la estimulación de PS10 durante este período. Tras la
exposición a PS1, la actividad CAT de las planarias aumentó el primer día y disminuyó
3.4. Efectos de los microplásticos en la apoptosis
después. La actividad de CAT disminuyó con el tiempo tras la exposición a PS0.1 (Fig. 5a).
La actividad de GPx después de la exposición a PS10 o PS0.1 disminuyó y alcanzó el nivel
La tasa de apoptosis disminuyó 2 días después de la exposición a PS1 o PS0.1 pero
más bajo en el décimo día; aumentó brevemente el primer día y luego disminuyó hasta el
no cambió significativamente con la exposición a PS10. También disminuyó después de 21
quinto día después de la exposición a PS1. Después del quinto día, la actividad de GPx
días de exposición a PS10 o PS0.1, mientras que fue similar entre el grupo de control y el
volvió al mismo nivel que el del grupo de control (Fig. 5b). La actividad de SOD después de
grupo expuesto a PS1 (Figs. S13 y S14). Se analizaron Dj Caspase3 y Dj-Caspase8, que
la exposición a PS1 aumentó el primer día, siguió aumentando el tercer día después de la
están estrechamente relacionados con la apoptosis (Cao et al., 2016). La expresión de Dj-
exposición a PS10, PS1 o PS0.1 y volvió al mismo nivel que el grupo de control a partir del
Caspase8 aumentó y disminuyó durante la primera semana de exposición a PS1 y PS0.1,
quinto día. Sin embargo, la actividad de SOD después de la exposición a PS10 aumentó
respectivamente, y disminuyó en todos los grupos de tratamiento en la tercera semana. En
significativamente nuevamente al décimo día (Fig. 5c). El contenido de MDA tras la
la primera semana, la expresión de Dj-Caspase3 se reguló a la baja después de la
exposición a PS10, PS1 o PS0.1 aumentó el primer y el tercer día. Los contenidos de MDA
exposición a PS10 y PS0.1. En la tercera semana, la expresión de Dj-Caspase3 después
después del tratamiento con PS1 y PS0.1 fueron comparables a los del grupo de control en
de la exposición a PS0.1 todavía estaba inhibida, pero aumentó con la exposición a PS1
el quinto y séptimo día.
(Fig. S12e-f).
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La estimulación ambiental puede inducir estrés oxidativo en las células vivas, y
los radicales libres así producidos pueden dañar las células. Los organismos con
fuerte resiliencia aceleran la apoptosis y eliminan las células dañadas cuando ocurre
el estrés oxidativo (Tang et al., 2019). La apoptosis puede eliminar rápidamente las
células dañadas y prohibir la formación de cáncer y otras enfermedades mortales.
Debido a que los PS-MP no solo inducen daño celular sino que también agotan la
capacidad de las planarias para eliminar las células dañadas, presentan potencialmente
efectos tóxicos como la inmunodeficiencia y pueden aumentar el riesgo de cáncer
para los organismos y quizás para los humanos.
El mantenimiento de las funciones, la regeneración, el crecimiento y la apoptosis
de las células madre está estrechamente relacionado con el estrés oxidativo, el cual,
junto con el estrés del retículo endoplásmico inducido, puede inhibir la diferenciación
de las células madre neurales (Chen et al., 2018). Las nanopartículas de selenio
pueden promover la viabilidad y la diferenciación de las células madre al disminuir el
estrés oxidativo (Fatima et al., 2021). Por lo tanto, mantener un bajo nivel de estrés
oxidativo puede sustentar la actividad y las funciones de las células madre, es decir,
el nivel de estrés oxidativo determina el destino de las células madre (Chen et al.,
2018; Fatima et al., 2021). Es probable que la estimulación exógena induzca estrés
oxidativo y afecte las funciones de las células madre, lo que fue corroborado por los
resultados de la exposición de planarias a PS-MP en el presente estudio. La regulación
a la baja de los genes relacionados con las manchas oculares y el sistema nervioso
indicó daño a las manchas oculares y las células madre nerviosas de las planarias
por parte de PS-MP. Esta es una señal peligrosa para las especies menos resistentes.
Los microplásticos pueden debilitar el sistema antioxidante natural de los organismos
y crear sinergias con otros contaminantes ambientales para disminuir la resistencia
de los organismos, lo que provoca enfermedades graves.
3.6. Efectos de PS-MP en la expresión de ARNm
Los niveles de transcripción de tres tipos de genes marcadores, incluidos los
genes relacionados con la mancha ocular (Dj-ovo), los genes relacionados con la
fibra muscular (Dj-MHC-B) y los genes relacionados con el sistema nervioso (Dj-PC2),
en las planarias representan los cambios en estos tejidos. El efecto de la exposición
a PS-MP en la polaridad de regeneración de las planarias podría reflejarse en los
genes relacionados con la polaridad (Dj-nlg) (Marandi et al., 2007; Ogawa et al.,
2002; Orii et al., 2002). La expresión del gen Dj-ovo relacionado con la mancha ocular
disminuyó después de la exposición a PS-MP en la primera y tercera semana (Fig.
S12a). La expresión del gen Dj-MHCB relacionado con la fibra muscular aumentó con
la exposición a PS0.1 en la primera y la tercera semana, pero disminuyó en la tercera
semana con la exposición a PS10 y PS1 (Fig. S12b). La expresión del gen Dj-PC2
Fig. 4. El efecto de los PS-MP en el área del cuerpo de las planarias. ( ac ) Cambios en
relacionado con el sistema nervioso disminuyó significativamente tras la exposición a
el área del cuerpo después de alimentar a PS-MP durante 3 semanas. Las áreas del
PS-MP en la primera semana en lugar de en la tercera semana (Fig. S12c). No hubo
cuerpo de cada grupo en los días 0, 7, 14 y 21 se muestran en un histograma. L, M y H
cambios significativos en Dj-nlg, que es un gen relacionado con la polaridad, tras la
representan dosis de 10 ÿg mg-1 (1%), 50 ÿg mg-1 (5%) y 100 ÿg mg-1 (10%), respectivamente.
exposición a PS-MP (Fig. S12d). Los niveles de transcripción de ARNm de genes
Los datos mostrados son los resultados de 22 réplicas biológicas por tratamiento por
*
triplicado. Diferencias significativas respecto al grupo control, p < 0,05;
**
* **
p < 0,01;
p < 0,001. Las barras de error representan desviaciones estándar.
relacionados con tejidos sugirieron que las proporciones de fibras musculares,
manchas oculares y nervios disminuyeron con la exposición a PS-MP y no regresaron
a los niveles de control al final de la exposición.
El presente estudio sugirió que no hubo trastorno de polaridad en ninguna de las
Los contenidos de MDA en planarias tras la exposición a PS1 y PS0.1 aumentaron
planarias cortadas después de ser alimentadas con PS-MP, pero el tiempo para la
el décimo día (Fig. 5d).
regeneración de la mancha ocular fue mucho más largo que el de las planarias sin
Claramente, la exposición a PS-MP provocó estrés oxidativo en las planarias,
que a su vez intentaron utilizar el sistema de defensa antioxidante para reducir el
exposición a PS-MP (datos no mostrados). Teniendo en cuenta que la regeneración
daño. La actividad de las enzimas antioxidantes y el contenido de MDA en planarias
de la mancha ocular de las planarias está estrechamente relacionada con la formación
se alteraron dinámicamente tras la exposición a PS-MP, lo que estuvo estrechamente
de neuronas (Okamoto et al., 2005), la expresión reducida de genes relacionados con
relacionado con el tamaño de las PS-MP y el tiempo de exposición.
la mancha ocular y el sistema nervioso puede implicar que la regeneración del sistema
Las planarias expuestas a PS-MP de menor tamaño exhibieron una respuesta de
nervioso de las planarias se vería afectada por la exposición a PS-MP. Las planarias,
estrés oxidativo más fuerte. Dentro de los 7 días posteriores a la exposición a PS-
con una gran capacidad de regeneración, no son resistentes al daño de los PS-MP.
MP, el contenido de MDA en las planarias mostró una tendencia ascendente al
Se ha informado que los PS-MP pueden penetrar la barrera hematoencefálica de los
principio y luego disminuyó. Sin embargo, el contenido de MDA en las planarias
peces (Kashiwada, 2006), lo que proporciona la base para invadir los nervios de los
volvió a aumentar el décimo día, lo que indica que el estrés oxidativo seguía
humanos y los mamíferos superiores y ejercer efectos tóxicos. Las neuronas en
aumentando incluso después de completar la exposición a PS-MP. Los microplásticos
humanos no pueden regenerarse una vez que mueren. Esta es una señal de alerta
no solo pueden inducir la producción de peróxido, sino que también pueden destruir
para los seres humanos y los organismos con una capacidad limitada para
el sistema antioxidante natural mediante el agotamiento de enzimas antioxidantes
regenerarse. Los resultados del análisis de proteómica confirmaron que el factor de
como CAT, GPX y SOD (Qiao et al., 2019). Por lo tanto, el mayor contenido de MDA
riesgo para la enfermedad de Alzheimer, NCSTN, se regulaba al alza tras la exposición a PS-MP (
puede atribuirse a la disminución de la actividad enzimática antioxidante y la
Para los grupos de alto riesgo sujetos a una exposición prolongada a PS-MP, como
capacidad antioxidante.
las personas de edad avanzada, si los PS-MP son factores de riesgo de enfermedades
multifactoriales de etiología desconocida, como la enfermedad de Parkinson y
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Fig. 5. Actividades de enzimas antioxidantes y productos de peroxidación lipídica en planarias. Evaluación de las actividades de CAT (a), GPx (b) y SOD (c) en planarias
sometidas a PS-MP. ( d ) Efecto de PS-MP en MDA en planarias. Las actividades enzimáticas y el contenido de MDA se midieron en tiempos de tratamiento de 1, 3, 5, 7 y 10 días.
**
* **
El experimento se realizó por triplicado (n = 10 o 15). * p < 0,05;
p < 0,01;
p < 0,001. Las barras de error representan desviaciones estándar.
La enfermedad de Alzheimer sigue siendo desconocida y debe investigarse a fondo
proporción y daño en su función fisiológica. Estos hallazgos descubren el riesgo
potencial de los microplásticos para las funciones de las células madre y descubren
en el futuro.
una nueva pista para futuros estudios sobre los efectos de los microplásticos en las
4. Conclusiones
células madre humanas y la regeneración.
Los efectos de la exposición a PS-MP sobre el crecimiento y la regeneración de
Declaración de contribución de autoría CRediT
tejidos, las funciones de las células madre, la apoptosis y el estrés oxidativo en
planarias se exploraron en experimentos de alimentación in vivo. Se confirmó que las
Tianyu Gao: Investigación, Curación de datos, Análisis formal, Redacción –
planarias ingirieron microplásticos y se distribuyeron principalmente en el intestino.
borrador original. Bingbing Sun: investigación, recursos, escritura: revisión y edición.
Se observaron retrasos en el crecimiento y la regeneración, proliferación inhibida y
Zhenbiao Xu: Recursos, Supervisión. Qiaoyun Chen: Validación. Meng Yang:
procesos de diferenciación de células madre y apoptosis, y respuesta al estrés
Metodología. Qinli Wan: Visualización. Lin xia Song: Recursos. Guo Chen:
oxidativo de las planarias después de la exposición a PS-MP. Estos resultados han
Adquisición de fondos. Chunxia Jing: Análisis formal. Eddy Y. Zeng: conceptualización,
mejorado nuestra comprensión de los efectos tóxicos de los microplásticos en las
plazo, administración del proyecto, supervisión, adquisición de fondos, redacción,
planarias e indicaron que el daño causado por las PS-MP merece nuestra atención,
revisión y edición. Guang Yang: conceptualización, plazo, administración del proyecto,
especialmente en términos de los efectos sobre las células madre.
supervisión, adquisición de fondos, redacción, revisión y edición.
El trabajo futuro puede centrarse en explorar la biotoxicidad combinada de los PS-MP
y los contaminantes orgánicos hidrófobos en las planarias. Debido a que hay muchos
genes relacionados con las células madre en las planarias que son altamente
Declaración de interés en competencia
homólogos a los de los humanos, también se recomienda la exploración de posibles
genes diana en las células madre de las planarias para PS-MP.
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia ni
relaciones personales conocidas que pudieran haber influido en el trabajo informado
Declaración de Novedad
en este documento.
Hasta donde sabemos, este es el primer informe sobre los efectos de los
Expresiones de gratitud
microplásticos de poliestireno en las células madre de Dugesia japonica. El manuscrito
demuestra que los microplásticos de poliestireno, contaminantes peligrosos
El presente estudio fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y
generalizados en el medio ambiente, pueden reducir la regeneración y el crecimiento
Desarrollo Clave de China (2021YFC2301500), la Fundación Nacional de Ciencias
de las planarias. Encontramos amenazas potenciales para las células madre de
Naturales de China (Nos: 91543132 y 21806056) y la Fundación de Ciencias Naturales
microplásticos en planarias por primera vez, incluida la reducción
de Guangdong (No: 2016A030313089).
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Revista de materiales peligrosos 432 (2022) 128673
Apéndice A. Información de apoyo
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