Dra. Eldy Valdivia TEMA NO 5 DETERMINACIÓN CUANTITATIVA 1. CONCEPTOS GENERALES Todo medicamento debe estar elaborado bajo una forma farmacéutica, concebida o seleccionada para facilitar su administración. Toda forma farmacéutica es portadora, desde luego, de uno o más principios activos, es decir, de la o las drogas que poseen determinadas propiedades terapéuticas o farmacológicas, que deben producir el efecto preventivo o curativo que el médico persigue con su prescripción. Pero ese efecto estará a su vez, directamente relacionado con la cantidad administrada del principio activo, o mejor, con la dosis instituida por el facultativo, administrada en forma y tiempo adecuados. Cuando la función primordial del farmacéutico era la preparación personal de la fórmula prescripta, la correcta dosificación de los medicamentos era una de sus mayores responsabilidades, tanto en esa operación como en el control de las hiper o hipodosis requeridas en algunos casos. Pero hoy, durante la moderna etapa de elaboración industrial, en cantidades masivas, de las formas farmacéuticas, las operaciones de mezclar y fraccionar las formulaciones complejas o simples, es labor que se realiza en máquinas y aparatos especiales, casi siempre automáticos y cuyo grado de perfección es siempre limitado. Este cambio operativo, divide ahora la responsabilidad de una buena dosificación en los miles de unidades, entre los profesionales o técnicos que pesan o miden las cantidades necesarias de cada ingredientes, los encargados de vigilar el funcionamiento de las máquinas y el personal del laboratorio de control que supervisa la corrección de las operaciones ejecutadas automáticamente. Se trata de todo un sistema analítico cuyo objetivo es establecer la exN.:titud y uniformidad de contenido, conceptos que se estudiarán en el Capítulo siguiente. lle ahí el origen de este nuevo problema que debe encarar y resolver el farmacéutico analista, antes de aprobar y autorizar la distribución de un lote determinado. La importancia de este problema cuantitativo radica no sólo en el hecho que los medicamentos modernos se elaboran industrialmente, sino en la elevada potencia de la mayoría de las drogas de uso actual y en el estrecho intervalo que separa generalmente su dosis terapéutica de sus dosis tóxica. 57 Dra. Eldy Valdivia V. Todo este juego de valores tan variables impone, pues, como control fundamental de la calidad, la determinación en términos estrictos de la concentración real de cada principio activo en cada unidad elaborada. Todo este juego de valores tan variables impone, pues, como control fundamental de la calidad, la determinación en términos estrictos de la concentración real de cada principio activo en cada unidad elaborada- Se verá 11Ego cómo esta labor está sembrada, en todas las etapas, de sorpresas y peligros que se complementan para dar resultados inesperados. Dice Stainier al respecto, frente al problema de valorar los principios activos de una especialidad: "En este momento, qué de factores a considerar, qué de escollos a evitar: elección de los disolventes, grado de pureza de los mismos, reacción del medio que permita la separación de los elementos sin riesgo de alteración por hidrólisis o por oxidación, evitar los arrastres por precipitación, por adsorción, las pérdidas por volatilización, sublimación, formación de complejos, bloqueo o doble solubilidad". 2. PRINCIPIO ACTIVO: CONCENTRACIÓN, POTENCIA, DOSIFICACIÓN Las fórmulas de los medicamentos son complejas en su mayoría, no sólo por la inevitable presencia de sustancias auxiliares que facilitan la elaboración y prolongan la conservación de las formas farmacéuticas, sino porque suelen contener dos o más principios activos, en algunos casos para obtener un frente terapéutico más amplio Control de Medicamentm (polivitaminas), o la potenciación de una droga (polisulfas) o la corrección de un efecto colateral (analgésicos y cardiotónicos). Esta diversidad y número de sustancia integrantes de una fórmula, impone a los fines del control cuantitativo, una clara diferenciación entre principios activos y sustancias Principio activo es toda sustancia dotada, en determinadas condiciones cuali y cuantitativas, de una propiedad farmacológica o terapéutica y es, por lo tanto, el elemento fundamental de la fórmula. I as sustancias auxiliares son todas aquellas que emplea la tecnología farmacéutica para obtener un medicamento bajo una forma adecuada y eficiente, es decir, que sólo sirven como elementos complementarios para la mejor vehiculización del principio activo, para la mayor estabilidad del producto y para su más fácil administración. 58 Dra. Eldy Valdivia V. Sin bien todo los ingredientes de una formulación deben encontrarse en las cantidades indicadas en el rótulo o fórmula original, es evidente que el punto crítico radica en los principios activos, de cuya magnitud dependerá la positividad e intensidad del efecto requerido. Esta magnitud, que fue fijada previamente en las experiencias biológicas, toxicológicas y clínicas, debe estar presente en cada unidad, en términos exactos y preciso. En constatar fehacientcmentc el cumplimiento de este requisito esencial, radica el problema en estudio- El analista debe pues determinar la concentración del principio activo, para establecer si la cantidad obtenida en la valoración, concuerda con la fijada en la fórmula. La concentración es la relación entre la cantidad de principio activo presente y la cantidad total de la unidad del producto. Generalmente, las fórmulas no están 59 Dra. Eldy Valdivia V. Medicamentm e.xptvsadas en cantidades absolutas sino relativas en que el total está representado por cien partes. Esta expresión porcentual suele llamarse título en el léxico farmacéutico. En una solución, por ejemplo, su título será la cantidad de soluto en 100 partes del total. (CINa 0.85 gramos % es el título de la "Solución fisiológica de cloruro de sodio" de la F.A. La dosis, por otra parte, se refiere a la cantidad de principio activo que el paciente debe incorporar por vez, durante el tratamiento. (Una cucharada cada 4 horas, una ampolla por día, dos comprimidos diarios, etc.). Dosificar es, para el médico, establecer las cantidades de principio activo para cada enfermo y su distribución por unidades en el tiempo, mientras que para el farmacéutico, significa preparar esas unidades con las cantidades fijadas en la fórmula, de manera rigurosa. Formas farmacéuticas cuyas unidades acusen grandes variaciones en la concentración del principio activo, traerán irregularidades en los efectos terapéuticos y defraudación las del médico, que confia en la eficacia de su prescripción. 3. VARIACIONES Y LIMITES DE TOLERANCIA Las dificultades apuntadas anteriormente para lograr una concentración exacta y rígidamente uniforme entre las unidades de un lotee, han inducido la incorporación de un nuevo criterio farmacotécnico, cual es el de sustituir ese desiderátum absoluto por la aceptación de un determinado ámbito en las variaciones, con ciertos límites máximos y mínimos de tolerancia en los valores individuales, como una especie de concesión ante la imposibilidad técnica de la dosificación perfecta. En la industria farmacéutica se emplea con este propósito, un método gráfico que permite distribuir entre dos líneas limitantes los valores obtenidos (la variabilidad) y establecer así la proporción de los que estuvieran por fuera de dichos límites. Este registro debe hacerse sistemática y rápidamente durante el proceso de producción, pues al decir de Lugones: "Los controles Contra de analiticos cumplen su función si advierten una anomalía antes que su repercusión sca demasiado importante". Las farmacopeas más evolucionadas han incorporado este nuevo criterio de los límites de tolerancia y dan especificaciones distintas según la forma farmacéutica y la concentración del principio activo. Los límites así especificados, que dan una cierta flexibilidad a la dosificación de la droga activa, son generalmente estrechos, por cuanto el objetivo de las normas es del obtener una relativa uniformidad de contenido entre unidades de un mismo lote y entre unidades de distintos lotes de un mismo medicamentom 4. METROLOGÍA. CRITERIOS PARA MEDIR Desde luego, toda determinación cuantitativa, importa una medición. Y toda medición requiere una unidad pre-establecida, es decir, un valor inmutable de referencia, por lo general arbitrariamente adoptado pero aceptado en forma universal. La ciencia especial que rige este dominio es la Metrología. 60 Dra. Eldy Valdivia V. Medicamentm En la mayor parte de los casos, el farmacéutico necesita medir pesos y volúmenes _y en algunas ocasiones deberá hacerlo con longitudes, tiempo, ángulos, energías, fuerzas, intensidades, potencias, etc. Cada uno de estos parámetros cuenta con una unidad y a veces con múltiplos y submúltiplos, con instrumentos especialmente diseñados y con métodos oficialmente adoptados para efectuar las mediciones. El empleo sistemático y controlado de estos tres elementos ha llegado a lograr una alta reproducibilidad de los resultados y por lo tanto una fácil comparación o confrontación de los mismos. La ad0Fión de un sistema internacional de unidades por todas las naciones del mundo, es una conquista muy reciente puesto que hay países como los anglosajones, que han mantenido y aún mantienen tradicionales sistemas de unidades, aunque ahora con tablas de conversión. En algunas farmacopeas modernas todavía es dable constatar el uso de libras, onzas, pies, yardas, granos farmacéuticos, etc. La farmacopea argentina en cambio, desde su primera edición, adoptó el sistema C.G.S. (centímetro, gramo, segundo), impuesto universalmente y por ello, de no sólo nacional, sino en todas las transacciones internacionales sobre drogas y medicamentos, así como de sistema referencial en las comparaciones. Ver la tabla siguiente: para mecnaas aaoptaaas por la Farmacopea Argentina 5a. Valor Unidad Simboio Longitud micrón u milimicrón mu miligramo (gamma) mugr Peso Volumen mililitro Tiempo ml s minuto 61 Dra. Eldy Valdivia V. Medicamentm hora h Temperatura grado centígrado 0C Presión barométrica atmósfera normal mm- Hg. (760 mm. Hg.) Desviación polarimétrica grado sexagesimal o Viscosidad cinemática stoke n Radiactividad curie c 4.1. Unidades de potencia. Las ciencias farmacéuticas han debido acudir a otro tipo de recursos para adoptar unidades específicas que expresen la intensidad o potencia de la 62 Dra. Eldy Valdivia V, terapéutica o farmacológica de ciertas drogas muy activas, las que, por diversos motivos, no pueden actualmente valorarse por método volumétricos o ponderables, Es el caso, por ejemplo, de la digital, en la que su valor terapéutico resulta de algo así como la suma algebraica de los valores individuales del conjunto de heterósidos presentes, presentes, con grandes variaciones cuali y cuantitativas en cada muestra. También es el caso de algunos antibióticos en los que no se ha llegado a un total purificación y se desconoce, por lo tanto, la real estructura química. Asimismo, varios antígenos y anticuerpos presentan este problema, cuyas composiciones muy complejas impiden toda valoración directa. Frente a esta original problemática y para eliminar definitivamente las antiguas unidades gato, ratón, perro, paloma, etc. impuestas por cada autor de método, de dudosa reproducibilidad, se ha llegado a una solución práctica y eficiente con la instauración de las unidades internacionales (U.I.) adoptadas por la Organización Mundial de la Salud (OMS.) cada una de las cuales representa la potencia de una determinada cantidad de un patrón constituido por una muestra especialmente seleccionada de cada prodiEto y cuya actividad se ha establecido por medio de método oficialmente adopto. La valoración de estos patrones suele realizarse por ensayos colectivos, realizados contemporáneamente, sobre fracciones de una única muestra, por varios laboratorios de expertos de distintos países, adoptándose como unidad internacional, el promedio de los resultados. El patrón y la unidad respectiva así adoptados por la O.M.S. se distribuye luego entre las naciones signatarias del convenio y, por valoraciones paralelas, cada país obtiene su sub patrón nacional que utilizarán los laboratorios locales y las oficinas de control De tal manera se ha superado un viejo problema para la valoración cuantitativa de drogas muy valiosas y se ha uniformado en el mundo el uso de las U.I., Io que importa un extrurdinario progreso en la medicina y en la industria farmacéutica. CL vez que se agota un patrón internacional, la O.M.S. elabora un nuevo patrón, cuya IX)tencia está expresada en unidades del anterior, procedimientos que permite la constancia del valor, independiente del cambio de patrón. La tabla que presentaremos se ha preparado con una selección de larga lista que la O.M.S. mantiene actualizada, como un elocuente ejemplo de este valioso esfuerzo internacional a favor de un medicamento más eficaz y seguro. Pafrones y tmidades internacionales en vigencia Productos Unidades en NO del patrón y año adopción 63 Observaciones mgr o gr Eldy Valdivia 1. Antígenos Tuberculina mamífero3er patrón 1965 También PPD de Shigella dysenteriae 2. Anticuerpos Surro antivariólico 0.08416 mgr 1er patrón 1965 20 patrón 1964 Bacitracina zinc 52% páncreas bovino y 40 patrón 1958 48% porcino 20 patrón 1949 1er patrón 1955 Testicular toro 3er patrón 1949 Hojas desecadas de D. purpurea 1er patrón 1958 3. Antibióticos 0.01351 mgr 4. Hormonas 0.04167 mgr 5. Vitarninas Vitamina mg,r 6. Enzimas I lialuronidasa 0.1 mgr 76.0 mgr 7. Otras sustancias Digital 8. Pirógeruys 2.0 mgr 64 Antígeno somático "O" Eldy Valdivia Contrvg de Afedü•amenfas Dm V. Los patrones de los grupos I y 2 se preparan, conservan y distribuyen en el Statens Seruminstitud de Copenhague (Dinamarca), mientras que los de los grupos 3 al 7 están a cargo del National Institute for Medical Research de Londres (Inglaterra). 4.1. Condiciones y formas de expresar los resultados. Contando con los sistemas de unidades anteriormente descriptos (C.G.S. y U.I.), es necesario fijar determinados criterios, normas y formas para expresar los valores obtenidos en las mediciones y valoraciones, en un lenguaje que no admita confusiones ni interpretaciones erróneas. Este tema también ha preocupado a las farmacopeas que han adoptado, entre otras, la siguiente nomenclatura: P/V, peso en volumen: para sólidos y gases disueltos en líquidos, gramos de soluto en 100 mililitros de solución. Ejemplos: Solución fisiológica de cloruro de sodio y solución de amoniaco. V/V, volumen en volumen: para líquidos en líquidos y gases en gases; mililitros de uno en 100 mililitros de mezcla. Ejemplos: alcohol etílico diluido 700 y mezcla de oxígeno y anhídrido carbónico. PIP, peso en peso: gramos de uno en 100 gramos de mezcla- Ejemplos: PIVO Dower, comprimidos de aspirina. Con respecto a las cifras significativas de los valores encontrados, las farmacopeas dan también sus normas de interpretación. Así, para la Farmacopea internacional: 100 _por ciento significa una proporción comprendida entre 99.5% y 1005%, mientras que 100.0 por ciento, significa un valor entre 99.95% y 100.05% y agrega: "cuando no se indica un límite superior para una valoración, se entiende que el límite es 100.05%" La fannacopea norteamericana aclara por su parte, que 9% significa 9.0% y no 8.9%. En cuanto al número de cifras decimales a expresar en los resultados, dependerá de los requisitos de la farmacopea y de la precisión del instrumento empleado. Algunas Uedü•amentm V, balanzas modernas permiten lecturas hasta la quinta cifra decimal, mientras que una microbureta sólo dejará apreciar centésimos de mililitro, es decir sólo dos cifras decimales. Igual diferencia se tiene en modelos diversos de polarímetro, con respecto a las fracciones de grados sexagesimales, lo que también ocurre con otro aparatos de medición, mecánicos, ópticos y eléctricos. 65 Eldy Valdivia 5. PASOS TÉCNICOS DE UNA VALORACIÓN Toda determinación cuantitativa requiere, por su misma esencia, una serie rigurosa de pasos ordenados que configuran un verdadero plan de trabajo. A pesar de las diferencias técnicas entre los distintos métodos de aplicación posible, concuerdan en la necesidad de considerar y seguir las siguientes operaciones: 5.1. Planificación. Acto previo al trabajo analítico que consiste en la adopción del método, la selección del material requerido, la verificación de los reactivos necesarios y una atenta consulta bibliográfica. 5.2. Muestreo. Como en la fabricación industrial de medicamentos es inconcebible un control del 100% de unidades, es imprescindible recurrir a la toma de muestras del lote o de la droga, delicada operación que le permite a Piersma decir que: "El costo de la labor analítica que se ha de realizar con las muestras seleccionadas, asciende a sumas considerables; por consiguientes, es de suma importancia que la operación de sacar muestra se lleve a cabo tan perfectamente como sea posible". La toma de muestras debe responden a criterios y normas definidos para que las mismas sean representativas del total, a fin de que los resultados obtenidos puedan ser transferidos con confianza al resto no analizado del lote o del producto. Una toma incorrecta de muestras, introduce en la valoración el llamado error de muestreo. Por supuesto que la norma a aplicarse en cada caso, dependerá de la naturaleza y de la magnitud del producto a valorarse. No será lo mismo cuando se trata de una Dra. V. droga sólida en frasco de 250 gramos o en un cuño de 50 kilos, ni tampoco en ej caso de un medicamento fraccionado en unidades, proveniente de un frasco de 10 o de un lote de 10.000. Algunas farmacopeas dan algunas normas para esta operación. Por ejemplo, la Farmacopea norteamericana indica para drogas vegetales, las siguientes relaciones para obtener muestras oficiales: Menos de 100 kilos: muestra de 250 gramos para partículas menores de I cm. o de 500 gramos para partícula mayores de 1 cm. Menos de IO kilos: muestra de 125 gramos. La misma Farmacopea indica en varias monografias de comprimidos, grageas, etc., el número necesario de unidades a separarse para su valoración. No obstante, existen reglas generales destinadas a la obtención de muestras representativas, como es la mezclar perfectamente el producto para lograr una homogeneización previa. Esta 66 Eldy Valdivia precaución es crítica cuando se trata de productos heterogéneos (polvos compuestos, suspensiones, emulsiones, pomadas, etc.) en los que, a diferencia de los productos homogéneos, la toma incorrecta de las muestras puede dar errores considerables. La técnica del cuarteo está especialmente indicada para productos pulverizados a la del azar para los de grandes lotes de unidades. En la industria farmacéutica se utiliza el muestreo sistemático, que consiste en tomar muestras cada determinado intervalo de producción. En lo que se refiere al muestreo de medicamentos divididos en unidades, la proporción de las que se toman para valorar, debe estar relacionada con la Ve magnitud del lote completo, por cuanto en estos casos, el error por muestreo es inversamente proporcional a la raíz cuadrada del número de muestras tomadas. 5.3. Preparación de la muestra. Pueden plantearse varias cuestiones previas a la valoración misma, por ejemplo: en las normas corrientes de las farmacopeas que dicen: pesar una determinada cantidad, previa desecación, hasta peso constante. En cada monografia indican la técnica de desecación a usarse _y, en cuanto al peso constante, lo definen así: cuando entre dos pesadas consecutivas, no hay pérdida superior a 0.1 % (F.A. 5a) o a 0.5 mgr. por gramo. También son operaciones preparatorias de la muestra, la pulverización hasta un grado determinado de tenuidad, el aislamiento del principio activo, la disolución, el ajuste del pH o de la temperatura, etc. 5.4. Conversión a la forma analizable. En muchas ocasiones, la muestra debe sufrir una transformEión química para llevarla a condiciones necesarias para la valoración; por ejemplo: en algunas colorimetrías o fluorometrías, la sustancia debe ser transformada en coloreada u fluorescente; en las gravimtetrías, es necesario llevar a la muestra soluble a un derivado insoluble tanto por precipitación como por hidrólisis, y en otros casos por calcinación a un residuo termoestable; en ciertas volumetrías, la muestra debe sufrir una destrucción, por vía húmeda como en cl método de Kjcldahl para determinar nitrógeno orgánico. 5.5. Puesta a _punto de los instrumentos. Se trata de una operación precautoria, indispensable y previa a toda valoración. Desde la carga y enrase de las buretas hasta el ajuste del 0 en los instrumentos ópticos, la estabilidad de la temperatura en los termostatos, la selección de las longitudes de onda en los espectrofotómetros, la regulación de la velocidad en algunos aparatos dinámicos, así como el control de cronómetros, termomómetros, barómetros, etc. Todo el material graduado de vidrio debe estar rigurosamente limpio y seco y en buretas y pipetas, matraces 67 V, Dra. Eldy Valdivia aforados, etc. controlada su calibración y ajuste de sus aforos. Todas estas ptvcauciones contribuirán en gran medida a la disminución del error analítico. 5.6. Determinación propiamente dicha. Es, desde luego, la operación fundamental que deberá cumplirse según las rigurosas normas del método. En muchos casos convendrá, aún cuando no estuviera indicado, realizar la valoración de la muestra, paralelamente con la de una sustancia de referencia, patrón o tipo. También es una buena norma la ejecución de un mínimo de dos determinaciones para promediar los resultados y calcular los factores y valores de los errores cometidos. Cada grupo de métodos analíticos cuantitativos, cuenta con indicaciones implícitas que deberán cumplirse aún cuando no estuvieran incorporadas al texto del método. Por ejemplo: en éste puede leerse. "lavar el precipitado", operación que cuenta con reglas especiales que impiden cometer algunas faltas por defecto(disolución parcial del precipitado) o por exceso (escaso líquido de lavado). 5.7. Cálculos. Como generalmente los resultados absolutos obtenidos en la valoración, corresponden a una parte alícuota de la muestra o del producto, es necesario practicar una serie de operaciones matemáticas para obtener las cifras relativas del valor porcentual. El manejo de factores de conversión o de corrección, la aplicación de fórmulas o ecuaciones y a veces el planteo de complejas relaciones matemáticas, crean un campo propicio para la introducción de errores de cálculo. Por ello es conveniente la revisión por dos o más veces, de las operaciones numéricas realizadas. 5.8. Calcificación del producto. El resultado final de la valoración debe ser luego confrontado con la especificación respectiva, sea de la farmacopea nacional o extranjera consultada, sea del trabajo original seleccionado, sea de las propias normas dc la fábrica o laboratorio. La mayor o menor concordancia entre ambas cifras servirá para calificar el producto valorado desde el punto de vista de la Medú-gm•ntas purvza en las drogas y desde la exactitud y uniformidad de contenido en jas tmidades de un medicamento. En la industria farmacéutica, esta conclusión final es de una enorme importancia y grande la responsabilidad de quien la determina, por las contingencias profesionales y económicas que puedan surgir del dictamen 68 V. analítico que importa, nada menos ni nada más, que la aceptación o el rechazo de un lote elaborado o la calificación de apto o inapto para una droga. 5.9. Redacción del informe. El resultado de la valoración debe ser presentada luego a quien corresponda y en tal caso, deberá ser por escrito, con un mínimo de datos: identidad de la muestra analizada, magnitud y características de la misma, datos numéricos del resultado obtenido y de la especificación respectiva, método empleado y calificación final, con la firma del autor del ensayo. 6. MÉTODOS Y VALORACIÓN. VENTAJAS Y DESVENTAJAS La cuantitativa de drogas y medicamentos cuenta actualmente con una tal de recursos, que es imposible dejar de resolver algún problema por falta de método apropiado. Las ciencias básicas han aportado numerosos métodos que fue necesario adaptar a las características del análisis farmacéutico. Tal es el número de estos métodos, especialmente fisicos y fisico-químicos, que constituyen hoy todo un nuevo capítulo bajo el nombre de análisis instrumental, ya que todos requieren aparatos ópticos o eléctricos de tecnología muy avanzada. Por otra parte, las ciencias farmacológicas, han contribuido también a resolver una serie importante de problemas, con los conocidos método biológicos que permiten medir otros valores no ponderales, como la potencia terapéutica. En fin, la microbiología también ha hecho sus aportes en el nuevo campo de los medicamentos anti-infecciosos. para estudiar sucintamente este enorme bagaje analítico, es conveniente clasificar los diversos métodos propuestos, lo que puede hacerse desde distintos puntos de vista. Dra. Eldy Valdivia 6.1. Según su fuente bibliográfica. Existen los llamados métodos oficiales, que son los instituidos por la farmacopea nacional y por lo tanto, de aplicación obligatoria en su ámbito. En cambio son métodos no oficiales los prescriptos por otras farmacopeas o formularios o bien aconsejados por la literatura científica. Varias farmacopeas como la Internacional, aclaran que puede optarse por otros métodos distintos al oficializado por ellas, a condición que den los mismos resultados. 6.2. Según su exactitud y precisión. Es posible agrupar los métodos, en este caso, en 1) cuantitativos, 2) semi-cuantitativos y 3) aproximados. Es evidente que, según la naturaleza e importancia del problema, sea exigible una mayor o menor exactitud en los resultados. Así lo admiten las diversas farmacopeas al prescribir para ciertas determinaciones, una extrema exactitud, mientras que también instituyen método con menor rigor en los resultados. 69 V. 6.3. Según la magnitud de la muestra. No siempre se dispondrá de una muestra más o menos generosa; en algunas oportunidades suelen ser extremadamente pequeñas. Por tal razón, los métodos se clasifican en: 1) Macrométodos: la muestra es mayor de 100 mgrode IO ml. 2) Semi-micrométodos: está entre 100 mgr. y 10 mgr. o entre IO y 1 ml. 3) Micrométodos: entre 10 y 0.1 mgr. o entre 1 y 0.01 ml. 4) Ultra-micrométodos: entre 100 y 0.1 mrg. o entre IO y I lambda. 1 Mrg = 1 gamma (u) = gr. 1 lambda (A) 0,000.001 litro Desde recordarse aquí la relación inversa entre la magnitud de la muestra y la dimensión del error; ello, la elección de un micro o un ultra-micrométodo, sólo estará justificada en la valoración de muestras muy pequeñas o de sustancias excesivamente potentes, que se dosifican en cantidades infinitesimales. (Vitamina B12). 6.4. Según la disciplina que los aporta. Se clasifica en: Métodos químicos. Son aquellos en que se aprovecha los fenómenos medibles, resultantes de un proceso de transformación química. Los aporta la Química analítica cuantitativa, inorgánica u orgánica y se subclasifican en: gravimétricos, volumétricos y gasométricos. Estos son los métodos que las farmacopeas oficializan en mayor número, posiblemente por ser los de menor costo y por lo tanto accesibles a las oficinas privadas de farmacia. 2) Métodos físicos. Son los aportados por esta ciencia básica y por ello se los agrupa en l) mecánicos, medición de energías y fuerzas; 2) térmicos, medición de temperaturas; 3) ópticos, medición de energía radiante (absorción, transformación o emisión); 4) eléctricos, medición de fenómenos electroquímicos; 5) radioquímicos, medición de radioactividad- 3) Métodos microbiológicos. Poseen una técnica operativa muy especial, con el empleo de diversos microorganismos, patógenos o no, cuyo desarrollo vital o muerte, es función de la potencia nutritiva, antibiótica o microbicida del producto que se valora. Según las características de los medios de cultivo empleados, se los agrupa en: a) métodos por difusión (medios sólidos) y b) métodos por dilución (medios líquidos). 70 V. 4) Métodos biológicos. Sus bases están en Biología, en la Fisiología comparada y en la Farmacodinamia. Como en el caso anterior, se emplea también en estos métodos, el reactivo vivo, perro con animales superiores. Se utilizan para medir tanto la toxicidad como la potencia terapéutica de ciertas drogas, o muy complejas o muy impuras y siempre de composición variable. Se los clasifica en: 1) Métodos para determinar la toxicidad; 2) para determinar la acción sobre un órgano o función de un animal vivo; 3) para determinar su acción sobre un órgano aislado; y 4) método carenciales (preventivos y curativos). 71 Dra. Eldy Valdivia V. de 5) Métodos especiales. Aunque no siempre oficializados por la Farmacopea argentina, se emplean en la valoración de drogas y medicamentos, otros métodos que no caen precisamente en la clasificación anterior. Así por ejemplo: a) Métodos enzimáticos. Son técnicas especiales para valorar el poder biocatalítico de algunas enzimas que se emplean como medicamentos sustitutivos (pepsina, pancreatina, papaína, etc.). b) Método inmunológicos. Por medio de procedimientos muy especiales, permiten apreciar cuantitativamente la potencia de sueros y vacunas, en tanto portadores de anticuerpos y antígenos específicos. c) Métodos cronométricos. Por los cuales una valoración es función sólo del tiempo, midiendo la velocidad de un fenómeno o reacción. d) Método estadísticos. Son métodos que se aplican por extensión, a cualquiera de los otros métodos. Por medio de ellos se obtienen datos complementarios de los resultados obtenidos: variabilidad, límites de confianza, etc. Setmkar ha efectuado un estudio crítico sobre la aplicación por las farmacopeas, de estos métodos. e) Métodos fotográficos. Estos métodos se han incorporado recientemente y con ellos se ha podido resolver problemas de dificil solución. f) Métodos planimétricos. Se emplean cuando se cuenta con gráficos obtenidos automáticamente por instrumentos inscriptores, en los que la superficie de un pico representa la cantidad presente de la sustancia valorada. La enumeración que antecede, no agota la lista de método a los que la valoración cuantitativa, especialmente de nuevas drogas, debe acudir para resolver los más arduos problemas que se presentan al farmacéutico analista. En la práctica corriente, los métodos citados suelen complementarse entre sí por razones científicas o técnicas. Por ejemplo: la polarimétrica de sacarosa antes y después de una hidrólisis ácida; una colorimetría después de una valoración enzimática; una turbidimetría como final de una determinación microbiológica; un estudio estadístico como culminación de un método biológico, etc. 72 Dra. Eldy Valdivia S.S. Selección de un método. Cuando el problema cuantitativo no está previsto en la Farmacopea argentina o cuando no es posible practicar el método oficial, queda en manos del operador la selección de un método que satisfaga plenamente el planteo a resolver, ya que, como es habitual, dispone de un cierto número de conductas posibles. Para esta elección, es conveniente, y a veces necesario, plantear previamente algunas cuestiones prácticas: Naturaleza y cantidad de la muestra disponible Tipo de información solicitada: concentración, potencia, etc Exactitud y precisión requeridas Mayor o menor urgencia Conservación o no de la muestra Instrumental y reactivos disponibles Preferencias personales, etc- Resueltas estas cuestiones, queda aún el problema de seleccionar uno entre varios métodos que responda, además, a los siguientes requisitos: La sensibilidad del método, que estará representada por la cantidad mínima del principio a determinar, que aquél pueda detectar, condición ésta que se relaciona con la magnitud de la muestra en examen. La especificidad o selectividad del método, que se vincula con la exclusión de toda sustancia extraña que, por parentesco químico, fisico o biológico, puedan ser aceptadas por la valoración y den, por lo tanto, errores por exceso. En lo que respecta a la sensibilidad, cabe tener presente las enormes diferencias que existen, por ejemplo, entre método fisico, los más sensibles y por lo tanto los más precisos, y métodos biológicos, los más inexactos, debido en primer término a las _:evnanies variaciones individuales qtr hay entre los animales de un lote de experiencias. Control de Medicamentm Ve En la que concierne a la especificidad, también deben tenerse en cuenta las grandes diferencias, ya que un valor ponderal acusado por los métodos químicos y fisicos no siempre concuerda con la potencia terapéutica o fisiológica de la sustancia con ensayo. Véase en la tabla siguiente esas significativas diferencias: 73 Dra. Eldy Valdivia Diferencias de resultados entre dos métodos Muestras Método Método cromatográficobimogco 414 mgr. % 10.86 U.l. 417 mgr. % 19.56 U.l. 444 mgr. % 23.35 U.l. Admitiendo que los resultados de la muestra NO 1 fueran equivalentes, los de la muestra NO 3 indican un aumento del 7,8% en el método fisico, mientras que en el biológico es del 115.094. Tan enorme desproporción demuestra la inespecificidad del método Por las razones apuntadas, es conveniente un estudio crítico de la metodología aconsejaia pr la literatura específica, para balancear ventajas y desventajas de los métodos a seleccionar, tal como propone el ya citado Stainier. 7. EXA(TITUS Y PRECISIÓN. TEORÍA DEL ERROR Como se ha podido apreciar en los párrafos anteriores, cada uno de los pasos en la operatoria analítica cuantitativa, resulta ser una fuente a veces fecunda de errores. En manos de un profesional inexperto o descuidado, esos errores se acumulan y distorsionan al resultado. Por ello es necesario revisar este importante campo del control de calidad de los medicamentos. En primer término, se deben conocer el origen y tipos de errores, para evitarlos o minimizarlos allí donde sea posible. Para esto se los clasifica según diversos puntos de vista. Por ejemplo: Jenkins y col. los agrupan en errores determinados o constantes e indeterminados o accidentales, a los que describen en la forma siguiente: 74 Dra. Eldy Valdivia V. a) Enores constantes o determinados que nacen por distintas causas como: I ) errores personales cometidos por cada analista (incapacidad para leer el punto final de una titulación); 2) errores del método causaos por procedimientos defectuosos (muestreo incorrecto, contaminación de precipitados y selección impropia de indicadores); 3) errores del instrumento por mala construcción o calibración (buretas o pipetas mal calibradas, pesas de una balanza de mala calidad, etc.). Estos errores, que se repiten en cada una de una serie de determinaciones, son generalmente detectables y pueden eliminarse, o corregirse. b) Errores accidentales o indeterminados, que se manifiestan por pequeñas variaciones en una serie de determinaciones efectuadas por un mismo operador bajo idénticas condiciones. Es dificil descubrir sus causas, las que pueden radicar en diferencias de juicio o de destreza del operador. Por tal razón, son errores que no pueden eliminarse. Mecarelli, en cambio, agrupa las variaciones producidas por los errores en: variaciones efectivas y variaciones aparentes. c) Variaciones efectivas, todas de origen operacional en la elaboración de los medicamentos, como ser: Las impurezas de las materias primas, que suelen tener parentesco químico con el vincipio activo y que, por ello, se suman a él en la valoración. La incorrecta distribución del principio activo en la mezcla, que se reflejará en la muestra no representativa, por falta dc homogeneidad. La complejidad de la fórmula, lo que incorpora operaciones de separación y purificación del principio activo, con las pérdidas consiguientes. La imperfección de las máquinas fraccionadoras, con grandes diferencias en el tamaño, peso o volumen de las unidades. d) Variaciones aparentes, originadas en la propia valoración del producto y son, por ejemplo: Muestreo incorrecto, por lo que el material a analizar no es representativo del lote o del producto a granel. Tal es la importancia de este paso que le permite decir a Fiorito; "Conocido es el hecho de que ningún análisis es mejor que el muestreo efectuado" V, Valoración es conjunto cuando se trata de medicamento fraccionados en unidades, de las que se toma un número determinado y se las redice a una muestra única, por pulverización, mezcla o solución. La valoración dará un resultado promedio. El procedimiento está oficializado por varias farmacopeas, a pesar de la elocuente objeción de Connors: "El paciente no toma un comprimido "promedio" sino una unidad real". No olvidar que varios resultados individuales inaceptables pueden dar un promedio aceptable. 75 Dra. Eldy Valdivia La concentración del principio activo, en el que juega un importante papel el método seleccionado con respecto a la magnitud de la muestra. A menor concentración, es más probable un error mayor. El error analítico, imputable al método mismo como pueden ser la solubilidad de un precipitado o la coprecipitación en las gravimetrías, la modificación del color en el tiempo en las colorimetrías, etc. Debe recordarse en este momento que los métodos biológicos son los más inexactos e imprecisos debido al cúmulo de factores variables y de imponderables que intervienen. Con la introducción de la teoría del error, del cálculo de probabilidades y de las deducciones estadísticas, se ha logrado en los métodos citados y aun en otros, conocer la magnitud de la suma de errores y calcular el resultado con un máximo de certeza. 7.1. Teoría del error. Lo absoluto o perfecto en materia de mediciones es imposible conseguir. La ciencia de la Metrología discurre precisamente en el plano humano y por lo tanto, todo cotejo, relación de valores o medición, debe prescindir de toda noción abstracta y recurrir, en cambio, a elementos objetivos. Por esa razón se hace necesario analizar los términos usados corrientemente en toda medición: exactitud y precisión, que suelen considerarse como sinónimos, cuando no lo son. En efecto, la Farmacopea argentina, como la mayor parte de las farmacopeas conocidas, emplea en las monografias la siguiente expresión: "Pesar exactamente en balanza precisión". De la que se infiere que ambos términos no significan lo mismo. Una buena definición de exactitud, entre muchas, expresa: "la fidelidad en la ejecución de una cosa", es decir, que está vinculada con la corrección del trabajo de medir ejecutado por el operador. En cambio, la precisión suele definirse como "el grado de coincidencia de varias medidas sucesivas, realizadas con el mismo instrumento y sobre el mismo objeto", lo que demuestra que la precisión está relacionada con la calidad de instrumento de medida y por ello, con la reproducibilidad de la misma. En una palabra, una buena medición, exacta y precisa, corresponde tanto a la excelencia del aparato usado, como a la competencia del operador. Son términos pues, que se complementan aunque no en forma recíproca, puesto que, por una parte, no se puede lograr exactitud sin precisión, pero es posible obtener precisión sin exactitud. Opina Delahay que "Un método puede conducir a resultados precisos, pero no exactos, si se comete un gran error sistemático". A pesar del más riguroso cumplimiento de los requisitos mencionados y habida cuenta de la inevitable aunque mínima imperfección de los mejores instrumentos y del no menos omnipresente error humano, el afán de lograr la perfección absoluta en este tipo de operaciones analíticas, se verá limitado por un cierto margen de error, cuya magnitud es necesario conocer. Su cálculo y apreciación están basados teóricamente en las siguientes consideraciones. a) Valor real (VR) es un concepto ideal y abstracto, imposible de determinar: b) Valor probable (VP), es el promedio de media aritmética de varias mediciones suceswas; se admite que, operando con y precisión, es el valor con error mínimo. 76 Dra. Eldy Valdivia c) Error absoluto (EA), sería la diferencia entre dos valores anteriores (VR — VP), imposible de determinar por razones obvias. d) Error aparente (EAp) que resulta de la diferencia entre el valor probable y un valor individual (VP — VI). 77 Dra. Eldy Valdivia V. e) Enor relativo (ER) es el error aparente llevado a porcentaje para poder establecer comparaciones. ER = EapX 100 VP Los errores aparentes de cada medición se llaman también desviaciones, es decir, las variaciones en más o en menos de cada una de las mediciones individuales con respecto al valor probable. f) Desviación individual (DI) es lo mismo que error aparente: DI=VP-VI g) Desviación media (DM) es el promedio o media aritmética de todas las desviaciones individuales de una serie sucesiva de medicamentos: Dia + Dlb nD1 DIC DM n Din nD1 h) Desviación media relativa (DMR) resulta de llevar a porcentaje la desviación media (DM) con respecto al valor probable (VP): DMR DM x 100 i) Desviación estandard o cuadrática (DS) que rcsulta de obtener la raíz cuadrada de la suma de los cuadrados de las desviaciones individuales, dividida por el producto del número dc mediciones por este mismo valor menor uno: 1)12 n(n - 1) valor al que también se llama error standard. 7.2. Error analítico. Como se dijo antes, dentro de las variaciones aparentes de Mecarelli, se encuentra el error analítico, es decir, el originado en el propio método de valoración utilizado y a las 0Fraciones respectivas. Las numerosas fuentes posibles de este error son de dos características: a) variables y b) constantes o sistemáticos. Entre los primeros pueden mencionarse factores muy importantes como la temperatura y la presión barométrica en los métodos gasométricos y el tiempo en los enzimáticos. 78 Dra. Eldy Valdivia V. También pueden incluirse dentro de los errores variables, algunos de carácter operativo como el error de paralaje en las lecturas volumétricas; el lavado excesivo o incompleto de precipitados en las gravimetrías; las variaciones de la corriente eléctrica, por defecto, de los estabilizadores, en las espectrofotometrías y en las determinaciones electroquímicas. Asimismo, se consideran errores variables los de índole personal como en ciertos defectos oculares (daltonismo); los errores de cálculo, etc. Entre los errores constantes, deben citarse en primer término, los provenientes de los instrumentos mal calibrados; la poca sensibilidad de las balanms; los defectos de los circuitos eléctricos o electrónicos de los aparatos, etc. Estas deficiencias instrumentales darán errores sistemáticos con graves riesgos para la confialidad de los resultados. Fig. En Io que respecta a los errores indeterminados de Jenkins y col, es decir, aquellos cuyo origen se desconoce y son por ello, inevitables, la única manera de controlarlos, después de eliminar las filentes de errores verificables, es por aplicación del control estadístico que provx»rciona la teoría del error. 79 Dra. Eldy Valdivia V. Los resultados de numerosas determinaciones con sus respectivas desviaciones, se pueden transportar a un gráfico muy característico como es la curva de Gauss, en cuyo eje horizontal AC se inscriben las magnitudes de las diversas desviaciones en más o menos, a partir de 0 y en el eje vertical OB, las frecuencias con que se presentan las distintas magnitudes de las desviaciones. La superficie total del gráfico encerrada por la curva y el eje horizontal, representa la poblu:ión, o sea la totalidad de las determinaciones efectuadas. Es indudable que, al ser más frecuentes las desviaciones menores„ la curva normal de Gauss sea alargada y angosta, representado así la distribución de las desviaciones según sus magnitudes, sus frecuencias y sus orientaciones a derecha e izquierda. Este gráfico gaussiano permite, por otra parte, fijar el valor del o de los límites de tolerancia que las farmacopeas modernas establecen para la aceptación de las unidades Por ejemplo: si esos limites se fijan en los valores EO para la izquierda y OG para la derecha, como primeros topes tolerados, la superficie EDBFGOE dará el total de la población aceptable, mientras que si se establece un nuevo límite IE a la izquierda Y GK a la derecha para las unidades que hubieran estado por fuera de los primeros, la nueva población estará dada por II IDBFJKGOELI. Cada uno de esos valores El, EO, OG y GK se les da el nombre de sigma (o), aproximadamente el 68% de la población total habrá cumplido el requisito, mientras que con 2 0 será el 95% y con 3 0, arriba del 99% de las unidades serán aceptadas. Por otra parte, una curva de Gauss normal, es decir, cuando representa las desviaciones inevitables de una serie de determinaciones, está indicando claramente que: Los errores pequeños son mayoría y que los grandes son menos. Los errores de distinto signo pero de igual magnitud, tiene aproximadamente la misma frecuencia. Cuando es mayor el número de determinaciones, la curva tiende a ser más elevada y angosta y siempre simétrica. 8. CONCLUSIONES En este capítulo se ha tratado de demostrar la enorme y fundamental importancia que la determinación cuantitativa tiene en la vigilancia y control de la calidad de los medicamentos, cuyo principio activo, rigurosamente dosificado, es una de las bases esenciales de todo proceso terapéutico. Como se ha podido apreciar, los peligros por errores durante el desarrollo del control analítico, no sólo se encuentran en las materias primas y en las operaciones fabriles, sino en el propio laboratorio de análisis, donde los errores cometidos y pueden ser varios crean la posibilidad de serias consecuencias terapéuticas, éticas y económicas. No obstante todo lo dicho hasta aquí, y con el objeto de alcanzar una visión del problema, cabe repetir las palabras de Rogers, citadas por Mecarelli: "Es inútil pretender precisiones no necesarias: a veces mayor precisión es muy costosa y el enfermo la paga sin obtener ningún 80 Dra. Eldy Valdivia V. beneficio". Sabia opinión según la cual, desechando las mediciones muy precisas y exactas no indispensables, el control de calidad brega por un medicamento eficaz y seguro, a la vez que de precio prudente. 81
