Traducido del inglés al español - www.onlinedoctranslator.com Revista de cromatografía B,878 (2010) 1246–1252 Listas de contenidos disponibles enCienciaDirecta Revista de cromatografía B revista Página de inicio :www. els ev ier. com/ l oc ate / ch r omb Determinación de fosfatos de dialquilo en cabello humano para el biomonitoreo de la exposición a plaguicidas organofosforadosAM Tsatsakiun,∗, MG Barbounisun,b, M. Kavalakisun, M. Kokkinakisun,C, I. Terziun, MN Tzatzarakisun unCentro bN de Ciencias e Investigación de Toxicología, División de Morfología, Facultad de Medicina, Universidad de Creta, Voutes, Heraklion 71003, Creta, Grecia Asteriadis SA, Departamento de Aplicaciones, Atenas 10022, Grecia CInstituto de Educación Tecnológica (TEI) de Creta, Centro de Investigación Tecnológica, Laboratorio de Calidad Alimentaria, 722 00 Ierapetra, Creta, Grecia información del artículo resumen Historial del artículo: En el estudio actual se presenta un método nuevo, simple, rápido y sensible que permite la medición de cuatro fosfatos de dialquilo (DAP) en el cabello de la cabeza humana. Los fosfatos de dialquilo, fosfato de dimetilo (DMP), fosfato de dietilo (DEP), tiofosfato de dietilo (DETP) y ditiofosfato de dietilo (DEDTP) son metabolitos no selectivos de los plaguicidas organofosforados (OP). La extracción de DAP de la matriz del cabello se logró mediante extracción metanólica en un solo paso. Las muestras de pelo de la cabeza de la población general y de la población ocupacionalmente expuesta a OP se analizaron mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) después de la derivatización con pentafluorobencilbromuro. La recuperación de los compuestos objetivo se estimó en 84,3 % para DMP, 116,1 % para DEP, 109,0 % para DETP y 91,5 % para DEDTP. El límite de cuantificación (LOQ) y detección (LOD) fue de 20 y 6 pg/mg para DMP, 10 y 5 pg/mg para DEP y DETP y 5 y 3 pg/mg para DEDTP, respectivamente. Se estimó la precisión con y entre ejecuciones, así como la exactitud. El porcentaje de muestras de cabello positivas para DMP, DEP, DETP y DEDTP para el grupo de población general fue del 63,0%, 96,3%, 66,7% y 70,4% respectivamente. Las muestras del grupo con exposición laboral fueron positivas para todos los fosfatos de dialquilo analizados. Las concentraciones medianas para DMP fueron 165,0 y 181,7 pg/mg, para DEP fueron 51,2 y 812,9 pg/mg, para DETP fueron 54,0 y 660,1 pg/mg, y para DEDTP fueron 40,0 y 60,6 pg/mg para el grupo de población general y el grupo con exposición ocupacional respectivamente.pag <0,001). Más concretamente, las concentraciones medianas de fosfato de etilo total (DEP) y DAP fueron de 119,5 y 301,5 pg/mg para el grupo de población general y de 1498,8 y 1694,4 pg/mg para el grupo con exposición laboral. Recibido el 9 de octubre de 2009 Aceptado el 16 de febrero de 2010 Disponible en línea el 23 de febrero de 2010 Palabras clave: Fosfatos de dialquilo Pelo Exposición biomonitoreo GC–MS pesticidas © 2010 Elsevier BV Todos los derechos reservados. 1. Introducción mento La población rural de Creta está expuesta a los OP a través de la cadena alimentaria y la contaminación ambiental[10]Sin embargo, la exposición severa se El cabello es una matriz que se ha utilizado ampliamente para el análisis de drogas de abuso en la práctica clínica o forense de rutina. En algunos casos post atribuye principalmente al uso ocupacional, por ejemplo, la exposición de los rociadores y aplicadores de pesticidas. mortem, el cabello es la única muestra biológica disponible para la evaluación de Las frecuencias de detección de OPs o de los metabolitos específicos de los la exposición a fármacos o productos farmacéuticos.[1,2,3]. El análisis del cabello OPs en el cabello fueron menores en comparación con las observadas en otros también se ha utilizado con éxito para evaluar la exposición crónica a metales.[4], grupos de plaguicidas como los organoclorados[11]. Esto se debe a que los OP se varios xenobióticos[5], contaminantes ambientales, plaguicidas organoclorados[6– metabolizan rápidamente a metabolitos de dialquilfosfato no específicos (DAP) ( 8]y recientemente, para la evaluación de la exposición a plaguicidas tabla 1). En consecuencia, los DAP se consideran biomarcadores para una gran organofosforados (OPs)[9]. Los plaguicidas y, en particular, los OP se utilizaron, y cantidad de pesticidas y se utilizan para monitorear la exposición acumulativa de se siguen utilizando, de forma intensiva en Creta, pero su uso tiene efectos organofosforados.[12,13]. secundarios tanto en los seres humanos como en el medio ambiente. Se han detectado DAP en diversas muestras, como muestras de orina, sangre, líquido amniótico y meconio de la población general, de la población ocupacionalmente expuesta y también de los casos de intoxicación.[14–17]. Recientemente, se demostró que los DAP también pueden detectarse en el pelo de conejos de laboratorio tratados con pesticidas organofosforados a través del agua de bebida.[18]mientras que otros estudios confirman la detección de DAP en el cabello humano de la población rural en Creta[19]. - Este artículo es parte del número especial 'Bioanálisis de tóxicos organofosforados y antídotos correspondientes', Harald John y Horst Thiermann (Editores invitados). ∗Autor para correspondencia en: Jefe del Departamento de Ciencias Forenses y Toxicología, Facultad de Medicina, Universidad de Creta, Voutes, 71003 Heraklion, Creta, PO Box 1393, Grecia. Tel.: +30 2810 394679; fax: +30 2810 542098. Dirección de correo electrónico:[email protected] (AM Tsatsakis). 1570-0232/$ – ver portada© 2010 Elsevier BV Todos los derechos reservados. hacer: 10.1016/j.jchromb.2010.02.021 AM Tsatsakis et al. / J. Chromatogr. B878 (2010) 1246–1252 1247 tabla 1 Estudió los metabolitos de fosfato de dialquilo, sus estructuras y los pesticidas organofosforados originales. DAP Estructura de los DAP DMP DEP DETP DEDTP pesticidas padres Azinfos-metilo, diclorvos, dicrotofos, dimetoato, fenitrotión, fentión, malatión, metilparatión, triclorfón, clorpirifos-metilo, metidatión, mevinfos, oxidemetón-metilo, fosmet, primifos-metilo, temefos, tetraclorvinfos, trihorfón, isazofos-metilo, naled , dicrotofos Cloretoxifos, clorpirifos, cumafós, diazinón, disulfotón, etión, paratión, forato, fosalona, sulfotepp, terbufos, tribufos Cloretoxifos, clorpirifos, cumafós, diazinón, disulfotón, etión, etilparatión, forato, fosalona, sulfotepp, terbufos, tribufos Disulfotón, etión, forato, fosalona, terbufos 2. Experimental Nueva York, Estados Unidos),O,O-la sal de dietiltiofosfato de potasio (98 %) (DETP) y la sal de dietilditiofosfato (95 %) (DEDTP) procedían de Sigma-Aldrich (3050 Spruce Street, St. Louis, EE. UU.). Tolueno (99,5%) y carbonato de potasio (K2CO3) se obtuvieron de Merck (Darmstadt, Alemania). El acetonitrilo y el fosfato de dibutilo (DBP) (97 %) se adquirieron de Roth (Karlsruhe, Alemania) y Fluka (Steinheim, Alemania), respectivamente. El agente derivado 2,3,4,5,6pentafluorobencilbromuro (PFBBr) (99%) se obtuvo de Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemania). 2.1. Coleccion de muestra 2.3. Condiciones de cromatografía de gases y espectrometría de masas El objetivo de este estudio fue desarrollar un método simple, preciso, eficiente y que requiera menos tiempo, en comparación con uno publicado anteriormente.[18], para la detección y cuantificación de DAP en muestras de pelo de la cabeza. Investigamos más a fondo los niveles de DAP en el pelo de la cabeza de la población general y la población ocupacionalmente expuesta a OP para identificar diferencias en los niveles de exposición, con fines de evaluación de riesgos. Se recogieron y analizaron un total de 33 muestras de pelo de la cabeza. Se cortaron aproximadamente 200–500 mg de cabello desde la raíz, en la parte posterior de la cabeza y se usaron para el análisis. Se recogieron veintisiete muestras de cabello de 10 hombres y 17 mujeres que trabajaban en el Departamento de Morfología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Creta, que no estaban expuestos ocupacionalmente a los OP y se clasificaron como muestras de la población general. La longitud de las muestras de cabello de los participantes varió de 3 cm a 24 cm, lo que corresponde a un período de prueba de hasta 24 meses.[11]. Se recolectaron seis muestras de aplicadores masculinos de pesticidas durante el período de rociado (longitud total del cabello de 3 a 5 cm). Se pidió a los sujetos que rellenaran un cuestionario sobre la duración y la intensidad de su exposición a pesticidas a través de su ocupación. Dos de ellos se quejaron de síntomas de intoxicación leve varias veces durante las aplicaciones (dolor de cabeza y vómitos). La longitud del cabello en estos sujetos era de 3 a 5 cm. Todas las muestras de cabello se almacenaron en sobres de papel, a temperatura ambiente hasta su análisis. En ambos casos (muestras reales), analizamos todo el mechón de cabello para estimar la exposición total de las poblaciones a los PO. 2.2. Materiales El dimetilfosfato (DMP; 98 %) se adquirió de Acros Organics (Geel, Bélgica; Nueva Jersey, EE. UU.), el fosfato de dietilo (DEP; 98,9 %) se adquirió de Chem Service (West Chester, El análisis espectrométrico de masas de ionización electrónica se realizó en un sistema GC-MS QP-2010 Shimadzu equipado con un BPX5 (30 m×0,25 mm×0,25 -m) columna capilar (SGE, Argent Place, Ringwood, Victoria, Australia). Como gas portador se utilizó helio puro (99,999 %) con un flujo de columna de 1 ml/min. Se inyectaron 2 l de la solución en el sistema en el modo splitless y se analizaron en las siguientes condiciones: la temperatura de la columna se mantuvo inicialmente a 60◦C durante 1 min, elevado a 180◦c a las 20◦C/min, mantenido durante 1 min, elevado a 250◦c a las 4◦C/min, se mantuvo durante 1 min y finalmente se elevó a 300◦C, a los 25◦C/min, donde permaneció estable durante 2 min. La temperatura del inyector era de 270◦C. La temperatura de la interfaz se fijó en 300◦C. La temperatura de la fuente de iones fue de 230◦C. Se realizó una sintonización automática del espectrómetro de masas utilizando perfluorotributilamina (PFTBA, estándar de sintonización) antes del análisis de cada conjunto de muestras. El análisis cuantitativo se logró en el modo de monitoreo de iones seleccionados (SIM) con un tiempo de exploración de 0,2 s, utilizando un ión objetivo para la cuantificación y dos iones calificadores para la confirmación de cada compuesto. El cromatograma se dividió en cinco segmentos diferentes para DAP e IS. El primer segmento fue de 17.0 a 18.0 min (m/z110, 306, DMP), el segundo de 19,5 a 20,5 min (m/z258, 334, DEP), el tercero de 23.0 a 24.0 min (m/z350, 274, DETP), el cuarto de 24,6 a 25,6 min (m/z 366, 185, DEDTP) y el quinto de 26,6 a 27,6 min (m/z335, DBP-IS) (Figura 1). La temperatura de la columna se programó de esta manera para evitar cualquier interferencia de la matriz (pelo) y el agente derivante. 1248 Figura 1.Cromatograma de (A) muestra de cabello en blanco con niveles de DAP por debajo del LOQ, (B) muestra de cabello con púas a una concentración de 100 pg/mg de DMP, DEP, DETP y DEDTP y (C) muestra de cabello de caso real. Las concentraciones de DMP, DEP, DETP y DEDTP en el caso real (C) fueron 33,01, 50,99, 83,21 y 40,30 pg/mg respectivamente. Los iones objetivo (cuantificación) (m/z)para cada DAP (derivados de pentafluorobencilbromuro) fueron 306 para DMP, 258 para DEP, 350 para DETP y 366 para DEDTP y los iones calificadores fueron 110 y 306 para DMP, 334 y 258 para DEP, 274 y 350 para DETP, 185 y 366 para DEDTP. Los tiempos de retención de DMP, DEP, DETP, DEDTP y DBP fueron 17,34, 19,84, 23,40, 24,97 y 26,98 min respectivamente. 2.4. Controles de calidad y muestras de cabello enriquecido Los DAP son sustancias altamente polares. No se dispone de normas en el cabello para plaguicidas y metabolitos. No esperamos obtener dichos estándares en un futuro cercano, especialmente debido al hecho de que los plaguicidas de interés probablemente cambiarán en los próximos años y los estudios de exposición se centrarán en nuevas estructuras. En este estudio cumplimos con las recomendaciones especiales para las pruebas de cabello en cuanto a los controles de calidad y la preparación de los estándares enriquecidos. Las muestras enriquecidas se prepararon siguiendo las recomendaciones de Society of Hair Testing (SoHT)[20]. Se usó un grupo de cabello de donante humano sin niveles detectables de DAP como muestras de cabello en blanco y se usó además para la preparación de los estándares enriquecidos y los controles de calidad. El grupo de homogeneizados de cabello sin niveles detectables de DAP se preparó combinando varias muestras de cabello de donante humano en cada una de las cuales no se detectó más de un DAP por debajo del valor LOQ. Finalmente, el grupo de cabello se preparó combinando al menos cuatro muestras de cabello diferentes con solo un DAP diferente detectado por debajo del valor LOQ. Los niveles de cada uno de los DAP en dicho grupo homogeneizado estaban por debajo del valor LOD. Las muestras de cabello en blanco de los homogeneizados se enriquecieron con concentraciones conocidas de DMP, DEP, DETP o DEDTP en un rango de concentración de 0 a 500 pg/mg (0, 25, 50, 100, 250 y 500 pg/mg) y se usaron como estándares enriquecidos. para las curvas de calibración y determinación adicional de las muestras de cabello desconocidas. Los controles de calidad se prepararon de manera similar. 2.5. Stock y soluciones de trabajo Se prepararon soluciones madre a la concentración de 1 mg/ml en metanol para cada DAP y se almacenaron a -20◦C. Se preparó una solución de trabajo mixta de DMP, DEP, DETP y DEDTP en metanol a una concentración de 10 g/ml. Se prepararon soluciones de trabajo de DAP mixtos mediante diluciones en metanol semanalmente en las concentraciones de 0, 5, 10, 25, 50, 100, 250 y 500 ng/ml. Todas las soluciones de trabajo se almacenaron a 4◦C en la oscuridad. 2.6. Descontaminación del cabello Los DAP son sustancias altamente polares y solubles en agua. Para la remoción de la contaminación externa de la matriz capilar, el cabello se lavó dos veces en 5 ml de agua (durante 10 min) y en 5 ml de metanol (durante 1 min) a temperatura ambiente. Las muestras de cabello lavado se secaron en el horno a 36◦C durante 10 min. El último lavado con metanol se analizó en busca de DAP para confirmar que se eliminó la contaminación externa. Más específico, 15 mg de K2CO3se añadió, el metanol se evaporó, se derivatizó con PFBBr y se analizó mediante GC-MS. El nivel detectado de cada DAP estaba por debajo del LOD. Posteriormente, se pesó una cantidad de cabello y se pulverizó en un homogeneizador de molino de bolas (Retsch-MM 2000, Bioblock Scientific, BP111, F67403 Illkirch Cedex). Se transfirió una cantidad de 100 mg de cabello en polvo en un tubo de ensayo con 2 ml de metanol y se agregaron 25 l de DBP (10 g/ml) como patrón interno en el cabello de la cabeza hasta una concentración final de 2500 pg/ mg. 2.7. Proceso de extracción y derivatización del cabello El cabello se incubó a temperatura ambiente en un baño ultrasónico durante 4 h y se realizó una extracción líquido-sólido durante 30 min mediante agitación mecánica. La temperatura del baño de agua ultrasónico se controló durante la extracción ultrasónica para que no exceda los 40◦C. AM Tsatsakis et al. / J. Chromatogr. B878 (2010) 1 La mezcla se centrifugó a 2576 g durante 5 min. El sobrenadante se transfirió a través de un econofiltro de 0,2 m, 25 mm (Agilent Technology) a una probeta que contenía 15 mg de K2CO3y el metanol se evaporó a sequedad bajo una suave corriente de nitrógeno a temperatura ambiente. Quince mg (15 mg) de K2CO3se añadió al residuo, se reconstituyó en 1 ml de acetonitrilo y 0,1 ml de solución de bromuro de pentafluorobencilo (PFBBr) en acetonitrilo (1:3, v/v) y se incubó a 80ºC.◦C en un baño de agua durante 30 min con agitación ocasional[14]. A continuación, la mezcla se llevó a temperatura ambiente y el acetonitrilo se evaporó a sequedad bajo nitrógeno a 35ºC.◦C. El residuo se disolvió finalmente en 50 l de tolueno y se inyectaron 2 l a GC-MS. 3. Análisis estadístico Los niveles de metabolitos no selectivos de OP se informaron como medianas y rangos intercuartílicos. Las diferencias entre los grupos de población se examinaron mediante la prueba de Mann-Whitney. Se utilizó el paquete estadístico SPSS 17.0 para el análisis de datos y la creación de gráficos. Se fijó un nivel de significación de 0,05. La figura presentada es un diagrama de caja y bigotes. Las barras de error muestran los valores mínimo y máximo. 4. Resultados 4.1. validación del método 4.1.1. linealidad Para la cuantificación se usaron las proporciones de área de pico (respuesta de DAP/respuesta estándar interna). Las curvas patrón obtenidas a partir de las soluciones de trabajo de DAPs fueron lineales entre las concentraciones de 0 y 500 ng/ml con coeficientes de linealidad superiores a 0,99. Nuestros resultados también indican una buena linealidad en el rango de concentraciones entre 25 y 500 pg/mg. La curva de la muestra enriquecida fue lineal,r2= 0,9915 para MPD,r2= 0,9913 para DEP,r2= 0,9932 para DETP yr2= 0,9941 para DEDTP (Tabla 2). Figura 2.Los valores medianos (pg/mg) de DMP, DEP, DETP y DEDTP en muestras de cabello para el grupo de población general y la población con exposición ocupacional. Las barras de error se refieren a valores mínimos y máximos. 4.1.4. Precisión y exactitud del método Además, evaluamos la precisión del método utilizando muestras de control positivo. La desviación estándar relativa intradiaria (% RSD) se determinó preparando y extrayendo cuatro muestras enriquecidas a concentraciones de 50, 250 y 500 pg/mg para cada analito e inyectándolas durante un día laboral en el sistema GC-MS. La RSD entre días del procedimiento también se evaluó preparando e inyectando muestras de control positivo a concentraciones de 50, 250 y 500 pg/mg durante tres días consecutivos. Para DMP, DEP, DETP y DEDTP, la precisión dentro del día se estimó en 8,18 %, 5,27 %, 5,71 % y 6,12 % respectivamente a las concentraciones de 50 pg/mg; 7,72%, 26,22%, 20,94% y 21,17% respectivamente a la concentración de 250 pg/mg; y 10,12%, 2,97%, 2,53% y 10,64% respectivamente a la concentración de 500 pg/mg. Para DMP, DEP, DETP y DEDTP, la precisión entre días se estimó en 11,76 %, 10,03 %, 13,57 % y 9,64 % respectivamente a la concentración de 50 pg/mg; 12,50%, 10,08%, 13,57% y 9,56% respectivamente a la concentración de 250 pg/mg; y 9,99%, 23,94%, 15,59% y 9,72% respectivamente a 4.1.2. Límite de cuantificación El límite de cuantificación (LOQ) y el límite de detección (LOD) se determinaron en cabello inyectando concentraciones decrecientes. Definimos LOQ y LOD como los picos que dieron una relación señal/ ruido de 10 y 3 respectivamente. El LOQ se estimó en 20 pg/mg para DMP, 10 pg/mg para DEP y DETP y 5 pg/mg para DEDTP. El LOD se estimó en 6 pg/mg para DMP, 5 pg/mg para DEP y DETP y 3 pg/mg para DEDTP (Tabla 2). Precisión w pelo de punta 50 4.1.3. Recuperación En cada lote de muestras analizadas se incluyeron soluciones patrón metanólicas a concentraciones de 100 y 500 ng/ml y soluciones enriquecidas a concentraciones de 25 a 500 pg/mg de cada analito. Se usaron muestras de control positivo para monitorear cualquier posible cambio en los parámetros analíticos. Se evaluó la recuperación del método en cabello en punta agregando DMP, DEP, DETP y DEDTP en cabello blanco en cuatro concentraciones diferentes. Estas concentraciones fueron 50, 100, 250 y 500 pg/mg que representan un nivel cercano al LOQ, concentración baja, media y alta en el cabello de la cabeza humana. Las muestras de cabello con púas se extrajeron de la misma manera que las muestras reales descritas anteriormente. Cada muestra se midió por triplicado. La recuperación de la extracción se determinó comparando la proporción de áreas máximas de DAP/áreas máximas de IS de la muestra de cabello extraído con la proporción de patrones metanólicos a la misma concentración. La recuperación media de los compuestos objetivo con el método empleado se estimó en 84,3 % para DMP, 116,1 % para DEP, 109,0 % para DETP y 91,5 % para DETP (Tabla 2). Las altas recuperaciones observadas reflejan la alta capacidad de extracción del metanol para aislar los DAP de la matriz del cabello. Fig. 3.Los valores medianos de SUM (pg/mg) de -DEP y -DAP en muestras de cabello para el grupo de población general y la población con exposición ocupacional. Las barras de error se refieren a valores mínimos y máximos. 1250 AM Tsatsakis et al. / J. Chromatogr. B878 (2010) 1246–1252 Tabla 2 Coeficientes de correlación, límites de cuantificación (LOQ), límite de detección (LOD), recuperaciones, exactitud, precisión y % de desviación estándar relativa (% RSD). Concentración (pg/mg) DMP norte 0.9915 r2de curvas de calibración % de 84.3 6 20 recuperación LOD (pg/mg) LOQ (pg/mg) Exactitud % de precisión intraensayo DSR Precisión entre ejecuciones % RSD 50 100 500 7 7 7 50 250 500 4 4 4 50 250 500 3 3 3 varió de 51,6% a 107,3% para DMP, de 86,2% a 94,5% para DEP, de 83,0% a 89,4% para DETP y de 62,6% a 98,4% para DEDTP (Tabla 2). 51.6 107.3 74.0 8.18 7.72 DEP DETP 0.9913 116.1 0.9932 109.0 5 10 89.5 86.2 94.5 DEDTP 0.9941 5 10 91.5 3 5 86.1 89.4 83.0 98.4 78.7 62.6 5.27 5.71 6.12 26.22 10.12 2.97 20.94 2.53 21.17 10.64 11.76 12.50 10.03 10.08 23.94 13.57 13.57 15.59 9.64 9.56 9.72 9.99 solvente de ción basado en los resultados experimentales para la extracción de DAPs. El metanol proporcionó las recuperaciones más altas de DAP en comparación con otros solventes o mezclas de solventes después de una extracción ultrasónica de 4 h y una extracción líquido-sólido de 30 min. 4.2. Niveles de fosfatos de dialquilo en grupos de población general y expuestos En estudios previos, se utilizó extracción líquido-sólido con agitación mecánica y sonicación para el aislamiento de DMP y DMTP de la matriz del cabello.[18,19]. En estos estudios, la muestra de cabello se sonicó en un baño de agua ultrasónico Los niveles de metabolitos no selectivos de los OP en el cabello se muestran enTabla 3. No incluimos DMTP y DMDTP en este estudio ya que estos DMP se estudiaron exclusivamente en detalle en dos artículos publicados anteriormente.[18,19]. La concentración media de DMP en las muestras de pelo de la cabeza fue de 165,0 pg/mg para la población general y de 181,7 pg/mg para el grupo de exposición ocupacional. Las concentraciones medianas de DEP, DETP y DEDTP fueron 51,2, 54,0 y 40,0 pg/mg para el grupo de población general y 812,9, 660,1 y 60,6 pg/mg para el grupo de exposición ocupacional (Tabla 3,Figura 2). Las concentraciones medianas de DEP y DAP totales (-DEP y -DAP) fueron 119,5 y 301,5 pg/mg para el grupo de población general y 1498,8 y 1694,4 pg/mg para el grupo de exposición ocupacional (Tabla 3,Fig. 3). En cada cabello de la cabeza se detectó al menos un DAP. El porcentaje de muestras de cabello positivas en el grupo de población general fue del 63,0% para DMP, 96,3% para DEP, 66,7% para DETP y 70,4% para DEDTP. Todas las muestras de cabello de la población con exposición laboral resultaron positivas para todos los DAP analizados. DEP se detectó con mayor frecuencia en comparación con DMP. Este fenómeno se atribuye principalmente al tipo de OP al que estuvieron expuestos los sujetos estudiados y menos, a la diferencia de valores LOQ entre DEP y DMP. 5. Discusión El estudio de la eficacia de la extracción se realizó con muestras de cabello real obtenidas de personas expuestas a OPs. La extracción de DAPs del cabello se realiza con metanol. El metanol fue seleccionado entre otros solventes como etanol, acetonitrilo, mezcla (1:1, v/v) de acetonitrilo y éter dietílico como el extractor apropiado. durante 1 h, seguido de agitación horizontal a temperatura ambiente durante 12 h para aislar los metabolitos OP de la matriz del cabello (tiempo total de extracción 13 h). Con el fin de reducir el tiempo de extracción del cabello, en nuestro estudio, el cabello se sonicó durante 4 h, seguido de una extracción líquido-sólido con agitación mecánica durante 30 min (tiempo total de extracción de 4,5 h). Este método de extracción resultó en recuperaciones aceptables como se describe en la Sección 4.1.3. Se documentaron las diferencias en los niveles de DAP en varias muestras entre sujetos que variaban en la gravedad de la exposición. Se detectaron altas concentraciones de DEP y DETP (0,2-8,53 -g/ml para DEP y 0,42-5,07 -g/ml para DETP) en el plasma de pacientes (8 casos) intoxicados con clorpirifos, quinalfos y fosalona inmediatamente después del ingreso en el hospital[21]. Se ha detectado una alta concentración de DMP en sangre en muestras de pacientes intoxicados con OP[22]. Se observaron diferencias en los niveles de concentración de metabolitos de dimetilfosfato en orina entre niños con dietas convencionales y niños con dietas orgánicas (0,17 y 0,03 -mol/l respectivamente)[23]. La mayoría de los estudios publicados han demostrado que los metabolitos de DAP pueden detectarse en muestras biológicas en altas frecuencias. Ye et al.[24]informaron frecuencias de detección del 81 % para DEDTP al 100 % para DMTP en muestras de orina de mujeres embarazadas. Bouvier et al.[25]detectó 85% de muestras positivas para DMTP, 83% para DMP y 46% para DEP después del análisis de orina recolectada de sujetos con exposición ocupacional o no ocupacional en el área de París. Otro estudio sugirió que los niños en o cerca de áreas agrícolas tenían niveles más altos de DMP, DETP, DMTP y DEDTP que aquellos que vivían fuera de las áreas agrícolas.[26]. Tabla 3 Valores medianos, 1er y 3er cuartil y valores de suma de metabolitos no selectivos (DMP, DEP, DETP, DEDTP, -DEPsuny -DAPb) (pg/mg) de OPs en cabello del grupo con exposición ocupacional y del grupo de población general. Población con exposición ocupacional DMP DEP DETP DEDTP - DEP - DAP un b 1er cuartil Mediana 96.3 447.8 481.4 181.7 812.9 660.1 1025.4 1241.0 1498.8 1694.4 20.8 60.6 pag Grupo de población general 3er cuartil 229.5 995.3 839.8 100.3 1894.7 1991.0 - DEPs: fosfatos de dietilo (DEP, DETP, DEDTP). - DAPs: fosfato de dietilo y fosfatos de dimetilo (DMP, DEP, DETP, DEDTP). 1er cuartil 41,9 38,9 21.3 33.6 80.4 153.1 Mediana 3er cuartil 165.0 471.3 119.5 301.5 227.0 506.4 51.2 54.0 40,0 97.3 84,9 78.6 0.829 <0.001 0.003 0.997 <0.001 <0.001 AM Tsatsakis et al. / J. Chromatogr. B878 (2010) 1246–1252 Las muestras de sangre y orina, así como el aliento salival y el sudor brindan información solo de exposición reciente, máximo de varios días. La exposición pasada y crónica no puede registrarse utilizando las muestras mencionadas anteriormente, mientras que la exposición acumulada también puede subrayarse o no presentarse en absoluto. Las muestras de cabello, por el contrario, proporcionan una medición fiable de la exposición pasada, la exposición sistemática, crónica y acumulada.[11,27,28]. Además, el análisis seccional proporciona un registro de una exposición durante un período de tiempo a largo plazo. Por supuesto, la existencia de una muestra adecuada es absolutamente necesaria para realizar una prueba de sección de este tipo del tallo del cabello, por ejemplo, desde los segmentos distales a los proximales. Se han detectado y cuantificado pesticidas organofosforados en muestras de cabello de la cabeza recolectadas de la población rural en Creta. [11]. Poseción et al.[29]encontró 0,35% y 2,84% de muestras de cabello positivas para el clorpirifos y el malatión originales, respectivamente (n =282) recolectados de mujeres embarazadas. Los autores informaron niveles de concentración promedio muy altos para malatión y clorpirifos, 4,85 y 4,58 ng/mg respectivamente, que fueron los plaguicidas organofosforados originales detectados. Estos niveles de pesticidas fueron sorprendentemente mucho más altos que los informados por Tsatsakis et al. [11]donde los niveles de concentración detectados estaban en escala pg/mg. Los valores medianos para diazinón, malatión y clorpirifos fueron 5,1 pg/mg (2,8 % de muestras positivas), 6,1 pg/mg (1,5 %) y 7,2 pg/mg (2,4 %) respectivamente. Los enormes niveles altos de malatión y clorpirifos en Posecion et al. el informe puede atribuirse a una exposición muy severa y/o una alta contaminación externa del cabello muestreado. De todos modos, los detalles sobre el procedimiento analítico del método y la información de la etapa de descontaminación no se proporcionaron en el artículo.[29]. Además, aunque no se observaron diferencias significativas entre los dos estudios en el porcentaje de muestras positivas para pesticidas organofosforados, los niveles de los pesticidas detectados fueron inconsistentes. Poseción et al.[29]observó que no se detectaron metabolitos de plaguicidas como el ácido monocarboxílico de malatión (MMA) en muestras de cabello (LOD = 5,88 ng/mg para MMA). Los autores sugirieron que los metabolitos ácidos como el MMA tienden a dividirse más en la sangre que en el cabello y pueden requerir métodos más sensibles para su detección. Los comentarios anteriores respaldan la conclusión de que el LOD es alto (ng/mg) y ciertamente no es adecuado para estimar la prevalencia de muestras positivas en tales estudios. Además compuesto ácido como MMA según la literatura.[30]tienda a incorporarse en el tallo del cabello a través de las glándulas sebáceas y sudoríparas además de la incorporación a través de la sangre, lo que hace que la contaminación externa sea un parámetro importante para la evaluación de la concentración medida. Ostrea et al.[31]analizaron pesticidas/herbicidas en muestras pareadas de cabello y sangre para determinar la matriz más adecuada para el seguimiento de la exposición de pesticidas a estos compuestos. Informaron un pequeño porcentaje de muestras de cabello materno positivas para malatión (1,8 %) obtenidas a mitad de la gestación y clorpirifos (0,4 %) obtenidas al nacer. Se detectó MMA en el 0,2 % de las muestras de cabello materno. A pesar del bajo porcentaje de organofosforados presentes, los autores concluyeron que el cabello es una matriz más apropiada para analizar la exposición de mujeres embarazadas a pesticidas en comparación con la sangre materna. El bajo porcentaje de detección de organofosforados o sus metabolitos específicos en los estudios anteriores[11,29,31], que se atribuye a la sensibilidad del método, no permite el seguimiento biológico de plaguicidas organofosforados de la población a bajos niveles de exposición. Recientemente, se detectaron DAP en el cabello de trabajadores rurales con exposición ocupacional potencial a OP[19]. En el estudio anterior, los autores informaron niveles detectables de DEP, DMTP y DMP en el 70 %, 20 % y 40 % de las muestras, respectivamente, a niveles de concentración de 0,32 a 0,44 ng/mg para DEP, 0,32 a 0,41 ng/mg para DMTP y 0,10 a 0,46 ng/mg para DMP. 1251 El análisis de metabolitos no específicos en cabello para el biomonitoreo de la exposición acumulada a OPs se propuso como un método más confiable en comparación con el análisis de sangre u orina. Se demostró que esto es eficaz, particularmente a niveles bajos de exposición. El porcentaje de muestras positivas oscila entre el 63,0 % (DMP) y el 96,3 % (DEP) en el presente estudio. DEP fue el metabolito con mayor frecuencia de detección. Resultados similares se presentaron en el estudio anterior.[19]. Generalmente, los metabolitos DEP dieron niveles detectables en frecuencias más altas que el metabolito DMP. Se observaron diferencias significativas en DEP (pag <0.001) y DETP (p = 0,003) niveles entre los grupos de población examinados. La mediana de los niveles de DEP en la población general fue de 51,2 pg/mg y en la población con exposición ocupacional fue de 812,9 pg/mg. Se obtuvieron resultados similares para DETP (Tabla 3). Las diferencias entre los valores de DAP detectados en las muestras de pelo de la cabeza se deben al hecho de que los pesticidas organofosforados como el diazinón, el paratión y el clorpirifos se usan comúnmente en el área de Creta para la protección de frutas y verduras. Producen DEP y DETP pero no DEDTP y DMP.tabla 1presenta ingredientes activos de formulaciones de pesticidas que se metabolizan a DMP, DEP, DETP y DEDTP. En contraste, los valores de DMP y DEDTP entre la población general y los rociadores de pesticidas no difirieron significativamente (Tabla 3). Los niveles medios de DEDTP (p =0.997) y DMP (p =0,829) fueron casi estables entre los grupos de población examinados (40,0 y 60,6 pg/mg para DEDTP y 165,0 y 181,7 pg/mg para DMP) (Tabla 3). Este hecho está asociado con el tipo de formulaciones a las que estuvieron expuestos los rociadores y son complementarias a los niveles más bajos de DEDTP. Nuestros resultados confirmaron que el análisis de metabolitos de DAP en el cabello se puede utilizar para evaluar la exposición a los OP. 6. Conclusión En conclusión, desarrollamos un método simple, rápido, preciso y altamente sensible (LOQ inferior a 20 pg/mg) para la cuantificación simultánea en cabello de cuatro metabolitos no específicos de pesticidas OPs, el DMP, DEP, DETP y DEDTP, y aplicó este método para evaluar la exposición a los OP en la población general y en la población con exposición documentada a los OP. Observamos diferencias significativas entre cada uno de ellos, los fosfatos de dietilo totales (DEPs) y los fosfatos de dialquilo totales (DAPs) en muestras de cabello entre los dos grupos examinados, el de población general y el expuesto. Un resultado importante de este estudio es que se midieron mayores niveles de metabolitos organofosforados en las muestras de cabello recolectadas de humanos expuestos ocupacionalmente, y también se controlaron los niveles detectables de estos metabolitos en el cabello de la población general. Este biomonitoreo de los OP mediante el análisis del cabello ganará mucha atención en futuros estudios para la investigación de problemas de protección de la salud y la seguridad. Expresiones de gratitud Los autores desean expresar su agradecimiento a Thanasis Alegakis, PhD, y Toutoudaki Maria, PhD, por sus útiles consejos en la preparación del manuscrito. El estudio fue cofinanciado por el Código de Programa de la Prefectura de Heraklion Universidad de Creta ELKE UC 2197 y subvenciones del Laboratorio de Toxicología 2600 y 2598, Comité de Investigación de la Universidad de Creta. Referencias [1] P. Fernández, M. Lago, RA Lorenzo, AM Carro, AM Bermejo, MJ Tabernero, J. Chromatogr. B 877 (2009) (1743). [2] M. Uhl, H. Sachs, Ciencias forenses. En t. 145 (2004) 143. [3] C. Jurado, T. Soriano, MP Gimenez, M. Menendez, Forensic Sci. En t. 145 (2004) 161. 1252 AM Tsatsakis et al. / J. Chromatogr. B878 (2010) 1246–1252 [4] TG Kazi, AR Memon, HI Afridi, MK Jamali, MB Arain, N. 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