Avances en Investigación Agropecuaria ISSN: 0188-7890 [email protected] Universidad de Colima México Reyes, J.; Bon, F.; Moreno, J.; Rubio, C.; Valdivia, A. Adulteración de leche pasteurizada con suero de quesería en la ciudad de Aguascalientes Avances en Investigación Agropecuaria, vol. 11, núm. 2, mayo-agosto, 2007, pp. 23-34 Universidad de Colima Colima, México Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=83711204 Cómo citar el artículo Número completo Más información del artículo Página de la revista en redalyc.org Sistema de Información Científica Red de Revistas Científicas de América Latina, el Caribe, España y Portugal Proyecto académico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto Revista de investigación y difusión científica agropecuaria Adulteración de leche pasteurizada con suero de quesería en la ciudad de Aguascalientes Pasteurized milk adulteration cheese whey in Aguascalientes city, México Reyes, J.;1 Bon, F.;1 Moreno, J.;1 Rubio, C.1 y Valdivia, A.2* 1 Centro de Ciencias Básicas; 2Centro de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Autónoma de Aguascalientes, Av. Universidad No. 940, CP 20100, Aguascalientes, México. *Correspondencia: [email protected] Resumen Abstract La adulteración de la leche con suero de quesería (AL) constituye un fraude al consumidor, competencia desleal al productor y afecta la cadena productiva lechera. La AL es muy difícil de detectar, excepto porque durante el proceso permanece un residuo de caseína denominado glucomacropéptido (GMP). El objetivo de este trabajo fue determinar la AL en leche pasteurizada preferente que se comercializa en la ciudad de Aguascalientes, mediante cuantificación de GMP. Durante el año 2005, mediante un muestreo no estadístico se obtuvieron mensualmente, por triplicado, muestras de ocho marcas de leche, las cuales se analizaron mediante: electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), espectrofotometría de luz visible y cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC); éstas fueron estandarizadas y validadas. Se estableció la incidencia y el porcentaje de adulteración por marca de leche, mes y estación del año. El promedio de muestras positivas fue del 31.6 ± 3.2 % y el volumen promedio de suero añadido en leche fue de 6.5 ± 0.47 %, presentando una alta tendencia estacional, así como diferencias signifi- The milk adulteration with cheese whey (MA) constitutes a consumer fraud, disloyal competency to producer and it affects milk productive chain. The MA is very difficult of detecting, except because during process a residual of casein named glucomacropeptide (GMP) it remains. The objective was to determine MA in preferential pasteurized milk expended in Aguascalientes City, México, by GMP quantification. During 2005, of eight brands, were monthly obtained by triplicates in non statistical sampling. Samples were analyzed by standardized and validated techniques: polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), visible light spectrophotometry and high performance liquid chromatography (HPLC). MA incidence and percentage for milk brand, month and year station were detected; the positive samples average was 31.6 ± 3.2 % and added serum volume average was 6.5 ± 0.47 %, showing seasonal variation and significant differences among brands (P< 0.01). These results suggest that milk is often adulterated with cheese whey in Aguascalientes, México. AVANCES EN INVESTIGACIÓN AGROPECUARIA Reyes etet al. al. 2007. 2007. Rev. AIA. 11(2): 15-21 23-34 García-Romero ISSN 0188789-0 •23 Adulteración de leche pasteurizada con... cativas entre marcas (P< 0.01). Los resultados sugieren que el suero de quesería es utilizado frecuentemente para adulterar la leche que se expende en Aguascalientes. Key words Glucomacropeptide, HPLC, electrophoresis, SDS-PAGE, spectrophotometry. Palabras clave Glucomacropéptido, HPLC, electroforesis, SDS-PAGE, espectrofotometría. Introducción U n producto se considera adulterado cuando su naturaleza o composición no correspondan con lo que se etiqueta, anuncia, expende, suministra, o cuando no corresponda a las especificaciones de su autorización; o haya sufrido tratamiento que disimule su alteración, se encubran defectos en su proceso, o en la calidad sanitaria de las materias primas utilizadas [Ley General de Salud, 1998]. La adulteración pretende obtener mayores rendimientos en el producto final, con la consecuente ganancia económica; actualmente (2005), el litro de suero se comercializa aproximadamente en $0.30, mientras que el litro de leche entera (cruda) tiene un costo de $3.80. Con base en lo anterior, los productos alimenticios son susceptibles de sufrir adulteraciones y la leche no es una excepción. Existen diversas maneras en las que la leche puede ser adulterada, destacándose los siguientes: la adición de agua, la presencia de agentes neutralizantes y la incorporación de suero de quesería. Para la mayoría de estas adulteraciones existen diversos métodos analíticos que permiten conocer la calidad del producto: para detectar la adición de agua existen principalmente tres métodos: a) refractométrico, b) crioscópico y, c) osmométrico. En el caso de agentes neutralizantes, las más sencillas son las pruebas colorimétricas que usan indicadores de pH como el ácido rosálico o rojo de fenol. Pero, específicamente en la adulteración de leche con suero, no existe una técnica oficial que pueda detectarlo (Pinto et al., 1991). Un problema analítico complejo ha sido el desarrollo de un método de análisis capaz de detectar una adulteración de la leche que nos permita identificar con un componente de la propia leche, el cual se ha basado en las propiedades físico-químicas de las proteínas, durante el fenómeno de coagulación ocurrida en el proceso de fabricación de los quesos [Nakano y Ozimek, 1999]. Durante la producción de queso por medio de enzimas del cuajo, se lleva a cabo una ruptura entre los aminoácidos 105 y 106 de la k-caseína. Esta hidrólisis tiene como resultado la separación de dos fracciones, una hidrofilica soluble, compuesta por 24• AVANCES EN INVESTIGACIÓN AGROPECUARIA Reyes et al. 2007. Rev. AIA. 11(2): 23-34 ISSN 0188789-0 Revista de investigación y difusión científica agropecuaria glucomacropéptido (GMP) que contiene los residuos ácidos, el grupo fosfato y las unidades de carbohidratos y la otra fracción de tipo hidrofóbica e insoluble, denominada para k-caseína [Noa et al., 2005]. El GMP está formado por 64 aminoácidos y su peso molecular es de 6800 Dalton, cuando se encuentra libre de carbohidratos [Noa, 2005]. La gran solubilidad del GMP se deriva del considerable número de grupos hidroxilos de los glúcidos y de los hidroxiaminoácidos presentes [Alais, 1997]. Pinto y colaboradores mostraron (1991) que es posible utilizar al GMP como un índice de suero de queserías adicionado en leche. Este GMP puede detectarse de manera cualitativa por medio de la técnica de electroforesis [Pinto, 1991] y de manera cuantitativa por métodos espectrofotométricos [Fukuda et al., 2004; Nakano y Ozimek, 1999] y mediante HPLC [Noa et al., 2005]. En la ciudad de Aguascalientes se distribuyen principalmente ocho marcas de leche pasteurizada y es de suma importancia que se realice un estudio de control de calidad de las mismas; específicamente, por la posible adulteración con suero, ya que esta práctica fraudulenta es la más reciente de las conocidas, por tal motivo, las técnicas de detección son novedosas e implican conocimientos y equipos modernos. En la actualidad no existe un estudio que reporte la incidencia de adulteración, así como el porcentaje con que se falsea la leche pasteurizada con suero. Motivo por el cual, el objetivo de este trabajo fue determinar la adulteración de leche pasteurizada con suero de quesería comercializada —en la ciudad de Aguascalientes— mediante las técnicas siguientes: SDS-PAGE, HPLC y espectrofotometría de luz visible. Materiales y métodos El presente estudio se realizó en la ciudad de Aguascalientes, México. Se colectaron, mediante el método no estadístico de conveniencia [Cochran, 85], ocho de las marcas comerciales más distribuidas; éstas fueron: “San Marcos”, “Lala”, “La Escondida”, “Al día”, “Sello rojo”, “D’lisa”, “Aguascalientes” y “Valley Foods”. Las muestras se obtuvieron en puntos comerciales de venta como tiendas departamentales y de abarrotes. Se compró leche pasteurizada preferente en presentación de un litro, con fecha de caducidad vigente, condiciones de refrigeración usuales y sin detección de alteraciones físicas aparentes (color, aspecto, heterogeneidad del contenido, etcétera) en el transcurso de los tres primeros días de cada mes —del año 2005— las ocho marcas comerciales por triplicado, lo que acumuló un total de 288 muestras colectadas. Éstas fueron conservadas en refrigeración (4°C) y se analizaron en el Laboratorio de Análisis Instrumental de la Universidad Autónoma de Aguascalientes. AVANCES EN INVESTIGACIÓN AGROPECUARIA Reyes et al. 2007. Rev. AIA. 11(2): 23-34 ISSN 0188789-0 •25 Adulteración de leche pasteurizada con... Métodos analíticos Se validaron las técnicas SDS-PAGE, espectrofotometría de luz visible y HPLC para la determinación de GMP, al construir una curva patrón mediante el método de regresión lineal simple a partir de los datos provenientes de leche con diferentes concentraciones de suero puro proveniente de la fabricación de queso en el taller de Lácteos de la UAA. Posteriormente, se realizaron las evaluaciones de las muestras-problema mediante los métodos descritos. Electroforesis para GMP (SDS-PAGE). El procedimiento electroforético fue desarrollado de acuerdo al método de Pinto (1991), el cual, brevemente consistió en precipitar las proteínas de cada una de las muestras de suero por adición de ácido tricloroacético (TCA) al 24%; se agitaron y se dejaron reposar durante un mínimo de dos horas a temperatura ambiente; la mezcla se filtró y en el filtrado se agregó TCA al 50% y se refrigeró durante 24 horas para precipitar el GMP; éste, se recuperó por centrifugación con una fuerza relativa de 9,000 gravedades (xg) durante 10 minutos. El sedimento se lavó con etanol-éter (1:1) y se resuspendió en tris acetato etilendiaminotetracetico (EDTA, pH 8.5) y buffer de azul de Bromofenol en sacarosa al 50%. Estas muestras se corrieron en electroforesis con geles continuos de poliacrilamida al 11% de un tamaño de 10 x 10 cm, a 100 volts y a un tiempo de corrida de 50 minutos. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie y se destiñeron con metanol: ácido acético:agua (40:10:50) para visualizar la banda correspondiente al GMP. Espectrofotometría para GMP. Siguiendo el método descrito por Fukuda et al. [2004], se les añadió TCA al 24% a las muestras. Después de un periodo de reposo, se filtraron y se les añadió ácido fosfotungstico. Se centrifugaron a 3,150 x g y los precipitados, se lavaron con metanol y se añadió ácido acético y ninhidrina. Las muestras se sometieron a baño maría (95ºC) y se enfriaron rápidamente hasta temperatura ambiente (25ºC). Se leyeron a 470 nm en un espectrofotómetro UV-VIS de doble haz, marca GBC, modelo Cintra 10e. HPLC para GMP. Siguiendo la metodología propuesta por Fukuda et al. [2004], se les añadió a las muestras TCA al 24 % en agitación constante. Se reposaron las muestras y se filtraron. El filtrado se inyectó (20 µL) en un equipo Perkín Elmer series 200, con detector de arreglo de diodos, longitud de onda de 210 nm de la banda de luz visible, con una columna de exclusión en gel (4.6 mm por 25 cm). Se utilizó un flujo de 1.0 mL/minuto de la fase móvil (solución estándar de fosfatos; pH de 6.0 y 21.4 g/L de sulfato de sodio). Análisis de datos Los datos fueron capturados en una hoja electrónica de cálculo y se analizaron mediante el módulo de modelos lineares generales del software Statistical Analysis 26• AVANCES EN INVESTIGACIÓN AGROPECUARIA Reyes et al. 2007. Rev. AIA. 11(2): 23-34 ISSN 0188789-0 Revista de investigación y difusión científica agropecuaria System [SAS, 1999] empleando estadística paramétrica para los resultados de espectrofotometría, y de HPLC la cantidad de suero añadido por marca de leche, mes y estación del año; mientras que con los resultados de la técnica de electroforesis se construyó un índice porcentual de adulteración y se consideró también como variable aleatoria paramétrica. Las curvas de calibración se sometieron a un análisis de regresión lineal considerando la concentración de suero de quesería añadido como la variable independiente y la lectura del espectrofotómetro y del cromatógrafo, se consideraron como variable respuesta. Se construyó una recta de regresión en el rango de concentración de GMP esperado y con la fórmula se estimó la concentración de suero presente en las muestras-problema. Resultados La evaluación de la adulteración de la leche con suero de quesería en Aguascalientes mediante la identificación del compuesto glucomacropéptido, derivado de la liberación de una fracción soluble de la caseína durante el proceso de fabricación del queso, mostró que todas las marcas comerciales de leche pasteurizada emplearon este procedimiento, al menos una vez durante el año (Figura 1). Sin embargo, en cinco de las ocho marcas analizadas la adición detectada fue reducida (1.58-4.9 %), mientras que dos de ellas la concentración estimada de suero añadida fue muy alta (19.5 ± 0.85 y 14.2± 0.91) a lo largo del periodo anual observado. Figura 1. Estimación de la concentración de suero de quesería en ocho marcas comerciales de leche pasteurizada expendida en la ciudad de Aguascalientes. Detección por espectrofotometría. Media ± EE. Barras con literales diferentes muestran diferencias estadísticamente significativas a la prueba de rango estudentizado de Tukey (P < 0.05). AVANCES EN INVESTIGACIÓN AGROPECUARIA Reyes et al. 2007. Rev. AIA. 11(2): 23-34 ISSN 0188789-0 •27 Adulteración de leche pasteurizada con... La adulteración de la leche pasteurizada con suero de quesería varió a lo largo de las estaciones del año (Figura 2), encontrando que en invierno la concentración de suero fue más alta que en el verano, ya que septiembre fue el mes con menos adulteración detectada (3.6 ± 1.10 %), mientras que enero mostró la concentración más alta (10.3 ± 1.75 %). Se observó una cantidad de suero añadido muy diverso entre las marcas, lo cual ocasionó un aumento del coeficiente de variación que alcanzó 64.6 % en el año. Figura 2. Estimación de la concentración de suero de quesería en leche pasteurizada expendida en la ciudad de Aguascalientes durante el año 2005. Detección por espectrofotometría. Media ± EE. Barras con literales diferentes muestran diferencias estadísticamente significativas a la prueba de rango estudentizado de Tukey (P < 0.05). Esta variación mensual de la concentración de suero de quesería, añadido a la leche pasteurizada para su adulteración, se redujo cuando se analizó de manera separada la variación estacional entre las marcas de leche (Figura 3). La mayor adulteración se observó en las marcas Cinco y Ocho, las cuales presentaron concentraciones de suero añadido hasta de un 28.2 ± 0.09 %. Las demás marcas presentaron adulteraciones menores, aunque también considerable (0.08 ± 0.04 a 9.9 ± 0.73). 28• AVANCES EN INVESTIGACIÓN AGROPECUARIA Reyes et al. 2007. Rev. AIA. 11(2): 23-34 ISSN 0188789-0 Revista de investigación y difusión científica agropecuaria Figura 3. Estimación mensual de la concentración de suero de quesería en leche pasteurizada de ocho marcas expendidas en la ciudad de Aguascalientes durante el año 2005. Detección por espectrofotometría. Media ± EE. Las técnicas utilizadas para la detección de la adulteración de la leche pasteurizada mediante la adición de suero de quesería tuvieron buena concordancia (92.5%) para descubrir muestras con concentraciones superiores al 2%. Especialmente la espectrofotometría y la cromatografía de líquidos de alta eficiencia fueron útiles al arrojar resultados cuantitativos. No obstante, debido a que el mínimo nivel de sensibilidad (HPLC) se ubicó en 0.75 %, las muestras que estuvieron por debajo de este rango fueron consideradas como sospechosas. En la Figura 4 se observan las curvas de calibración por HPLC y cromatografía; la espectrofotometría tuvo un nivel de detección del 1.85% de suero añadido (Cuadro 1), mientras que la electroforesis detectó muestras con concentraciones iguales o superiores a 5.0 %. La detección de GMP por estas técnicas permitió calcular la cantidad de suero añadido a las diferentes marcas de leche pasteurizada. Se encontró que el promedio general de suero añadido de las ocho marcas de leche pasteurizada —durante el año 2005— fue de 6.5 %, presentando una alta dispersión. La técnica de SDS-PAGE mostró que la cantidad de muestras positivas fue en promedio del 36.5± 41.3 % del total de marcas de leche analizadas. AVANCES EN INVESTIGACIÓN AGROPECUARIA Reyes et al. 2007. Rev. AIA. 11(2): 23-34 ISSN 0188789-0 •29 Adulteración de leche pasteurizada con... Figura 4. Curvas de calibración de la concentración de suero de quesería en leche pasteurizada mediante A: cromatografía de líquidos de alta eficiencia (HPLC) y B: espectrofotometría. Se muestra la recta de regresión (línea sólida) y el intervalo de confianza al 95 % (línea punteada). Condiciones cromatográficas: Inyección de 20 µL, columna de exclusión en gel (4.6 mm por 25 cm), flujo de 1.0 mL/minuto de la fase móvil (solución estándar de fosfatos; pH de 6.0 y 21.4 g/L de sulfato de sodio), detector de arreglo de diodos, longitud de onda de 210 nm de la banda de luz visible. mV = milivolts; UA = Unidades de absorbencia. Cuadro 1. Concentración y frecuencia de suero de quesería (media ± EE) en ocho marcas de leche pasteurizada preferente, estimado por tres técnicas analíticas. 30• AVANCES EN INVESTIGACIÓN AGROPECUARIA Reyes et al. 2007. Rev. AIA. 11(2): 23-34 ISSN 0188789-0 Revista de investigación y difusión científica agropecuaria Discusión En este estudio se detectó que la leche pasteurizada preferente que se comercializa en la ciudad de Aguascalientes contenía una adulteración con suero de quesería en concentración promedio de 5.7 a 6.5 % y con una frecuencia promedio de muestras positivas de 31.6 %. El hecho de que las marcas comerciales de leche preferente pasteurizada, en nuestro conocimiento, es la primera vez que se reporta en esta ciudad; sin embargo, ya ha sido señalada la adulteración en otros lugares. Por ejemplo, Galindo-Amaya et al. [2006] demostraron, mediante electroforesis en gel de poliacrilamida duodecil sulfato de sodio, la contaminación de leche pasteurizada en cinco de diez marcas comerciales de leche expendidas en Maracaibo, Venezuela. También con esta técnica, Alácazar y colaboradores [2000] demostraron que en la ciudad de México se presenta la adulteración de leche con suero de quesería en tres marcas de leche deshidratada, dos de leche entera y una de leche descremada; ellos encontraron una frecuencia de 14.8 % de muestras positivas. Lo anterior sugiere que la adulteración de la leche es una práctica común que ocasiona un fraude al consumidor al no cumplir con las normas oficiales mexicanas (NOM-155-SCFI-2003, apartado 9.1.2) ni con la legislación sanitaria vigente (Ley General de Salud, 2007; artículo 206). Este fraude al consumidor no implica necesariamente un daño a la salud, pues como lo ha señalado por Brody [2000], las proteínas lácteas y sus derivados poseen una gran variedad de funciones biológicas. De tal forma que su consumo parece no poner en riesgo la salud del consumidor; sin embargo, la adquisición y consumo de un producto alimenticio debe ser una decisión soberana del consumidor y no un engaño del fabricante que la etiqueta no ostenta en el contenido real del producto. En el presente estudio se observó que la adulteración de la leche pasteurizada con suero de quesería presenta una tendencia estacional con mayor frecuencia y concentración en la temporada invernal así como los menores valores en el verano. La estacionalidad de la producción lechera ya ha sido demostrada en vacas Holstein [de Vries y Risco, 2005] en un estudio de larga duración (1976-2002), con 1552 hatos mostró que la producción se incrementa en primavera y desciende en el otoño, alcanzando los valores máximos en el verano y los mínimos durante el invierno. Ello permite suponer que en el invierno el precio de la leche se incrementa al disminuir la producción lechera pero se mantiene estable la demanda del alimento. Palacios [2002] ha mostrado que la leche de vaca es un producto inelástico en cuanto a su precio, es decir, que la cantidad demandada no varía claramente en función del incremento o decremento de su precio. Por lo anterior, se puede suponer que en el invierno una alternativa para que la industria lechera pueda mantener fijos sus precios, AVANCES EN INVESTIGACIÓN AGROPECUARIA Reyes et al. 2007. Rev. AIA. 11(2): 23-34 ISSN 0188789-0 •31 Adulteración de leche pasteurizada con... consiste en recurrir a utilizar el suero de quesería para completar los volúmenes de venta y aprovechar la dificultad instrumental que significa la detección de este tipo de adulteración. Las técnicas de espectrofotometría, cromatografía de líquidos y de electroforesis utilizadas en este estudio, para detectar la adulteración de la leche con suero de quesería, se basan en el principio de que la leche recién ordeñada y adecuadamente pasteurizada no contiene el glucomacropéptido y que este compuesto se produce durante el proceso de coagulación de la leche, indispensable para la fabricación del queso [de Vries y Risco, 2005]. Algunos autores [Fukuda et al., 2004; Pinto, 1991; Noa et al., 2005] han mostrado que dichas técnicas instrumentales son apropiadas para detectar el GMP de origen lácteo y, por lo tanto, son útiles para identificar y cuantificar la adulteración de la leche con suero de quesería. En el presente estudio se observó una alta concordancia entre las técnicas (92.5 %), por lo que los resultados de la frecuencia y concentración de suero de quesería añadido a las diferentes marcas pudieran considerarse como indicativos del fraude al consumidor al venderle un preparado de origen lácteo en calidad de leche pura de vaca, como se ostenta en el etiquetado. Aunque el GMP se produce solamente durante el proceso de desnaturalización de la proteína, se ha detectado la cantidad de grasa en la leche [Calvo, 2002] y las condiciones de pasteurización [Silva-Hernández et al., 2004] pueden provocar la aparición de cantidades pequeñas de este compuesto, sin que exista necesariamente una adulteración. Por lo que existe la posibilidad que los valores pequeños (< 1.0 %), detectados en este estudio, en realidad estén reflejando la precisión de los procesos de recepción y pasteurización de la leche; por lo cual sería conveniente analizar la generación, in situ, de GMP durante todo el proceso, desde la ordeña hasta la conservación en el punto de venta. En este estudio, dos marcas comerciales de leche mostraron una concentración muy alta de suero de quesería (> 10%) durante todo el año y no hay duda de su etiquetación fraudulenta; sin embargo, todas las marcas comerciales mostraron valores superiores a los límites de detección al menos en el periodo invernal, por lo que los resultados permiten suponer que la adulteración de la leche con suero de quesería es una práctica común en la agroindustria nacional que distribuye leche pasteurizada en la ciudad de Aguascalientes. Conclusiones Se encontró adulteración en las ocho marcas comerciales de leche pasteurizada preferente, lo que sugiere acción fraudulenta en contra del consumidor. La 32• AVANCES EN INVESTIGACIÓN AGROPECUARIA Reyes et al. 2007. Rev. AIA. 11(2): 23-34 ISSN 0188789-0 Revista de investigación y difusión científica agropecuaria magnitud de tal acción contra el consumidor puede expresarse en términos de que el 31.6 ± 3.2 % de las muestras de leche pasteurizada preferente, comercializadas en la ciudad de Aguascalientes presentaron adulteración con suero de quesería en una concentración promedio de 6.5 ± 0.47 %. Las técnicas de HPLC y electroforesis (SDS-PAGE) utilizadas son útiles para detectar la adulteración de la leche; aunque es más recomendable —para la mayoría de los casos— la espectrofotometría, ya que tiene las ventajas de que es una técnica cuantitativa, rápida (15 horas), sencilla, económica y su nivel de detección es adecuado (1.85 %). Literatura citada Alais, C. 1997. 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