ESTUDIO DE LA EFICACIA DE LA QUIMIOTERAPIA METRONÓMICA CON METFORMINA Y CICLOFOSFAMIDA EN UN MODELO DE ADENOCARCINOMA DE MAMA MURINO TRIPLE NEGATIVO EN RATONES SOMETIDOS A UNA DIETA RICA EN GRASAS Trabajo Final de Grado de la alumna MAGDALENA LANZILLOTTA Este trabajo ha sido presentado como requisito para la obtención del título de Licenciada en Genética Carrera Licenciatura en Genética Escuela de Ciencias Agrarias, Naturales y Ambientales. Universidad Nacional del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires. Pergamino,…………………………… ESTUDIO DE LA EFICACIA DE LA QUIMIOTERAPIA METRONÓMICA CON METFORMINA Y CICLOFOSFAMIDA EN UN MODELO DE ADENOCARCINOMA DE MAMA MURINO TRIPLE NEGATIVO EN RATONES SOMETIDOS A UNA DIETA RICA EN GRASAS Trabajo Final de Grado de la alumna MAGDALENA LANZILLOTTA Aprobada por el Tribunal Evaluador (Nombre y Apellido) Evaluador Fabiana García Co-Directora (Nombre y Apellido) Evaluador (Nombre y Apellido) Evaluador Leandro E. Mainetti Director Escuela de Ciencias Agrarias, Naturales y Ambientales, Universidad Nacional del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires Pergamino,………………………………. ÍNDICE INTRODUCCIÓN Cáncer 7 7 Cáncer de Mama 7 Microambiente tumoral 8 Cáncer y Enfermedades Metabólicas 11 Modalidades Terapéuticas 13 Quimioterapia Metronómica 14 Reposicionamiento de Fármacos 15 Metronomics 15 Fármacos 16 Ciclofosfamida 16 Metformina 17 OBJETIVOS E HIPÓTESIS 19 Hipótesis de Trabajo 19 Objetivo General 19 Objetivos Específicos 19 MATERIALES Y MÉTODOS 20 Fármacos 20 Tumor 20 Animales 20 Dieta HFD 20 Modelo experimental 21 Parte 1: Inducción de SM 21 Parte 2: Desafío Tumoral 21 Crecimiento tumoral 22 Análisis de toxicidad 22 Determinaciones bioquímicas 22 Histoquímica 22 Análisis de mecanismos de acción 23 Análisis estadísticos 23 RESULTADOS 24 Estudio del efecto antitumoral 24 Estudio de la toxicidad 24 Estudios bioquímicos 24 Estudio de los mecanismos de acción 24 DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES 25 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 26 PRODUCCIÓN CIENTÍFICA 30 AGRADECIMIENTOS RESUMEN RESUMEN SBR 2019 (FALTA COMPLETAR Y MODIFICAR) Las dietas altas en grasas (HFD, del inglés: High Fat Diet) causan obesidad y síndrome metabólico (SM) y están asociadas con la progresión del cáncer de mama. La quimioterapia metronómica (QTM) se caracteriza por la administración crónica, a intervalos regulares, de fármacos quimioterapéuticos en dosis significativamente menores a la dosis máxima tolerada, sin periodos de descanso prolongados, con baja toxicidad. El uso de fármacos existentes en aplicaciones terapéuticas diferentes para las cuales fueron diseñados, es conocido como “reposicionamiento terapéutico”. Nuestro objetivo fue evaluar el efecto de la QTM con ciclofosfamida (Cy) y el fármaco reposicionado metformina (Met) en un modelo de tumor de mama murino triple negativo (M-406), en ratones con alteraciones metabólicas generadas por una dieta con alto contenido graso. Metodología: Ratones machos de la línea CBi fueron distribuidos en dos grupos (n=40/grupo): Control (C), los cuales fueron alimentados con una dieta estándar, y HFD, los cuales recibieron una dieta con 40% de calorías de grasa bovina. A las 16 semanas, una vez que se confirmaron las alteraciones metabólicas del SM, observándose valores similares a los reportados previamente por nuestro equipo de investigación, los animales fueron inoculados por vía s.c. con el adenocarcinoma M-406. Cuando el tumor fue palpable se comenzó el tratamiento con Cy (25 mg/kg peso/día) y Met (300 mg/kg peso/día) disueltos en el agua de bebida, quedando los animales distribuidos en 8 grupos (n=10/grupo): GI: Control sin tratamiento, GII: C+Met, GIII: C+Cy, GIV: C+Met+Cy, GV: HFD sin tratamiento, GVI: HFD+Met, GVII: HFD+Cy, GVIII: HFD+Met+Cy. Durante el experimento se determinaron la evolución del volumen tumoral y el peso corporal, como una medida de la toxicidad del tratamiento. Resultados: Al finalizar el experimento (semana 20), los parámetros bioquímicos y morfológicos no se vieron modificados por la metformina independientemente del grupo analizado. El tumor creció por igual en los grupos GI, GII, GV y GVI. El volumen tumoral fue menor en GIII vs. GI (P<0,01) y en GVII vs. GV (P<0,01). El grupo GVIII perdió un 10% de su peso corporal desde el inicio de la QTM. Conclusiones: 1) La ciclofosfamida es igualmente efectiva en ambas dietas. 2) La metformina no mejora las características del SM en las cuatro semanas de tratamiento. 3) La metformina no agrega efecto terapéutico sobre la QTM con Cy y, en los animales del grupo HFD + Met + Cy, podría generar toxicidad. INTRODUCCIÓN Cáncer El término “cáncer” designa a un amplio grupo de enfermedades crónicas que comienzan cuando el ciclo celular se descontrola, debido a la adquisición de alteraciones en el material genético de una célula, lo cual produce cambios en el crecimiento y la división normales de las células (Puglisi et al., 2002; Shen, 2011). La carcinogénesis es un proceso multifactorial que eventualmente da como resultado la aparición de distintas subpoblaciones de células malignas. Se trata de un proceso dinámico que avanza a través de etapas cualitativamente diferentes que comprenden Iniciación, Promoción y Progresión. Clínicamente, un tumor se caracteriza por la presencia de una masa de tejido anormal heterogéneo que crece progresivamente, y puede o no estar acompañado por distintos signos y síntomas, dependiendo del órgano que afecta (Burrell et al., 2013). Según las estimaciones realizadas por el Centro Internacional de Investigaciones sobre el Cáncer (IARC, por sus siglas en inglés: International Association of Cancer Registries) en base a datos disponibles a nivel mundial para el año 2020, su incidencia mundial fue de 19.292.789 casos nuevos por año. En Argentina es la segunda causa principal de muerte, luego de las enfermedades cardiovasculares y seguida por las respiratorias. Su incidencia para el año 2020 fue de 130.878 nuevos casos por año, que se corresponde con una tasa de 218 casos por 100.000 habitantes (considerando ambos sexos y todos los tumores), cifra que la posiciona dentro de los países del mundo con incidencia de cáncer media-alta, y la ubica en el sexto lugar en Latinoamérica. El cáncer de mayor incidencia es el de mama, siendo las mujeres las principales afectadas, con una tasa de 73 casos por cada 100.000 mujeres, seguido por los cánceres de próstata en varones (42/100.000), y colorrectales (25/100.000) y de pulmón (19/100.000) en ambos sexos (IARC, 2020). Cáncer de Mama El cáncer de mama es un tumor maligno que se origina en las células de la mama. Según las estimaciones del Observatorio Global de Cáncer (GCO por sus siglas en inglés: Global Cancer Observatory) de la Organización Mundial de la Salud (OMS), el cáncer de mama es el de mayor incidencia en Argentina: con más de 22.000 nuevos casos durante 2020, representa el 17% de todos los tumores malignos y casi un tercio (32%) de los cánceres en mujeres. Es una enfermedad que afecta a hombres y mujeres, siendo más frecuente en estas últimas, con una tasa de 73 casos nuevos por cada 100.000 habitantes (IARC, 2020). Ciertos factores aumentan el riesgo de cáncer de mama, incluidos el sexo, la edad, los antecedentes familiares, los antecedentes reproductivos, las mutaciones genéticas y un estilo de vida poco saludable (Matsen & Neumayer, 2013). El cáncer de mama comprende un grupo heterogéneo de enfermedades que varían en morfología, biología, comportamiento y respuesta a la terapia (Rakha & Ellis, 2009). Casi todos los cánceres de mama son carcinomas porque se originan en las células epiteliales del tejido mamario. Dentro de los carcinomas, los adenocarcinomas son aquellos que surgen en tejidos glandulares, ya sea en los conductos o en los lóbulos de la mama (Weigelt & Reis-Filho, 2009). Entre los distintos subtipos de cáncer de mama, los llamados “triple-negativo” (TNBC, por sus siglas en inglés: Triple-Negative Breast Cancer) se caracterizan por la ausencia de expresión de los receptores de estrógeno (RE), progesterona (RP) y del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (Her-2/neu), y representan entre un 15 y 20 % de los cánceres de mama reportados (Bauer et al., 2007; Morris & Carey, 2007). Comparados con otros subtipos, éstos son más agresivos, invasivos, con mayor porcentaje de desarrollo de metástasis, recurrencias y mortalidad, afectando incluso a mujeres jóvenes (Carey et al., 2010). En la actualidad, las únicas opciones de tratamiento para los pacientes con TNBC son la cirugía, la quimioterapia, la radioterapia o combinaciones de éstas, debido a que no pueden recibir terapias hormonales ni terapias dirigidas a blancos celulares. Por lo mencionado anteriormente, los TNBC están asociados a un pronóstico muy pobre, y el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento se ha convertido en una necesidad clínica urgente. Cabe mencionar que, actualmente, se están estudiando distintos enfoques terapéuticos avanzados para el tratamiento de los TNBC (Medina et al., 2020). Microambiente tumoral Hace ya dos décadas que Hanahan y Weinberg propusieron una serie de características biológicas que adquieren las células tumorales durante las distintas etapas de la carcinogénesis, que les permiten su crecimiento y diseminación (Hanahan & Weinberg, 2000). Éstas comprenden la proliferación sostenida, la resistencia a los factores inhibidores del crecimiento, la evasión de la apoptosis, el potencial de replicación ilimitado, la inducción de la angiogénesis y la invasión y desarrollo de metástasis. Esta adquisición es posible gracias a dos factores subyacentes: la inestabilidad genómica, que genera mutaciones aleatorias, y el estado inflamatorio generado por células del sistema inmune, que promueve la progresión tumoral mediante distintos medios. Sin embargo, actualmente se sabe que los tumores no son masas aisladas de células cancerosas en proliferación, sino que son tejidos complejos y heterogéneos, formados por distintos tipos celulares que incluyen células endoteliales, pericitos, fibroblastos asociados a tumor, adipocitos, células madre y poblaciones leucocitarias, que interactúan entre sí. Por consiguiente, la definición tuvo que ampliarse para incluir el aporte del "microambiente tumoral". Hanahan y Weinberg añadieron, entonces, nuevas características a la lista original, entre las cuales se encuentran la reprogramación metabólica y la evasión del sistema inmune (Figura 1) (Hanahan & Weinberg, 2011). Figura 1: Características del tumor. Adaptado de (Hanahan & Weinberg, 2011) y modificado en BioRender.com Una de las características principales de la célula tumoral es su alta tasa de proliferación, obtenida como consecuencia de mutaciones que le permiten desobedecer las señales que controlan el ciclo celular, y destruyen así el equilibrio homeostático del organismo. Por otro lado, sabemos que el crecimiento tumoral es angiogénico-dependiente, es decir que requiere la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de células endoteliales, para nutrirse y oxigenarse (Folkman, 1971). Sin embargo, los vasos sanguíneos tumorales se caracterizan por su inmadurez, lo que trae consigo importantes consecuencias para el microambiente tumoral, tales como hipoxia, disminución de infiltración de células inmunes y aumento de riesgo de metástasis (Viallard & Larrivée, 2017). A su vez, las condiciones hipóxicas, mediante un aumento de los niveles del factor inducible por hipoxia (HIF), estimulan la producción de factores angiogénicos por las células cancerosas y del estroma, que promueven la angiogénesis en un bucle interminable que se refuerza a sí mismo (Carmeliet & Jain, 2011). En este sentido, se han desarrollado estrategias anti-angiogénicas con el objetivo de inhibir la formación de nuevos vasos y/o destruir vasos existentes para privar al tumor de sus nutrientes (Browder et al., 2000; Hanahan et al., 2000; R. S. Kerbel et al., 2002, 2013; Jayson et al., 2016). Con respecto al sistema inmune, éste juega un papel central en la progresión tumoral, mediante el infiltrado de gran cantidad de células inmunitarias que interactúan dinámicamente con el microambiente circundante. Se trata de un proceso conocido como “Inmunoedición” (Dunn et al., 2002) que consta de tres fases: eliminación, equilibrio y escape. Durante la fase de eliminación, las células inmunes intentan montar una respuesta inmunitaria antitumoral eficaz para erradicar las células malignas; luego se establece un equilibrio entre la contención del tumor (por la muerte de células tumorales) y la presión inmune selectiva (que promueve la supervivencia de células resistentes al ataque inmune); finalmente, las células tumorales superan la presión inmune gracias a su inestabilidad genética, y los clones tumorales seleccionados pueden escapar a la respuesta inmune y progresar con éxito (Calì et al., 2017). Por lo tanto, el control de tumores por parte del sistema inmunológico abarca distintos tipos de células inmunes innatas y adaptativas que luchan contra el desarrollo del cáncer mediante diferentes mecanismos. La primera línea de combate la ejercen los linfocitos T citotóxicos CD8+, capaces de promover la apoptosis de células malignas. Al mismo tiempo, los linfocitos citotóxicos son estimulados por los linfocitos T colaboradores CD4+. Una pequeña subpoblación de linfocitos T CD4+, los T reguladores CD4+CD25+Foxp3+ (Treg), cuentan con una serie de mecanismos supresores que les permite regular la respuesta inmune e inhibir la activación y la proliferación de los linfocitos T efectores. La calidad y cantidad de infiltrado inmunológico en el sitio del tumor se ha aceptado como un marcador pronóstico de la progresión de gran variedad de cánceres humanos (Galon et al., 2006, 2014). Los avances acerca de la complejidad del tejido tumoral y sus características, han promovido el diseño de distintas estrategias terapéuticas, ahora dirigidas no sólo a destruir directamente las células neoplásicas, sino también a alterar el equilibrio del microambiente tumoral (Candeias & Gaipl, 2016; Lee & Hong, 2017; Viallard & Larrivée, 2017). Cáncer y Enfermedades Metabólicas Existe cada vez más evidencia de la relación entre los desórdenes alimenticios causados por una dieta desbalanceada y la incidencia de tumores, incluido el cáncer de mama (Chen et al., 2016; Godsland, 2010) . Recientemente se ha comenzado a considerar a la obesidad como un factor de riesgo más que aumenta el desarrollo de diversos tipos de cáncer (Ecker et al., 2019; HerreraCovarrubias et al., 2015; Renehan et al., 2010). El síndrome metabólico (MetS, por su abreviatura en inglés: Metabolic Syndrome) es una condición definida por la coexistencia de 3 o más de las siguientes condiciones: hipertensión arterial, obesidad abdominal, hipertrigliceridemia, colesterol-HDL bajo, hiperglucemia e insulinorresistencia (ALAD, 2019; Aydin et al., 2014). Algunas causas importantes de estas patologías en seres humanos son las dietas altas en grasas (HFD, del inglés High Fat Diet) y el sedentarismo (Aydin et al., 2014; Gallagher et al., 2011). El MetS comprende un conjunto de factores de riesgo para desarrollar diabetes y enfermedades cardiovasculares (Gallagher et al., 2011). Por otra parte, la evidencia epidemiológica indica que las personas con MetS también tienen un mayor riesgo de desarrollar cáncer y un peor pronóstico luego del diagnóstico (Chen et al., 2016; Davis & Kaklamani, 2012; Ecker et al., 2019; Mendonça et al., 2015). El principal consejo para tratar el MetS es un estilo de vida saludable. Se recomienda una pérdida de peso con déficit calórico y actividad física; abandono del hábito de fumar; una dosis baja de aspirina en todos los casos de riesgo moderado a alto de enfermedad cardiovascular (Gallagher et al., 2011). Para aquellos en quienes el cambio de estilo de vida no es suficiente, la farmacoterapia está disponible para el tratamiento de la obesidad, la dislipidemia y la hiperglucemia. La metformina es uno de los tratamientos farmacológicos elegidos para la obesidad, mediante su acción reductora de la producción de glucosa hepática, que induce pérdida de peso y una disminución en la incidencia de diabetes (Morantes-Caballero et al., 2017). En nuestra sociedad actual, que cuenta con niveles crecientes de obesidad, diabetes, enfermedades cardiovasculares y tumores, tanto el MetS como su vínculo con el cáncer, son objeto de estudio de numerosas investigaciones. Distintos trabajos han reportado la asociación entre la obesidad, la diabetes tipo 2, el MetS y el desarrollo de cáncer de mama triple negativo (Arcidiacono et al., 2012; Bader et al., 2020; Davis & Kaklamani, 2012; Ecker et al., 2019; Maiti et al., 2010; Vona-Davis et al., 2008). Entre las posibles explicaciones que vinculan a la obesidad y el cáncer se incluyen alteraciones en procesos endocrinos y metabólicos, que comprenden la producción de hormonas y citocinas capaces de promover el desarrollo de inflamación crónica y estrés oxidativo, procesos que favorecen el establecimiento de un microambiente ideal para el desarrollo del cáncer (HerreraCovarrubias et al., 2015). El tejido adiposo es un órgano endocrino que produce gran cantidad de factores, tales como interleucina-6 (IL-6), factor de necrosis tumoral (TNFα), resistina, lipoproteína lipasa, proteína de unión al retinol-4 (RBP4), estrógenos, leptina, angiotensinógeno, adiponectina y factor de crecimiento similar a la insulina-1 (IGF-1) (Gallagher et al., 2011). Las hormonas leptina, prolactina e insulina participan en la regulación del apetito, del metabolismo, del sistema inmune y cumplen una función fundamental en la génesis tumoral. Su importancia radica en que participan en la cascada de señalización de vías que regulan la expresión génica y mitogénica, estimulando la proliferación celular. Por otro lado, se ha vinculado a la obesidad con un estado inflamatorio crónico, el cual se presenta como consecuencia del incremento de tejido adiposo. Las citocinas proinflamatorias secretadas por los adipocitos (TNFα, IL-1, IL-6, IL-18) atraen células del sistema inmune como macrófagos y linfocitos que, a su vez, secretan estas moléculas mediante un ciclo de regulación positiva. Además, alteran la diferenciación, la proliferación y el metabolismo de las células adiposas, y su acumulación ha sido asociada con la resistencia a la insulina. El estado inflamatorio crónico promueve los procesos carcinogénicos, estimula el crecimiento de las células tumorales y facilita la inestabilidad de su genoma, favoreciendo así la progresión y la diseminación del tumor. Por otra parte, contribuye a la generación de radicales libres, favoreciendo con esto a la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS, por su abreviatura en inglés: reactive oxygen species), las cuales han sido vinculadas con el desarrollo de diversos tipos de cáncer, debido a su capacidad de dañar el ADN y contribuir a la mutagénesis y carcinogénesis (Arcidiacono et al., 2012). Un mayor conocimiento acerca de los mecanismos detrás de esta compleja relación puede mejorar nuestra comprensión para conocer cómo prevenirla y/o tratarla. En este sentido, resulta esencial un modelo dependiente de obesidad inducida por la dieta Para la investigación experimental sobre la incidencia del síndrome metabólico en ratones portadores de tumores, desarrollado utilizando animales genéticamente normales. No obstante, los esfuerzos por alimentar con una dieta alta en grasas (HFD) a las principales cepas endogámicas de ratones no han dado como resultado el establecimiento de un modelo de cáncer ideal en tales condiciones. Los modelos animales de obesidad inducida por la dieta son importantes y pueden proporcionar información valiosa sobre la fisiopatología del síndrome de obesidad en humanos (Thibault L 2013). Thibault L. Animal Models for the Study of Human Disease. 2013; 13:277-303. Lo interesante acá es que se usó un modelo de una línea de ratones endocriadas desarrollada por el IGE y deberías hablar de eso también. Esta es la primera vez que esa línea se usó con dieta HFD. Esto debería ser mencionado Hinrichsen LI, Di Masso RJ. Empleo de un modelo murino original de Argentina en la caracterización de fenotipos complejos. Journal of Basic & Applied Genetics. 2010; 21:2. Cita del modelo animal empleado El consumo crónico de una dieta HFD por parte de un modelo animal de ratón aumentó la mortalidad, y el crecimiento de un tumor sólido de células 4T1 (carcinoma mamario) así como la metástasis pulmonar. Igualmente se registraron aumentos en el número de vacuolas de lípidos y macrófagos en los tejidos tumorales de los ratones alimentados con HFD (Kim et al. 2011). Modalidades Terapéuticas Actualmente, existen múltiples terapias contra el cáncer que se aplican solas o combinando sus efectos para aumentar el potencial de acción. En términos generales, el tratamiento se clasifica en dos grandes grupos. Las estrategias de control local son aquellas en las que se ataca a las células tumorales en un área determinada sin afectar al resto, e incluyen la cirugía y la radioterapia. Por otro lado, se encuentran las estrategias de control sistémico, en las que se administran medicamentos por vía oral o endovenosa para que alcancen el torrente sanguíneo y así las células cancerosas en todo el cuerpo; comprenden la quimioterapia, la hormonoterapia y la bioterapia, que abarca la terapia dirigida a blancos moleculares y la inmunoterapia. La quimioterapia fue introducida hace más de medio siglo para el tratamiento de varios tipos de cánceres avanzados o metastásicos. La misma consiste en el uso de fármacos en dosis altas, cercanas a la dosis máxima tolerada por el organismo, siendo administradas en ciclos repetidos, a intervalos de tiempo definidos, determinados principalmente por el período necesario para la recuperación del paciente frente a la toxicidad derivada de la terapia. Así, si bien la acción citotóxica de la quimioterapia permite la destrucción de células tumorales, al ser de administración sistémica, puede también dañar otras células sanas, generando gran cantidad de efectos adversos que afectan drásticamente la calidad de vida del paciente. Los más comunes son: náuseas y vómitos, pérdida de cabello, cambios en la médula ósea, que llevan a inmunodepresión, cambios en la boca y la piel, en la vida sexual y reproductiva, en la memoria y las emociones. Puesto que estos períodos de descanso favorecen el crecimiento de las variantes celulares más malignas y generan resistencia al tratamiento, es posible que el paciente genere incluso nuevas neoplasias. Este conjunto de efectos secundarios requiere la implementación de estudios y tratamientos compensatorios, y en ocasiones la re-internación del paciente. Sumado al alto costo de los fármacos regularmente utilizados, estas necesidades elevan los gastos públicos en salud asociados con la terapia (Dasari & Tchounwou, 2014). Quimioterapia Metronómica Como alternativa a la quimioterapia convencional, hace ya dos décadas, surgió la quimioterapia metronómica (QTM) (Hanahan et al., 2000). Tal estrategia se caracteriza por la administración crónica, a intervalos regulares, de fármacos quimioterapéuticos en dosis significativamente menores a la dosis máxima tolerada, sin periodos de descanso prolongados. Este nuevo enfoque, de que “menos es más, cuando se administra crónicamente”, se opone al paradigma terapéutico del momento y ha resultado ser eficaz y presentar una toxicidad mínima (Kerbel et al., 2002; Malik et al., 2014). Desde su lanzamiento, muchos investigadores contribuyeron con sus investigaciones a nivel experimental para aumentar el conocimiento sobre esta modalidad, tanto para tratamientos individuales como combinados. Hoy en día, se considera una alternativa válida para pacientes que progresaron a varias líneas de quimioterapia y, lo que es más importante, para cáncer pediátrico en países de ingresos bajos y medianos. El efecto terapéutico de la QTM se consigue principalmente mediante su acción antiangiogénica sobre los vasos sanguíneos tumorales, por la cual se inhibe tanto las células endoteliales circulantes (CEC) como las células endoteliales progenitoras (CEP). Otro mecanismo de acción consiste en la restauración de la respuesta inmune antitumoral, mediante la inhibición de las células Treg y las células supresoras mieloides y la estimulación de las células dendríticas. También se han descrito como mecanismos probables, al menos en parte del efecto terapéutico de la QTM: la inhibición de las células madre cancerosas (CSC), la inducción de la latencia tumoral o, incluso, un efecto antitumoral directo sobre las células tumorales (Scharovsky et al., 2020). Reposicionamiento de Fármacos Hace algunos años se comenzó a utilizar una estrategia conocida como “reposicionamiento terapéutico”, que implica el uso de fármacos existentes en aplicaciones terapéuticas diferentes para las cuales fueron diseñados. El reposicionamiento de fármacos en oncología (ReDO, por sus siglas en inglés: Repurposing Drugs in Oncology) se refiere al uso de fármacos originalmente formulados para otras indicaciones que mostraron potencial antitumoral. Los fármacos en reposicionamiento poseen dos ventajas fundamentales frente al desarrollo convencional: por un lado, el conocimiento farmacológico, es decir, ya se conocen las vías de acción, sus efectos secundarios y la farmacodinamia, y por otro, que ya fueron aprobados en humanos (Cragg et al. 2014). Además, los estudios de fase 1 no son obligatorios y el desarrollo clínico puede comenzar directamente con ensayos de fase 2 para evaluar la eficacia del medicamento para el tratamiento del cáncer y su toxicidad, lo que acorta al final, gran cantidad de tiempos y costos. Además, debido a que la mayoría de estos medicamentos ahora tienen equivalentes genéricos, son baratos. Metronomics La QTM suele combinarse con el ReDO. Tal combinación, conocida en inglés como metronomics, permite la generación de tratamientos innovadores dirigidos a los tres compartimentos principales del microambiente tumoral (es decir, la vasculatura tumoral, el sistema inmune y las células tumorales,) con distinta intensidad de una estrategia y otra en el efecto de cada objetivo (la QTM con un efecto principalmente antiangiogénico, y el ReDo, directamente sobre las células tumorales) lo que finalmente conduce al control del cáncer (André et al. 2013). Ambos enfoques comparten varias características que hacen que esta sea una opción atractiva para el tratamiento del cáncer: efecto terapéutico; baja toxicidad, lo que implica una mejor calidad de vida del paciente; menor tiempo, debido al uso de medicamentos conocidos y aprobados; bajo costo, ya que se utilizan medicamentos fuera de patente y no se requieren estudios e internaciones posteriores; por lo tanto y por último, pero no menos importante, la posibilidad de su uso en todos los países, incluso en aquellos con recursos económicos muy bajos. Fármacos Ciclofosfamida La ciclofosfamida (Cy) es un agente alquilante que ha sido ampliamente utilizado para el tratamiento de diferentes tipos de tumores, así como también en enfermedades autoinmunes (Mainetti et al., 2011, 2013; Perroud et al., 2013, 2016, 2016; Rozados et al., 2004). Este fármaco se ha utilizado durante décadas y se sigue utilizando en la quimioterapia convencional en dosis altas, y es uno de los primeros y más estudiados fármacos en la QTM en dosis bajas, como monoterapia o en combinación con otros fármacos, tanto en modelos experimentales como en protocolos clínicos. El principal efecto lo ejerce mediante su acción antiangiogénica. Con respecto al sistema inmune antitumoral, se ha observado un efecto paradójico de Cy sobre el mismo, que depende de la dosis y del esquema de administración: dosis altas de Cy producen reducción de las masas tumorales, pero son inmunosupresoras, y, en consecuencia, favorecen infecciones oportunistas o incluso segundas neoplasias. Por otro lado, la administración de dosis bajas ha demostrado potenciar la respuesta inmune, tanto en animales como en humanos, logrando en algunos casos la eliminación de tumores primarios. (CITA) Anteriormente, se demostró el efecto antitumoral de la QTM utilizando Cy en modelos de un linfoma B y un sarcoma de rata (Rozados et al., 2004), por inhibición de la angiogénesis y por la modulación de la respuesta inmune (Rozados et al., 2010). Resultados similares se obtuvieron en el tratamiento de tumores primarios y metástasis pulmonares en modelos de adenocarcinomas de mama murinos, utilizando Cy como monoterapia (Mainetti et al., 2005), en combinación con Celecoxib (Cel) (Mainetti et al., 2011), o en combinación con Doxorrubicina (Dox) (Mainetti et al., 2013). En todos los casos el tratamiento con ambos fármacos resultó más efectivo que la monoterapia y ambas combinaciones mostraron resultados similares, siendo el tratamiento con Cy + Cel el más efectivo para las metástasis pulmonares (Rico et al., 2014). Metformina La Metformina (Met) es un fármaco de administración oral de primera elección en el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 2 y en la actualidad, tiene muchas otras indicaciones, como por ejemplo el síndrome de ovario poliquístico, la hiperglucemia y el síndrome metabólico. Su mecanismo de acción a nivel molecular es inhibir el complejo I mitocondrial, lo que provoca una disminución de la concentración de ATP en sangre, que hace que se inhiba la gluconeogénesis en el hígado, aumente el consumo de glucosa en el músculo y aumente la sensibilidad a la insulina.(CITAS) Numerosos estudios poblacionales retrospectivos han sugerido que Met administrada en pacientes diabéticos disminuye la incidencia y mortalidad del cáncer. Se ha propuesto que Met es capaz de prevenir la progresión tumoral a través de la regulación del metabolismo tumoral y de la biología de las células madre del cáncer (Gonzalez-Angulo y Meric-Bernstam 2010, Del Barco et al. 2011). Distintos estudios clínicos y preclínicos han señalado el potencial de este fármaco como agente antineoplásico (Gonzalez-Angulo y Meric-Bernstam 2010, Del Barco et al. 2011). Este efecto antineoplásico se daría mediante dos vías de acción posibles: una indirecta (dependiente de insulina) a través de su efecto antidiabético a nivel sistémico, y una vía directa (independiente de insulina) sobre las células de cáncer. A nivel celular, los efectos son explicados por el ingreso de la metformina a través del canal OCT-1 y su transporte hacia la mitocondria, donde inhibe el Complejo I Mitocondrial, disminuyendo la concentración de ATP y activando la AMPK. Esta activación conduce a la fosforilación y activación de TSC2, que inhibe Rheb–GTP, el principal activador del complejo mTORC1, que por lo tanto se mantiene inhibido. Esta inhibición finalmente disminuye la síntesis de proteínas y el crecimiento celular, y aumenta la apoptosis. Además, la activación de AMPK también conduce a la autofagia o apoptosis dependiente de p53. Por otro lado, a nivel sistémico, la metformina reduce los niveles de insulina circulante y del IGF-1 (Factor de Crecimiento Insulínico 1), disminuyendo así la señalización de la tirosina quinasa receptora a objetivos aguas abajo como la vía PI3K (FosfoInositol3Quinasa)-Akt (ProteinQuinasaB)-ComplejomTORC1, cuya actividad suele encontrarse aumentada en algunos tipos de cáncer. Met también puede suprimir la señalización de mTORC1 a través de mecanismos independientes de AMPK, por ejemplo a través de la inducción de la expresión de REDD1, o mediante la inhibición de las GTPasas de Rag. OBJETIVOS E HIPÓTESIS Hipótesis de Trabajo La quimioterapia metronómica con ciclofosfamida y metformina es menos efectiva en los ratones alimentados con una dieta de alto contenido graso, en comparación con los ratones con metabolismo normal, debido a las alteraciones metabólicas desarrolladas en los mismos. Objetivo General Evaluar el efecto de la quimioterapia metronómica en un modelo de tumor de mama murino triple negativo en ratones con alteraciones metabólicas generadas por una dieta de alto contenido graso. Objetivos Específicos ● Evaluar el efecto de la quimioterapia metronómica con ciclofosfamida combinada con metformina en ratones portadores del adenocarcinoma de mama triple negativo M-406, que fueron sometidos previamente a una dieta rica en grasa. ● Evaluar mecanismos de acción involucrados en el efecto de la quimioterapia metronómica: proliferación celular, regulación de la respuesta inmune y angiogénesis. MATERIALES Y MÉTODOS Fármacos ● Ciclofosfamida (Cy): (Filaxis SA, Argentina) en una dosis de 25mg/kg/día. ● Metformina (Met): (clorhidrato de metformina; Sigma-Aldrich) en una dosis de 300mg/kg/día. Los fármacos fueron disueltos en el agua de bebida a la concentración deseada. Se procedió al cambio de las botellas con los fármacos disueltos tres veces por semana, midiendo el volumen restante para estimar la dosis ingerida por animal, y ajustarla. Tumor Se trabajó con el adenocarcinoma de mama M-406. Es un adenocarcinoma semidiferenciado de tipo B, triple negativo, de origen espontáneo que surgió en un ratón de la línea CBi. Se mantiene in vivo por injertos vía intraperitoneal (i.p.) en su huésped singeneico. Cuando el tumor se inocula por vía subcutánea (s.c.) la incidencia tumoral es del 100%. Animales Se utilizaron ratones machos (35 días) de la línea endocriada CBi del bioterio del Instituto de Genética Experimental, Facultad de Ciencias Médicas, U.N.R. Fueron provistos de agua ad libitum y se mantuvieron en ciclos de luz/oscuridad de 12 horas. Todos los experimentos se llevaron a cabo durante la primera mitad del ciclo de luz. Los animales fueron tratados siguiendo los lineamientos éticos institucionales que acuerdan con los del Canadian Council on Animal Care. fueron anestesiados, punción cardiaca y dislocación O La eutanasia de los animales se realizó por sobreexposición a CO2. Dietas ● Dieta HFD (HFD): dieta comercial estándar enriquecida con un 40% de calorías grasas provenientes del primer jugo bovino. cita ● Dieta estándar (DE): dieta comercial estándar. Modelo experimental Parte 1: Inducción de SM Resultados Previos Previamente, nuestro equipo de investigación, junto con el Laboratorio de Fisiología Metabólica (LaFiMe), logró el desarrollo y la caracterización del modelo de alteración metabólica en ratones CBi machos sometidos a una dieta rica en grasas (HFD) durante 16 semanas. Esta dieta consiste en alimento comercial estándar que se enriquece con un 40% de calorías grasas provenientes del primer jugo bovino. En la tabla se detallan todas las características metabólicas y de obesidad central estudiadas, para las cuales se observaron diferencias significativas en este grupo HFD con respecto a uno CONTROL. Los animales se distribuyeron al azar en dos grupos (n=40/ por grupo): el grupo Control, que fue alimentado con una dieta estándar (DE), y el grupo HFD, que recibió una dieta con 40% de calorías de grasa bovina, durante todo el experimento. Luego de 16 semanas se confirmó el desarrollo de las alteraciones metabólicas del SM. COMO? Parte 2: Desafío Tumoral Todos los animales fueron inoculados con trócar, por vía subcutánea en el flanco derecho con M406. Se determinó la evolución del volumen tumoral, y cuando el mismo fue palpable, los animales fueron distribuidos en 8 grupos (n=10/grupo) y comenzaron a recibir el tratamiento. ● Grupo I: alimentado con dieta estándar (DE), testigo sin tratamiento ulterior. ● Grupo II: alimentado con DE, tratado con Cy en el agua de bebida (dosis estimada de 25mg/kg/día). ● Grupo III: alimentado con DE, tratado con Met en el agua de bebida (300mg/kg/día). ● Grupo IV: alimentado con DE, tratado como Grupos II + III. ● Grupo V: alimentado con HFD, testigo sin tratamiento ulterior. ● Grupo VI: alimentado con HFD, tratado con Cy en el agua de bebida (25mg/kg/día). ● Grupo VII: alimentado con HFD, tratado con Met en el agua de bebida (300mg/kg/día). ● Grupo VIII: alimentado con HFD, tratado como Grupos VI + VII. Todos los animales fueron sacrificados por sobre-exposición a CO2 el mismo día en que el primer animal alcanzó el máximo volumen tumoral éticamente permitido. Se realizó la extirpación de los tumores y se los fijó en solución salina formolada (10%), para futuros estudios. Al inicio y al final del tratamiento se extrajeron muestras de sangre para realizar distintas determinaciones serológicas. Crecimiento tumoral Se determinó tres veces por semana el volumen tumoral. Se midió con calibre los diámetros mayor (a) y menor (b) del tumor y se estimó el volumen tumoral con la fórmula (a x b 2) x 0,4. Análisis de toxicidad Con el fin de determinar posibles efectos tóxicos de los tratamientos, se evaluó la evolución del peso de los animales luego de los tratamientos. También se tomaron muestras de sangre de la vena de la cola al comienzo y al final del tratamiento para realizar el recuento de glóbulos blancos en Cámara de Neubauer. Determinaciones bioquímicas Al final del tratamiento se tomaron muestras de sangre de todos los animales, los cuales fueron previamente ayunados por 12 horas. La concentración de glucosa en plasma se determinó utilizando un glucómetro con tiras reactivas Accu-Chek® (Roche). Se utilizaron kits comerciales (Laboratorios Wiener) para determinar los niveles de colesterol y triglicéridos séricos. Histoquímica Se realizó una necropsia de los animales sacrificados, mediante la cual se obtuvieron muestras de tumor. Las mismas fueron fijadas en solución salina formolada (10%) por 24 horas a 4 ºC, incluidas en parafina, y cortadas con micrtótomo de 5 micras de espesor. Los cortes histológicos fueron sometidos a tinciones con Hematoxilina-Eosina (HE) e inmunohistoquímicas (IHC). Análisis de mecanismos de acción Se analizó el infiltrado inflamatorio en los cortes realizados mediante técnicas IHC. Se evaluó la proliferación celular a través de la proporción de células Ki67+, la angiogénesis, mediante el marcador de hipoxia HIF-1α y las distintas poblaciones linfocitarias CD4, CD8 y Foxp3. Se realizó el conteo de células positivas en 30 campos microscópicos consecutivos por corte de tejido tumoral, con un aumento de 1000X. Análisis estadísticos La comparación estadística de los resultados obtenidos en los diferentes grupos experimentales se realizó utilizando tests paramétricos y no paramétricos, dependiendo de la variable a analizar, mediante el software GraphPad Prism® versión 7.00 (GraphPad Software, Inc). Se consideró que las diferencias son estadísticamente significativas a partir de un valor de P<0,05. RESULTADOS Estudio del efecto antitumoral ● Volumen tumoral ● Tiempo de duplicación del volumen tumoral Estudio de la toxicidad ● Peso corporal ● Recuento de glóbulos blancos Estudios bioquímicos ● Glicemia ● Colesterolemia ● Trigliceridemia Estudio de los mecanismos de acción ● Proliferación ● Angiogénesis ● Linfocitos DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES En pacientes con diferente tipo de tumores se ha reportado un número aumentado de Tregs en el sitio del tumor, en los nódulos linfáticos drenantes o en circulación (Zamarron BF, et al, Int J Biol Sci. 2011; 7(5):651-8). En un modelo de linfoma murino se ha demostrado que una dosis baja y única de Cy, que estuvo acompañada de un efecto antimetastásico fue capaz de reducir los niveles de células Tregs (Rico MJ et al, Exp Oncol. 2012; 34:38) (PROYECTO CINTIA) REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Bauer, K. R., Brown, M., Cress, R. D., Parise, C. A., & Caggiano, V. (2007). 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Histological and molecular types of breast cancer: Is there a unifying taxonomy? Nature Reviews https://doi.org/10.1038/nrclinonc.2009.166 Clinical Oncology, 6(12), 718–730. PRODUCCIÓN CIENTÍFICA Los resultados de este Trabajo Final de Grado dieron origen a la siguiente presentación en Congreso Nacional: Lanzillotta, Magdalena; Barranco, María M.; Habib, Martín J.; Sylvestre Begnis, María; Massuh, Greta; Sigal, Nicolás; Del Giúdice, Antonela; Rico, María J.; Rozados, Viviana R.; Scharovsky, O. Graciela; García, Fabiana; Mainetti, Leandro E. “Eficacia de la quimioterapia metronómica con metformina y ciclofosfamida en un modelo de adenocarcinoma de mama murino triple negativo en ratones sometidos a una dieta rica en grasas” XXI Congreso y XXXIX Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario, Rosario, noviembre 2019. ISSN: 2314-1484.
