Reacción en cadena de la polimerasa

PCR
Indice
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¿Qué es la PCR?
Orígenes e historia de la PCR
Reactivos necesarios
El ciclo de la PCR
Optimización del proceso
Diseño de cebadores
Aplicaciones
Variantes de la PCR
Análisis de datos de PCR
¿Qué es la PCR?
• Las siglas PCR provienen de “Polymerase Chain
Reaction”. (reaccion en cadena de la polimerasa).
• Es un método para la produccion de un gran numero
de copias de un fragmento de ADN a partir de un
pequeño número de fragmentos originales.
• Toma elementos del proceso de replicación de ADN.
• El proceso podría interpretarse
fotocopiadora molecular.
como
una
Una fotocopiadora molecular
Supongamos que el siguiente texto es una secuencia de ADN:
“En un lugar de la Mancha, de cuyo nombre no quiero acordarme,
no ha mucho tiempo que vivía un hidalgo de los de lanza en
astillero, adarga antigua, rocín flaco y galgo corredor. Una olla de
algo más vaca que carnero, salpicón las más noches, duelos y
quebrantos los sábados, lantejas los viernes, algún palomino de
añadidura los domingos, consumían las tres partes...”
Miguel de Cervantes, 1605
El fragmento del texto que queremos copiar [en rojo], ha de ser
único, de forma que la fotocopiadora (polimerasa) solo copie
dicha porción del texto y no otros productos indeseados.
Antecedentes a la PCR
• Southern Blot (1975) permitía una rudimentaria
visualización del número de copias de genes en los
individuos (RFLPs, inserciones y deleciones).
• Secuenciación de DNA (1978) requería una previa
copia de los genes en plásmidos o vectores.
• La construccion de bibliotecas y el escaneo
constituia un trabajo de meses que eran exclusivas
de cada individuo analizado.
PCR. El descubrimiento
• Ideada por Kary B.
Mullis en 1983.
• Publicada por primera
vez en 1985.
Kary B. Mullis fue galardonado con el premio Nobel de Química en
1993.
¿Invento realmente Mullis la
PCR?
• El principio básico de la replicación de un fragmento
de DNA ya fue descrito por Gobind Khorana en 1971:
• El proceso estaba limitado por la síntesis de los
cebadores y los procesos de purificación de la
polimerasa.
• Mullis desarrolló especificamente el proceso de la
copia.
Reactivos Necesarios
Solución tampón en la que se
desarrollará el proceso.
Fragmento de DNA molde
que queramos copiar.
2 Cebadores flanqueantes de la
zona a copiar.
Nucleótidos (dNTPs).
ADN polimerasa.
ADN Polimerasa
La copia del molde requiere
(separacion de las dos hebras).
desnaturalizacion
DESNATURALIZACION
temperaturas.
de
adn
requiere
Polimerasas normales
temperaturas.
son
destruidas
por
altas
altas
Solucion: Es necesaria una polimerasa que sea
estable a altas temperaturas.
Taq polimerasa
Propiedades:
- No se destruye a
94ºC.
- Temperatura optima a
72ºC.
Desventajas:
- No tiene capacidad
autocorrectora.
- Tasa de error: 1 base/104
Thermus aquaticus
El Proceso de la PCR
Una PCR consiste en la repetición de 30 a 35 ciclos cada uno de
los cuales se divide en las siguientes 3 fases:
Desnaturalización: separación de las 2 hebras.
Alineación: unión de los cebadores con la hebra
desnaturalizada.
Temperatura
Polimerización: síntesis de una copia de la hebra original de
DNA por la polimerasa.
100
50
Desnaturalización
94 oC
Alineación
50 oC
0
Tiempo
Desnaturalización
Polimerización
72 oC
94 oC
¿Cuantas copias?
Es en el tercer ciclo cuando tenemos amplificado
nuestro fragmento.
¿Cuantas copias?
En teoria, en cada ciclo se dobla el número de
fragmentos. En la practica la eficiencia nunca es del
100%.
Con 30 ciclos tendremos
teoricamente 109 copias de
nuestro fragmento (230) y 60
copias de otros fragmentos.
¿Cuantos ciclos?
• Por encima de 35 ciclos el copiado no mejora
sustancialmente.
• El proceso acaba cuando:
– Se agotan los reactivos.
– Los productos realinean.
– La polimerasa se dañe.
– Acumulación de productos
indeseados.
¿Ha funcionado?
Esto se puede verificar por
electroforesis:
¿se ha formado un producto?
¿Tiene el producto el tamaño
esperado?
¿Se observa más de un
producto/ banda?
Optimización del proceso
Optimización del proceso
Templado de la temperatura de los cebadores.
Cada
cebador
tiene
una
temperatura optima de unión al
molde de acuerdo a su secuencia.
La correcta temperatura se
determina analizando varias
temperaturas
Optimización del proceso
Efecto de la concentración de Mg2+ en la reacción.
Resultado:
No hay
copias
Banda
correcta
Aparición de
bandas
inespecíficas
Diseño de los Cebadores
Longitud aproximada de 20 bases.
El contenido de nucleotidos G C ha de estar
comprendido entre un 45-55%.
No deberá OCURRIR hibridación de cada cebador
CONSIGO MISMO (Horquillas) o entre Los 2
CEBADORes (dimeros).
Deben ser específicos por el gen que se trata de copiar.
Aplicaciones
• Analisis de expresión génica.
• Clonación y Genotipado.
• Detección de mutaciones y diagnóstico de
enfermedades genéticas.
• Inducción de mutaciones in vitro.
• Identificación de polimorfismos moleculares (huella
genética).
• Obtención de ADN para secuenciación.
• Amplificación indiscriminada de ADN.
• Diagnostico prenatal.
• Detección de patógenos
• Estudios de evolución.
Variantes de la PCR
La PCR se realiza en aparatos conocidos
como termocicladores.
•PCR multiple (multiplex PCR)
•PCR anidada (nested PCR)
•PCR in situ
•PCR inversa
•RT- PCR
•PCR en tiempo real (Q-PCR)
PCR multiplex
Permite copiar alrededor de 15
fragmentos distintos a la vez en
una sola reacción.
Los cebadores de los distintos
moldes a copiar deben tener una
temperatura
de
alineamiento
similar.
PCR anidada
Se copia un fragmento y a continuación se usa este como
molde para una segunda reacción, la cual usa cebadores
más cercanos entre si.
Aumentan la sensibilidad
y la especificidad.
PCR in situ
Preparaciones fijas sobre un portaobjetos.
PCR en secciones histológicas donde los productos
generados se visualizan en el sitio de copiado.
Característica de detección de pequeñas zonas de
genoma viral.
RT PCR
El molde inicial no
es ADN sino ARN.
Por transcripción
inversa se genera
un ADN
denominado
cADN, que se
copia después por
PCR.
Limitaciones de las anteriores
técnicas
La detección se produce al final de la reacción.
La visualización de ADN se lleva a cabo en gel tras su
tinción.
La discriminación entre productos se basa en su
tamaño.
La cuantificación se basa en la intensidad de la tinción
y es imprecisa.
PCR cuantitativa o en
tiempo real
PCR cuantitativa
Los fragmentos copiados incorporan durante la reacción
un marcador fluorescente que pérmite controlar tras
cada ciclo la cantidad de material copiado.
No se tiene que utilizar un gel al final del proceso,.
Ventajas y Desventajas PCR
cuantitativa
Ventajas
• Reducida probabilidad de aparición de
productos no deseados.
• Control de lo que se copia ciclo a ciclo.
Desventajas
• Elevado Coste del equipo
• Requiere un mayor conocimiento técnico.
PCR Cuantitativa
Existen 3 formatos genéricos de detección:
1. Agentes de unión a ADN
– (SYBR Green)
2. Sondas de hidrólisis
– (TaqMan)
3. Sondas de hibridación
– (Beacons, Scorpions)
Sybr Green
Taqman
Beacons
Scorpions
Análisis de datos de Q-PCR
Una vez realizada la PCR se obtienen unos valores de
intensidad fluorescente. La linea umbral es aquella a
partir de la cual la fluorescencia se considera por
encima del ruido y el ciclo en el que se alcanza dicho
valor se llama Ct (Cycle Threshold) escala logaritmica.
Análisis de datos de Q-PCR
• Cuando se trabaja con sondas Taqman se considera
una eficiencia del 100%.
• Los valores de Ct se normalizan respecto a los
genes de referencia.
• Se realizará la estadística.
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