Subido por Yareli Jaime

42445206

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Folia Entomológica Mexicana
ISSN: 0430-8603
[email protected]
Sociedad Mexicana de Entomología, A.C.
México
del Rincón Castro, Ma. Cristina; Méndez Lozano, Jesús; Ibarra, Jorge E.
Caracterización de cepas nativas de bacillus thuringiensis con actividad insecticida hacia el gusano
cogollero del maíz spodoptera frugiperda (lepidoptera: noctuidae)
Folia Entomológica Mexicana, vol. 45, núm. 2, 2006, pp. 157-164
Sociedad Mexicana de Entomología, A.C.
Xalapa, México
Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=42445206
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Proyecto académico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto
Folia Entomol. Mex., 45(2): 157-164 (2006)
ISSN-0430-8603
CARACTERIZACIÓN DE CEPAS NATIVAS DE BACILLUS
THURINGIENSIS CON ACTIVIDAD INSECTICIDA HACIA EL GUSANO
COGOLLERO DEL MAÍZ SPODOPTERA FRUGIPERDA
(LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE)
M A . C R ISTIN A DEL RINCÓN-CASTRO 1, J ESÚ S M ÉNDEZ-LOZANO 2 Y J OR GE E. IBARRA 1
1
CIN VESTAV-IPN . Unidad Irapuato. Apdo. Postal 629, 36500 Irapuato, Gto.
2
CIID IR-IPN Sinaloa, Km .1.0 Carr. a Las Glorias, 80000 Guasave, Sin.
< m [email protected] ira.cinvestav.m x >,< jm [email protected] ipn.m x >, < [email protected] ira.cinvestav.m x >
D el R incón-Castro, M . C ., J. M éndez-Lozano y J. E. Ibarra. 2006. Caracterización de cepas nativas de Bacillus thuringiensis
con actividad insecticida hacia el gusano cogollero del m aíz Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae). Folia Entom ol.
M ex., 45(2): 157-164.
R ESUMEN . El gusano cogollero del m aíz Spodoptera frugiperda es una plaga im portante en los cultivos de m aíz en el continente
am ericano. Su control se realiza con insecticidas quím icos, pero existe una alternativa biológica para ello, m ediante el uso de la
bacteria insecticida Bacillus thuringiensis. En este trabajo se analizaron tres cepas nativas de B. thuringiesis, y éstas se
caracterizaron m ediante la estim ación de su concentración letal m edia o CL 5 0 , el patrón de plásm idos, su perfil de proteínas y la
m orfología del cristal. Para las cepas LBIT-27, LBIT-181 y LBIT-193 se estim ó una CL 5 0 de 7.636 :g/cm 2 , 3.867 :g/cm 2 y 3.966
:g/cm 2 , respectivam ente, sobre el prim er estadio larval. Las tres cepas presentaron patrones de plásm idos diferentes, aunque los
de las cepas LBIT-27 y LBIT-193, presentaron cierta sim ilitud con respecto al de la cepa estándar H D -1. El patrón de plásm idos
de la cepa LBIT-181 fue totalm ente diferente al de las otras dos cepas nativas. D os de las cepas nativas presentaron un patrón
de proteínas sim ilar al de H D -1 (LBIT-27 y LBIT-181) con dos proteínas m ayoritarias de 130 y 65 kD a, pero la cepa LBIT-193
solam ente presentó una banda de 130kD a. Las tres cepas presentaron una m orfología de cristal bipiram idal típico, m ás la
presencia de una inclusión cuadrada aplanada, con la excepción de la cepa LBIT-193 que no la presentó. Las tres cepas nativas
caracterizadas en este trabajo, m uestran potencial para desarrollarse com o bioinsecticidas contra S. frugiperda en M éxico.
P ALABRAS CLAVE: Bacillus thuringiensis, Spodoptera frugiperda, bioensayos, plásm idos, proteínas Cry.
D el R incón-Castro, M . C ., J. M éndez-Lozano, and J. E. Ibarra. 2006. Characterization of Bacillus thuringiensis native
strains with insecticidal activity against the fall arm yworm Spodoptera frugiperda (Lepidotera: Noctuidae). Folia Entom ol.
M ex., 45(2): 157-164.
A BSTRACT. The fall arm yworm Spodptera frugiperda is a very im portant pest of corn throughout the Am ericas. Although control
is m ostly achieved with chem ical pesticides, the use of the entom opathogenic bacterium Bacillus thuringiensis is a feasible
alternative. This study describes the characterization of three native strains of B. thuringiensis based on their insecticidal activity
against S. frugiperda, plasm id profiles, SD S-polyacrylam ide electrophoresis (PA GE), and crystal m orphology. The LC 5 0 of strains
LBIT-27, LBIT-181 and LBIT-193 was estim ated at 7.636, 3.867 and 3.966 :g/cm 2 , respectively, on first instars. The three strains
differed in their plasm id patterns, although som e sim ilarities were apparent when strains LBIT-27 and LBIT-193 were com pared
to the standard strain H D -1. The plasm id profile of strain LBIT-181 was com pletely different. The PAGE analysis of pure crystals
showed two bands of ca. 130 and 65 kD a, for the strains LBIT-27 and LBIT-181, whereas strain LBIT-193 showed only one band
of ca. 130 kD a. U ltrastructural analysis of parasporal bodies of the three strains showed the typical bipyram idal crystal of
pathotype I, along an inclusion partially em bedded in the m iddle of the bipyram idal crystal, except for the strain LBIT-193. The
B. thuringiensis strains analyzed in this report show potential as a biological insecticide against S. frugiperda in M exico.
K EY WORDS: Bacillus thuringiensis, Spodptera furgiperda, bioassays, plasm ids, Cry proteins.
Del Rincón-Castro et al.: Bacillus thuringiensis vs. Spodoptera frugiperda
El gusano cogollero del maíz, Spodoptera frugiperda (J. E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae), es una de las principales plagas del maíz
en regiones tropicales y subtropicales de América
(Polanczyk et a.l, 2000; Vergara et a.l, 2001). El
daño causado por esta plaga puede ocasionar una
reducción en la producción, la cual puede llegar
desde un 20% hasta la pérdida total del cultivo,
si la plaga ataca en periodos cercanos a la etapa
de floración. En M éxico también se ha reportado
la presencia de esta plaga en las distintas regiones del país donde se siembra maíz (Lopez-Edwards et al., 1999). Como muchas otras plagas de
importancia agrícola, el control del gusano cogollero se basa en el uso de insecticidas químicos.
No obstante, existen otros métodos alternativos
para el control de esta plaga, como lo es el uso de
entomopatógenos que causan enfermedades infecciosas en los insectos. Dentro de los entomopatógenos, el grupo de las bacterias posee el mayor
potencial como agentes bioinsecticidas y, por tal
motivo, los productos a base de la bacteria Bacillus thuringiensis (Berliner, 1915) constituyen los
bioinsecticidas más utilizados a nivel mundial
(Powell y Jutsum, 1993). Bacillus thuringiensis
es una bacteria Gram positiva, la cual produce un
cristal parasporal durante la etapa de esporulación. El cristal está conformado por una diversidad de proteínas que, al ser activadas, se les denomina δ-endotoxinas. Dichas toxinas presentan
actividad insecticida hacia diversos órdenes de
insectos, principalmente Lepidoptera, Diptera y
Coleoptera. En la actualidad se conoce con bastante precisión el modo de acción de B. thuringiensis, y se sabe que las diferentes δ-endotoxinas actúan a nivel de intestino medio de los
insectos, formando huecos en el epitelio de este
órgano, lo cual induce el paso del contenido intestinal hacia la hemolinfa del insecto y viceversa, provocando una parálisis en primer instancia, seguida por una septicemia que les causa la
muerte (Schnepf et al., 1998).
En algunos países latinoamericanos como Cu158
ba, Brasil y Colombia, se han encontrado cepas
nativas de B. thuringiensis, que poseen un alto
potencial para utilizarse como agentes de control
biológico hacia el gusano cogollero (Silva-W erneck et al., 1999; Arango et al., 2002). Más aún,
ya existen plantas transgénicas de maíz y algodón, que expresan los genes que codifican para
algunas δ-endotoxinas con actividad hacia S. frugiperda (Hassell y Shepard, 2002; Stewart et al.,
2001). Sin embargo, los productos comerciales a
base de esta bacteria presentan un efecto tóxico
de bajo a moderado hacia esta plaga. Debido a lo
antes mencionado, se considera de vital importancia continuar con la búsqueda de nuevas cepas
de B. thuringiensis que posean potencial para desarrollarse como bioinsecticidas, para el control
de S. frugiperda en México. En el presente
trabajo, se describe la caracterización de tres cepas nativas de B. thuringiensis aisladas en diferentes regiones del estado de Guanajuato, mediante la estimación de su concentración letal
media (CL 50), la morfología del cristal, el patrón
de plásmidos y el perfil de proteínas de cada una
de ellas.
M ATERIAL Y M ÉTODOS
Cepas. Se utilizaron tres cepas nativas de B.
thuringiensis: LBIT-27, LBIT-181 y LBIT-193,
aisladas de muestras de suelo en el Estado de
Guanajuato y mantenidas en el cepario de entomopatógenos del Laboratorio de Bioinsecticidas
del CINVESTAV-Irapuato. Estas cepas se cultivaron en caldo de leche peptonizada (leche peptonizada 10 g, dextrosa 10 g, extracto de levadura 2 g, MgSO 4.7H 2O 0.3g, FeSO 4.7H 2O 20 mg,
ZnSO 4.7H 2O 20 mg, MnSO 4 20 mg, 1 litro de
agua, pH 7.2-7.5) a 28ºC y con una agitación de
340 rpm, hasta alcanzar la etapa de autólisis. Posteriormente, el complejo espora-cristal se centrifugó a 10,000 rpm por 10 min, se liofilizó y se
utilizó para realizar los estudios descritos a continuación.
Insectos. La colonia de S. frugiperda se obtuvo
Folia Entomol. Mex., 45 (2) (2006)
a partir de un pie de cría donado por D. J. Bergvinson (CIMMYT-México). Esta se mantuvo bajo condiciones de insectario a 28ºC, con un fotoperíodo de 12:12 h luz:oscuridad y una humedad
relativa de 80%. Las larvas de los diferentes estadios se mantuvieron de manera individual, desde
el primer instar hasta el estado de pupa, en contenedores desechables de plástico de 30 ml, a los
cuales se les suministró dieta artificial para S.
frugiperda a base de maíz opaco y frijol soya
molidos (Mihm, 1984). Las pupas se colocaron
en bolsas de papel estraza hasta la emergencia de
los adultos. Después de la oviposición, los huevecillos se colectaron de estas bolsas y se colocaron
sobre cajas de Petri que contenían dieta artificial,
hasta su posterior eclosión e individualización.
Bioensayos. Los bioensayos se realizaron aplicando diferentes concentraciones del liofilizado
del complejo espora-cristal de las distintas cepas
de B. thuringiensis, sobre la superficie de la dieta
artificial para S. frugiperda en cajas de Petri con
un área de 5674 mm 2. Se utilizaron diez concentraciones entre 9.26 y 0.018 µg del complejo espora-cristal por cm 2 de dieta en cada bioensayo.
Para formar celdas individuales sobre la dieta, se
colocaron rejillas de plafón y se probaron diez
larvas de primer instar, una por celda, en cada caja. Se utilizaron un total de 30 larvas por concentración y por bioensayo, hasta obtener tres repeticiones válidas, que cumplieran con los parámetros estadísticos establecidos previamente (Ibarra
y Federici, 1987). Los bioensayos se incubaron
bajo condiciones de insectario por un período de
7 días, antes de cuantificar la mortalidad. La relación dosis-mortalidad se estimó mediante análisis Probit (Finney, 1971).
Patrones de plásmidos. Las diferentes cepas
de B. thuringiensis se cultivaron en medio Spizizen (0.2% NH 4SO 4, 1.4% k 2HPO 4, 0.6% kH 2PO 4,
0.1% citrato de sodio, 0.02% MgSO 4.7H 2O) suplementado con 0.5% de glucosa, 0.1% de casaminoácidos (DIFCO) y 0.01% de extracto de levadura, a 30ºC por 12 h o hasta alcanzar una
159
D.O. 600 entre 0.6 y 1.0. Posteriormente se centrifugaron a 6000 rpm por 10 min, se lavaron con
TES frío (30mM Tris, 5mM EDTA, 50mM
NaCl, pH 8.0). Enseguida se incubaron con 2 ml
de TES-sacarosa-lisozima (TES, sacarosa 20% y
lisozima 5 mg/ml) a 37ºC por una hora o hasta
observar la formación de esferoplastos. Las
muestras se incubaron en hielo por 10 min, se
agregaron 4 ml de amortiguador de lisis por 5
min (1% SDS, 0.2N NaOH) y posteriormente 3
ml de solución III (acetato de sodio 3M, pH 4.8)
realizando una incubación de 30 min a -20 oC.
Finalmente, se centrifugó a 13,000 rpm por 15
min y el sobrenadante se utilizó para obtener el
DNA, agregando dos volúmenes de etanol por
30 min a -70 oC y centrifugando nuevamente bajo
las mismas condiciones. Los patrones de plásmidos se observaron por electroforesis en geles
de agarosa al 0.6%.
Perfil de proteínas. Los geles de poliacrilamida se realizaron siguiendo el protocolo de SDSPAGE previamente establecido (Schägger y von
Jagow, 1987). El liofilizado del complejo esporacristal de cada cepa se calentó a 100ºC por 5 min
y posteriormente se analizaron las muestras de
proteínas por electroforesis en geles de poliacrilamida al 8%.
M icroscopía electrónica de barrido. Se utilizaron suspensiones del complejo espora-cristal
de cada una de las cepas, las cuales se colocaron
sobre la superficie de portaobjetos cilíndricos de
aluminio. Una vez que las muestras se secaron al
aire, se recubrieron con una capa de oro en una
ionizadora de oro Fullam EMS-76M por 5 min.
Posteriormente, las muestras se observaron y fotografiaron en un microscopio electrónico de barrido Philips XL30-ESEM a un voltaje de 10 a
15 kV con aumentos de 2,000 hasta 18,000 X.
RESULTADOS
Para las cepas LBIT-27, LBIT-181 y LBIT-193
se estimaron valores de CL 50 de 7.636, 3.867 y
3.966 :g/cm 2, respectivamente (Cuadro 1).
Del Rincón-Castro et al.: Bacillus thuringiensis vs. Spodoptera frugiperda
Cuadro 1
Parám etros estadísticos de los bioensayos con cepas nativas de Bacillus thuringiensis contra larvas de prim er estadio de
Spodoptera frugiperda.
IP
CL 5 0 (L.F. 95% )
χ2
Pendiente (± EE)
D .S.
LBIT-181
690
3.867 (2.948-5.072
7.307
2.62±0.53
A
LBIT-193
690
3.966 (2.644-5.949)
5.541
1.62±0.35
A
LBIT-27
690
7.636 (4.160-14.017)
2.663
1.34±0.38
B
CEPA
IP: Individuos probados; CL 5 0 : Concentración letal m edia con sus lím ites fiduciales, en :g de cristales puros/cm 2 de superficie
de dieta; y D .S.: D iferencia significativa entre cepas (Tuckey, P<0.05).
Como puede observarse, dos de las cepas nativas (LBIT-181 y 193) fueron estadísticamente
similares en sus niveles de toxicidad hacia S. frugiperda. En cambio, la cepa nativa LBIT-27 resultó ser significativamente menos tóxica que las
otras cepas analizadas.
Al caracterizar a las cepas por su contenido de
DNA extracromosómico (plasmídico), se observó
que las tres cepas presentan patrones de plásmidos diferentes, pero las cepas LBIT-193 y LBIT27 presentan plásmidos co-migrantes con algunos
de los de la cepa estándar HD-1 del serovar kurstaki (Figura 1). La cepa LB IT-181 presentó un
patrón muy diferente a la cepa estándar HD-1. En
todos los casos se observaron plásmidos de alto
y bajo peso molecular.
Los cristales de las cepas LBIT-181 y LBIT-27
presentan un contenido de proteínas muy similar
al de la cepa estándar HD-1, con dos proteínas
mayoritarias de 130 y 65 kDa (Figura 2). Mientras tanto, en la cepa LBIT-193, solamente se observó una banda mayoritaria de 130 kDa, y puede
notarse la ausencia de la banda de 65 kDa presente en las otras dos cepas nativas estudiadas y
en el estándar HD-1 (Figura 2).
Las tres cepas presentaron una morfología de
cristal bipiramidal típica de las cepas de B. thuringiensis con actividad hacia lepidópteros, la
160
cual es característica de los cristales constituidos
por las proteínas Cry1 (Figuras 3a, b y c). Dos de
las cepas analizadas (LBIT-181 y LBIT-27) presentaron adicionalmente al cristal bipiramidal,
una inclusión cuadrada aplanada más pequeña, la
cual es típica de cristales que están constituidos
por proteínas Cry2 (Figuras 3a y 3c). Puede observarse que la cepa LBIT-193 también presentó
cristales bipiramidales, pero destaca la ausencia
de la inclusión cuadrada aplanada presente en las
otras dos cepas (Figura 3b).
DISCUSIÓN
Los niveles de toxicidad de las tres cepas de B.
thuringiensis probadas, se encontraron dentro de
los rangos de toxicidad reportados para cepas de
B. thuringiensis con potencial bioinsecticida moderado (Arango et al., 2002). Es decir, los niveles de toxicidad reportados para la cepa estándar
HD-1 de B. thuringiensis serovar kurstaki que es
la base de productos como Dipel o Thuricide, es
aproximadamente cuatro veces mayor que las dos
cepas nativas más tóxicas (LBIT-181 y 193). Es
importante hacer notar que el gusano cogollero
del maíz S. frugiperda es una de las especies poco sensibles a las toxinas de B. thuringiensis, si
las comparamos con especies altamente susceptibles, como Manduca sexta, Bombyx mori y Tri-
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F IGURA 1.- Patrones de plásm idos de las cepas nativas de
Bacillus thuringiensis. Carriles: 1) H D -1, 2) LBIT-193, 3)
LBIT-27 y 4) LBIT-181. M D a: M egadaltones, C: D N A
crom osóm ico.
161
choplusia ni. Esto puede observarse claramente
en el trabajo de M aciel-Rosas y colaboradores
(1994), quienes estimaron una CL 50 del orden de
nanogramos para una cepa mexicana de B. thuringiensis contra M. sexta, lo cual difiere ampliamente con los valores en microgramos reportados
en este trabajo, para las cepas con actividad hacia
S. frugiperda. De la misma forma, es importante
subrayar que la susceptibilidad de una especie de
lepidóptero a las toxinas de B. thuringiensis, depende directamente del tipo de toxinas que contenga cada cepa, ya que se sabe que existe una
enorme diversidad de proteínas Cry, con más de
250 diferentes genes que las codifican (Crickmore et al., 1998).
El establecimiento del patrón de plásmidos de
las cepas de B. thuringiensis constituye un parámetro importante para determinar su originalidad, ya que el número y tamaño de éstos se asocia a un tipo particular de cepa. Asimismo, es
precisamente en estos plásmidos en donde se localizan los genes cry que codifican para las diferentes δ-endotoxinas (González et al., 1981).
En este trabajo se encontró que las cepas LBIT27 y LBIT-193, presentaron patrones de plásmidos muy similares a los de la cepa estándar HD1, a pesar de las significativas diferencias en toxicidad con respecto a ésta última. Esto último nos
indica que muy probablemente los genes cry de
la cepa estándar y de las cepas nativas analizadas
son diferentes. Más aún, la cepa LBIT-181 presentó un patrón de plásmidos muy distinto al de
las otras dos cepas nativas analizadas, a pesar de
que sus niveles de toxicidad fueron estadísticamente similares a los de la cepa LBIT-193
(Cuadro 1). Cabe destacar que esta cepa (LBIT181), fue la más tóxica de las tres analizadas, de
ahí que sería importante continuar con una caracterización a nivel molecular de su contenido de
genes cry, como ya se ha hecho con anterioridad
para diferentes cepas de B. thuringiensis mediante la técnica del PCR (Chak et al., 1994; Bravo et
al., 1998).
Del Rincón-Castro et al.: Bacillus thuringiensis vs. Spodoptera frugiperda
F IGURA 2.- Perfiles de proteínas de las cepas las nativas de Bacillus thuringiensis. Carriles: 1) M arcadores de peso m olecular,
2) LBIT-181, 3) LBIT-193, 4) LBIT-27, 5) H D -1. kD a: Kilodaltones.
162
Folia Entomol. Mex., 45 (2) (2006)
La determinación de los patrones de proteínas
de los cristales parasporales de las cepas de B.
thuringiensis, nos permite estimar el peso molecular de cada una de las toxinas que los componen y son un rasgo adicional de caracterización. Para las cepas analizadas en este estudio, se
encontró una correlación directa del tipo de cristal observado mediante microscopía electrónica
de barrido, con el peso molecular y número de
proteínas observadas en los geles de poliacrilamida. Así pudimos observar que las cepas LBIT-27
y LBIT-181 presentaron dos bandas mayoritarias,
una de 130 kDa y otra de 65 kDa (Figura 2). Al
observar la morfología del cristal de ambas cepas, pudimos notar la presencia de un cristal bipiramidal, correspondiente a la proteína de 130
kDa, y una inclusión cuadrada aplanada dentro
de éste último (Figuras 3a y 3c), el cual corresponde a la banda de 65 kDa observada en los geles de poliacrilamida. Por otro lado, se observó
una correlación en la cepa LBIT-193, con la presencia de una sola banda de 130 kDa en los geles
de polacrilamida y la presencia de un cristal bipiramidal sin inclusión (Fig. 3b).
F IGURA 3.- M icroscopía electrónica de barrido de cepas las
nativas de Bacillus thuringiensis. A) LBIT-181, B) LBIT-193,
C) LBIT-27.
163
CONCLUSIONES
No obstante que en México se han evaluado cepas de B. thuringiensis contra el gusano cogollero, ninguna de ellas se han caracterizado
empleando los criterios que se siguieron en este
trabajo, motivo por el cual no se conoce su identidad. De ahí la importancia del mismo, ya que
demuestra la existencia de cepas nativas de B.
thuringiensis, aisladas en la región de Bajío, las
cuales son originales, como lo demuestra la caracterización de plásmidos y proteínas. Estas cepas poseen potencial insecticida que, si bien no
es elevado, se ubica dentro del rango de actividad
eficaz de las cepas de B. thuringiensis con actividad hacia S. frugiperda, que se distribuyen comercialmente y que se utilizan a nivel de campo.
Estas cepas podrían desarrollarse en el futuro como bioinsecticidas alternativos para el control del
Del Rincón-Castro et al.: Bacillus thuringiensis vs. Spodoptera frugiperda
gusano cogollero, en las diferentes regiones de
México en donde este insecto representa un problema importante en el maíz y otros cultivos.
A G R A D E C IM IE N TO S
Este trabajo contó con el apoyo económico parcial de la Fundación Produce Sinaloa, A. C. Los
autores agradecen el valioso apoyo técnico de Javier Luévano, Regina Basurto y Priscilla Vargas.
LITERATURA CITADA
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Recibido: 17 de agosto del 2005.
Aceptado: 12 de julio del 2006.
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