Proyecto del Genoma Humano Origen -­‐ 1990: USA proyectos nac de salud+Dept de E-­‐USA+cienCficos para amplificar la secuencia de 3mM de bpADN. -­‐ 20-­‐30 mil genes en 23 pares de cromosomas. Beneficios -­‐ Seq de 23 pares cromosomas -­‐ Mejoramiento de tecnicas moleculares -­‐ Interdisciplinalidad -­‐ -­‐ Origen y funcinibilidad de genes relacionados con enfermedades Abarato costo de bio mol. -­‐ Desarrollo de la bioeCca y ciencias sociales. DNA recombinante, marcadores moleculares y genomica DNA recombinante: es una nueva secuencia de DNA formada por la combinacion de dos moleculas de DNA no homologas. A su vez, conCenen secuencias derivadas de mas de una fuente. Marcadores moleculares: Estos son herramientas que nos permiten estudiar y entender desde diferentes perspecCvas con enfoques novedosos y que complementan las herramientas tradicionales. La selección de los marcadores apropiados para un estudio implica, conocer el alcance de las técnicas, los métodos análisis y tener siempre en cuenta aspectos prácCcos como las estandarizaciones y los costos de dichas técnicas. • Qué es un alelo? Es una de las formas variantes (mutantes) de un gen en un locus (lugar donde se encuentra un gen en un cromosoma). • Qué es polimorfismo? Polimorfismo genéCco son los múlCples alelos de un gen entre una población. “The ocurrence in a populaCon of several phenotypic forms associated with alleles of one gene or homologs of one chromosome” Griffith et al., 2012 Un gen es polimórfico cuando la frecuencia alélica del alelo más común es menor de 0.95/0.99. Con una proporción mayor de 10% ó 1% (0.95/0.99) de heterogeneidad para “determinado alelo” entonces existen desviaciones del principio de equilibrio de Hardy-­‐Weinberg. EXTRACCION DE ADN Ø Es la primera etapa con que inician toda técnica molecular o el marcador molecular elegido: Ø Extracción y Purificación del ADN. v Extracción Tradicional o Común. Consiste en la uClización de compuestos orgánicos, con la centrifugación se obCenen dos fases donde el ADN se queda en la fase acuosa y siendo precipitado por etanol. En general estas técnicas tradicionales constan de 5 pasos: -­‐ Homogenización del tejido. -­‐ Lisis celular. -­‐ Separación de proteínas y lípidos. -­‐ Precipitación. -­‐ Redisolución del ADN. v Extracción por combos o Kit comerciales. Consiste en la uClización de matrices inorgánicas compactas con cargas posiCvas capaces de retener microgramos de ADN separándolos del resto de las biomoléculas, permiCendo así obtener un extracto libre de inhibidores. EXTRACCION DE ADN q Para una buena extracción de ADN genómico, es sumamente importante tener siempre en cuenta: Ø Preservación de la muestra para conservar el ADN, dependerá del Cpo de tejido a guardar. Ø CanCdad de tejido a uClizarse en la extracción ya sea el tradicional o el comercial (combo). Ø En el caso del tradicional, las canCdades y Cempos son muy importantes y deben ser exactas. Ø En el caso del comercial, debe seguir al pie de la letra todo lo que indica el protocolo, con el Cempo ambos puede variar o eliminar pasos, pero de tener problemas vuelva a usarlo ELECTROFORESIS Ø Es una de las metodología más uClizadas en los laboratorios en todo lo relacionado con el trabajo de ácidos nucleicos. Ø Una de las herramientas más importantes en el desarrollo de técnicas del ADN recombinante o ingeniería genéCca. Esta invención correspondo al bioquímico Vin Thorne en los años 60, basado en la idea de caracterizar las disCntas formas del ADN de partculas purificadas de un polyomavirus. Ø Esta puede llevarse a cabo uClizando agarosa o acrilamida. v El gel de agarosa es un método estándar que se uCliza para separar y purificar fragmentos de ADN, se corre de forma horizontal. v El gel de acrilamida es un método un poco mas complejo y permite la separación de moléculas que difieren en un solo par de bases, se corre de forma verCcal. ELECTROFORESIS Gel de poliacrilamida (verCcal) Poco usado, pero es importante tener los platos verCcales correctamente lavados, limpios y secos. Gel de agarosa (horizontal) Más uClizado por su facilidad de uso, sus cámaras y peines son lavados con agua y jabón, se vierten con mucha más facilidad y no se corre el riego de crear burbujas. ELECTROFORESIS En caso de alguna falla o error: Ø Verificar los cálculos y la concentración que será preparado el gel. Ø Verificar el buffer que esta uClizando; además de la agarosa o poliacrilamida que esta uClizando. Ø Verifique las temperaturas que uClizo para diluir la garosa, recuerde que solo calentando el buffer puede llegar a diluir la agarosa. Recuerde agregar el bromuro de eCdio o el compuesto que permiCrá observar con luz UV la corrida de ADN Ø Verificar el molde y la cámara de electroforesis, además de la fuente de poder que debe correr generalmente a 93 volCos por 30 segundos. REACCION EN CADENAS DE LA POLIMERASA q PCR es una de las técnicas más importantes y revolucionaria en la biología molecular, esta fue descubierta en 1983 por Karl Mullis. Este método permite obtener o amplificar de forma in vitro millones de copias de un fragmento de ADN a parCr de una sola molécula. q La PCR para llevarla a cabo, necesita una serie de reacCvos los cuales reaccionan en forma conjunta; estos son: buffer o amorCguador, magnesio (MgCl2), nucleóCdos (dNTP), dos cebadores (forward & reverse), taq polimerasa, agua y el ADN genómico obtenido en la extracción. Todos estos reacCvos deben ir en concentraciones y canCdades exactas para que la reacción sea posible. q Completa la reacción de PCR se lleva a un termociclador donde hay tres etapas importantes, estas son: desnaturalización, alineamiento o hibridación y elongación. REACCION EN CADENAS DE LA POLIMERASA La PCR, conlleva una serie de cuidados y precisión que debe tener al momento de preparar la misma. v La canCdad de Mg2+ ya que este ayuda en la unión de los cebadores producida por la Taq. v Las temperaturas de los cebadores son de suma importancia al realizar la PCR. v La concentración del ADN genómico. REACCION EN CADENAS DE LA POLIMERASA v Que hacer cuando una PCR falla? Al probar las condiciones estándares y obCene doble bandas o no hay ningún resultado, existen algunos posibilidades que podría ser y debería revisarse: ü Calidad de ADN extraído. ü Concentración de cloruro de magnesio (MgCl2). ü Concentración de los nucleóCdos (dNTPs). ü CanCdad del buffer y agregar adiCvos. ü Revisar los oligonucleóCdos (cebadores). REACCION EN CADENAS DE LA POLIMERASA q Concentración de cloruro de magnesio (MgCl2). Son de suma importancia los iones de magnesio para el adecuado funcionamiento de la reacción, la más común es de 1.5mM de magnesio, pero se pueden realizar pruebas en un rango de 1 a 4mM, este se denomina !tración de magnesio. q Recordar que demasiado magnesio presente inhibe a la polimerasa, mientras que poco magnesio puede llegar a generar productos inespecíficos dentro de la PCR. REACCION EN CADENAS DE LA POLIMERASA Es importante tener en cuenta las fases dentro del termociclador, estas son: Ø Desnaturalización, donde las hebras del ADN extraído se van a abrir a una temperatura alta por una fracción de segundos, estas oscilan entre 94° a 96°C. Ø Alineamiento o Hibridación, esta fase es sumamente importante ya que es donde los cebadores se unirán a las hebras del ADN. Las temperaturas aquí van a variar entre 50° hasta 65°C. Ø Elongación, esta fase va a permiCr que los nucleóCdos sueltos elongen o alargen las hebras del ADN. Esta fase ocurre a los 72°C. SECUENCIACION Ø La técnica de secuenciación, se basa en la interrupción controlada de la replicación del ADN in vitro. Ø Se realiza una reacción de secuenciación, método muy parecida a la PCR convencional, con la diferencia de que solo se uCliza un cebador y se le agregan dideoxinucleoCdos que carecen del grupo hidroxilo en el extremo 3´y están marcados con radiacCvidad o con fluorocromos-­‐ SECUENCIACION Para solucionar problemas en la secuenciación, debe tener en cuenta: q Los combos o kit de secuenciación como vienen adheridos los dinucleoCdos marcados con fluorocromos, la solución del combo viene con un color que reacciona contra la luz, por lo tanto se debe verificar la coloración del reacCvo. q Verificar la concentración, canCdad de sus cebadores y que estos no estén contaminados. q Verificar que el producto obtenido de la PCR sea bueno, tenga una concentración adecuada y sobretodo este limpio y no con impurezas. POLIMORFISMO DE LONGITUD DE LOS FRAGMENTOS DE RESTRICCION v Los RFLPs por sus siglas en ingles (Restric!on Fragment Length Polymorphism), ha sido una técnica usada desde los años 60 hasta el momento en los programas de invesCgaciones. v Esta técnica permite disCnguir organismos entre si, mediante análisis de los patrones que se derivan al romper el ADN en pequeños fragmentos. POLIMORFISMO DE LONGITUD DE LOS FRAGMENTOS DE RESTRICCION Que hacer si un RFLP falla: Ø Tener un producto mayor de PCR de la región elegida. Ø Verificar las concentraciones de la enzima. Ø Verificar el buffer de la enzima sus canCdades. POLIMORFISMO DE LONGITUD DE LOS FRAGMENTOS DE RESTRICCION Existen muchos Cpos de enzimas de restricción, encontrando disCntos Cpos de cortes en cada una. v Extremos cohesivos, es decir que cortan en forma escalonada. v Extremos romos, es decir que cortan en forma verCcal. Rflp Polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción Definición: variaciones detectables en la longitud de los fragmentos generados al cortar ADN con una enzima de restricción. Causa: cambio en la secuencia del siCo de restricción. Aloenzimas Qué son?: son múlCples versiones alélicas de una única/específica enzima y pueden ser diferenciadas una de otra por electroforesis (migración de las proteínas por medio de un campo eléctrico). Ejemplo. Allozyme Electrophoresis and PopulaCon Structure in the Snowy Campion, Silene la,folia ssp.alba Aloenzimas cont. Proteína es monomérica (constan de una sola cadena polipeptdica, como la mioglobina), entonces una unidad heterocigota consta de 2 bandas (una de cada alloenzima) Proteína es oligomérica (constan de varias cadena polipeptdicas, como la hemoglobina), entonces una unidad heterocigota consta de 3 bandas (una de cada alloenzima+una banda entre ellas). Aloenzimas cont. Por qué se uLlizan como marcadores de diversidad? porque la presencia de variaciones de la misma aloenzima en una población indican diferentes alternaCvas alélicas presentes en el mismo locus. Pro: -­‐ Su funcionamiento cumple con los mecanismos de codominancia Mendeliana (los efectos fenotpicos de un alelo se encuntra totalmente y simultaneamente expresados en los heterocigotos). -­‐ Bajo costo. -­‐ Polimorfismo mulCple en un loci puede ser detectado. -­‐ La tasa de mutación detectada es aprox. de 10-­‐6. Limitaciones: -­‐ variaciones limitadas en comparación de la variación total del DNA. -­‐ otras variaciones limitadas debido a (pH, T) o exageradas debido (concentración en los tejidos). -­‐ única idenCficación de subsCtuciones de los aa que cambian su densidad eléctrica. Además que subsCtuciones de los aa pueden ser producto de selección natural. ConecLvidad entre áreas costero‑marinas protegidas: ¿Se requieren corredores biológicos? Las aloenzimas es adecuada para determinar aspectos de conecCvidad genéCca entre poblaciones de corales y proporciona un gran poder de resolución a nivel de especies y géneros relacionados (Stoddart 1984, Ayre et al. 1991, Stobart and Benzie 1994, Benzie et al. 1995, Amaral et al. 1997; Maté 2001). D Mar Caribe RVS Isla d e Ta b og a B C Futura Prop u e sta p a ra RVS A rc h ip ié la g o d e La s Pe rla s PN Ma rino G olfo d e C hiriq uí Golfo Panamá D 8° I. C éb a c o I. Fra ile s P N C oiba PN C e rro Ho ya Océano Pacífico Isla s Se c a s I. Pa rid a RVS Isla Ig ua na Golfo de Chiriquí 120 Km I. Sec a Is. La d rone s Isla s C ontrera s C B I. Silva d e Afue ra 8°40' Sa b og a I. I. Uva I. C a na l d e Afuera I. Mo g o Mog o H2. Las barreras |sicas como el afloramiento en el Golfo de Panamá y las corrientes pueden bloquear o impedir la dispersión y el flujo genéCco entre áreas protegidas. I. Ta bog uilla Ba hía d e Pa na m á I. Ta bog a 8°45’ I. Ura bá I. Pe d ro G o nzá le z Isla de C oib a I. D e l Re y 8°20' I. G a le ra I. Sa n J o sé I. O toque I. Boná 5 Km 79°40’ Ba hía Da m a s I. Montuosa 5 Km 79° J ic a rón 82° I. J ic a rita H3. Los eventos catastróficos de El Niño‑Oscilación Sur (ENOS), causan mortalidades en los corales y reducen la diversidad genéCca dentro de las áreas protegidas.
