UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA BÁSICA Y APLICADA CÁTEDRA DE QUÍMICA ORGÁNICA PRACTICA N° 11 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN DOCENTE: Mg. Norma Angélica, Carlos Casas Dr. Cueva Mestanza Ruben GRUPO: MIÉRCOLES 10.00 - 1.20pm INTEGRANTES: ● ● ● ● ● ● ● Chávez Mendoza, Claudia Diana Culque Sopla, Llesy Mallqui Bravo, Isabel Jhosselyn Oliva Lluen, Marcos Brando Peláez Salas, Sergio Segundo Vega Rivas, Mayra Alejandra Zeña Chiara, Elizabeth Nivia Semestre:2019-II Lima - Perú I. OBJETIVOS ● Conocer las partes del equipo de cromatografía líquida de alta resolución(HPLC) , su manejo y su cuidado. ● Conocer los fundamentos de la cromatografía líquida de alta resolución. II. MARCO TEÓRICO Cromatografía La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización de mezclas complejas cuyo objetivo es separar sus diversos componentes. Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) La cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) es un tipo de cromatografía en columna en el que por acción de una bomba, se hace pasar una mezcla de compuestos o analitos en un sistema disolvente comúnmente conocido como fase móvil. La fase móvil pasa a través de una columna cromatográfica, que contiene a la fase estacionaria a un flujo especificado. La separación de los compuestos ocurre en base a la interacción de éstos con la fase móvil y la fase estacionaria. (1) Los componentes básicos de un HPLC son los siguientes: (2) ● Reservorios (dispositivo de mezcla de eluyentes): Constituidos por recipientes inertes como botellas de vidrio y tubos de teflón que evitan la contaminación por descomposición de ciertas muestras. Además estos tubos de teflón están provistos de una forma indispensable para eliminar los gases disueltos y partículas que pudiera tener la fase móvil. ● Bomba: Son necesarios para conseguir y regular la presión, además de la velocidad de flujo de la fase móvil. El sistema de bombeo debe ser capaz de gestionar altas presiones, mantener un flujo libre de flujos y ser químicamente inerte. Tipos de bomba: -Bomba recíproca -Bombas de desplazamiento -Bombas neumáticas -Sistema de bombeo ● Dispositivo de inyección: Son válvulas rotatorias dosificadoras de alta presión de varias vías manuales o automatizadas. Consta de un doble circuito, uno de los cuales está conectado al exterior y el otro al propio sistema, para que puedan intercambiarse de forma rápida y simple entre las dos posiciones; esto permite regular la aplicación de la muestra en volúmenes de 5 a 500 microlitros. ● Columna de HPLC: Contiene a las partículas en fase estacionaria. Son columnas rectas, fabricadas generalmente de acero, pero también se construyen de vidrio y algunos polímeros, usadas con menor frecuencia. La mayoría de ellas tienen una longitud entre 5 y 30 cm, y su diámetro interno varía entre 3 y 10 mm. Los rellenos más comunes son de 5 a 10 μm y se mantienen en el interior del tubo mediante cierres porosos de metal o de vidrio. (3) Parte importante de la columna: -Precolumnas: Como su mismo nombre lo indica, se colocan delante de la columna para eliminar la materia en suspensión y partículas contaminantes del disolvente. ● Detector: Responderá a una propiedad química de la fase móvil. Entre sus características principales tenemos la sensibilidad adecuada, estabilidad, respuesta lineal y tiempo de respuesta corto, respuesta selectiva a algunos analitos, etc. (3) Tipos de detectores: -Detector de absorbancia -Detector de fluorescencia -Detector de índice de refracción -Detector de dispersión de luz -Detector electroquímico -Detector por espectrometría de masas ● Registro: Se registran los cambios de alguna propiedad en función del tiempo. La representación gráfica de este registro se denomina “cromatograma”, donde se observan picos simétricos sobre el eje del tiempo para la identificación cuantitativa (área bajo los picos) y cualitativa (posición en el eje) de los componentes de una muestra. (3) Además de los dispositivos anteriormente mencionados se pueden incorporar en el sistema otros que pueden simplificar el trabajo o bien mejorar algún aspecto concreto de la técnica cromatográfica, como pueden ser: ● ● ● ● Inyectores automáticos. Colectores de fracciones. Hornos termostatizados para las columnas Sistemas de tratamiento de datos. Fundamento La cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) es una técnica de separación, como ya se mencionó, que consiste en una fase estacionaria no polar (columna) y una fase móvil. La fase estacionaria es sílica que se ha tratado con RMe2SiCl (4), la fase móvil actúa como portador de muestra. La muestra en solución es inyectada en la fase móvil. Los componentes de la solución emigran de acuerdo a las interacciones no covalentes de los compuestos con la columna. Estas interacciones químicas van a determinar la separación de los componentes de la muestra. (4) La utilización de distintos detectores depende de la naturaleza de los componentes a determinar. Manual de uso EQUIPO USADO: Sistema HPLC Agilent Technologies 1200 Series Cualesquiera que sean sus necesidades de análisis de cromatografía líquida, encontrará su solución individual dentro de la cartera de Agilent LC. La serie Agilent 1200 es el estándar líder de la industria y ofrece todo lo que necesita para las metodologías analíticas de HPLC. Desde el análisis de rutina hasta la investigación y el desarrollo de nuevos productos en el análisis químico y las industrias farmacéuticas, la serie Agilent 1200 lo ayuda a lograr resultados confiables y sólidos para todas sus aplicaciones. (5) FIG.1 Partes del Sistema HPLC Agilent Technologies 1200 Series FUENTE: https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5989-5200ES.pdf Procedimiento 1. Para preparar la fase móvil, agregar 400 mL de acetonitrilo a aproximadamente 1,5 L de agua ultrapura. 2. Cuidadosamente añadir 2,4 mL de ácido acético glacial a esta solución. 3. Diluir la solución hasta un volumen total de 2.0 L en un matraz aforado con agua ultrapura. La solución resultante debe tener un pH entre 2.8 a 3.2. 4. Ajustar el pH a 4.2 agregando hidróxido de sodio 40%, mediante goteo con el uso de un medidor de pH digital calibrado. Agregue muy lentamente una vez que el pH llegue a 4.0. Esto debe tomar alrededor de 50 gotas para llevar a cabo. 5. Filtrar la fase móvil a través de un filtro de membrana de Nylon 66 de 0.47 μm bajo vacío para desgasificar la solución y eliminar sólidos que podrían conectar la columna cromatográfica. 6. Verificar que el caudal de la fase móvil se establece en 0, 5 mL/min. Esto es lo suficientemente alto como para permitir que todos los picos se encuentre separados y así eluir dentro de 5 min y frenar lo suficiente para permitir la buena resolución. 7. Verificar que la presión mínima y máxima y el caudal se establecen en los valores correctos en el panel frontal del sistema solvente (la bomba). ● Presión mínima: 250 psi (esto es para apagar la bomba, si se produce una fuga). ● Presión máxima: 4.000 psi (esto es para proteger la bomba de última hora, si la forma de un estorbo). 8. Enjuague una jeringa de 100 μl con agua desionizada, y llene la jeringa con la solución. 9. Con el mango del inyector en la posición de carga, lentamente inyectar 100 μl de solución a través del puerto de tabique. 10. Cuando esté listo para iniciar la prueba, gire la manija del inyector a la posición de inyectar (que inyecta la muestra en la fase móvil) y haga clic en "Iniciar prueba" en el programa de recolección de datos de computadora inmediatamente. 11. Retire la jeringa del septo y repita el proceso. III. CONCLUSIÓN ● Se reconoció las partes del equipo de cromatografía líquida de alta resolución(HPLC) , como los reservorios, las bombas, dispositivos de inyección, columna de HPLC, detectores y registro. ● En el manejo del equipo se conoció que se debe verificar que el caudal de la fase móvil se establece en 0, 5 mL/min, para permitir la buena resolución; verificar también que la presión mínima y máxima y el caudal se establecen en los valores correctos en el panel frontal del sistema solvente (la bomba). ● Se conoció el fundamento de cromatografía líquida de alta resolución(HPLC); que consiste en una fase estacionaria no polar (columna) y una fase móvil. La muestra es inyectada en la fase móvil. Los componentes de la solución emigran de acuerdo a las interacciones no covalentes de los compuestos con la columna. Estas interacciones químicas van a determinar la separación de los componentes de la muestra. IV. CUESTIONARIO 1. Definir tiempo de retención, estándar externo, separación isocrática y separación por gradiente. Tiempo de retención En cromatografía líquida y cromatografía de gases, el tiempo de retención, tR, se define como el tiempo transcurrido entre la inyección de la muestra y la aparición de la respuesta máxima. Se puede usar tR como un parámetro para identificación. Los tiempos de retención cromatográficos son característicos de los compuestos que representan, pero no son únicos. (10) Estándar externo Un estándar o patrón externo se prepara por separado de la muestra. Los estándares externos se usan para calibrar instrumentos y procedimientos cuando no hay efectos de interferencia de la matriz de componentes sobre la disolución del analito. Se prepara una serie de tales estándares externos que contienen el analito en concentraciones conocidas. Lo ideal es usar tres o más de las disoluciones en el proceso de calibración. (11) Separación isocrática Cuando, durante toda la separación, se utiliza siempre el mismo solvente, se denomina isocrática, sin embargo es normal realizar un gradiente de composición del solvente a lo largo de la cromatografía para mejorar la eficiencia y acortar la duración del proceso. Estos gradientes de solvente también son realizados en forma automática por las bombas. (12) Separación por gradiente Es un término que se utiliza para describir el proceso mediante el cual se cambia la composición de la fase móvil. Pueden efectuarse de dos maneras: (12) ● A baja presión ● A alta presión 2. ¿ Qué cuidados debe practicarse en la operación de HPLC para favorecer la vida útil de una columna?(6)(7) ● Para el buen funcionamiento y durabilidad de la columna se debe de seguir los siguientes puntos: ● Las muestras tienen que ser previamente filtrado. ● Se debe colocar una pre columna antes de ingresar a la columna esto con el fin de que en estas columnas se queden las todas las partículas o suciedades que pueden dañar nuestra columna. ● Se usan filtros en las botellas. ● Se usa filtro en las bombas. ● Evitar que sufra golpes ya que esto dañará la fase estacionaria. ● Evitar el ingreso de pelusas la presión se elevaría demasiado la presión y produce daños. ● Para guardar de se conserva con un solvente orgánico 3. Menciona ¿Cuál es la influencia de la fase móvil en HPLC y cual en CG? En la cromatografía de líquidos el establecimiento del método tiende a ser más complejo que en cromatografía de gases, debido a que cuando la fase móvil es líquida, los componentes de la muestra interaccionan con la fase estacionaria y la móvil. Por el contrario, en la cromatografía de gases la fase móvil simplemente lleva los componentes de la muestra a través de la fase estacionaria y no contribuye al proceso de separación. Es decir, en cromatografía de gases que la fase móvil sea helio, nitrógeno o hidrógeno no afecta de manera importante la separación. En cambio, los resultados satisfactorios de una separación en cromatografía de reparto dependen en forma determinante de que la fase móvil sea acetonitrilo, hexano o dioxano, por ejemplo. (11) 4. Cual es la diferencia entre fase reversa y fase normal. FASE REVERSA La cromatografía en fase reversa (RPC) consiste en una fase estacionaria apolar (RMe2SiCl) y una fase móvil de polaridad moderada, permitiendo separar moléculas en base a su polaridad. El principio de la cromatografía en fase reversa es semejante al de la cromatografía en capa fina. Sin embargo, aquí la fase estacionaria es de partículas de sílica químicamente modificadas con hidrocarburos saturados, insaturados o aromáticos de diferentes tipos. Esto convierte a la fase estacionaria en una matríz apolar. Por lo tanto, para este tipo de cromatografías se emplean mezclas de solventes polares, tales como agua, acetonitrilo, acetato de etilo, acetona. ( 8)(7) FASE NORMAL La cromatografía en fase normal es una técnica utiliza una fase estacionaria polar (sílice o alúmina) o bien un soporte al que se unen químicamente moléculas orgánicas que presentan grupos funcionales de alta polaridad y una fase móvil apolar, es usada cuando el compuesto de interés es bastante polar.(9)(6) V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Graciani E. Cromatografía líquida de alta eficacia. Grasas y Aceites. 1974;25(3):165–75. 2. Hernández JM. Cromatografía Líquida de Alta Eficacia. Enfermedades Hepáticas Autoinmunes. 2007;7(Unidad de Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad de Granada, Granada):44–52. 3. Skoog D. A. “Principios de análisis instrumental”, 4ta Edición. McGraw Hill. Madrid, España. (2001). 4. Miranda A., Martín O. Cromatografía Líquida (HPLC). Facultad de Ingeniería Química. Universidad Complutense de Madrid. (2013). Disponible en: https://www.ucm.es/data/cont/docs/650-2013-12-02gases%20l%C3%ADquidos.pdf 5. Search | Agilent [Internet]. [citado 12 de noviembre de 2019]. Disponible en: https://www.agilent.com/search/?Ntt=HPLC%201200 6. Skoog D, Holle J, Nieman T. Principios de Análisis Instrumental, 5a Edición. McGraw Hill. Madrid, España. 2001 7. Rubinson K, Rubinson J. Análisis Instrumental. Pearson Educación, S.A. Madrid, España, 2001. 8. McNair H. Basic Gas Chromatography. John Wiley and Sons. Hoboken, USA. 1997 9. Valls O, Del Castillo B. Técnicas instrumentales en farmacia y ciencias de la salud. Primera edición. Lima: Fondo editorial UNIVERSIDAD WIENER; 2009 10. Anmat [Internet]. [citado 13 Noviembre 2019]. Disponible en: http://www.anmat.gov.ar/webanmat/mercosur/ACTA0114/AGREGADO_XVI/2-14/uni_XIV/Anexo_2_Cromatograf%C3%ADa_V7.pdf 11. Skoog D, Holler F, Crouch S, Skoog D. Principios de análisis instrumental. 6e. 6th ed. Mexico, México: Cengage Learning Editores S.A. de C.V.; 2008. 12. Marketizer.com Q. Selección y uso de solventes en cromatografía HPLC | QuimiNet.com [Internet]. Quiminet.com. 2019 [cited 13 November 2019]. Available from: https://www.quiminet.com/articulos/seleccion-y-uso-de- solventes-en-cromatografia-hplc-14775.htm
