FRANK MENYHA ABOAGYE CLINICA GENETICA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Y CHIPS DE ADN 1. ¿QUÉ APLICACIONES TIENE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) EN LA MEDICINA? La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio que permite la producción (amplificación) rápida de millones a miles de millones de un segmento específico de ADN, que así se podrá estudiar en mayor detalle. La PCR implica el uso de fragmentos cortos de ADN sintético, denominados cebadores, para seleccionar un segmento del genoma que se amplificará, y luego múltiples sesiones de síntesis de ADN para amplificar ese segmento. ¿Qué es PCR y cómo trabaja? PCR es una técnica in vitro que imita la habilidad de un organismo para replicar el DNA. A continuación, se exponen los fundamentos sobre el DNA y el RNA que servirán de base para la comprensión de PCR. La Reacción en Cadena de la Polimerasa (peRl. • La Reacción en Cadena de la Polimerasa se basa en el principio natural de replicación del DNA. La PCR es un proceso que consta de tres pasos, que se denomina ciclo, que se repite un número determinado de veces. • Un ciclo de PCR consiste en los siguientes pasos: 1. Desnaturalización: (96°C) la reacción se calienta bastante para separar, o desnaturalizar, las cadenas de ADN. Esto proporciona los moldes de cadena sencilla para el siguiente paso. 2. Templado: (55 - 65C°) la reacción se enfría para que los cebadores puedan unirse a sus secuencias complementarias en el molde de ADN de cadena sencilla. 3. Extensión: (72 °C) la temperatura de la reacción se eleva para que la Taq polimerasa extienda los cebadores y sintetice así nuevas cadenas de ADN. • Este proceso se lleva a cabo en un termociclador, un instrumento que automáticamente controla y alterna la temperatura as durante periodos programados de tiempo para el número apropiado de ciclos (usualmente 30-40 ciclos). ¿Para qué sirve una PCR? Todo investigador que trabaje con moléculas de ADN conoce esta técnica. Y es que la PCR es una técnica imprescindible en múltiples ámbitos. Por ejemplo, en investigación bioquímica y médica, la PCR permite preparar fragmentos de ADN para su clonación en plásmidos bacterianos o virus para utilizarlos como vectores, paso imprescindible en el desarrollo de terapias génicas. Además, en Medicina, esta técnica es utilizada para diagnosticar enfermedades hereditarias. ¡Incluso se utiliza para identificar patógenos! Por si fuera poco, la PCR es una técnica importantísima en las pruebas de paternidad y en los análisis forenses de la policía científica. Interesante, ¿verdad? ¿Qué se necesita para hacer una PCR? Seguir el procedimiento de una técnica de laboratorio no es tan diferente de una receta de cocina. Antes de nada, necesitamos reunir los ingredientes. ¿Cuáles son? Los ingredientes esenciales para llevar a cabo una PCR son los siguientes: ADN molde Se trata del fragmento de ADN que queremos amplificar mediante la PCR. Desoxirribonucleótidos-trifosfato: Como sabéis, el ADN está compuesto por 4 tipos de nucleótidos, formados por 4 bases nitrogenadas: adenina, guanina, citosina y timina. Es de esperar, entonces, que estos 4 desoxirribonucleótidos-trifosfato sean indispensables para poder obtener nuevas moléculas de ADN Cebadores (en inglés, primers) Los cebadores son oligonucleótidos, secuencias cortas de ADN, que se unen a la molécula de ADN molde y sirven como punto de inicio para comenzar la síntesis de ADN. En la PCR necesitamos dos cebadores, cada uno complementario a una cadena del ADN que buscamos amplificar. Estos oligonucleótidos determinan la región del ADN a amplificar. ADN polimerasas Las reinas de esta técnica bioquímica. En la PCR se pueden utilizar diferentes ADN polimerasas, obtenidas de varios organismos. Sin embargo, la más utilizada dada su efectividad, es la ADN polimerasa de la bacteria Thermus aquaticus, también llamada Polimerasa Taq. Esta polimerasa es idónea para la PCR por su resistencia a las altas temperaturas que se utilizan en el proceso. Iones divalentes de magnesio En la PCR se utilizan iones de carga positiva como cofactores de la polimerasa. Estos cationes son esenciales para la función de la ADN polimerasa. Normalmente se añade cloruro de magnesio para que al disociarse se libere magnesio (con carga +2). Solución tampón Una solución tampón es una disolución que es capaz de regular el pH, es decir, las condiciones de acidez o basicidad, de nuestra PCR. Esto es muy importante, porque los cambios en el pH de la disolución pueden alterar los resultados de nuestra PCR o evitar que se produzca Estos son los ingredientes básicos. Sin embargo, como en cualquier receta de cocina, necesitamos algo (un instrumento) para procesar los ingredientes y conseguir los resultados que buscamos. En el caso de la PCR es muy importante regular las condiciones de temperatura en las que se encuentran las reacciones. Para ello, se utiliza un “horno” especial, el termociclador. Termociclador Un termociclador es un aparato que regula la temperatura en cada ciclo de la PCR. Gracias a él es posible realizar esta técnica en muchísimo menos tiempo, ya que, para realizarla, se debe modificar la temperatura de la solución en varias ocasiones. ¡Bien! Ya sabemos qué elementos básicos necesitamos para realizar una PCR. Ahora, solo nos queda conocer el procedimiento a seguir en esta técnica: ¿Cómo funciona una PCR? La PCR se compone de varios ciclos, que se repiten unas 30 veces, dependiendo de la cantidad de muestra que necesitamos. Cada ciclo comprende la desnaturalización de la doble hebra de ADN y la síntesis de la una nueva cadena de ADN por cada cadena haya presente. De este modo, si comenzamos con una única molécula de ADN en la muestra, obtendremos 2 en el primer ciclo, ¡4 en el segundo ciclo y 2 147 483 648 moléculas en el ciclo número 29! En la primera parte del ciclo de una PCR, se desnaturalizan la moléculas de ADN de la muestra. Esto significa que las dos cadenas que forman cada molécula se separan, dando lugar a dos moléculas de ADN monocatenario. Normalmente, este primer paso se logra realizar mediante un aumento muy grande de la temperatura de la solución (aproximadamente a 95º). El siguiente paso de un ciclo de la PCR implica unas moléculas muy importantes, de las que hablaba antes, los cebadores. En este paso, se disminuye la temperatura de la solución para favorecer la unión de los cebadores al ADN monocatenario que habíamos obtenido en el proceso anterior. Recordad que los cebadores se unen al ADN de forma específica, así que solo amplificaremos la región de las moléculas que nos interese. Acto seguido, se ajusta la temperatura de la solución de nuevo, para que la ADN polimerasa pueda actuar a partir de los cebadores. La temperatura en este paso es dependiente de la ADN polimerasa que se esté utilizando. Por ejemplo, para la polimerasa Taq, la temperatura ideal está entre los 70 ºC y los 80 ºC. En este paso, la polimerasa utiliza como molde las cadenas de ADN monocatenario y va añadiendo al cebador los desoxirribonucleótidos-trifosfato complementarios a la cadena molde, formando una nueva cadena. Aquí os muestro un esquema de la reacción en cada ciclo: Otros tipos de PCR PCR anidada: se trata de una variante de la PCR básica que utiliza dos pares de cebadores. En un primer paso, se realiza la amplificación de una región del genoma, para después concretar más la región mediante una segunda amplificación más específica. Esta PCR se utiliza para amplificar fragmentos muy específicos del genoma. RT-PCR: Esta técnica convierte el ARN de una muestra en ADN. Para ello utiliza la transcriptasa inversa, una enzima utilizada por los retrovirus Se utiliza para múltiples objetivos. Por ejemplo, se puede utilizar para saber si un gen se está expresando en una muestra biológica. También se utiliza para genotipar diferentes virus de ARN, como el SARS-Co-V o el VIH. PCR cuantitativa: es una PCR que permite medir en tiempo real la cantidad de fragmentos que se van produciendo. Se utiliza a menudo para analizar la expresión de los genes. PCR múltiple: en este tipo de PCR se realizan amplificaciones simultáneas de más de un fragmento de ADN. Para ello, se utilizan varios cebadores diferentes en una misma reacción. PCR in situ: esta PCR se realiza en células o tejidos. Se utiliza para poder detectar secuencias de ADN en el interior de las células que no son detectables mediante otras técnicas. PCR digital: es una de las últimas generaciones en técnicas de amplificación de ADN. Está basada en la separación de cada muestra en múltiples particiones (microgotas), de forma que la reacción de amplificación se produce de forma independiente cada una de ellas. 2. ¿QUÉ APLICACIONES TIENEN LOS CHIPS DE ADN EN LA MEDICINA? Los microarrays son una tecnología que, básicamente, miniaturizan procesos que se han utilizado en los laboratorios de genética molecular desde hace años. Permiten la detección de moléculas de ADN o ARN por hibridación o adherencia de las moléculas en cuestión de ADN o ARN en un portaobjetos de vidrio, y detección del ADN o ARN adherido mediante diferentes etiquetas o colores que les permiten ser detectados al microscopio. ¿Para qué sirven los microarrays de ADN? Las aplicaciones de los microarrays se amplían cada día, aunque por el momento hay 3 grandes áreas consolidadas: El análisis del nivel de expresión génica Ya se ha mencionado y se explicará con mayor detalle más adelante. En estos experimentos se obtienen datos sobre el nivel de expresión de miles de genes. A partir de estos datos, empleando un diseño experimental correcto y técnicas estadísticas adecuadas, se pueden realizar estudios de diagnóstico y caracterización de tumores u otros tejidos5-8, identificación de los genes que modifican su expresión tras la administración de fármacos9 o identificación de genes con valor pronóstico10,11. También se han empleado para asignar función a secuencias de ARN que se expresan pero cuya función era desconocida (EST) y para identificar grupos de genes que forman redes de regulación génica12. Otras aplicaciones son el diagnóstico de enfermedades infecciosas a partir de la detección del genoma del germen en tejidos13,14. Genotipificación Una muestra de ADN obtenida de un tejido o fluido, adecuadamente amplificada, puede ser estudiada para detectar mutaciones en genes de interés o variantes génicas (polimorfismos en un nucleótido, SNP en la terminología de este campo). Esta metodología tiene usos potenciales para la detección de riesgo o susceptibilidad para presentar enfermedades15,16. Variantes de estos microarrays permiten secuenciar genes con mutaciones conocidas. Detección del número de copias del ADN Similar a la técnica de hibridación genómica comparada (CGH), se han diseñado microarrays para detectar ganancias o pérdidas alélicas en miles de secuencias, lo que permite obtener mapas cromosómicos mucho más detallados que la CGH tradicional17. Estas técnicas tienen interés potencial en el estudio del pronóstico de tumores, ya que éste se halla asociado al nivel de daño genómico. También puede ser útil para detectar nuevos oncogenes y genes supresores de tumores. Fabricación Los chips de ADN se fabrican usando una gran variedad de tecnologías. El gran desarrollo de esta técnica ha llegado al normalizarse el uso de robots que se encargan de la mayor parte del proceso de manipulación de los chips (sintetizar el ADN molde que se une al chip, unirlo, añadir los reactivos necesarios, etcétera). Los chips de ADN se pueden usar para detectar ARN, que puede traducirse o no en proteínas. Los científicos se refieren a esta clase de análisis como análisis de expresión o análisis del transcriptoma, y tiene por objeto establecer un patrón o perfil de los genes transcritos presentes en un tipo de células determinado.1 Se suele retro transcribir el ARN a ADN para estos casos, de manera que lo que se utiliza como muestra es ADNc. Tipos Microarrays de dos canales En este tipo de chips de ADN (en inglés spotted microarrays), las sondas son oligonucleótidos, ADN complementario (ADNc) o pequeños fragmentos de reacción en cadena de la polimerasa, que corresponden con ARN mensajero (ARNm). En este tipo de chip de ADN se utilizan preparaciones de ADNc obtenido a partir de dos muestras biológicas distintas; por ejemplo, de células cultivadas en dos distintas condiciones. El ADNc de cada muestra se marca con un fluoróforo diferente, y las dos preparaciones de ADNc marcadas se mezclan e hibridan sobre el mismo chip de ADN. Una vez realizado este primer paso, se procede al escaneo del resultado y a la visualización del mismo. De esta forma se pueden detectar genes que se activan o se reprimen en distintas condiciones. La contrapartida de estos experimentos es que no se pueden observar niveles absolutos en la expresión y requieren qPCR para un análisis cuantitativo absoluto. Chips de oligonucleótidos de ADN En los chips de oligonucleótidos de ADN o micromatrices de canal único, las sondas se diseñan a partir de una secuencia conocida o un ARNm predicho. Estos chips de ADNs dan estimaciones del nivel de expresión, pero en una misma matriz no pueden observarse distintas condiciones, por lo que por cada condición se debe utilizar un chip. Idea principal: las sondas se sintetizan in situ (en el chip). No están basadas en la hibridación competitiva. Esto quiere decir: un chip, una muestra. Las secuencias se construyen en la superficie del chip mediante el elongamiento secuencial de una cadena en crecimiento con un solo nucleótido utilizando fotolitografía. GeneChips de Affymetrix Affymetrix es la compañía líder en este tipo de chips. Se denominan genéricamente "GeneChips". Cada gen representado por un conjunto de secuencias cortas que lo caracterizan. Algunos chips: genomas completos con más de 50.000 grupos de sondas. Microarray cromosómico El microarray cromosómico o CMA (del inglés, Chromosomal Microarray) es una técnica que se usa para detectar variantes en el número de copias o CNV (del inglés, Copy Number Variants), ya sean pérdidas o ganancias de material cromosómico, en el ADN que pueden ser benignas, patogénicas o de importancia clínica incierta. Siendo mucho más sensible que los cariotipos, el CMA detecta tanto las CNV grandes como las pequeñas. Dependiendo del método usado, el CMA puede implicar el escaneo del genoma completo (también llamado CMA citogenómico), regiones diana en el genoma, o cromosomas o segmentos cromosómicos específicos. Los métodos de CMA más usados clínicamente incluyen el array de oligonucleótidos, el array de SNP (Single-Nucleotide Polymorphism), y la combinación de ambos. Aplicaciones Los chips de ADN se han aplicado al estudio de casi cualquier tipo de problema biológico. El número de publicaciones anuales es muy alto y continúa creciendo. Algunas de sus aplicaciones más frecuentes son: Estudio de genes, que se expresan diferencialmente en condiciones diversas (sanos/enfermos, mutantes/salvajes, tratados/no tratados). Clasificación molecular en enfermedades complejas. Identificación de genes característicos de una patología (firma o signatura). Predicción de respuesta a un tratamiento. Detección de mutaciones y polimorfismos de un único gen (SNP). REFERENCIAS 1. https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Reaccion-en-cadena-de-la-polimerasa 2. https://genotipia.com/pcr/#:~:text=Y%20es%20que%20la%20PCR,el%20desarrollo%20d e%20terapias%20g%C3%A9nicas. 3. https://es.khanacademy.org/science/ap-biology/gene-expression-andregulation/biotechnology/a/polymerase-chain-reaction-pcr 4. http://bibliotecadigital.fia.cl/bitstream/handle/20.500.11944/144842/F01-1-BT080_MA.pdf?sequence=4&isAllowed=y 5. https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Tecnologia-de-microarrays 6. https://www.elsevier.es/es-revista-medicina-clinica-2-articulo-uso-chips-adnmicroarrays-medicina13057538#:~:text=Los%20microarrays%20de%20ADN%20son,de%20miles%20de%20ge nes1.
