PROCEDIMIENTO PARA EL AREA DE BACTERIOLOGIA Fecha de emisión: Rev. 02 Página 1 de 21 PROCEDIMIENTO PARA EL ÁREA DE BACTERIOLOGÍA Elaborado por: Revisado y Autorizado por: Nombre: Nombre: Firma: Firma: Fecha: Fecha: PROCEDIMIENTO PARA EL AREA DE BACTERIOLOGIA Fecha de emisión: Rev. 02 Página 2 de 21 I. OBJETIVO Describir las actividades que se realizan en el área de bacteriología con el fin de obtener resultados confiables que ayuden al diagnóstico correcto y oportuno del paciente. II. ALCANCE El presente procedimiento aplica a todo el personal que realice el procesamiento de las muestras del área de bacteriología. III. RESPONSABILIDADES Jefe de Laboratorio Clínico: Verificar que las actividades se realicen según lo descrito en el presente procedimiento. Coordinador de Laboratorio Clínico: Realizar las actividades descritas en el presente procedimiento. IV. FUNDAMENTOS Tinción Gram: Por la composición de la pared bacteriana, las bacterias gram positivas retienen el colorante cristal violeta, en el caso de las bacterias gram negativas se teñirán con el colorante de contraste, por lo que al microscopio se verán azules y rosadas respectivamente. Prueba de Catalasa: La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias con lo cual se descompone el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. El desprendimiento de burbujas procedentes del oxígeno indica que la prueba es positiva. Prueba de Oxidasa: Los discos están impregnados con el reactivo NNNNtetrametil-p-fenilendiamina, por lo que en presencia de la enzima citocromo C oxidasa y la presencia de oxigeno se oxida el reactivo dando una coloración azul. Prueba O/F: Las bacterias pueden utilizar los carbohidratos por la vía fermentativa o por la vía oxidativa. Las bacterias anaerobias los fermentan; las facultativas pueden fermentarlos o degradarlos oxidativamente; las aerobias estrictas sólo pueden oxidarlos. Para detectar si las bacterias utilizan los carbohidratos por la vía oxidativa o fermentativa se utiliza el agar OF, que contiene agar, peptona y azul de PROCEDIMIENTO PARA EL AREA DE BACTERIOLOGIA Fecha de emisión: Rev. 02 Página 3 de 21 bromotimol como indicador de pH. Inicialmente el medio es de color verde (pH 7,1) y vira a amarillo cuando el medio se acidifica (pH de 6 a 7,6) producto de la fermentación u oxidación del carbohidrato. Ureasa. Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos moléculas de amoniaco por acción de la enzima ureasa. Esta actividad enzimática es característica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o positivo retardado. Agar de hierro y lisina (LIA) Algunos microorganismos son capaces de provocar la descarboxilación de los aminoácidos por inducción de enzimas específicas, el resultado de esta descarboxilación es la producción de una amina (o diamina) y dióxido de carbono. Tal es el caso de la producción de la enzima lisina descarboxilasa la cual al actuar sobre la lisina produce una diamina llamada cadaverina. En el medio LIA se puede detectar la producción de la lisina descarboxilasa ya que se produce una reacción coloreada por un cambio en el pH del medio, que contiene como indicador púrpura de bromocresol. Un cambio del color original del medio (morado) hacia amarillo en el fondo indica una reacción ácida por la fermentación de una pequeña cantidad de glucosa en el medio. Si el microorganismo produce lisina descarboxilasa, la acción de esta enzima sobre la lisina dará lugar a la cadaverina, la cual provocará un cambio de pH hacia la alcalinidad dando un color morado que sobrepasa la acidez debida a la glucosa. Así pues, un fondo amarillo indica que no se produce lisina descarboxilasa y un color morado que si es producida. Agar de hierro y triple azúcar (TSI) El agar TSI es uno de los más usados para ver la fermentación de carbohidratos en la familia Enterobacteriácea. Se pueden tener varias posibilidades de fermentación de acuerdo con las características metabólicas del microorganismo como son: Utilización de glucosa sola. Los microorganismos que fermentan solo la glucosa provocan en este medio una reacción alcalina en la superficie (roja) sobre un fondo ácido (amarillo, k/a) debido a que realizan una degradación aeróbica de la glucosa en la superficie, convirtiendo el piruvato en agua y dióxido de carbono. Después de 18 a 24 horas de incubación como la concentración de glucosa es baja (0.1%), los microorganismos empiezan a utilizar las peptonas que se encuentran en el medio, causando la liberación de amoniaco y produciendo un pH alcalino (rojo) gracias al rojo de fenol que tiene el medio como indicador de pH. En el fondo, como no hay oxígeno, se realiza una degradación anaeróbica y el piruvato se convierte en lactato con lo cual el pH disminuye quedando el pH ácido (amarillo). PROCEDIMIENTO PARA EL AREA DE BACTERIOLOGIA Fecha de emisión: Rev. 02 Página 4 de 21 Medio MIO (Movilidad, Indol y Ornitina) Este medio como su nombre lo indica sirve para observar la movilidad, la producción de indol y descarboxilación de la ornitina. La movilidad se detectará por la presencia de turbidez alrededor del punto de inoculación. El indol se formará si la bacteria tiene la capacidad de producir la enzima triptofanasa que desdoblará el aminoácido triptófano en indol, ácido pirúvico y amonio. El indol es incoloro, pero al reaccionar con el reactivo de Kovacs (p-dimetil-aminobenzaldehido) que se adiciona después de que creció la bacteria, dará un color rojo violeta. Por lo que respecta a la descarboxilación de la ornitina como el medio tiene púrpura de bromocresol y una pequeña cantidad de glucosa cuando esta se fermenta se produce un color amarillo en el fondo (ornitina descarboxilasa negativa), sin embargo, al descarboxilarse la ornitina se produce putresina la cual es alcalina y sobrepasa la acidez dada por la fermentación de las glucosas resultando en un color morado en el fondo. Coagulasa. Permite determinar la capacidad de coagular el plasma por la acción de la enzima coagulasa. Se utiliza para diferenciar S. aureus (coagulasa positiva) de otras especies de Staphylococcus. La prueba de la coagulasa en tubo se puede leer tras incubación de 4h, pero si es negativa debe incubarse hasta 24h. Rojo de metilo. El rojo de metilo es un indicador de pH. Actúa entre pH 4,2 y 6,3 variando desde rojo (pH 4,2) a amarillo (pH 6,3). Mediante esta prueba se comprueba la capacidad de un microorganismo de producir y mantener estables los productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa por la vía de la fermentación ácido-mixta. Se utiliza como parte de la identificación a nivel de especie de los bacilos entéricos gramnegativos. Voges-Proskauer. Permite observar si el microorganismo fermenta la glucosa por la vía butanodiólica. Si es así, se forma un producto intermedio (acetoína) que forma un complejo de color rojizo con el α-naftol. Se usa en la identificación a nivel de especie de bacilos entéricos gramnegativos. Utilización de citrato. Esta prueba sirve para determinar si un microorganismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Bacitracina. La bacitracina es un antibiótico que inhibe la síntesis de pared celular bacteriana, y a la concentración que se encuentra en los discos (0,04 U) inhibe el crecimiento de los estreptococos betahemolíticos del grupo A de Lancefield, pero no inhibe el desarrollo de otros estreptococos betahemolíticos. Los micrococcus y los estomatococcus también son inhibidos por la bacitracina, mientras que los PROCEDIMIENTO PARA EL AREA DE BACTERIOLOGIA Fecha de emisión: Rev. 02 Página 5 de 21 estafilococos coagulasa negativa son resistentes. Un resultado sensible a la bacitracina 0,04 U es presuntivo de la presencia de estreptococo grupo A, y se puede incrementar además el valor diagnóstico y facilitar la identificación de la cepa bacteriana en cuestión mediante la utilización de los discos de PYR-A Enterococos Prueba de CAMP. Sirve principalmente para determinar la capacidad de un microorganismo para producir una proteína conocida como factor CAMP. Los estreptococos grupo B secretan el factor CAMP La proteína produce un efecto sinérgico con la β-hemolisina de S. aureus sobre eritrocitos ovinos y bovinos que se observa como un fenómeno lítico en la intersección de los dos microorganismos cuando se siembran en proximidad. Como alternativa se puede utilizar el CAMP inverso. En esta prueba la hemólisis producida por algunos microorganismos se inhibe por la β-hemolisina de S. aureus (por ejemplo, la producción de fosfolipasa D de Arcanobacterium haemolyticum o la fosfolipasa E de Rhodococcus spp.). Optoquina. El clorhidrato de etilhidroxicupreÌna (optoquina) inhibe a muy baja concentración (5 µg/ml o menos) el crecimiento de S. pneumoniae, mientras que no afecta al crecimiento de otros Streptococcus alfa-hemolíticos. V. Descripción del proceso A) Procedimiento para sembrado en placa. El sembrado de acuerdo con las técnicas utilizada en AM se describe a continuación: PROCEDIMIENTO PARA EL AREA DE BACTERIOLOGIA Fecha de emisión: Rev. 02 Página 6 de 21 TECNICAS DE SEMBRADO EN PLACA DILUCION AMERICANA: Se realiza en placa con el asa previamente esterilizada, se toma una porción pequeña de una colonia y se inocula en un extremo de la placa a sembrar, se extiende el inoculo realizando movimientos en forma de “S”; se realiza otro estriado en un ángulo de 45°, este paso se repite 2 o 3 veces concluyendo con un estriado en “s” hacia el centro del agar como se muestra con la flecha roja. CUANTITATIVA: Con el asa de 0.001 ml se toma la muestra liquida, se realiza un inoculo de extremo a extremo dividiendo por la mitad la caja Petri, se esteriliza el asa y posteriormente se realiza un estriado separado a través de impronta central. TECNICA DE EXTENDIDO O SEMBRADO MASIVO: Para esta técnica se puede utilizar suspensión bacteriana empleando un hisopo estéril o a partir de una cepa pura con un asa bacteriológica, la técnica que se emplea es la misma para ambos casos, se realiza una impronta que divide la caja por la mitad de extremo a extremo, posteriormente sin necesidad de esterilizar se realiza el estriado cerrado, generando un “césped” bacteriano, posteriormente el estriado cerrado se vuelve a realizar girando la caja 90° Tabla 1. “Técnicas de sembrado en placa” B) Procedimiento para el sembrado de medios de cultivo de acuerdo con el origen de la muestra. En la tabla que se muestra a continuación se puede observar los medios de cultivo adecuados para realizar la siembra según las diferentes muestras que se procesan en A.M. Lab. PROCEDIMIENTO PARA EL AREA DE BACTERIOLOGIA Fecha de emisión: Rev. 02 Página 7 de 21 Tabla 2. “Medio a utilizar por muestra” C) Procedimiento para anaerobiosis 1. Colocar dentro del frasco de vidrio donde se incubarán los medios en anaerobiosis un frasco pequeño cuyo volumen no exceda los 50 mL agua y un trozo de vela de aproximadamente 3 cm. 2. Introducir en el frasco los medios a incubar previamente inoculados 3. Agregar una tableta efervescente en el frasco con agua y encender la vela para crear un ambiente de anaerobiosis. 4. Colocar la tapa del frasco. 5. Dejar incubar de 35-38°C de 18 a 24 horas (los medios que no requieren anaerobiosis se incubaran de 35-38 °C de 18 a 24 hrs) 6. Observar si existe desarrollo y hacer el conteo de colonia A continuación, se indica cuáles son los medios que se deben incubar en las condiciones anteriormente descritas: PROCEDIMIENTO PARA EL AREA DE BACTERIOLOGIA Fecha de emisión: Rev. 02 Página 8 de 21 MUESTRA MEDIO DE CULTIVO Agar Cassman X X Uretral Vaginal Diversos Sangre Tabla 3. “Anaerobiosis” D) Tipos de cultivos MEDIO DE CULTIVO Tayer Martin X X MEDIO DE CULTIVO Agar sangre X X D.1 Cultivo de lesión (diversos), cultivo ótico, cultivo nasal, cultivo faríngeo, cultivo de secreción bronquial, cultivo uretral y espermocultivo. 1. Colocar un inoculo de la muestra en los medios indicados en la tabla 2 “Medios a utilizar por muestra” y sembrar por estriado americano (Ver. Tabla 1 “Técnicas de sembrado en placa”). 2. Introducir en anaerobiosis los medios que así lo requieran (Ver. Tabla 3 “Anaerobiosis”) 3. Si se presenta desarrollo microbiano, evaluar si son o no patógenas o representativamente clínicas para ser identificadas. 4. Realizar las pruebas bioquímicas primarias y secundarias que se consideren necesarias para la identificación y reportarlas en la bitácora PRO-LC-08-A “Bitácora de bacteriología” el cual se muestra a continuación: PROCEDIMIENTO PARA EL AREA DE BACTERIOLOGIA Fecha de emisión: Rev. 02 Página 9 de 21 BITACORA DE BACTERIOLOGÍA Folio: Edad: Nombre: Estudio: Microorganismo aislado: ANTIBIOGRAMA Pruebas bioquimicas (opcional): GRAM + GRAM - UFC/ mL: Nombre de quien realiza la prueba: Nombre de quien valida la prueba: Observaciones: AM CFX CPF CLM E PE TE CF DC GE SXT VA AM CB CF CFX CPF CL NF AK GE NET NOF SXT PRO-LC-08-A Se llena de la siguiente forma: Folio: Registrar el folio del paciente Nombre: Registrar el nombre del paciente Edad: Registrar la edad del paciente Estudio: Registrar los estudios solicitados Pruebas bioquímicas (opcional): Registrar las pruebas bioquímicas que se requieran (En caso de que la identificación del microorganismo no sea posible mediante su morfología) Antibiograma: Indicar los antibiogramas realizados para el análisis de la muestra Microorganismo aislado: Registrar el nombre del microorganismo que se aisló. UFC/mL: Registrar el número de unidades formadoras de colonias por cada mililitro de muestra PROCEDIMIENTO PARA EL AREA DE BACTERIOLOGIA Fecha de emisión: Rev. 02 Página 10 de 21 Nombre de quien realiza la prueba: Registrar el nombre de personal que procesa la muestra. Nombre de quien valida la prueba: Registrar el nombre del personal que valida el resultado (coordinador de laboratorio / jefe de laboratorio). Observaciones: Registrar si se presenta alguna desviación en el proceso. 5. Una vez identificada la bacteria deberá proceder a realizarse la prueba de susceptibilidad a antibióticos (Ver apartado D.8) D.2 Cultivo ocular 1. Para poder realizar este estudio se debe tener 3 partes, un hisopo sumergido en solución salina con muestra, una laminilla con muestra extendida, y el medio de transporte, 2. la primera (fresco) deberá colocarse en entre porta y cubreobjetos y observarse al microscopio a 40x, en la búsqueda de trofozoítos de parásitos, La segunda deberá teñirse con la técnica de Gram. 3. Con el tercero, el medio Stuart Colocar un inoculo de la muestra en los medios indicados en la tabla 2 de este procedimiento el cual es diferente de acuerdo con el origen de la muestra y sembrar por estriado americano de acuerdo con la tabla 1 de este procedimiento. 4. Introducir los medios necesarios en un ambiente de anaerobiosis (Ver Tabla 3. “Anaerobiosis”). 5. Si se presenta desarrollo microbiano, evaluar si son o no patógenas o representativamente clínicas para ser identificadas. 6. Realizar las pruebas bioquímicas primarias y secundarias que se consideren necesarias para la identificación y reportarlas en la bitácora PRO-LC-08-A “Bitácora de bacteriología” 7. Una vez identificada la bacteria deberá proceder a realizarse la prueba de susceptibilidad a antibióticos (Ver apartado D.8) D.3 Coprocultivo 1. 2. 3. La muestra deberá ser homogenizada con ayuda de un abatelenguas. Colocar un inoculo de la muestra en los medios indicados en la tabla 2 de este procedimiento el cual es diferente de acuerdo con el origen de la muestra y sembrar por estriado americano de acuerdo con la tabla 1 de este procedimiento. Introducir los medios necesarios a anaerobiosis de acuerdo con el inciso C) del presente documento. PROCEDIMIENTO PARA EL AREA DE BACTERIOLOGIA Fecha de emisión: Rev. 02 Página 11 de 21 4. 5. 6. Si se presenta desarrollo microbiano, evaluar si son o no patógenas o representativamente clínicas para ser identificadas. Realizar las pruebas bioquímicas primarias y secundarias que se consideren necesarias para la identificación y reportarlas en la bitácora PRO-LC-08-A “Bitácora de bacteriología” Una vez identificada la bacteria deberá proceder a realizarse la prueba de susceptibilidad a antibióticos (Ver apartado D.8) D.4 Cultivo cervicovaginal 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. En este caso la muestra constará de 3 partes, un hisopo en medio de Stuart, otro en solución salina (fresco) y una laminilla con un extendido de la secreción, El primer paso que seguir será la revisión al microscopio de una gota en portaobjetos a 40x, con la finalidad de buscar parásitos como Tricomonas vaginalis. El extendido se tiñe con tinción de Gram, para luego ser observado al microscopio con objetivo 100X. Con el hisopo del medio un inoculo de la muestra en los medios indicados en la tabla 2 de este procedimiento el cual es diferente de acuerdo con el origen de la muestra y sembrar por estriado americano de acuerdo con la tabla 1 de este procedimiento. Introducir los medios necesarios a anaerobiosis de acuerdo con el inciso C) de este procedimiento Si se presenta desarrollo microbiano, evaluar si son o no patógenas o representativamente clínicas para ser identificadas. Realizar las pruebas bioquímicas primarias y secundarias que se consideren necesarias para la identificación y reportarlas en la bitácora PRO-LC-08-A “Bitácora de bacteriología” Una vez identificada la bacteria deberá proceder a realizarse la prueba de susceptibilidad a antibióticos (Ver apartado D.8) D.5 Urocultivo 1. 2. Inocular el Agar CLED, con asa calibrada de 0.001 (1/1000), aplicando la técnica de cuantitativa indicada en la tabla 1 de este procedimiento. Si se presentara desarrollo realizar el conteo de colonias en este medio. Colocar un inoculo de la muestra en los medios indicados en la tabla 2 de este procedimiento el cual es diferente de acuerdo con el origen de la muestra y sembrar por estriado americano de acuerdo con la tabla 1 de este procedimiento. PROCEDIMIENTO PARA EL AREA DE BACTERIOLOGIA Fecha de emisión: Rev. 02 Página 12 de 21 3. 4. 5. 6. Introducir los medios necesarios a anaerobiosis de acuerdo con el inciso C) del presente documento Si se presenta desarrollo microbiano, evaluar si son o no patógenas o representativamente clínicas para ser identificadas. Realizar las pruebas bioquímicas primarias y secundarias que se consideren necesarias para la identificación y reportarlas en la bitácora PRO-LC-08-A “Bitácora de bacteriología” Una vez identificada la bacteria deberá proceder a realizarse la prueba de susceptibilidad a antibióticos (Ver apartado D.8) D.6 Pruebas bioquímicas primarias PROCEDIMIENTO PARA LA TINCION GRAM 1. Colocar una gota de agua estéril sobre un portaobjetos limpio. 2. Tomar una colonia de la bacteria a identificar y realizar un extendido en el portaobjetos homogenizando con la gota de agua. 3. Fijar al calor o dejar secar al aire. 4. Colocar cristal violeta y dejar actuar durante un minuto, enjuagar y decantar 5. Colocar Lugol y dejar actuar durante un minuto, enjuagar y decantar. 6. Decolorar con alcohol: cetona durante 5 segundos aproximadamente, según se observe la decoloración. Enjuagar y decantar 7. Colocar colorante safranina y dejar reposar durante un minuto, enjuagar y decantar. 8. Dejar secar y observar al microscopio a 100X. PROCEDIMIENTO PARA LA PRUEBA DE CATALASA 1. Colocar una gota de peróxido de hidrógeno al 30% sobre un portaobjetos. 2. Con ayuda de un aplicador de madera estéril, colocar una colonia de la bacteria a identificar. 3. Observar la formación o no de burbujeo. PROCEDIMIENTO PARA LA PRUEBA DE OXIDASA 1. Colocar un disco de oxidasa sobre un portaobjetos. 2. Con ayuda de un aplicador de madera estéril colocar una colonia de la bacteria a identificar sobre el disco de oxidasa y mantener durante 10 segundos. PROCEDIMIENTO PARA EL AREA DE BACTERIOLOGIA Fecha de emisión: Rev. 02 Página 13 de 21 3. Observar la aparición o no de color violeta en el disco. PROCEDIMIENTO PARA LA PRUEBA O/F 1. Inocular 2 tubos de medio O/F por picadura, y colocar aceite mineral estéril a uno de los dos, mismo que se ha de enroscar firmemente. 2. El otro tubo permanecerá con la tapa enroscada a 1 o 2 vueltas 3. Incubar ambos por 24 horas de 35-38°C. D.7 Pruebas bioquímicas secundarias PRUEBA PRODUCCIÓN DE INDOL 1. Inocular por picadura a fondo el medio MIO 2. Incubar de 35-38°C durante 18 – 24 horas. 3. Interpretar agregando 5 gotas del reactivo p-dimetilaminobelzaldehido. PRUEBA ROJO DE METILO EN MR-VP 1. 2. 3. 4. 5. Inocular el caldo MR-VP por inoculo pesado. Incubar de 35-38°C durante 18 -24 horas Tomar una alícuota en un tubo estéril y añadir 2 gotas de rojo de metilo Observar la coloración. Incubar por 6 horas más el resto del caldo inoculado y añadir una gota de alfa naftol al 5% en alcohol etílico y una gota de hidróxido de potasio al 40%, observar la coloración en la interfase. PRUEBA DE CITRATO 1. Sembrar en la superficie del medio Citrato de Simmons un inoculo ligero de la colonia a identificar. 2. Incubar a 35-38°C durante 24. PRUEBA TSI 1. Sembrar por picadura y en la superficie del medio TSI un inoculo ligero de la colonia a identificar. 2. Incubar a 35-38°C durante 24. PROCEDIMIENTO PARA EL AREA DE BACTERIOLOGIA Fecha de emisión: Rev. 02 Página 14 de 21 PRUEBA LIA 1. Sembrar por picadura y en la superficie del medio TSI un inoculo ligero de la colonia a identificar. 2. Incubar a 35-38°C durante 24. PRUEBA UREA 1. Sembrar en la superficie del medio Urea un inoculo ligero de la colonia a identificar. 2. Incubar a 35-38°C durante 24. PRUEBA DE COAGULASA 1. Colocar 200 microlitros de plasma citratado en un tubo bien lavado. 2. Colocar una colonia de Staphylococcus que se presume es Staphylococcus aureus. 3. Incubar 35-38°C durante 4 horas, si la prueba es negativa transcurrido este tiempo, se puede proceder a dejarla incubar durante 24 horas si se considera pertinente. PRUEBA DE BACITRACINA 1. Tomar una colonia y sembrarla en agar sangre en modo masivo. 2. Colocar un disco de bacitracina en el centro. 3. Observar inhibición o resistencia alrededor del disco. PRUEBA DE CAMP 1. Inocular con una sola estría una cepa de S. aureus β- hemolítico en agar sangre y en paralelo y diametralmente opuesto una cepa del que se cree es un Streptococcus del grupo B un aplaca de agar sangre de cordero. 2. Incubar 35-38°C por 24 horas. PROCEDIMIENTO PARA EL AREA DE BACTERIOLOGIA Fecha de emisión: Rev. 02 Página 15 de 21 D.8 Prueba de susceptibilidad a antimicrobianos 1. Una vez teniendo una cepa sospechosa, en cultivo, que se presume juega un rol patógeno, se deberán seleccionar colonias con la misma morfología, su correcta identificación y la búsqueda de su perfil de sensibilidad a antimicrobianos. 2. Con las colonias seleccionadas se deberá inocular un tubo agua desionizada. 3. Con la solución formada se introduce un hisopo, quitando el exceso de líquido y posteriormente se inocula una de Mueller Hinton por medio de sembrado masivo. 4. En el laboratorio de A.M. Lab S. A. de C.V. se trabaja con poli discos 5. Se coloca el Poli disco en la placa de Mueller Hinton. Por un lapso de 12 a 24 horas se deja el Poli disco en el medio de cultivo, en la estufa de 35-38 grados centígrados. 6. Se hace la lectura de la reacción de la bacteria a los antibióticos por medio del uso de la raya negra. Si el halo rebasa la raya negra, la bacteria es sensible, si está en el límite de la raya, es de sensibilidad intermedia, y si está dentro de la raya negra es resistente. 7. La interpretación de este resultado se registra en la bitácora PRO-LC08-A “Bitácora de Bacteriología” D.9 Interpretación de resultados en base al control interno de los medios de cultivo Para la interpretación de resultados se basa en el certificado de control de calidad y la determinación de cada medio de cultivo de MCD LAB, como se muestra en la siguiente tabla: PROCEDIMIENTO PARA EL AREA DE BACTERIOLOGIA Fecha de emisión: Rev. 02 Página 16 de 21 AGAR Sal y Manitol Sal y Manitol Gelosa Chocolate Gelosa Chocolate Gelosa Chocolate Gelosa Chocolate Gelosa Chocolate Cassman Cassman Cassman Cassman CLED CLED CLED CLED Tayer Martin Tayer Martin Biggy Biggy Mac conkey Mac conkey Mac conkey Mac conkey Mac conkey Sangre Sangre Sangre Sangre Sangre Sangre Salmonella- Shigella Salmonella- Shigella Salmonella- Shigella Salmonella- Shigella Salmonella- Shigella Cassman Meller Hinton CRECIMIENTO BACTERIANO Colonias amarillas con zonas amarillas Colonias rojas- rosas con zonas rojas Colonias pequeñas brillantes, muestran decoloración verde del medio. Colonias pequeñas lisas opacas, incoloras a blanco grisáceo Colonias medianas opacas, gris azulado Colonias pequeñas húmedas color perla con olor a ratón Colonias pequeñas blancas a grises Crecimiento satisfactorio Crecimiento con beta hemolisis Colonias de incoloras a grises, húmedas con olor a ratón Crecimiento con alfa hemolisis Colonias amarillas opacas con centro amarillo intenso Colonias translúcidas azules, swarming inhibido Colonias amarillo intenso homogéneo Colonias pequeñas amarillas Colonias pequeñas blanco grisáceo mucoides Colonias pequeñas opacas incoloras o blanco grisáceo lisas y brillantes Colonias café obscuro, elevadas con borde micelial delgado. Colonias lisas de color café obscuro con centro negro borde delgado Colonias rosas con halo de precipitado Colonias medianas incoloras, transparentes Colonias pequeñas incoloras transparentes Colonias grandes rosadas mucoides Colonias incoloras opacas sin swarming Colonias medianas color crema Crecimiento con alfa hemolisis Crecimiento con beta hemolisis Colonias circulares color crema con beta hemolisis Colonias cremas con swarming Colonias incoloras a grises húmedas con olor a ratón Colonias color rosa a rojo Colonias color rosa transparente Colonias incoloras con centros blancos Incoloras con centros negros Incoloras Colonias con beta hemolisis con olor a tortilla Colonias verde claro con olor a tortilla Tabla 4. “Identificación de colonias” MICROORGANISMO AISLADO Staphylopcoccus aureus Staphylopcoccus epidermidis Streptococcus pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Neisseria menigitidis Haemophilus influenzae Streptococccus pyogenes Neisseria gonorrhoeae Streptococcus pyogenes Haemophilus influenzae Streptococcus pneumoniae Escherichia coli Proteus vulgaris Staphylococcus aureus Enterococcus faecalis Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Candida albicans Candida tropicalis Escherichia coli Salmonella typhi Shigella flexneri Enterobacter aerogenes Proteus mirabilis Escherichia coli Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Staphylococcus aureus Proteus mirabilis Haemophilus influenzae Escherichia coli Enterobacter/ Klebsiella Proteus Salmonella typhi Shigella Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa PROCEDIMIENTO PARA EL AREA DE BACTERIOLOGIA Fecha de emisión: Rev. 02 Página 17 de 21 D.10 Control de calidad interno Inóculo La turbidez de la suspensión bacteriana a inocular en el medio de cultivo debe tener una densidad correspondiente 0.5 Mc Farland (1.5x108 UFC). La medición de la turbidez puede ser realizada a través de un turbidímetro o comparando directamente (visualmente) la suspensión preparada con el control 0.5 de Mc Farland. El estándar de Mc Farland o también llamado etalón, está hecho de sulfato de bario (0.5mL BaCl2 1.175% + 99.5mL H2SO4 1%). Se debe agitar antes de usar y terminar su uso se debe guardar protegido de la luz. A mayor densidad hay menor inhibición de los microrganismos y mayor probabilidad de ocurrencia de falsa resistencia a los antimicrobianos estudiados. A menor densidad hay mayor inhibición de los microrganismos y mayor probabilidad de ocurrencia de falsa sensibilidad a los microbianos estudiados. Discos de antimicrobianos Con respecto, a la utilización de los sensidiscos se debe tener las siguientes consideraciones: El numero de discos a utilizar puede variar dependiendo del tipo de bacteria, entre un máximo de 12 discos en placas de 150 mm o 6 discos en placas de 100mm. Incubación de las placas y lectura: Incubar en atmosfera normal a 35± 2°C Tiempo de incubación de 18 a 24 hrs. dependiendo del agente bacteriano probado. La medida de punto final esta dada por la lectura de los halos de inhibición Cuantificar y registrar los halos de inhibición en milímetros Los resultados de las pruebas de Control de calidad interno se registran en el siguiente formato PRO-LC-08-B: PROCEDIMIENTO PARA EL AREA DE BACTERIOLOGIA Fecha de emisión: Rev. 02 Página 18 de 21 CONTROL DE CALIDAS INTERNO DEL ANTIBIOGRAMA CEPAS ATCC Fecha Antimicrobiano No. De lote Fecha de expiracion Halo de inhibicion Aceptado/ No aceptado Realiza Valida PRO-LC-08-B El formato se llena de la siguiente manera: Cepas ATCC: Fecha : Antimicrobiano : No. De lote: Fecha de expiración: Halo de inhibición: Aceptado/ No aceptado: Realiza: Valida: laboratorio clínico) Registrar a cepa ATCC a realizar el CCI Dia mes y año en que se realiza el CCI Registral el nombre del antimicrobiano a utilizar Numero de lote indicado en el cepa ATCC Fecha de caducidad de la cepa ATCC Resultado obtenido Resultado de aceptado o no aceptado de la prueba Nombre de quien realiza el CCI Nombre de quien valida el CCI ( coordinador/ jefe de Los resultados de aceptación se verifican con las siguientes tablas: PROCEDIMIENTO PARA EL AREA DE BACTERIOLOGIA Fecha de emisión: Rev. 02 Página 19 de 21 PROCEDIMIENTO PARA EL AREA DE BACTERIOLOGIA Fecha de emisión: Rev. 02 Página 20 de 21 E) Verificación, validación y liberación de resultados Los resultados del microorganismo aislado, así como las diversas pruebas bioquímicas y el antibiograma se registran en la bitácora PRO-LC-08-A “Bitácora de Bacteriología” y se reporta en el sistema sysweb solo la bacteria aislada, las UFC/Ml si es que aplica y el antibiograma si de igual forma aplica. Nota: en caso de contar con personal de nuevo ingreso el coordinador o jefe del laboratorio deberán verificar el resultado durante el mes de capacitación. Para verificar que todos los estudios de las diferentes sucursales estén en el sistema se corrobora con el PRO-LC-11-C VI. Registros PROCEDIMIENTO PARA EL AREA DE BACTERIOLOGIA Fecha de emisión: Rev. 02 Página 21 de 21 Código del formato Nombre Tiempo de Retención Responsable PRO-LC-08-A Bitácora de bacteriología 1 año Coordinador de Laboratorio PRO-LC-08-B Formato de CCI de antibiograma 1 año Coordinador de Laboratorio VII. Referencias Norma ISO-9001:2015 Sistemas de Gestión de Calidad-Requisitos VIII. Control de cambios MODIFICACIONES Descripción del Cambio Emisión inicial Se realiza la modificación del formato PRO-LCC-08-A “Bitácora de bacteriología”, se indica que las pruebas bioquímicas son opcionales y se incluye la tabla 4. “Identificación de colonias” Se incluye la forma de realizar el CCI y su registro, así como se modifica la bitácora de bacteriología anexando el nombre de quien realiza y de quien valida el resultado Nivel de Revisión 0 Fecha de Emisión 15/05/2018 1 12/06/2018 2 04/07/2018 REVISIÓN La firma indica que el procedimiento se mantiene SIN modificaciones Fecha de la próxima Revisión Julio 2020 Fecha de Revisión Nombre Puesto Observaciones o Firma