NTC AEROBIOS MESOFILOS

NORMA TÉCNICA
COLOMBIANA
NTC
4519
2009-04-15
MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS PARA
CONSUMO HUMANO Y ANIMAL.
MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE
MICROORGANISMOS. TÉCNICA DE RECUENTO
DE COLONIAS A 30 °C
E:
MICROBIOLOGY OF FOOD AND ANIMAL FEEDING
STUFFS. HORIZONTAL METHOD FOR THE ENUMERATION
OF MICROORGANISMS COLONY-COUNT TECHNIQUE AT
30 DEGREES C
CORRESPONDENCIA:
esta norma es modificada (MOD) con
respecto a su documento de
referencia, la norma ISO 4833:2003.
DESCRIPTORES:
microbiología;
alimentos
para
consumo humano; alimentos para
animales; detección y numeración de
enterobacterias; técnica de NMP;
técnica con pre-enriquecimiento.
I.C.S.: 67.240
Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC)
Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. (571) 6078888 - Fax (571) 2221435
Prohibida su reproducción
Primera actualización
Editada 2009-04-28
PRÓLOGO
El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo
nacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993.
ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el
sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en
los mercados interno y externo.
La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica
está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último
caracterizado por la participación del público en general.
La NTC 4519 (Primera actualización) fue ratificada por el Consejo Directivo el 2009-04-15.
Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.
A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a
través de su participación en el Comité Técnico 25 Microbiología.
3M COLOMBIA
ALIMENTOS POLAR COLOMBIA S.A.
ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS S.A.
ANNAR DIAGNÓSTICA IMPORT LTDA.
ARCHIVO DE BOGOTÁ – ALCALDÍA MAYOR
DE BOGOTÁ
ASBIOQUIM LTDA.
BIANÁLISIS
BIOCONTROL LTDA.
BIOQUILAB LTDA.
BIOTRENDS LABORATORIOS LTDA.
CALIDAD INDUSTRIAL LTDA.
CARULLA VIVERO S.A.
CONGELAGRO S.A.
CASA LUKER
CREPES & WAFFLES S.A.
CONGELAGRO S.A.
CORPOLAC
ECOKAPKA
ENZIPÁN DE COLOMBIA LTDA.
INDUSTRIAS ALIMENTICIAS ZENÚ S.A.
INDUSTRIA PRODUCTORA DE ACEITES
RENOVABLES.
INSTITUTO DE GENÉTICA UNIVERSIDAD
NACIONAL DE COLOMBIA
IVONNE BERNIER LABORATORIO LTDA.
KOYOMAD S.A.
LABCONTROL E.U.
LABFARVE
–
LABORATORIO
DE
FARMACOLOGÍA VEGETAL
LABORATORIOS ERMA S.A.
LABORATORIOS GRAM
LABORATORIOS MICROLAB LTDA.
LABORATORIO SFC LTDA.
MERCADEO DE ALIMENTOS DE COLOMBIA
S.A.
MICROBIÓLOGOS ASOCIADOS
NULAB LTDA.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE FLUIDOS
LTDA
QUALA S.A.
SECRETARÍA DISTRITAL DE SALUD DE
BOGOTÁ
SUIZO S.A.
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
VECOL S.A.
VILASECA LTDA.
VITROFARMA S.A.
Además de las anteriores las siguientes empresas aportaron durante la consulta publica:
ACEGRASAS S.A.
ACUAGYR S.A. E.S.P.
ALGARRA S.A.
AQUALAB
AREPAS DOÑA ALEJA
ASEBIOL
ASINAL
ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE CIENCIA
Y TECNOLOGÍA COSMÉTICA -ACCYTECASOCIACIÓN
COLOMBIANA
DE
MICROBIOLOGÍA
BAVARIA S.A.
BECTON DICKINSON DE COLOMBIA LTDA.
CALIDAD INDUSTRIAL LTDA.
CARULLA VIVERO S.A.
CERVECERÍA LEONA S.A.
COLOMBIANA S.A.
COMPAÑÍA NACIONAL DE CHOCOLATES
S.A.
CORPORACIÓN PARA EL AVANCE DE LA
MICROBIOLOGÍA Y LA MICROSCOPIA
MICROS
CORPOICA - CORPOLAB
DUPONT QUALICON
EMPRESA
DE
ACUEDUCTO
Y
ALCANTARILLADO DE BOGOTÁ E.S.P.
FABRICA
DE
ESPECIAS
Y
CONDIMENTOS EL REY S.A.
FRUGAL S.A.
JOHNSON DIVERSEY
KLIK S.A
LABORATORIO A.B.B.A
LABORATORIO BIOCONTROL LTDA.
LABORATORIO DE GENÉTICA Y BIOLOGÍA
MOLECULAR
LA CAMPIÑA
MICROBIOLOGOS ASOCIADOS LTDA.
MULTIDIMENSIONALES S.A.
NESTLÉ DE COLOMBIA S.A.
QUIK LTDA.
ROCHE DIAGNOSTICS
SERVICIOS DE LABORATIO CLÍNICO
LTDA.
UNIVERSIDAD MANUELA BELTRÁN
ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales.
DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4519 (Primera actualización)
CONTENIDO
Página
INTRODUCCIÓN......................................................................................................................1
1.
OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN ........................................................................1
2.
REFERENCIAS NORMATIVAS ...................................................................................2
3.
TÉRMINOS Y DEFINICIONES .....................................................................................2
4.
PRINCIPIO....................................................................................................................2
5.
MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES......................................................................2
5.1
DILUYENTES ...............................................................................................................3
5.2
AGAR PARA RECUENTO EN PLACA (PCA).............................................................3
5.3
MEDIO DE RECUBRIMIENTO ....................................................................................4
6.
APARATOS Y MATERIAL DE VIDRIO .......................................................................4
6.1
APARATO PARA ESTERILIZACIÓN EN SECO (HORNO) O
ESTERILIZACIÓN HÚMEDA (AUTOCLAVE) .............................................................5
6.2
ESTUFA DE INCUBACIÓN..........................................................................................5
6.3
CAJAS DE PETRI ........................................................................................................5
6.4
PIPETAS.......................................................................................................................5
6.5
BAÑO DE AGUA..........................................................................................................5
6.6
EQUIPO DE RECUENTO DE COLONIAS...................................................................5
6.7
PH-METRO...................................................................................................................5
6.8
TUBOS DE ENSAYO ...................................................................................................5
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4519 (Primera actualización)
Página
7.
TOMA DE MUESTRAS ................................................................................................5
8.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA ANÁLISIS ................................................5
9.
PROCEDIMIENTO........................................................................................................6
9.1
PORCIÓN PARA ANÁLISIS, SUSPENSIÓN INICIAL Y DILUCIONES ......................6
9.2
SIEMBRA E INCUBACIÓN ..........................................................................................6
9.3
RECUENTO DE COLONIAS........................................................................................6
10.
EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS.........................................................................7
10.1
MÉTODO DE CÁLCULO..............................................................................................7
10.2
PRECISIÓN ..................................................................................................................7
10.3
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS ANALÍTICOS .......................................7
10.4
LÍMITES DE CONFIANZA............................................................................................8
11.
INFORME DE ANÁLISIS..............................................................................................8
BIBLIOGRAFÍA......................................................................................................................10
ANEXOS
ANEXO A (Informativo)
UTILIZACIÓN DE LA DIFERENCIA CRÍTICA (DC) PARA LA INTERPRETACIÓN
DE LOS RESULTADOS...........................................................................................................9
ANEXO B (Informativo)
CUADRO DE DIFERENCIAS ENTRE LA NTC4519 (Primera actualización) y la
ISO 4833:2003 .......................................................................................................................12
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4519 (Primera actualización)
MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS
PARA CONSUMO HUMANO Y ANIMAL.
MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE
MICROORGANISMOS. TÉCNICA DE RECUENTO
DE COLONIAS A 30 °C
INTRODUCCIÓN
Dada la gran variedad existente de productos alimenticios destinados al consumo humano y animal
este método horizontal puede no ser directamente aplicable para ciertos productos. En estos casos,
se pueden emplear diferentes métodos, específicos para estos productos, si está absolutamente
justificado por razones técnicas. Sin embargo, se debería intentar aplicar este método horizontal
siempre que sea posible.
Cuando se revise esta norma nacional, se tendrá en cuenta toda la información disponible en ese
momento, sobre la aplicación de este método y las razones que han originado desviaciones para
productos concretos.
La armonización de los métodos de análisis no puede ser inmediata y, para ciertos grupos de
productos pueden existir ya normas internacionales que no se ajusten a este método horizontal. Se
espera que cuando esas normas se revisen, se cambien para que se ajusten a esta norma
nacional y que solo se conserven las divergencias inevitables justificadas por razones técnicas.
Esta norma es una adopción modificada (MOD) por traducción, respecto a su documento de
referencia, la norma ISO 4833:2003. Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs. Horizontal
Method for the Enumeration of Microorganisms Colony-Count Technique at 30 Degrees C
1.
OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN
Esta norma nacional especifica un método horizontal para el recuento de microorganismos, contando
las colonias que crecen en un medio sólido después de la incubación aeróbica a 30 °C. Esta norma
nacional es aplicable a los productos destinados al consumo humano o animal, aunque sujeta a las
limitaciones expuestas en la introducción.
La aplicabilidad de esta norma nacional al examen de determinados alimentos fermentados y
alimentos para animales es limitada. Para el examen de determinados alimentos fermentados y
alimentos para animales, pueden ser más apropiados otros medios y/u otras condiciones de
incubación.
1 de 12
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
2.
NTC 4519 (Primera actualización)
REFERENCIAS NORMATIVAS
Las normas que a continuación se relacionan contienen disposiciones válidas para esta norma
nacional. En el momento de la publicación estaban en vigor las ediciones indicadas. Toda
norma está sujeta a revisión por lo que las partes que basen sus acuerdos en esta norma
nacional deben estudiar la posibilidad de aplicar la edición más reciente de las normas
indicadas a continuación. Los miembros de CEI y de ISO poseen el registro de las normas
internacionales en vigor en cada momento.
NTC 4491-1, Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Preparación de
las muestras de ensayo, suspensión inicial y las diluciones decimales para examen
microbiológico Parte 1: Reglas generales para la preparación de la suspensión inicial y de
diluciones decimales
NTC 4092, Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Reglas generales
para los exámenes microbiológicos
GTC 78, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Guía para la preparación y
producción de medios de cultivo. Guía general para el aseguramiento de la calidad para la
preparación de los medios de cultivo en el laboratorio.
ISO 8261, Leche y productos lácteos. Directrices generales para la preparación de muestras
para análisis, suspensiones iniciales y diluciones decimales para el examen microbiológico.
ISO 4833-2, Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs. Horizontal Method for the
Enumeration of Microorganisms. Surface Colony Count Technique at 30 ºC.
3.
TÉRMINO Y DEFINICIÓN
Para los propósitos de esta norma nacional, se aplica el siguiente término y definición.
3.1 Microorganismo. Bacterias, levaduras y mohos que forman colonias contables, producidas
en las condiciones especificadas en esta norma nacional .
4.
PRINCIPIO
4.1
Se siembran en profundidad dos cajas empleando un medio de cultivo determinado y
una cantidad determinada de la muestra para análisis, si el producto es líquido, o empleando
una cantidad determinada de una suspensión inicial en el caso de otros productos.
Se preparan otros pares de cajas en profundidad, bajo las mismas condiciones, empleando
diluciones decimales de la muestra para análisis o de la suspensión inicial.
4.2
Las cajas se incuban aeróbicamente a 30 ± 1 °C durante 72 h ± 3 h
4.3
El número de microorganismos por mililitro o por gramo de muestra se calcula a partir
del número de colonias obtenidas en cajas seleccionadas (véase el numeral 10).
5.
MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES
Para las prácticas habituales de laboratorio, véanse las normas NTC 4092 e ISO/TS 11133-1.
2
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
5.1
NTC 4519 (Primera actualización)
DILUYENTES
Véase la parte adecuada de la NTC 4491-1
5.2
AGAR PARA RECUENTO EN PLACA (PCA)
5.2.1
Composición
Digerido enzimático de caseína
5,0 g
Extracto de levadura
2,5 g
Glucosa anhidra
1,0 g
1)
Agar
de 9 g a18 g
Agua
1 000 mI
Cuando se examinan productos lácteos, añádase 1,0 g de leche en polvo desnatada por litro
de medio de cultivo. La leche en polvo desnatada debe estar libre de sustancias inhibidoras.
5.2.2
Preparación
5.2.2.1 Preparación a partir de medio completo deshidratado comercial. Síganse las instrucciones del
fabricante y añádase, si es necesario, la leche en polvo desnatada (véase el numeral 5.2.1).
Se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que después de la esterilización sea de 7,0 ± 0,2
a 25 °C.
5.2.2.2 Preparación a partir de los componentes básicos deshidratados. Se disuelven y
dispersan en el agua en el orden siguiente: el extracto de levadura, el digerido enzimático de
caseína, la glucosa y, si fuera necesario, la leche en polvo desnatada. Si se calienta el agua se
facilita la preparación.
Se añade el agar y se calienta hasta ebullición agitando frecuentemente, hasta que el agar se
disuelva completamente.
Se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que después de la esterilización sea de 7,0 ± 0,2
a 25 °C.
5.2.2.3 Distribución, esterilización y almacenamiento. Se reparte el medio en tubos de ensayo
(véase el numeral 6.8), en cantidades de 10 ml a 15 mI por tubo, o en matraces o frascos
(véase el numeral 6.8) de capacidad no superior a 500 mI.
Se esteriliza en autoclave a 121 °C De durante 15 min.
Si el medio se va a usar inmediatamente, se enfría antes de su empleo a una temperatura
entre 44 °C y 47 °C en un baño de agua (véase el numeral 6.5). En caso contrario, se
almacena en oscuridad a una temperatura de 6 °C ± 2 °C por un período no mayor de 3 meses,
bajo condiciones que no permitan ningún cambio de su composición ni de sus propiedades.
Antes de comenzar el examen microbiológico, con el fin de evitar todo retraso en el momento
de verter el medio, antes de su empleo se funde completamente el medio y a continuación se
enfría a una temperatura entre 44 °C y 47 °C en un baño de agua (véase el numeral 6.5).
1)
Dependiendo de la capacidad de gelificación del agar.
3
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4519 (Primera actualización)
Con el objeto de comprobar la temperatura del agar, se recomienda colocar un termómetro en
una porción de una disolución control de 15 g/l de agar en un recipiente separado idéntico al
empleado para el medio o se pueden utilizar termómetros por contacto. La temperatura de la
disolución control debería ser expuesta a las mismas condiciones de calentamiento y
enfriamiento que el propio medio.
5.2.3 Análisis de rendimiento para la garantía de calidad del medio de cultivo. Para analizar el
rendimiento del medio, véase la GTC 78.
5.3
MEDIO DE RECUBRIMIENTO (si fuera necesario; véase el numeral 9.2.7)
5.3.1
Composición
Agar1) de
12 g a 18 g
Agua
1 000 mI
5.3.2
Preparación
Se añade el agar al agua y se calienta hasta ebullición agitando frecuentemente, hasta que el
agar se disuelva completamente o se pone al vapor durante unos 30 min.
Se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que después de la esterilización sea de 7,0 ± 0,2
a 25 °C.
5.3.3
Distribución, esterilización y almacenamiento
Se reparte el medio en tubos de ensayo (véase el numeral 6.8), en cantidades de 4 mI por
tubo, o en matraces o frascos (véase el numeral 6.8) de capacidad adecuada.
Se esteriliza en autoclave a 121 °C durante 15 min.
Si el medio se va a usar inmediatamente, se enfría antes de su empleo entre 44 °C y 47 °C en un
baño de agua (véase el numeral 6.5). En caso contrario, se almacena en oscuridad a una
temperatura de 6 °C ± 2 °C o según las indicaciones dadas por el fabricante durante un máximo de
3 meses, bajo condiciones que no permitan ningún cambio de su composición ni de sus
propiedades.
Antes de comenzar el examen microbiológico, con el fin de evitar todo retraso en el momento
de verter el medio, antes de su empleo se funde completamente el medio y a continuación se
enfría a una temperatura entre 44 °C y 47 °C en un baño de agua (véase el numeral 6.5).
6.
APARATOS Y MATERIAL DE VIDRIO
El material de un solo uso es una alternativa aceptable al material de vidrio reutilizable, si las
especificaciones son similares.
El equipamiento de laboratorio microbiológico habitual y, en particular, lo siguiente:
1)
Dependiendo de la capacidad de gelificación del agar.
4
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
6.1
NTC 4519 (Primera actualización)
EQUIPO PARA ESTERILIZACIÓN EN SECO (HORNO) O ESTERILIZACIÓN HÚMEDA
(AUTOCLAVE)
Véase la NTC 4092
6.2
ESTUFA DE INCUBACIÓN
Capaz de operar a 30 °C ± 1 °C.
6.3
CAJAS DE PETRI
De vidrio o plástico y de 90 mm a 100 mm de diámetro.
6.4
PIPETAS
De capacidad nominal de 1 mI.
6.5
BAÑO DE AGUA
Capaz de operar a una temperatura entre 44 °C y 47 °C.
6.6
EQUIPO DE RECUENTO DE COLONIAS
Por ejemplo, puede emplearse uno consistente en una base iluminada con un fondo negro,
equipado con una lente de aumento preferiblemente de unos 1,5x y un contador mecánico o
electrónico digital.
6.7
PH-METRO
Que tenga una precisión de calibración de ± 0,1 unidades de pH a 25 °C.
6.8
TUBOS DE ENSAYO
Matraces o frascos de capacidad adecuada y no superior a 500 mI.
7.
TOMA DE MUESTRAS
Es importante que el laboratorio reciba una muestra que sea verdaderamente representativa y
que no haya sufrido daños o cambios durante el transporte o el almacenamiento.
La toma de muestras no constituye una parte del método especificado en esta norma nacional.
Para ello véase la norma internacional específica referente al producto de que se trate. Si no
existe una norma internacional específica, se recomienda que las partes interesadas adopten
un acuerdo sobre este punto.
8.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA ANÁLISIS
La muestra para análisis se prepara de acuerdo con la parte concerniente de la NTC 4491-1 y
la norma ISO 8261, y con la norma específica referente al producto de que se trate. Si no existe
una norma internacional especifica, se recomienda que las partes interesadas adopten un
acuerdo sobre este punto.
5
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4519 (Primera actualización)
9.
PROCEDIMIENTO
9.1
PORCIÓN PARA ANÁLISIS, SUSPENSIÓN INICIAL Y DILUCIONES
Véase la parte concerniente de la NTC 4491-1 y la norma nacional específica referente al
producto de que se trate.
9.2
SIEMBRA E INCUBACIÓN
9.2.1 Se toman dos cajas de Petri estériles (véase el numeral 6.3). Mediante una pipeta estéril
(véase el numeral 6.4), se transfieren a cada placa 1 mI de la muestra para análisis si es
líquida, ó 1 ml de la suspensión inicial en el caso de otros productos (dilución 10-1).
9.2.2 Se toman otras dos cajas de Petri estériles (véase el numeral 6.3). Mediante otra pipeta
estéril (véase el numeral 6.4), se transfieren a cada placa 1 ml de la dilución 10-1 (producto
líquido) o 1 mI de la dilución 10-2 (otros productos).
9.2.3 Si es necesario, se repite el procedimiento con más diluciones, empleando una nueva
pipeta para cada dilución decimal.
9.2.4 Si es adecuado y posible, se seleccionan sólo las secuencias de diluciones criticas (por
lo menos dos diluciones decimales consecutivas) para la siembra de las cajas de Petri que den
recuentos de colonias entre 30 colonias y 300 colonias por placa.
9.2.5 Se vierten aproximadamente de 10 ml a 15 ml de agar para recuento en placa (véase el
numeral 5.2) que se encuentre a una temperatura entre 44 °C y 47 °C en cada una de las cajas
de Petri. El tiempo transcurrido entre el final de la preparación de la suspensión inicial (o de la
dilución 10-1 si el producto es líquido) y el momento en el que el medio (véase el numeral 5.2)
se vierte en las cajas no debe superar los 15 min.
9.2.6 Se mezcla cuidadosamente el inóculo con el medio mediante rotación de las cajas de
Petri y se permite solidificar la mezcla dejando reposar las cajas de Petri en una superficie
horizontal lisa.
9.2.7 Después de que se haya completado la solidificación y, sólo en el caso en el que se
sospeche que el producto que se esté examinando contiene microorganismos cuyas colonias
sobrecrecerán en la superficie del medio, se vierten unos 4 mI del medio de recubrimiento
(véase el numeral 5.3) que se encuentre entre 44 °C y 47 °C en la superficie del medio
inoculado. Se deja solidificar como se describió anteriormente.
9.2.8 Las cajas de Petri preparadas se invierten y se sitúan en la incubadora (véase el numeral 6.2) a
30 °C ± 1 °C durante 72 h ± 3 h. No se deben apilar más de seis cajas una encima de la otra. Es
conveniente que las pilas de cajas estén separadas una de otra y de las paredes y parte superior
de la incubadora.
9.3
RECUENTO DE COLONIAS
9.3.1 Después del período de incubación especificado (véase el numeral 9.2.8), se cuentan
las colonias de las cajas (véase el numeral 10.1), empleando el equipo de recuento de colonias
(véase el numeral 6.6). Se examinan las cajas de Petri bajo luz tenue. Seria importante que las
colonias en punta de alfiler sean incluidas en el recuento, pero es esencial que la persona que
realiza la lectura evite confundir las partículas no disueltas o precipitadas con colonias en punta
de alfiler. Se examinan con atención los elementos dudosos, empleando una lupa cuando sea
necesario, con el objeto de diferenciar las colonias de partículas extrañas.
6
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4519 (Primera actualización)
Incluir la forma de hacer el recuento (que se referencia en la norma de coliformes)
NOTA
Si es necesario, se pueden adicionar reactivos que faciliten la visualización de las colonias.
9.3.2 Las colonias invasoras deben ser consideradas como una sola colonia. Si menos de un
cuarto de la placa está invadida por dichas colonias, se cuentan las colonias de la parte no
afectada de la placa y se calcula el número correspondiente a la placa entera. Si está invadido
más de un cuarto de la placa, se desecha el recuento.
10.
EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
10.1
MÉTODO DE CÁLCULO
Véase la NTC 4092
10.2
PRECISIÓN
10.2.1 Generalidades
Los datos de precisión han sido calculados para cajas que contienen entre 30 colonias a 300 colonias.
Los datos de precisión dependen de la flora en asociación y de la matriz de la muestra. Los datos
presentados se derivan de estudios en colaboración (véanse las referencias [1], [2] y [3]) Y son
válidos para leche cruda y pasterizada. Pueden utilizarse como estimación en el caso de recuentos
en otros productos. Véase la NTC 4092.
10.2.2 Repetibilidad
La diferencia absoluta entre dos resultados analíticos individuales independientes, obtenidos
empleando el mismo método sobre material analítico idéntico, en el mismo laboratorio, por el
mismo analista y empleando el mismo equipo en un intervalo de tiempo corto, no debería ser
mayor que el límite de repetibilidad, r= 0,25, en log10 microorganismos por mililitro
(correspondiente a 1,8 en la escala normal de microorganismos por mililitro).
NOTA Este límite de repetibilidad proviene de estudios colaborativos realizados sobre leche cruda y pasteurizada
(véanse las referencias [1], [2] y [3]) y puede ser aplicado a dichos productos.
10.2.3 Reproducibilidad
La diferencia absoluta entre dos resultados analíticos individuales, obtenidos empleando el
mismo método sobre material analítico idéntico, en diferentes laboratorios, por analistas
diferentes y empleando equipos diferentes, no debería ser mayor que el límite de
reproducibilidad, R = 0,45, en log10 microorganismos por mililitro (correspondiente a 2,8 en la
escala normal de microorganismos por mililitro).
NOTA
Este límite de reproducibiliIdad proviene de estudios colaborativos realizados sobre leche cruda y
pasteurizada (véanse las referencias [1], [2] Y [3]) Y puede ser aplicado a dichos productos.
10.3
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS ANALÍTICOS
En los siguientes ejemplos, se consideran los datos promedio de la precisión, un nivel de
probabilidad del 95 % y el análisis de una muestra. Se debería tener en cuenta que, en la
práctica, se emplea a menudo el promedio de varias muestras. Las cifras se expresan en
microorganismos por mililitro.
7
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
a)
NTC 4519 (Primera actualización)
Condiciones de repetitibilidad
Primer resultado:
105 = 100 000
La diferencia entre el primer y segundo resultado no debería ser superior a 0,25 unidades
log10,
Segundo resultado: log 104,75 = 56 000 ó
log 105,25 = 178 000
La diferencia entre el primer y segundo resultado es aceptable si el segundo resultado
no es inferior a 56 000 o no es superior a 178 000.
b)
Condiciones de reproducibilidad
Resultados obtenidos en el primer laboratorio (media de la determinación
duplicada): 10 5 = 100 000
La diferencia entre el primer y segundo resultado obtenido en el segundo laboratorio no
debería ser superior a 0,45 unidades log10.
Segundo resultado: log 104,55 = 36 000, ó
log 105,45 = 280 000
La diferencia entre los resultados obtenidos en el primer y segundo laboratorio es
aceptable, si el segundo laboratorio obtiene un resultado que no es inferior a 36 000 y no es
superior a 280 000.
El Anexo A muestra los cálculos y el empleo de las diferencias críticas (DC) para interpretar los
resultados.
10.4
LIMITES DE CONFIANZA
Véase la NTC 4092
11.
INFORME DE ANÁLISIS
El informe del análisis debe especificar lo siguiente:
a)
toda la información necesaria para la identificación completa de la muestra;
b)
el método de toma de muestras empleado, si se conoce;
c)
el método analítico utilizado, con referencia a esta norma;
d)
todos los detalles operativos no especificados en esta norma o considerados
opcionales, junto con los detalles de todo tipo de incidencias que pudieran haber
afectado a los resultados;
e)
los resultados obtenidos.
8
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4519 (Primera actualización)
ANEXO A
(Informativo)
UTILIZACIÓN DE LA DIFERENCIA CRÍTICA (DC)
PARA LA INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
En los siguientes ejemplos, se consideran los datos de precisión media, un nivel de
probabilidad del 95 % y el análisis de una muestra. Se debería tener en cuenta que, en la
práctica, se emplea a menudo la media de varias muestras. Las cifras se expresan en
microorganismos por mililitro.
a)
Condiciones de reproducibilidad
Resultados obtenidos en el primer laboratorio (media de la determinación duplicada): 105 =
100 000.
La diferencia entre este resultado y un resultado obtenido en un segundo laboratorio
(media de n determinaciones; n = 2 en este ejemplo) es aceptable si no excede la
diferencia crítica (DC), en unidades log10,
CD =
1⎞
⎛
R 2 − r 2 ⎜1 − ⎟
n⎠
⎝
=
R2 −
r2
=
2
0,45 −
0,25 2
2
= 0,41
en donde
r
es el límite de repetitibilidad;
R
es el límite de reproducibilidad.
La diferencia entre los resultados obtenidos en el primer y segundo laboratorio es aceptable
si el segundo laboratorio obtiene un resultado que no es inferior a 104,59 = 39 000 o no es
superior a 105,41 = 257 000.
b)
Comparación con un límite (test unilateral)
Límite: 105 = 100 000.
La diferencia entre el límite y el resultado del laboratorio (media de n determinaciones; n
= 2 en este ejemplo) ha de compararse con el límite de diferencia critica (LDC):
CDL = 0,84 2 x
1⎞
⎛
R 2 − r 2 ⎜1 − ⎟
n⎠
⎝
= 0,84 2 x
R2 −
r2
2
= 0,24
Los resultados hasta 105,24 = 174 000 no indican una no conformidad con el límite.
9
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4519 (Primera actualización)
ANEXO B
(Informativo)
Cuadro de diferencias entre la NTC 4519 (Primera actualización) y la ISO 4833:2003
NTC 4519
(Primera actualización)
OBJETO:
Esta norma nacional especifica un
método horizontal para el recuento
de microorganismos, contando las
colonias que crecen en un medio
sólido después de la incubación
aeróbica a 30 °C.
ISO 4833:2003
Sustentación Técnica
OBJETO:
Esta norma da directrices
generales para el recuento de
microorganismos presentes en
productos destinados al consumo
humano o alimentación animal,
contando las colonias que crecen
en un medio sólido después de la
incubación aeróbica a 35 °C ±
2°C.
El documento de referencia ISO 4833 de la
NTC 4519 fue actualizado en el año 2003,
modificando la temperatura de 35 °C a 30 °C
para
la
técnica,
cambio
sustentado
técnicamente en la necesidad de que el
método permitiera tener recuentos verídicos
teniendo en cuenta la posible contaminación
ambiental del proceso o por mala limpieza en
el proceso además porque se busca estudiar
microorganismos mesófilos y psicrófilos y una
parte de los termotolerantes; de esta manera
la temperatura de 30 °C es utilizada para
determinar el deterioro del alimento y la calidad
del procesamiento de los alimentos. En Colombia
el Comité 25- realizó pruebas interlaboratorios
teniendo en cuenta como comparativo
condiciones de incubación a 30 °C, durante 48 h
a 72 h y a 35 °C de incubación durante 48 h
a 72 h. Al finalizar el tratamiento estadístico en el
país se da validez al sustento ténico internacional
(ISO e Instituto Pasteur) para adoptar la
temperatura a 30 °C. (Acta No.113 2008-07-15).
El tiempo de incubación (72 h) se encuentra
estandarizado por la ISO, adicionalmente el
consenso del Comité define darle un rango de
± 3 h armonizando de esta forma con las
condiciones de tiempo de incubación
estipuladas en los métodos y documentos
normativos colombianos.
DEMAS PARTES DEL
DEMAS
PARTES
DEL
DOCUMENTO QUE REFIEREN A DOCUMENTO QUE REFIEREN
LA
TEMPERATURA
DE A LA TEMPERATURA DE
INCUBACIÓN
INCUBACIÓN
4.2
Las
cajas
se
incuban 4.2 Incubación aeróbica de las
aeróbicamente a 30 ±1 °C durante cajas a 35 °C ± 2 °C durante 48 h
72 h ±3 h.
5.2.2.1 Se ajusta el pH, si fuera
necesario,
de
manera
que
después de la esterilización sea
de 7,0 ± 0,2 a 25 °C.
MEDIO DE CULTIVO ... Se
ajusta el pH, si es necesario, de
tal modo que después de la
esterilización sea de 7,0 °C a
25 °C.
5.2.2.3 ... Se reparte el medio en 5.2.2.3 ... Se reparte el medio
tubos de ensayo (véase el en tubos de ensayo (véase el
numeral 6.8), en cantidades de 10 numeral 6.8), en cantidades de
12 ml a 15 mI por tubo ...
ml a 15 mI por tubo ...
Las unidades de pH se establecen en un rango
de ± 0,2. Armonizando las unidades de acuerdo
con el documento de referencia ISO 4833.
Las metodologías implementadas en el país
estipulan utilizar volúmenes de medio de 10 ml
en tubos de ensayo, ya que 10 ml es más
práctico para medir en material volumétrico
(pipetas etc).
9.2.5...Se vierten aproximadamente
12 ml a 15 mI por tubo
5.2.2.3 ... En caso contrario, se La temperatura estipulada para estas
almacena en oscuridad a una condiciones en la ISO 7218:2008 es de 2 °C a
8 °C, con el rango que se define en este
temperatura de 3 °C ± 2 °C
documento se cumple requisito.
5.3.3 ... 6 °C ± 2 °C
5.3.3 ... 3 °C ± 2 °C
6.5
BAÑO DE AGUA
6.5
BAÑO DE AGUA
El consenso colombiano define que las
condiciones de operación de estos equipos se
Capaz de operar entre 44 °C y 47 °C O aparato similar, con capacidad encuentra entre estas temperaturas.
de operar 45°C ± 0,5 °C
9.2.5...Se vierten aproximadamente
10 ml a 15 mI por tubo
5.2.2.3 ... En caso contrario, se
almacena en oscuridad a una
temperatura de 6 °C ± 2 °C
Continúa...
10
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4519 (Primera actualización)
ANEXO B
(Informativo)
(Continuación)
NTC 4519
(Primera actualización)
9.2.4 Si es adecuado y posible, se
seleccionan sólo las secuencias
de diluciones criticas (por lo
menos dos diluciones decimales
consecutivas) para la siembra de
las cajas de Petri que den
recuentos de colonias entre 30
colonias y 300 colonias por placa.
ISO 4833:2003
Sustentación Técnica
9.2.4 Si es adecuado y posible,
se
seleccionan
sólo
las
secuencias de diluciones criticas
(por lo menos dos diluciones
decimales consecutivas) para la
siembra de las cajas de Petri que
den recuentos de colonias entre
15 colonias y 300 colonias por
placa.
Las normas técnicas colombianas que
relacionan estas especificaciones de recuento,
contemplan el recuento entre 30 colonias y
300 colonias
9.3.1 ...
NOTA
Si es necesario, se 9.3.1 ... No contempla la nota
pueden adicionar reactivos que aclaratoria
faciliten la visualización de las
colonias.
11
Es necesario aclarar que se pueden utilizar
este tipo de reactivos que son válidos para la
aplicación de la técnica en el país.
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4519 (Primera actualización)
BIBLIOGRAFÍA
[1]
PITON, C., GRAPPIN, R. A Model For Statistical Evaluation Of precision Parameters Of
Microbiological Methods: Application To Dry Rehydratable Film Methods And IDG
Reference Methods For Enumeration Of Total Aerobic Mesophilic Flora And Coliforms In
Raw Milk. J AOAC, 74, 1991, pp. 92-103.
[2]
SCOTTER, S., ALDRIDGE. M., BACK, J., WOOD, R. Validation of European Community
Methods for Microbiological and Chemical Analysis of Raw and Heat-Treated Milk. J.
Assoc. Publ. Analyst., 29, 1993, pp.I-32.
[3]
DAHMS. S., WEISS, H. Estimation of Precision Values for Microbiological Reference
Methods: Standardized Pour Plate Technique. Milchwiss., 53, 1998, pp.555-559.
12