Fase Enlazada Diferentes tipos: – C18 - C8 – CN – Amide –PFP.... Diferentes enlaces: – Trifuncional – Monofuncional – Embeeded Group Diferentes densidades ©2012 Waters Corporation 21 Evolución del tamaño de partícula 70’s (inicio) recubrimiento pelicular no-poroso de 40µm 100 – 500 psi 1.000 platos/metro Columnas de 1m 70’s (finales) Partículas Irregulares micro-porosas de 10µm 1000 – 2500 psi 25.000 platos/metro Columnas de 3,9 x 300 mm 10 min 80’s hasta hoy Partículas esféricas micro-porosas de 3.5 – 5 µm 1500 – 4000 psi 50.000 – 80.000 platos/metro Columnas de 3,9 x 150 – 300 mm 10 min 10 min ©2012 Waters Corporation 22 Fases Híbridas ©2012 Waters Corporation 23 Evolución de las partículas ©2012 Waters Corporation 24 End Capping CH3 Cl Si CH3 CH3 Si CH3 CH3 ©2012 Waters Corporation CH3 Es un proceso que implica una segunda derivatización con trimetilclorosilano ( C1), que bloquea los grupos hidroxilo libres, haciéndolos inaccesibles a nuestros analitos Primera Derivatización C18 Quedan ~ 50% OH Segunda Derivatización C1 Quedan ~ 40% OH. 25 Waters Selectivity Chart ©2012 Waters Corporation 26 ©2012 Waters Corporation 27 ©2012 Waters Corporation 28 ©2012 Waters Corporation 29 Rellenos columnas BEH UPLC® BEH C18 – Relleno C18 trifuncional – Primera elección en columna UPLC – Máxima eficacia y óptima simetría de picos BEH C8 – Relleno C8 trifuncional – Nuevo proceso de endcapping – El mayor rango de pH BEH Shield RP18 – Relleno monofuncional – Grupo polar embebido – Selectividad alternativa BEH Phenyl – Relleno Fenilo trifuncional – Combinación única de partícula y ligando – Amplio rango pH BEH HILIC – Partícula BEH sin funcionalizar – Relleno para bases muy polares BEH Amide – Relleno trifuncional con grupo amida – Modo Hilic para ácidos muy polares y azúcares ©2012 Waters Corporation Tipo Ligando Densidad Ligando Carga Carbono Endcapping Rango pH Trifuncional C18 3.1 µmol/m2 18% Proprietary 1-12 Trifuncional C8 3.2 µmol/m2 13% Proprietary 1-12 Monofuncional Grupo Polar Embebido 3.3 µmol/m2 17% TMS 2-11 Trifuncional C6 Fenil 3.0 µmol/m2 15% Proprietary 1-12 Sin ligando --- --- --- 1-8 Trifuncional Amide 7.5 µmol/m2 12% None 2-11 30 Rellenos columnas HSS UPLC® HSS T3 – Tecnología T3 de enlazado y endcapping – Mayor retención para compuestos polares HSS C18 – Alta cobertura, relleno C18 trifuncional – Universal, relleno C18 de altas prestaciones – Proceso de endcapping patentado para picos óptimos HSS C18 SB – SB: Selectividad para Bases – Sin encapping: selectividades silanólicas alternativas – Diseñada para desarrollo de métodos Densidad Ligando Carga Carbono Endcapping Rango pH Trifuncional C18 1.6 µmol/m2 11% Proprietary 2-8 Trifuncional C18 3.2 µmol/m2 15% Proprietary 1-8 Trifuncional C18 1.6 µmol/m2 8% None 2-8 – Estable, compatible con RP & NP, química CN reproducible Trifuncional Propilfluorofenil 3.3 µmol/m2 7.5% None 2-8 – Baja hidrofobicidad y selectividad única comparada con ligando C18 Monofuncional Diisopropil Ciano 2.0 µmol/m2 5.5% None 2-8 HSS PFP – Selectividad excepcional para isómeros posicionales, compuestos halogenados y compuestos polares HSS CN ©2012 Waters Corporation Tipo Ligando 31 Rellenos columnas CSH UPLC® CSH C18 — Media/alta cobertura trifuncional C18 — Superior forma pico para productos básicos en fases móviles de baja fuerza iónica — Menor retención para bases (vs. BEH C18) CSH PFP Fluorofenil — Forma pico excepcional y baja retención para bases con grandes diferencias en selectividad — Elevada reproducbilidad CSH Fenil Hexil — Excepcional forma de pico para compuestos básicos — Selectividad complementaria para compuestos aromáticos ©2012 Waters Corporation Tipo Ligando Densidad Ligando Carga Carbono Endcapping Rango pH Trifuncional C18 2.3 µmol/m2 15% Proprietary 1-11 Trifuncional Propilfluorofenil 2.3 µmol/m2 10% None 1-8 Trifuncional C6 Fenil 2.3 µmol/m2 14% Proprietary 1-11 32 UPLC Columns calculator ©2012 Waters Corporation 33 Condiciones Cromatográficas HPLC Condiciones Cromatográficas HPLC : Columna: XTerra® MS C18 4,6 x 150 mm, 5 µm Fase Móvil A: 0,1% TFA en agua Fase Móvil B: 0,08% TFA en acetonitrilo Caudal: 1,0 mL/min Perfil Gradiente: Tiempo Perfil (min) %A %B curva 0,0 92 8 2,0 92 8 6 32,0 50 50 7 35,0 10 90 6 36,0 92 8 6 41,0 92 8 6 Vol. inyección: 10 µL Conc. muestra: 100 µg/mL Temperatura: 40 oC Detección: UV @ 330 nm Velocidad adquisición datos: 5 pts/sec Constante Tiempo: 1,0 Instrumento: Módulo Separación Alliance® 2695 con 2996 PDA ©2012 Waters Corporation 34 Método HPLC original: Derivados de ácido cafeico en Echinacea Purpurea 5 0.40 1 2 3 AU 0.30 Pc = 94 0.20 4 0.10 0.00 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 Minutos Tiempo Retención Resolución USP Nombre 1. Acido caftárico 5,71 2. Acido clorogénico 7,07 4,20 3. Cinarina 13,96 21,19 4. Equinacosida 16,54 10,16 5. Acido cicoico 20,32 17,14 ©2012 Waters Corporation 35 Opción 1: Escalado geométrico del gradiente a la misma velocidad lineal de HPLC HPLC Pc = 94 0.40 AU 0.30 Name caftaric acid chlorogenic acid cynarin echinacoside cichoic acid 0.20 0.10 Retention Time 5.71 7.07 13.96 16.54 20.32 USP Resolution 4.20 21.19 10.16 17.14 0.00 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 Minutes 25.00 30.00 35.00 UPLC™ 0.40 Name caftaric acid chlorogenic acid cynarin echinacoside cichoric acid Pc = 99 AU 0.30 0.20 0.10 Retention USP Time Resolution 1.99 2.38 4.85 5.93 7.11 3.97 25.00 15.09 19.62 0.00 0.00 2.00 ©2012 Waters Corporation 4.00 6.00 Minutos 8.00 10.00 12.00 36 Opción 2: Escalado geométrico del gradiente a velocidad lineal de UPLC HPLC Pc = 94 0.40 Retention USP Time Resolution Name caftaric acid 5.71 chlorogenic acid 7.07 cynarin 13.96 echinacoside 16.54 cichoic acid 20.32 AU 0.30 0.20 0.10 4.20 21.19 10.16 17.14 0.00 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 Minutos 25.00 30.00 UPLC™ Pc = 85 0.40 AU 0.30 0.20 0.10 35.00 Name caftaric acid chlorogenic acid cynarin echinacoside cichoric acid Retention Time 0.71 0.87 1.72 2.06 2.44 USP Resolution 3.96 22.12 11.40 14.28 0.00 0.00 0.50 ©2012 Waters Corporation 1.00 1.50 2.00 Minutos 2.50 3.00 3.50 4.00 37