Producción de interferón Materia: I n g e n i e r í a d e bioprocesos Profesor: Bruno Solís Cruz Alumnas: Bravo Aguilar Karol Naomi García Granillo Esly Lizeth Medina Guerrero Frida Alin Mejía Juárez Carmen Cecilia Pale Soto María Guadalupe Grupo: 8220752 Fecha de entrega: 08/Abril /2022 Contenido Objetivo................................................................................................................................. 3 Justificación .......................................................................................................................... 3 Marco teórico ........................................................................................................................ 4 Contenido ............................................................................................................................. 8 Desarrollo ........................................................................................................................... 16 Conclusiones ...................................................................................................................... 29 Referencias......................................................................................................................... 30 Anexo ................................................................................................................................. 32 Objetivo El trabajo actual está enfocado al desarrollo de herramientas y metodologías para la obtención de líneas celulares humanas productoras de proteínas terapéuticas recombinantes, usando como modelo la línea celular humana HEK293. Este objetivo general engloba los siguientes objetivos específicos: ● Realizar un proyecto de investigación argumentativo de los pasos y etapas de un bioproceso, además del bioproceso a seguir para la obtención del interferón gamma. Justificación A lo largo de la asignatura de Fundamentos de Bioprocesos hemos revisado los pasos y las características fundamentales que debe de tener un bioproceso, iniciando con identificar las características que va a necesitar nuestro microorganismo o nuestro bioproceso, por ello es importante caracterizar lo más detallado que se pueda nuestro microorganismo de interés, conocer las condiciones ideales a la que se debe conservar, la alimentación adecuada que le debemos de brindar, entre otras cosas. De igual forma debemos conocer el modo de operación de nuestro biorreactor y las condiciones de esterilidad que este debe de tener para evitar errores o contaminaciones en nuestro bioproceso, así como las características e impacto del diseño del proceso, la geometría del reactor y seleccionar adecuadamente el agitador a utilizar, otra cosa a considerar es el diseño de los accesorios que serán necesarios dentro del bioproceso, otro aspecto importante son las CIP y SIP involucradas en el lavado y esterilizado del biorreactor y por último la optimización de los costes de producción que se encuentra ampliamente ligado a el modelado del bioproceso. Es por ello que en el presente proyecto se realizará un ejemplo del bioproceso que debe de llevarse a cabo en la producción de interferón, el cual es una biomolécula farmacéutica de gran interés dentro de la industria biotecnológica, esto para poder emplear todos los conocimientos adquiridos en la presente materia, recopilando información de clases, evidencias y exposiciones, añadiendo la investigación puntual del bioproceso del interferón. Marco teórico a) Definición de bioproceso Un bioproceso es “una metodología específica que usa células vivas” (Gelambi, M. 2019, Abril 24) incluyendo lo que son también otros diferentes microorganismos como por ejemplo enzimas, con el fin de obtener un producto para el beneficio ya sea de la industria o el beneficio del ser humano. El bioproceso permite la obtención de productos ya conocidos, bajo condiciones ambientales óptimas, con una calidad superior a la manera de generarlo tradicionalmente. Los bioprocesos permiten la obtención de organismos modificados genéticamente que pueden ser usados con el objetivo de mejorar la eficiencia de procesos puntuales (enzimas o proteínas para ser usadas en tratamientos médicos, como la insulina) o bien ser consumidos directamente por el ser humano. Es aplicable a distintas áreas como la fabricación de alimentos, inducir mejoras en estos, creación de medicamentos, controlar la contaminación de distintos tipos y también al control del calentamiento global. La figura principal de un bioproceso es un fermentador o biorreactor, el cual es un sistema de contención apropiado, que debe diseñarse para brindar el mejor medio ambiente para el crecimiento celular y actividad metabólica. En otras palabras, es un pequeño ecosistema totalmente controlado que le permite al organismo vivo crecer adecuadamente. Existen diferentes tipos, pero la diferencia principal en el diseño se da dependiendo de los requerimientos para el cultivo, el tipo de microorganismo y el tipo de fermentación. La desventaja principal de dichos equipos son los altos costos que representa la adquisición de un biorreactor comercial. b) Etapas de los bioproceso Una de las primeras etapas que se deben realizar en un bioproceso “upstream” (río arriba), en la cual podemos observar el ingreso de “materias primas, esterilización del medio de cultivo y la administración del inóculo” (José Martin Marquez Villa, 2011). Para la etapa de biocatálisis, que toman lugar en los biorreactores que ofrecen las condiciones necesarias de producción, “se efectúan operaciones relacionados de parámetros como” (José Martin Marquez Villa, 2011): ❖ aireación ❖ agitación ❖ temperatura ❖ ph ❖ oxígeno disuelto ❖ etcétera En el downstream o también llamado “río abajo”, que sería la última de las etapas del bioproceso, se encuentran operaciones unitarias como: biomasa, purificación, distribución, entre otras. “Éstas incluyen operaciones como extracción sólido-líquido / líquido- líquido, destilación, filtración, secado, cromatografía, liofilización, etc” (José Martin Marquez Villa, 2011). c) Crecimiento microbiano y fases El crecimiento microbiano es el “incremento ordenado de todos los componentes celulares” (Microbiología, 2020), el cual conlleva a un aumento de masa y por lo tanto a un aumento del número de células. Para poder obtener un crecimiento bacteriano adecuado es necesario un aporte adecuado de nutrientes. “Todos los microorganismos necesitan carbono, nitrógeno, hidrógeno, oxígeno, azufre, fósforo y diversos minerales para crecer.” (Microbiología, 2020). Existen: 1.-Crecimiento individual o ciclo celular Replicación y segregación de cromosomas Síntesis de nuevos materiales de las envueltas Coordinación de la replicación y la división celular. 2.-Crecimiento poblacional Cinética del crecimiento Factores que afectan al tiempo de generación (g) Factores ambientales que afectan al crecimiento: - físicos - químicos. Fases del crecimiento microbiano • Fase lag o periodo de latencia o adaptación: representa el tiempo que le lleva a la bacteria adaptarse al nuevo medio cultivo, durante esta fase el crecimiento es prácticamente nulo. “La fase puede interpretarse como el tiempo que necesitan las bacterias para sintetizar las enzimas necesarias para metabolizar los nuevos nutrientes.” (Liz López, 2016). • Fase exponencial o de crecimiento balanceado: representa el periodo en el que hay suficientes nutrientes; las bacterias recuperan el ciclo celular e “incrementan su número exponencialmente.” (Liz López, 2016). • Fase estacionaria: “representa el periodo de crecimiento nulo.” (Liz López, 2016). Es el momento en el que el número de células en el cultivo no aumenta ni disminuye. Las células inician los procesos que son necesarios para sobrevivir al periodo de falta de nutrientes. • Fase de muerte: representa cuando la bacteria deja de crecer, eventualmente mueren. Ciertas bacterias pueden alimentarse de materia orgánica de las células muertas. d) Importancia de los bioprocesos en la ingeniería biotecnológica. Como bien sabemos la definición de bioprocesos se encuentra dentro del concepto de Biotecnología: “Biotecnología es el uso de organismos vivos o parte de ellos para obtener un producto o servicio útil para el hombre”. Mientras tanto, un bioproceso es “un proceso que involucra métodos de la ingeniería química a los procesos biotecnológicos” La importancia de estos se pueden aplicar en los bioprocesos para obtener productos que serán utilizados por los seres humanos en salud humana y animal (antioxidantes, antiinflamatorios), industria química(enzimas), las industrias de las fermentaciones (alcoholes), en la agricultura y alimentación (biocontroladores, colorantes), en el medio ambiente (degradadores de contaminantes) o para obtener energía (biocombustibles) y en la industria farmacéutica (antibióticos).Para, ello requiere de la aplicación de distintas técnicas biotecnológicas: biología molecular, biología celular, bioquímica, microbiología, ingeniería de procesos, cultivo de tejidos, química y biología. (Jorge Mayer, 2020) Contenido ¿Qué es el interferón? El interferón es una sustancia natural que ayuda al sistema inmunitario del cuerpo a combatir infecciones y otras enfermedades, como el cáncer. Los glóbulos blancos y otras células del cuerpo elaboran interferones, pero también se producen en el laboratorio para su uso en el tratamiento de diferentes enfermedades.” En el tratamiento del cáncer, es posible que los interferones ayudan a impedir que las células se multipliquen y a destruir células cancerosas.” Hay tres tipos principales de interferones: el interferón alfa, el interferón beta y el interferón gamma, son glicoproteínas que pertenecen a la gran clase de proteínas conocidas como citocinas, moléculas empleadas para la comunicación entre células para desencadenar las defensas protectoras del sistema inmunitario que participan en la erradicación de patógenos. (Diccionario de cáncer del NCI, 2020) Como bien ya sabemos los interferones son un grupo de proteínas señalizadoras producidas y secretadas por las células anfitrionas como respuesta a la presencia de diversos patógenos, tales como virus, bacterias, parásitos y células tumorales. Con la pandemia que estamos viviendo ahora, este tipo de respuesta inmune es aún más importante en la lucha contra el virus SARS-CoV-2, ya que el propio virus tiene mecanismos para reducir la producción de interferón por parte de las células del sistema inmunitario. Por lo tanto, en las personas con estas mutaciones los efectos se sumarían y el virus pasaría inadvertido para las defensas del organismo. Existen 3 tipos de interferones diferentes como ya lo mencionamos anteriormente que según sus características estructurales y biológicas son de gran importancia a nivel terapéutico estas son: interferón α o tipo leucocitario, interferón β o tipo fibroblástico e interferón γ o tipo inmune, producido por linfocitos T y células NK. (Avendaño Solà, 2006) Interferones tipo I. Interferón alfa: ● Este grupo de IFN es producido por leucocitos cuando estas células son infectadas por virus. ● El RNA o DNA presente en los virus es reconocido por determinadas proteínas tales como los TLR, las cuales inician una cascada de señalización intracelular, terminando en la fosforilación de un factor transcripcional. ● Produciéndose el IFN, que irá hacia células vecinas. ● Otra actividad relacionada con el interferón a, es que puede actuar de manera autocrina, para estimular la síntesis de CMH-I, el cual actúa con los linfocitos T citotóxicos. Interferón beta ● Al igual que el IFN a, estas proteínas también cumplen funciones similares, pero son producidas por fibroblastos infectados por virus. Interferones tipo II. Interferón gamma ● Estas citocinas, son producidas por linfocitos activados al entrar en contacto con antígenos durante una respuesta inmune. ● La principal acción de este tipo de interferón consiste en actuar como una linfocina, es decir, como una molécula capaz de activar otras células del sistema inmune, como son las células asesinas naturales (NK) los macrófagos, y los linfocitos B. ● Este tipo de interferón no depende de la presencia de ARN de cadena doble y tiene un papel suplementario en la respuesta por el interferón tipo 1 ● El interferón tipo II es particularmente eficaz en el control de infecciones producidas por virus capaces de inhibir en síntesis de ARN ¿Para qué se utiliza el interferón? El interferón como ya lo mencionamos en repetidas ocasiones se puede utilizar para demasiadas cosas cada tipo de interferón explicado anteriormente tiene un uso el cual ya fue mencionado, pero de manera general podemos decir que “el interferón que ayuda al sistema inmunológico del cuerpo a combatir infecciones y otras enfermedades” (Fernández Rúa,2020) Producto de interés Nuestro producto de interés lo vamos a basar en el interferón gamma ya que es el representante de los interferones de tipo II que se caracterizan por tener como receptor al (interferon gamma receptor) y lleva a cabo la transcripción de 30 genes que están relacionados con respuestas celulares. El Interferón gamma es producido por linfocitos CD4+ de tipo Th1, linfocitos CD8+ y células NK y existen evidencias de que también las células B, las NKT y las célulaspresentadores de antígeno (APC) son capaces de producirlo tiene un importante papel en la inmunidad innata, es demasiado eficaz para luchar contra algunas bacterias y también impide la replicación de virus.”Esta citoquina estimula y modula el sistema inmune de las personas”(Herrera, 2020) La forma biológicamente activa del interferón gamma es como homodímero (Estructura que se forma cuando se combinan dos moléculas del mismo tipo de proteína) estabilizado por fuerzas no covalentes, con subunidades de 143 aminoácidos. Este tipo de interferón en específico sirve para combatir infecciones asociadas con la enfermedad granulomatosa crónica ya que es muy útil para estimular macrófagos para eliminar bacterias fagocitadas también otro uso de IFNγ es como un agente antifibrótico ha sido utilizado en el tratamiento de la fibrosis pulmonar idiopática, y como ayudante a un tratamiento primario en cáncer de ovario, cáncer de vejiga, esclerodermia/esclerosis sistémica y tuberculosis principalmente por sus propiedades inmunomoduladoras, con diferentes grados de éxito. Junto con los efectos benéficos del interferón, vienen los efectos colaterales como fiebre, cefalea, mialgia, fatiga, que han logrado reducirse conforme el tratamiento progresa y con la administración de acetaminofén impide la replicación en células infectadas aún no destruidas por acción vírica y también se puede llegar a utilizar para retrasar el progreso de la osteoporosis y potencia la transcripción de genes involucrados en actividades inmunomoduladoras, antivirales, antitumorales y anti proliferativas por eso es que decidimos basar este trabajo en este tipo específico de interferón que se ha usado como proteína modelo en varios estudios, produciéndose en una gran variedad de hospedadores y que se conoce que industrialmente se produce en E.coli pero nosotros nos vamos a estar basando en las células embrionarias humanas del riñón 293 (HEK 293, HEK-293, o HEK) gracias a todo lo ya mencionado es que se eligió como nuestro bioproceso de interés por la gran cantidad de beneficios y usos que tiene dentro la industria. Organismo Productor Para la realización del presente trabajo se construirán distintas líneas celulares que expresen proteínas modelo para validar las diferentes herramientas que se pretenden desarrollar. En algunos documentos encontrados se menciona que el interferón gamma es producido a partir de las células hospedera de mamífero HEK293 este tipo de célula es más común para uso con fines de investigación por varias razones en primer lugar, son muy fáciles de crecer y de mantener, con alta reproducibilidad, cuáles les hacen excesivo preferible otras variedades de células menos robustas y de crecimiento lento. Además, son muy eficientes en la producción de la proteína y accesibles para la transfección. Con la inserción de los vectores del plásmido, la maquinaria sintetizada de la proteína de la célula se puede influenciar para hacer la proteína transferida, utilizando la información genética insertada como ya se mencionó las células HEK293, su alta tasa de transfección es la que permite que sean usadas rutinariamente para producir a nivel de laboratorio proteínasde manera transitoria. (Simmons, 2019) Pero también se van a utilizar plásmidos de la bacteria escherichia coli como un vector para poder introducir en gen de la secuencia del interferón la información genética de la proteínaa producir usualmente se inserta en un vector (plásmido) de expresión. Los elementos esenciales de un vector de expresión para bacterias como ya bien sabemos la mayoría de las proteínas bio terapéuticas aprobadas por la EMA y la FDA se producen en células de mamífero (56%), E.coli (24%) y S.cerevisiae (13%), con aportaciones menores del resto de sistemas porque la producción de proteínas terapéuticas principalmente en células de mamífero y en la bacteria E. coli son variadas ya que fueron el primer organismo usado para la producción de proteínas recombinantes. El vector pIRES puro 3 es la base de la mayoría de vectores de clonación estándar de E.coli, compuesto por un origen de replicación (pMB1), el gen bla para la selección por ampicilina y un MCS integrado dentro del gen lacZ En la célula HEK293 no resulta posible la aplicación de diversos sistemas ya que la presencia de altos niveles endógenos de DHFR y GS impide la selección de los clones recombinantes, incluso aunque se usen grandes concentraciones de inhibidores. Debido a ello no existen, hoy en día, sistemas industriales para la selección metabólica de células HEK293, existiendo una única publicación acerca de la posibilidad de usar la GS mediante la aplicación de tecnologías de edición genómica. Las células HEK293 son muy versátiles metabólicamente. Pueden usar una variedad de fuentes de carbono (Glucosa y Fructosa) como ya lo sabemos son capaces de sintetizar los aminoácidos probados, incluyendo la glutamina pero no son capaces de usar la galactosa como fuente de carbono y, además, son auxótrofas para el aminoácido tirosina. ¿Organismo modificado genéticamente? Durante este punto, se quiere alcanzar el objetivo de obtener poblaciones celulares estables productoras de las proteínas terapéuticas elegidas como modelos para el estudio de la mejora de la producción. La producción biotecnológica de proteínas bio terapéuticas mediante células de mamífero, hace uso en la práctica en gran totalidad de los casos, de líneas celulares modificadas genéticamente que integran el gen que codifica para la proteína de interés de manera estable en su genoma. El organismo a modificar a base de la obtención de células HEK293 productoras de las proteínas terapéuticas de interés será el primer objetivo de este trabajo. Los pasos básicos para la obtención del producto en este trabajo son los siguientes : ● Obtención: de la secuencia genética que codifica para el producto(s) de interés ● Clonación: de esta secuencia en un vector comercial ampliamente usado que contenga los elementos adecuados para la expresión de la proteína en células de mamíferos. ● Amplificación: del vector en un hospedador bacteriano mediante transformación y selección de los clones receptores y comprobación de la secuencia correcta de bases mediante secuenciación Sanger ● Transfección: del vector a las células productoras modelo. ● Selección: de las células que hayan integrado el vector de forma estable en su genoma. ● Escalado: de las células seleccionadas y prueba de expresión de la proteína y de su funcionalidad (Ilustración de los pasos a seguir) El uso de la secuencia IRES en el vector pIRES puro 3, es la característica principal de este vector y la razón principal de su elección en el presente trabajo. Esta secuencia permite la traducción de un gen sin la necesidad de que este tenga la modificación Cap en el extremo 5’ del mensajero. Esto se consigue gracias a que la secuencia permite el acceso del ribosoma a una zona interna del mRNA codificante, habiendo sido explotado este hecho para expresar dos o más proteínas simultáneamente en el mismo mRNA. Algunas ventajas a la hora de seleccionar las células productoras: ● Dado que el plásmido carece de origen de replicación para células de mamíferos, todas las células supervivientes al proceso selectivo han de tener forzosamente integrado en su genoma todo el cassette de expresión. ● Debido a que la expresión del marcador de selección lleva aparejada la expresión del gen de interés, todas las células de la población, a su vez, son células productoras. ● Este hecho permite acortar los tiempos de construcción de las líneas celulares y evita efectos indeseables que ocurren con otro tipo de aproximaciones, como la de usar promotores separados para cada gen La secuencia codificante del IFN-y humano se obtenida mediante retrotranscripción del RNA codificante para la proteína seguida de la reacción en cadena de la polimerasa, se ha realizado un aislamiento de RNA total, seguida de una retrotranscripción para obtener el DNA copia (cDNA) y después el cDNA obtenido se ha realizado una amplificación del marco de lectura u ORF del IFN, usando oligonucleótidos que contienen dianas de restricción adecuadas para la clonación del inserto obtenido directamente en el vector pIRES puro 3. El vector pIFN_IRES_puro se obtuvo anteriormente y fue transfectado a las células HEK293 utilizando el sistema K2 que como bien sabemos está basado en la transfección mediada por complejos lipídicos. Las células fueron seleccionadas usando una concentración de puromicina de 2g/mL, previamente determinada como la concentración mínima para matar al 100% de células HEK293 no transfectadas en menos de 48h. Tras comprobarse la muerte en el pocillo de células no transfectadas, las células transfectadas supervivientes fueron escaladas 1 semana después de la transfección momento en el que se analizó la producción y secreción de IFN gamma en el sobrenadante del cultivo, mediante un test basado en ELISA, obteniendo un resultado positivo estos tipos de test se basa en el uso de un anticuerpo capaz de reconocer específicamente el IFN gamma y es útil no solo para la determinación de la concentración del mismo, si no también como una prueba in vitro para su funcionalidad. Balance de materia Para la parte de nuestro balance de materia no se nos fue posible contar con una reacción ya que estamos trabajando con productos de alta demanda. Para tener en cuenta como debemos trabajar con estos productos debemos conocer qué parámetros son los que les afectan más o cuales deben estar controlados de manera adecuada para obtener unos resultados satisfactorios. Algunos ejemplos de los que son más importantes son: Concentración de oxígeno disuelto: La concentración de oxígeno puede afectar de manera que nos puede oxidar nuestros microorganismos ya que puede generar especies que podrían llegar a ser tóxicas en nuestro bioproceso. Temperatura: La temperatura es uno de los parámetros más importantes ya que nuestro proceso va a sufrir cambios de temperatura debido al metabolismo de crecimiento y esto a una temperatura alta puede hacer que no exista crecimiento al igual que a temperaturas bajas. pH: El ph puede afectar a lo que es nuestro microorganismo ya que cuando este se encuentre en nuestro biorreactor y empiece con su proceso va a producir ácidos como “producto de su metabolismo” (A. Hernández, M. Ramírez, A. Arízaga, O. Flores, I. Huitzil, 2014). “Como bien sabemos las condiciones de almacenamiento, transporte y manejo de los medicamentos biotecnológicos son esenciales para mantener su estabilidad y potencia: “las proteínas recombinantes son susceptibles a sufrir modificaciones en la conformación de su plegamiento como consecuencia de la alteración de su entorno físico químico (Inyección de Interferón gamma: MedlinePlus medicinas, 2020) En particular sabemos, que se conoce que el IFN gamma en disolución sufre cambios en su estructura secundaria inducidos por altas temperaturas que con llevan a la agregación de la proteína, lo cual es de sustancial importancia, puesto que la agregación de proteínas puede causar la pérdida de su potencia o eficacia terapéutica y alterar su inmunogenicidad, además de generar citotoxicidad. Se encontró que a temperaturas bajas se mantiene la actividad antiviral entre 90-100 %, a 37 °C disminuye al 50 %, mientras que a 56 °C permanece menos del 90 % de la actividad. Las condiciones que maximizan la estabilidad estructural y potencia de los medicamentos biotecnológicos son esenciales para proponer procesos adecuados de transporte, almacenamiento y uso como ya se había mencionado. Estimación de la proporción de distintas estructuras en Interferón gamma IFNs: Dato: Las letras en superíndice indican grupos con diferencias significativas (P<0.01) entre sí, de acuerdo con la prueba post hoc de Duncan. Pese a que se han estudiado con anterioridad los efectos de tiempos largos de almacenamiento en la estructura de los IFNs, no existe información sobre el impacto que tienen los tiempos menores de 6 horas de almacenamiento a distintas temperaturas en su efecto terapéutico. Los análisis de esta índole, como el realizado en el presente trabajo, son importantes ya que el proceso de transporte, almacenamiento y uso de los IFNs terapéuticos debe ser regulado y correctamente especificado. Los resultados obtenidos de la tabla muestran claramente que la exposición de los medicamentos analizados durante un tiempo corto de 30 min a temperaturas relativamente bajas tiene un efecto indeseable en ellos Desarrollo Propiedades del bioproceso (descripción de las etapas del bioproceso) a) Upstream En esta etapa se va a preparar nuestro inóculo, vamos a comenzar con la preparación de nuestra bacteria de ayuda por medio de un banco de células de trabajo (WCB por sus células en inglés) para poder continuar con lo que es la descongelación de nuestro inóculo. Procedemos a pasar a lo que son nuestras etapas del tren de escalado hasta llegar a la cantidad de células necesarias para inocular nuestro biorreactor de producción. b) Biocatálisis En esta fase se lleva el cultivo en biorreactor en donde se van a controlar las condiciones para mantener a las células de una manera adecuada. Las condiciones que vamos a controlar por medio de la “Unidad Digital de Control (UDC) son Tª (temperatura ambiente), pH y pO 2 (presión arterial del oxígeno)” (Ramón Román Roldán, 2018). Se va a realizar un seguimiento de estos parámetros por medio de un on-line a través de las correspondientes sondas, estas sondas son capaces de determinar otros parámetros como “el parámetro potencial del redox, número de células mediante turbidimetría, etc..” (Ramón Román Roldán, 2018), así mismo como un seguimiento off-line que al igual que el anterior tiene el seguimiento de otros parámetros como por ejemplo “contaje de células viables, análisis de metabolitos, análisis del producto, etc… (Ramón Román Roldán, 2018) utilizando muestras que se extraen de manera periódica. c) Downstream: En lo que es nuestra última etapa se llevarán a cabo lo que son las operaciones unitarias que son la separación, purificación y acondicionamiento del producto de interés. 1.- Esta etapa nos va a llevar a lo que son como unas subetapas para poder llegar a nuestro producto de interés. La primera etapa será una separación de sólido-líquido mediante lo que es la filtración o centrifugación, esto con el fin de separar lo que son algunas células de nuestro cultivo para facilitar la llegada a nuestro producto de interés. 2.- Esta etapa consta de lo que es la “concentración y diálisis mediante la ultrafiltración tangencial” (Ramón Román Roldán, 2018), mediante el uso de membranas que correspondan o sean adecuadas al tamaño molecular de nuestro producto y de esta forma poder dejar lo que es nuestro cultivo en condiciones de pH, condiciones salinas y conductividad adecuados para lo que serán nuestras próximas etapas al igual que reducir lo que es nuestro volumen para que se nos facilite el proceso. 3.- Pasamos a lo que sería nuestra etapa donde debemos hacer una o varios procesos de cromatografía normalmente de “afinidad para los anticuerpos monoclonales (mAbs) o de interacción iónica (IEX) o intercambio hidrofóbico (HIC)” (Ramón Román Roldán, 2018), esto con el fin de poder obtener nuestro producto de interés de la formas más pura deseada, esto lo podemos calcular con la siguiente ecuación u expresión: 4.- Algunas de nuestras subetapas finales de nuestra última etapa es la implementación de uno o varios usos de la filtración o cromatografía adicionales para poder eliminar con seguridad algunos restos de pequeños habitantes que pudieran permanecer aún como lo son “virus, endotoxinas, DNA y proteínas del huésped, etc..” (Ramón Román Roldán, 2018). Al igual que la implementación de la liofilización y diálisis para con esto poder lograr dejar a nuestro producto de interés en condiciones estables con el fin de así poder pasar a nuestra fase de envasado final de nuestro producto. En el siguiente diagrama se observan de mejor manera lo que son estas etapas del bioproceso. Medio de cultivo para la línea celular HEK293 “El medio base que se ha utilizado para el cultivo de línea celular HEK293 es el medio comercial SFM 4 Transfex (SH3086002, Hyclone). Este medio de cultivo es un medio libre de suero bovino, cuya composición no está publicada. Los análisis efectuados han determinado que contiene una concentración de glucosa de 4g/L. Este medio se ha de suplementar en función de la línea celular a cultivar, como se detalla en los siguientes apartados.” (Ramón Román Roldán, 2018) Pasos del Bioproceso para la producción de interferón a nivel piloto. Ramón Román Roldán describe los siguientes pasos como el protocolo a seguir para realizar los cultivos: 1. Desembalar la bolsa estéril de cultivo siguiendo las instrucciones del fabricante y montarla en el bag holder. 2. Realizar las conexiones de la conducción de gases. 3. Preparar el medio de cultivo en un recipiente limpio, preferiblemente, una bolsa de preparación de medio estéril. Una vez disuelto el medio, introducirlo en la bolsa del biorreactor mediante un filtro esterilizante de 0,22mm (Sartopore 2, Sartorius). Usar una bomba peristáltica para impulsar el medio, no aire comprimido, ya que la bolsa no tiene garantía de esterilidad si es sometida a una presión superior a 0,25 bar. 4. Introducir las sondas de fibra óptica de pH y pO2 en los puertos correspondientes. Introducir los valores de calibrado (en una pegatina sobre la bolsa) en la DCU. 5. Cuando el medio esté en el reactor, se pueden activar los valores de consigna para el cultivo, o la receta mediante el software MFCS win (registro informático de los datos del proceso). 6. Es necesario dejar el medio en el reactor con los valores de consigna un mínimo de 12 horas para comprobar su esterilidad antes de la inoculación. 7. Previamente a introducir el inóculo en el reactor, comprobar que se han estabilizado las variables controladas en los valores de consigna de pH, temperatura, pO2 y agitación en el medio de cultivo, y que este no esté contaminado. 8. Unir el biorreactor de inoculación (biorreactor de 2L) a la bolsa mediante conexión estéril usando el puerto preparado a tal efecto en la bolsa STR (Operación en cabina de flujo). 9. Presurizar ligeramente el reactor de inóculo con aire para impulsar el inóculo hasta la bolsa STR. Inocular la cantidad necesaria para una densidad inicial de 0,2*106 cell/mL 10. Comprobar que no quede ninguna entrada ni salida de gases y cerrar todas las conexiones excepto la que conecta la botella con el inóculo y el reactor. 11. A partir de este momento, se desarrolla el cultivo, según los parámetros definidos en la DCU. Los procesos en Batch realizados en este trabajo tienen una duración aproximada de 1 semana. Se ha de muestrear diariamente, determinando concentración y viabilidad celular, niveles de glucosa y lactato y nivel de producción de la molécula de interés, si aplica. 12. Purificación 13. Recuento de células automatizado. 14. Determinación de la concentración de interferón gamma. Pasos dentro del biorreactor de inoculación Para el biorreactor de inoculación se utilizó el biorreactor Biostat B-DCU-II (Sartorius), equipado con una cuba de 2L de volumen de trabajo, con el siguiente procedimiento: 1. Esterilizar la cuba previamente mediante autoclave a 121ºC, 30 minutos, con 2 L de PBS y preparado para el cultivo (filtros, conducciones, botellas de adición de Ácido y base) 2. Una vez estéril y a Tª de trabajo, comprobar que no haya ninguna entrada de gases y cerrar todas las conexiones excepto la botella estéril de entrada/salida al reactor y la del Sparger, comprobando que su filtro de gases esté en buen estado. 3. Introducir aire por Sparger para impulsar el PBS del biorreactor hacia la botella estéril vacía por sobrepresión. Tener cuidado con la sobrepresión y el burbujeo, utilizando un caudal bajo cuando quede poco PBS (0,1-0,2 lpm) y parar la entrada de aire cuando empiece a burbujear dentro de la botella. 4. Entrar la botella estéril con el PBS en la cabina de flujo laminar y cambiarla por la botella que contenga el medio de cultivo. Sacar la botella de la cabina. 5. Comprobar que no haya ninguna entrada de gases y cerrar todas las conexiones excepto la de la botella con el medio y la salida de gases hacia el condensador. 6. Introducir aire por el filtro de la botella con el medio para impulsarlo hacia el reactor por sobrepresión. Tener cuidado con la sobrepresión acumulada, utilizando un caudal bajo de aire cuando quede poco medio en la botella y parar la entrada de aire cuando empiece a burbujear dentro del reactor. Cerrar la conexión entre botella y reactor. 7. Cuando el medio esté en el reactor, se pueden activar los valores de consigna para el cultivo, o la receta mediante el software MFCS win (registro informático de los datos del proceso). 8. Es necesario dejar el medio en el reactor con los valores de consigna un mínimo de 12 horas para comprobar su esterilidad antes de la inoculación. 9. Previamente a introducir el inóculo en el reactor, comprobar que se han estabilizado las variables controladas en los valores de consigna de pH, temperatura, pO2 y agitación en el medio de cultivo, y que este no esté contaminado. 10. Dentro de la cabina de flujo laminar, abrir la botella estéril con la que se introdujo el medio de cultivo y trasvasar el volumen de inóculo necesario desde el Shake de escalado hasta la botella que conecta con el reactor. Usar la siguiente expresión para el cálculo: Donde: Vi: volumen de inóculo a introducir en el reactor en mL Vr,t: volumen total del reactor, sumando el volumen de medio introducido previamente y el del inóculo. Ci: concentración del inóculo (x 105 células/mL) Cr,0: concentración inicial deseada en el reactor (x 105 células/mL) 11. Sacar de la cabina la botella. 12. Con la ayuda de una bomba peristáltica, impulsar el inóculo desde la botella hasta el reactor (si la bomba no tiene suficiente fuerza para impulsar el inóculo, ver punto 5). 13. Comprobar que no quede ninguna entrada ni salida de gases y cerrar todas las conexiones excepto la que conecta la botella con el inóculo y el reactor. Tampoco cerrar el tubo de salida del condensador. Sin dejar de usar la bomba peristáltica, introducir un caudal bajo (e.g. 0,1 lpm) de aire a presión por el filtro de gases de la botella que contiene el inóculo para ayudar a impulsarlo hacia el reactor por sobrepresión. Tener mucho cuidado con el burbujeo, ya que puede comprometer el estado de las células. Parar el caudal de aire y sacar el tubo de la bomba. Cerrar la conexión entre la botella ya vacía y el reactor. 14. A partir de este momento, se desarrolla el cultivo, según los parámetros definidos en la DCU. Los procesos en Batch realizados en este trabajo tienen una duración aproximada de 1 semana. Se ha de muestrear diariamente, determinando concentración y viabilidad celular, niveles de glucosa y lactato y nivel de producción de la molécula de interés, si aplica. Tipo de bioproceso a) Sistema de cultivo en el que opera el Bioproceso. (Lote, Lote-alimentado o continuo En el bioproceso llevado en el cual basamos esta investigación escrito por Ramon Roman, 2018 se establece que el cultivo será de tipo batch, esto nos dice que los microorganismos se inoculan en un volumen fijado y los nutrientes serán consumidos progresivamente a la vez que se genera el producto. b) Tipo de biorreactor. (tipo de agitador y accesorios) En su trabajo titulado Desarrollo de procesos de producción de proteínas terapéuticas de Ramón Román Roldán menciona que el bioproceso para la obtención de interferón a nivel piloto se llevó a cabo en un biorreactor a escala piloto Biostat STR 50 (Sartorius), el cual se caracteriza por el uso de la tecnología de un solo uso (Single-Use). Con capacidad de 50 L. En este biorreactor, la cuba de proceso es sustituida por una bolsa plástica estéril que se utiliza para un solo proceso, minimizando las posibilidades de contaminación por parte de microorganismos termorresistentes, y eliminando las contaminaciones e interferencias debidas al cruce de diferentes productos y líneas celulares (Crossover), ya menciona que estos requieren de costosos procesos de limpieza y validación en las plantas piloto convencionales de acero inoxidable. Partes del biorreactor STR 50: 1. Pantalla de la unidad digital de control (DCU) 2.Soporte para bolsa de cultivo (Bag Holder) 3.Brazo del motor 4.Motor del agitador 5.Soporte para filtros 6.Camisa de calefacción 7. Tubos de entrada/salida de agua a la camisa de calefacción 8. Bombas de la DCU 9. Rotámetros para caudal de gases 10. Manivela para fijar la posición del soporte 11. Brazo para ajustar la posición del soporte De igual forma se utilizó un biorreactor de laboratorio con capacidad de 2L destinado al cultivo de microorganismos y células animales en condiciones controladas de Tª, pH y concentración de oxígeno disuelto (pO2). Consta de una cuba de cultivo, donde se realiza el mismo en condiciones controladas y estériles y de una unidad de control digital, que recoge la información de las sondas y actúa sobre el cultivo para mantener los parámetros establecidos por el usuario. (A) Partes del biorreactor de laboratorio 1. Cuba de cristal 2. Soporte metálico para la cuba 3. Condensador 4. Soporte para reactivos de adición al biorreactor 5. Tapa con puertos para entradas y salidas 6. Tornillos para fijar la tapa a la cuba 7. Soporte para el motor del agitador. (B) Partes de la DCU: 1. Botón de encendido/apagado de la Supply Tower 2. Rotámetro para los gases de salida hacia Sparger 3. Rotámetro para los gases de salida hacia Overlay 4. Bomba para adición de ácido 5. Botón on/off manual de la bomba de adición de ácido 6. Bomba para adición de base 7. Botón on/off manual de la bomba de adición de base 8. Bomba para adición de sustrato SUBS-A 9. Botón on/off manual de la bomba de adición de sustrato SUBS-A 10. Bomba para adición de sustrato SUBS-B 11. Botón on/off manual de la bomba de adición de sustrato SUBS-B Un accesorio que es posible observar en este biorreactor es el llamado sparger o rociador anular el cual cuando se conectan al aire a presión, distribuyen el aire como burbujas finas en el biorreactor / fermentador para permitir una aireación eficaz y se puede observar en la siguiente image. (bb, biotech) “Es necesario tanto la agitación del medio para un mejor intercambio y para prevenir el asentamiento de las células. El mezclado se realiza con un imán encasillado dentro de un péndulo de cristal o mediante un sistema de palas. Aunque las células que crecen en suspensión son más fáciles de manejar, las células ancladas con su potencial resultante para el desarrollo de la polaridad, puede representar un mejor modelo para la modificación postranslacional de proteínas y el flujo de membrana apropiado conllevandoa una secreción en una forma bioactiva.” (Lopez, Perea A. 2016) Y aunque el autor no describa el tipo de biorreactor exactamente lo podemos considerar como un biorreactor de tanque agitado debido a que puede operar en modo continuo o discontinuo y está agitado por palas e, idealmente, las condiciones del medio son las mismas en cualquier punto del biorreactor. (net-pharma) c) Explicar cada uno de los parámetros que se deben monitorear durante las etapas del bioproceso. Cada biorreactor va a contar con una unidad encargada para el registro del comportamiento de los parámetros necesarios para nuestro bioproceso, esto va a contener un pequeño software adecuado para poder controlar nuestros parámetros que son: pH: Es unos de los responsables junto con el CO2 del cambio metabólico de lo que será nuestro co-consumo de lactosa y lactato, ya que una cantidad mínima es necesaria para lo que serán nuestras células base. Debemos monitorear el pH ya que en casos de que este tenga variaciones puede crear problemas en nuestro bioproceso como podrían ser la “desnaturalización de proteínas, inhibición enzimática, modificaciones en la concentración, etc…” (Microbiología, 2020). CO2: Este parámetro se ha demostrado que es mejor mantenerlo a una “corriente de 1% en el flujo de aireación en el biorreactor sin el control de pH” (Ramón Román Roldán, 2018), ya que esto nos va a permitir mantener una mejor reproducción permitiendo así a las células una mejor densidad celular y productividad. O2: La medición de nuestro oxígeno al igual que los parámetros anteriores será muy relevante ya que este nos va a garantizar condiciones óptimas para un buen crecimiento de nuestro producto. Una baja concentración de oxígeno puede afectar nuestro crecimiento, la “absorción de nutrientes morfología celular y la síntesis de metabolitos” (Mettler-Toledo, 2020) esto va a provocar que nuestro rendimiento celular disminuya la calidad de nuestro producto de interés. Por el contrario, unos niveles altos de nuestra oxigenación puede provocar “la formación de especies reactivas del oxígeno que pueden oxidar los componentes del medio y convertirse en mutaciones celulares” (Mettler-Toledo, 2020). Al igual que en algunos casos se utilizan biorreactores bastante grandes por lo que si llegamos a tener un nivel alto de oxigenación puede provocarnos lo que es el gasto de energía que puede llegar a ser costoso. Temperatura: La medición de nuestra temperatura es un parámetro relevante y uno de los más importantes ya que es algo primordial para nuestro crecimiento microbiano ya que contiene la cantidad de oxígeno disuelto en nuestro biorreactor” (A. Hernández, M. Ramírez, A. Arízaga, O. Flores, I. Huitzil, 2014), al igual que es muy importante para nuestras reacciones químicas que se llevan dentro de nuestro bioproceso. Dentro de nuestro biorreactor enfocándonos en nuestra temperatura va a ocurrir el cambio debido a nuestro metabolismo celular, ya que se lleva a cabo una liberación de energía y esto puede llevar a afectar a nuestro microorganismo durante el crecimiento celular. Presión: En lo que es este parámetro se va a instalar un medidor de presión para poder mantener controlados los gases que se generen, al igual que este le va a ayudar al oxígeno a mantenerse controlado de manera más adecuada. Nos ayudará a poder diferenciar lo que es la presión entre el fluido y la presión normal. d) Diagrama de bloques del bioproceso seleccionado. e) Técnicas de recuperación de los bioproductos del Bioproceso Las técnicas de recuperación o recuento celular que el autor (Ramón Román Roldán) realiza son las siguientes: ➔ Recuento manual mediante observación microscópica ➔ Recuento automatizado ➔ Determinación de la concentración de glucosa y lactato ➔ Análisis de poblaciones celulares mediante citometría de flujo ➔ Determinación de la concentración de interferón gamma ➔ Electroforesis de proteínas mediante SDS-PAGE Por otra parte Agustina Gugliotta describe en su trabajo -Diseño y optimización de un proceso de producción de muteínas de interferón-α2b humano con mayor actividad biológica mediante glicosilación en células de mamífero- diversas técnicas para la recuperación de IFN entre las que podemos destacar las siguientes relacionadas a nuestro bioproceso: ➔ Purificación de las variantes glicosiladas del hIFN-α2b a partir de sobrenadantes de cultivo por cromatografía de inmunoafinidad ➔ Purificación empleando la resina CA5E6-Sepharose ➔ Concentración y diafiltración de la proteína De las técnicas anteriores abundaremos en dos de ellas que son las más comunes. Recuento automatizado “El recuento se realiza a partir de la toma de una alícuota de la suspensión celular de manera estéril. Durante los experimentos realizados en biorreactor, la concentración y viabilidad celular se han determinado mediante un contador automatizado Scepter. Este equipo es un citómetro portátil que se puede usar con una sola mano, a modo de micropipeta y que utiliza unos sensores desechables. Estos sensores constan de unos microcanales por los que circula la muestra, y de unos sensores de impedancia capaces de determinar el tamaño, el volumen y el nº de partículas que los atraviesan. El equipo dispone de una pantalla LCD donde se muestran los datos, a modo de Histograma, indicando el nº de células viables en la muestra de manera directa.” (Ramón Román, 2018) (A) Partes del contador automático Scepter: 1. Pantalla 2. Émbolo 3. Empuñadura 4. Puerto de encaje del sensor 5. Punta del sensor 6. Entrada del cable 7. Botón de control 8. Cobertura del filtro. (B) 1. 2. 3. Concentración Volumen medio Histograma Gráfico de celular de las células mostrado contaje de en en pantalla: versus diámetro la la zona muestra seleccionada 4. Diámetro medio de las células en la zona seleccionada. Determinación de la concentración de interferón gamma “La determinación se realiza sobre el sobrenadante centrifugado (1000 g, 5 min.) y filtrado a 0,45m, obtenido a partir de la toma de una alícuota de la suspensión celular de manera estéril. La concentración de IFN se realiza mediante ELISA usando el kit comercial Novex (CHC 1233, Thermo), siguiendo las instrucciones del fabricante. El kit contiene los elementos necesarios para la detección y cuantificación inmunológica del IFN humano, usando la técnica conocida como ELISA “sándwich”, en la que se usa un anticuerpo monoclonal inmovilizado en una placa de poliestireno para capturar por afinidad inmunológica el IFN presente en las muestras de cultivo (anticuerpo primario, o de captura). Posteriormente, se añade un anticuerpo policlonal biotiniliado, capaz de reconocer el IFN en diferentes puntos de la molécula con el fin de amplificar la señal (anticuerpo secundario, o de detección). El último elemento del kit es una molécula de Peróxidasa de rábano (HRP), conjugada con estreptavidina, que reconoce al anticuerpo de detección a través de la interacción estreptavidina-biotina. La HRP produce un cambio cromogénico cuando se añade el sustrato TMB (3,3′,5,5′-Tetrametilbenzidina), virando este a un color azul. La intensidad del color es proporcional a la concentración de IFN. Con el kit se suministra un estándar de concentración conocido.” (Ramón Román, 2018) f) Diagrama de proceso. Disponible en: https://drive.google.com/file/d/17MMp2ajgwHu5whTYWEoP3M8InmD_0qFd/view?usp=sh aring Conclusiones Concluyendo con el presente proyecto se fueron presentando y desarrollando el proceso para la obtención de interferón gamma, mediante el uso de células HEK293, desde la selecciónde nuestro producto, la elección de nuestro biorreactor, los accesorios del mismo, entre otras cosas. Podemos darnos cuenta de la gran importancia de conocer los biorreactores, sus partes, su funcionamiento, sus ventajas y sus desventajas ya que no todos pueden trabajar con los mismos microorganismos y mucho menos con los mismos accesorios, incluso sus operaciones, ya que lo vamos a ocupar demasiado a lo largo de nuestra carrera, así mismo es importante conocer a nuestros microorganismos con los que vamos a trabajar, su lugar de hábitat y las condiciones en las que debemos ponerlo para poder mantenerlo en un lugar adecuado y poder trabajar con este mismo. Referencias ★ Román R. (2018). Desarrollo de procesos de producción de proteínas terapéuticas: Aumento de la productividad específica en células HEK293. Universidad Autónoma de Barcelona. ★ Gugliotta A. (2016). Diseño y optimización de un proceso de producción de muteínas de interferón-α2b humano con mayor actividad biológica mediante glicosilación en células de mamífero. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL LITORAL ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● Gelambi, M. (2019, Abril 24). Bioprocesos: características, tipos, ventajas y etapas. Recuperado Julio 28, 2021, de Lifeder website: https://www.lifeder.com/bioprocesos/ (n.d.). Curva de crecimiento bacteriano en la producción de proteínas recombinantes. Recuperado de https://www.conacyt.gov.py/sites/default/files/Transferencia_de_conoci mientos_Liz_Lopez_2015.pdf Crecimiento microbiano. (n.d.). Recuperado de: http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/U4a_CrecimientoMicrobian o_19836.pdf (n.d.). Crecimiento microbiano. 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Upstream: Río arriba Downstream: Río abajo TLR: Receptor de tipo Toll DNA: Ácido desoxirribonucleico RNA: Ácido ribonucleico Células NK: Células Natural Killer CMH-1: Complejo mayor de histocompatibilidad de clase I IFN-Y: Interferón gamma Tª: Temperatura ambiente APC: células presentadoras de antígeno Linf. CD4+: glóbulos blancos que combaten infecciones E. coli: Escherichia coli EMA: Agencia Europea de Medicamentos FDA: Administración de Alimentos y Medicamentos DHFR: Dihidrofolato reductasa IRES: Sitio Interno de Entrada al Ribosoma ELISA: Enzimoinmunoanálisis de adsorción WCB: Banco de células de trabajo mAbs: Anticuerpo monoclonal IEX: Interacción iónica HIC: Intercambio hidrofóbico GS: Glutamina sintetasa
