RFLP-PCR para diferenciar bacterias aeróbicas de la miel

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Viabilidad de utilizar RFLP de genes de ARNr 16S amplificados por PCR para la diferenciación rápida de aislados de bacterias formadora…
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Revista de métodos microbiológicos 165 (2019) 105690
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Revista de métodos microbiológicos
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Viabilidad de utilizar RFLP de genes de ARNr 16S amplificados por PCR para
diferenciación de aislamientos de bacterias aeróbicas formadoras de esporas de la miel
T
Ana C. López, Adriana M. Alippi⁎
Unidad de Bacteriología, Centro de Investigaciones de Fitopatología, Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales, Universidad Nacional de La Plata, cc 31, calle 60 y 119,
1900 La Plata, Argentina
INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO
ABSTRACTO
Palabras clave:
Este estudio tuvo como objetivo evaluar la viabilidad de utilizar RFLP de genes de rRNA 16S amplificados por PCR mediante el uso de
PCR-RFLP
cebadores 27f / 1492r y una combinación de tres enzimas de restricción, Alu I, Cfo I y Taq I, para una rápida
Bacilo
Detectar una diferenciación principalmente de aislamientos del complejo de bacterias aeróbicas formadoras de esporas comúnmente
Paenibacillus
encontrado en muestras de miel. El método descrito produjo patrones únicos y distinguibles para diferenciar
Brevibacillus
entre 80 aislamientos pertenecientes a 26 especies diferentes de Bacillus , Brevibacillus , Lysinibacillus , Rummeliibacillus y
Lisinibacilo
Paenibacillus reportado en miel y otras fuentes de colmena.
1. Introducción
milus, Bacillus simplex, Bacillus subtilis, Brevibacillus borstelensis ,
Brevibacillus brevis, Brevibacillus laterosporus, Lysinibacillus fusiformis ,
“La miel es la sustancia dulce natural producida por las abejas melíferas de
Lysinibacillus sphaericus, Paenibacillus alvei, Paenibacillus apiarius,
néctar de plantas o de secreciones de partes vivas de plantas o ex-
Larvas de Paenibacillus, Paenibacillus polymyxa y Rummeliibacillus stabe-
creaciones de insectos chupadores de plantas en las partes vivas de las plantas, que el
kisii ( Alippi, 1995; Alippi y col., 2004 ; Alippi y Abrahamovich, 2019 ;
las abejas recolectan, transforman al combinarse con sustancias específicas de su
Bartel et al., 2018 ; Evans y Armstrong, 2006; Gilliam, 1979, 1997 ;
poseer, depositar, deshidratar, almacenar y dejar en el panal para que madure y
Gilliam y Morton, 1978; Gilliam y Valentine, 1976 ; Iurlina y
maduro"
Fritz, 2005, Piccini y col., 2004 ; Sinacori et al., 2014 ; Snowdon y
www.fao.org/input/download/standards/310/cxs_012e.pdf.
La miel es una solución de azúcar sobresaturada que contiene pequeñas cantidades de
Cliver, 1996 ; Wen et al., 2017 ). Dentro de esta comunidad, algunos grupos
ácidos orgánicos, minerales, vitaminas, enzimas, proteínas y aminoácidos
se componen de parientes filogenéticos cercanos, es decir , el Bacillus cereus
( Machado De-Melo et al., 2018). La calidad de la miel está influenciada por mi-
sensu lato que consiste en Bacillus cereus sensu stricto, Bacillus anthracis ,
microorganismos, principalmente levaduras y bacterias formadoras de esporas; sin embargo,
Bacillus mycoides; Bacillus cytotoxicus ; Bacillus pseudomycoides ; Bacilo
La miel vendida comercialmente tiene una mínima contaminación microbiana debido a
thuringiensis y Bacillus toyonensis (Guinebretière et al., 2013 ; Liu
sus propiedades antibacterianas naturales, incluida la acidez, alta osmótica
et al., 2018 ; Vilas-Boas et al., 2007) y el grupo Bacillus subilis compuesto
presión, peróxido de hidrógeno y viscosidad ( Molan, 1992a, 1992b;
de Bacillus subtilis , Bacillus amyloliquefaciens; Bacillus athrophaeus, Ba-
Mundo et al., 2004; Snowdon y Cliver, 1996 ). A pesar de las diversas
cillus licheniformis; Bacillus mojavensis, Bacillus paralicheniformis , Bacillus
factores inhibidores, algunos microorganismos pueden sobrevivir en la miel,
pumilus , Bacillus safensis, Bacillus siamensis, Bacillus tequilensis, Bacillus
cularmente bacterias formadoras de esporas, que son las principales fuentes de
vallismortis, Bacillus velezensis y Bacillus xiamenensis (Dunlap y col.,
manipulación del tracto digestivo de larvas y abejas adultas, panales de cría,
2016; Jeyaram y col., 2011 ; Lai et al., 2014 ;). Además, Lysinibacillus fusi-
polvo ambiental, aire, suelo, polen, néctar y superficies florales ( Gilliam,
formis y Lysinibacillus sphaericus están estrechamente relacionados entre sí y
1979, 1997; Gilliam y Prest, 1978; Gilliam y Valentine, 1976).
con otras especies de Lysinibacillus (Ahmed y col., 2007).
La comunidad de bacterias formadoras de esporas aeróbicas reportadas en la miel
Se han identificado bacterias aeróbicas formadoras de esporas de la miel.
comprende Bacillus amyloliquefaciens , Bacillus badius, Bacillus cereus sensu
utilizando diferentes metodologías, incluido el aislamiento en selectivos, diferentes
lato, Bacillus circulans, Bacillus clausii , Bacillus coagulans, Bacillus firmus,
medios de cultivo entiales o cromogénicos, microscopía, pruebas bioquímicas,
Bacillus flexus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pu-
y la secuencia del (los) gen (es) del ARNr 16S ( Alippi, 1995 ; Alippi et al.,
https://translate.googleusercontent.com/translate_f
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Viabilidad de utilizar RFLP de genes de ARNr 16S amplificados por PCR para la diferenciación rápida de aislados de bacterias formadora…
⁎
Autor para correspondencia.
Dirección de correo electrónico: [email protected] (AM Alippi).
https://doi.org/10.1016/j.mimet.2019.105690
Recibido el 21 de junio de 2019; Recibido en forma revisada el 15 de agosto de 2019; Aceptado el 15 de agosto de 2019
On-line el 16 de agosto de 2019
0167-7012 / © 2019 Elsevier BV Todos los derechos reservados.
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AC López y AM Alippi
Revista de métodos microbiológicos 165 (2019) 105690
tabla 1
Lista de cepas bacterianas y condiciones de cultivo utilizadas en este estudio con números de acceso y referencias de GenBank.
Cepa
Número de acceso
Condiciones de cultivo a
Colección de culturaB
Referencia
m39
MG004187.1
TSA / 30 ° C
UB-CIDEFI
Alippi y Abrahamovich, 2019
m287b
MG004189.1
TSA / 30 ° C
UB-CIDEFI
Alippi y Abrahamovich, 2019
m163b
MG004188.1
TSA / 30 ° C
UB-CIDEFI
Alippi y Abrahamovich, 2019
m164b
MG004193.1
TSA / 30 ° C
UB-CIDEFI
Alippi y Abrahamovich, 2019
mv35
MG004186.1
TSA / 30 ° C
UB-CIDEFI
Alippi y Abrahamovich, 2019
xx
KP177517.1
TSA / 30 ° C
UB-CIDEFI
Bartel et al., 2018
m291b
MG004190.1
TSA / 30 ° C
UB-CIDEFI
Alippi y Abrahamovich, 2019
N / AC
TSA / 32 ° C
CCT
N/A
ATCC 11778
AF290546
TSA / 32 ° C
ATCC
N/A
m6c
KP005456.1
TSA / 32 ° C
UB-CIDEFI
Minnaard y Alippi, 2016
mv33
KU230015.1
TSA / 32 ° C
UB-CIDEFI
Bartel et al., 2018
m387
KP005455.1
TSA / 32 ° C
UB-CIDEFI
Minnaard y Alippi, 2016
m434
KU230027.1
TSA / 32 ° C
UB-CIDEFI
Bartel et al., 2018
LPcer1
KX431225.1
TSA / 32 ° C
UB-CIDEFI
Bartel et al., 2018
MexB
KU230012.1
TSA / 32 ° C
UB-CIDEFI
Bartel et al., 2018
MexC
KU230013.1
TSA / 32 ° C
UB-CIDEFI
Bartel et al., 2018
N/A
MYPGP / 37 ° C
ATCC
N/A
Fr231
KU232014.1
MYPGP / 37 ° C
UB-CIDEFI
Bartel et al., 2018
m448b
KX685159.1
MYPGP / 37 ° C
UB-CIDEFI
Bartel et al., 2018
BclENT
N/A
MYPGP / 37 ° C
UB-CIDEFI
N/A
N/A
TSA / 30 ° C
ATCC
N/A
N/A
TSA / 32 ° C
ATCC
N/A
NRRLB-1001
N/A
TSA / 30 ° C
NRRL
N/A
mv55
KU232018.1
TSA / 30 ° C
UB-CIDEFI
Bartel et al., 2018
mv68
MF187633.1
TSA / 30 ° C
UB-CIDEFI
Alippi y Abramovich, 2019
NRRL B-939
N/A
TSA / 32 ° C
NRRL
N/A
m327
MF187637.1
TSA / 32 ° C
UB-CIDEFI
Alippi y Abrahamovich, 2019
m435
KU232028.1
TSA / 32 ° C
UB-CIDEFI
Bartel et al., 2018
ATCC 10206
N/A
TSA / 32 ° C
ATCC
N/A
m336
MF187638.1
TSA / 32 ° C
UB-CIDEFI
Alippi y Abrahamovich, 2019
m425
N/A
TSA / 32 ° C
UB-CIDEFI
N/A
ATCC 7061 T
AY876289.1
TSA / 30 ° C
ATCC
N/A
mv41aA
MG366818.1
TSA / 30 ° C
UB-CIDEFI
Alippi y Abrahamovich, 2019
mv49b
KU232016.1
TSA / 30 ° C
UB-CIDEFI
Bartel et al., 2018
mv74
MF972935.1
TSA / 30 ° C
UB-CIDEFI
Alippi y Abrahamovich, 2019
mv81
KU232019.1
TSA / 30 ° C
UB-CIDEFI
Bartel et al., 2018
m116
KU232020.1
TSA / 30 ° C
UB-CIDEFI
Bartel et al., 2018
m288
MF187635.1
TSA / 30 ° C
UB-CIDEFI
Alippi y Abrahamovich, 2019
m332
MF187646.1
TSA / 30 ° C
UB-CIDEFI
Alippi y Abrahamovich, 2019
m339
MG366884.1
TSA / 30 ° C
UB-CIDEFI
Alippi y Abrahamovich, 2019
m350
KU232023.1
TSA / 30 ° C
UB-CIDEFI
Bartel et al., 2018
m357
MF187634.1
TSA / 30 ° C
UB-CIDEFI
Alippi y Abrahamovich, 2019
m358
MG345110.1
TSA / 30 ° C
UB-CIDEFI
Alippi y Abrahamovich, 2019
m360
MF187636.1
TSA / 30 ° C
UB-CIDEFI
Alippi y Abrahamovich, 2019
m363
KU232024.1
TSA / 30 ° C
UB-CIDEFI
Bartel et al., 2018
m414
KU232026.1
TSA / 30 ° C
UB-CIDEFI
Bartel et al., 2018
NRRL B-543
N/A
TSA / 30 ° C
NRRL
N/A
m13
MF187645.1
TSA / 30 ° C
UB-CIDEFI
Alippi y Abrahamovich, 2019
cm45
MF187639.1
TSA / 30 ° C
UB-CIDEFI
Alippi y Abrahamovich, 2019
m191
MF187644.1
TSA / 30 ° C
UB-CIDEFI
Alippi y Abrahamovich, 2019
m329
KU232021.1
TSA / 30 ° C
UB-CIDEFI
Bartel et al., 2018
m334
KU232022.1
TSA / 30 ° C
UB-CIDEFI
Bartel et al., 2018
m347
KP175515.1
TSA / 30 ° C
UB-CIDEFI
Bartel et al., 2018
m392
MF187640.1
TSA / 30 ° C
UB-CIDEFI
Alippi y Abrahamovich, 2019
ATCC 10792 T
D16281.1
TSA / 32 ° C
ATCC
N/A
mv50b
KU232017.1
TSA / 32 ° C
UB-CIDEFI
Bartel et al., 2018
Bacillus amyloliquefaciens
Bacilo badius
CCT 0196
Bacillus cereus
Bacillus circulans
ATCC 4515
Bacilo claussi
Bacillus coagulans
ATCC 35670
Bacilo firmus
ATCC 8247
Bacillus licheniformis
Bacillus megaterium
Bacillus mycoides
Bacillus pumilus
Bacillus subtilis
bacilo turingiensico
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Viabilidad de utilizar RFLP de genes de ARNr 16S amplificados por PCR para la diferenciación rápida de aislados de bacterias formadora…
m395
KU232025.1
TSA / 32 ° C
UB-CIDEFI
Bartel et al., 2018
RC
MF187641.1
MYPGP / 37 ° C
UB-CIDEFI
Bartel et al., 2018
m348
KP177514.1
MYPGP / 37 ° C
UB-CIDEFI
Alippi y Abrahamovich, 2019
Brevibacillus borstelensis
Brevibacillus brevis
( continúa en la página siguiente )
2
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AC López y AM Alippi
Revista de métodos microbiológicos 165 (2019) 105690
Tabla 1 ( continuación )
Cepa
Número de acceso
Condiciones de cultivo a
Colección de culturaB
Referencia
ATCC 8246
N/A
MYPGP / 37 ° C
ATCC
N/A
LAT169
KX102627.1
MYPGP / 37 ° C
UB-CIDEFI
Bartel et al., 2018
LAT170
KX431223.1
MYPGP / 37 ° C
UB-CIDEFI
Bartel et al., 2018
LAT171
KX431224.1
MYPGP / 37 ° C
UB-CIDEFI
Bartel et al., 2018
MG004185.1
MYPGP / 37 ° C
UB-CIDEFI
Alippi y Abrahamovich, 2019
ATCC 245
N/A
MYPGP / 37 ° C
ATCC
N/A
m533
MG001492.1
MYPGP / 37 ° C
UB-CIDEFI
Alippi y Abrahamovich, 2019
LMDZA
MG004191.1
MYPGP / 37 ° C
UB-CIDEFI
Alippi y Abrahamovich, 2019
NRRL B-383
N/A
MYPGP / 37 ° C
NRRL
N/A
mv82
MF187643.1
MYPGP / 37 ° C
UB-CIDEFI
Alippi y Abrahamovich, 2019
m291a
MF187632.1
MYPGP / 37 ° C
UB-CIDEFI
Alippi y Abrahamovich, 2019
m420
MF187642.1
MYPGP / 37 ° C
UB-CIDEFI
Alippi y Abrahamovich, 2019
N/A
MYPGP / 37 ° C
ATCC
N/A
ATCC 9545 T
NR_118956.1
MYPGP / 37 ° C
ATCC
Ash y col., 1991
PL36
N/A
MYPGP / 37 ° C
UB-CIDEFI
N/A
ATCC 13537 T
KT363749.1
MYPGP / 37 ° C
ATCC
Dingman, 2015, inédito
SAG 290
N/A
MYPGP / 37 ° C
UB-CIDEFI
N/A
SAG 10367
KT363748.1
MYPGP / 37 ° C
UB-CIDEFI
Dingman, 2015, inédito
N/A
MYPGP / 37 ° C
NRRL
N/A
MF972934.1
MYPGP / 37 ° C
UB-CIDEFI
Alippi y Abrahamovich, 2019
Brevibacillus laterosporus
Lysinibacillus fusiformis
mv119
Lysinibacillus sphaericus
Paenibacillus alvei
Paenibacillus apiarius
ATCC 29575
Paenibacillus larvae subsp. larvas
Paenibacillus larvae subsp. pulvifaciens
Paenibacillus polymyxa
NRRL B-510
Rummeliibacillus stabekisii
mv111
a
TSA: Agar tríptico de soja, MYPGP: Müller-Hinton - Levadura - Peptona - Glucosa - Agar piruvato.
b
ATCC: Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville , Estados Unidos; CCT: Coleção de Culturas Tropical, Fundaçao André Tosello, Brasil; NRRL: Utilización del norte
División de Investigación y Desarrollo, Peoria, Illinois, EE. UU.; UB-CIDEFI: Unidad de Bacteriología, Centro de Investigaciones de Fitopatología, Facultad de Ciencias
Agrarias y Forestales, Universidad Nacional de La Plata, La Plata, Argentina.
c
N / A: No aplica.
2004 ; Alippi y Abrahamovich, 2019; Sinacori et al., 2014 ; Wen y col.,
2. Materiales y métodos
2017 ). Técnicas microbiológicas clásicas, incluida la microscopía y
Las pruebas bioquímicas son laboriosas y requieren mucho tiempo. Solo comparaciones
2.1. Cepas bacterianas, medios y condiciones de cultivo
de secuencias de genes de ARNr 16S completas permiten la diferenciación entre
especies estrechamente relacionadas, en particular dentro de B. cereus y B. subtilis
Un total de 80 cepas de bacterias formadoras de esporas aeróbicas mesófilas
grupos o especies de Lysinibacillus ; mientras que las secuencias parciales o de baja calidad
enumerados en la Tabla 1 fueron examinados en este trabajo. La colección incluye 61
de los genes de ARNr 16S pueden producir una identificación errónea (Logan
aislamientos de miel u otras fuentes de colmena pertenecientes a la Colección
et al., 2009).
ción de la UB-CIDEFI (Unidad de Bacteriología del Centro de In-
Se han identificado cepas de bacterias formadoras de esporas estrechamente relacionadas.
vestigaciones de Fitopatología) y 19 cepas de International Cul-
Utilizado varios métodos novedosos o sofisticados, incluido el análisis
Colecciones actuales ( Tabla 1). Todos los aislamientos se cultivaron de forma rutinaria en
lisis de los espaciadores transcritos intergénicos (ITS) del rRNA 16Se23S, es decir , ITS-
agar tríptico de soja (TSA) (Britania®, Argentina) o en Müller-Hinton -
Huella digital por PCR o ITS-RFLP ( Daffonchio et al., 1998 ; Haque y
Agar levadura-péptona-glucosa-piruvato (MYPGP) ( Dingman y
Russel, 2005 ; Shaver y col., 2002 ); Espectroscopia Raman (Hutsebaut
Stahly, 1983) a la temperatura adecuada según la especie
et al., 2006 ), Desorción / ionización láser asistida por matriz, tiempo de
probado ( Tabla 1).
vuelo- Masa (MALDI-TOF-MS) (Fernández-No et al., 2013 ; Pomastowski
et al., 2019 ; Shu y Yang, 2017) y aprendizaje automático asistido
2.2. Preparación de ADN, amplificación por PCR y análisis RFLP de ARNr 16S
Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) ( Bağcıoğlu et al.,
genes
2019 ). Sin embargo, la mayoría de estas técnicas requieren un alto nivel de experiencia.
pertise y equipo caro.
Por otro lado, los polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción
Las células bacterianas para la extracción de ADN se cultivaron en el
temperatura y medio en condiciones aeróbicas durante 24 a 48 h de actividad.
Se ha empleado el análisis (RFLP) de los genes de ARNr 16S amplificados por PCR.
según la especie utilizada ( Cuadro 1). Para la preparación de ADN, un rápido
examinar la diversidad de varias especies formadoras de esporas aisladas de
El procedimiento que utiliza células enteras de placas se utilizó como se describió anteriormente.
diferentes fuentes ( Alippi et al., 2002 ; Ash et al., 1991; Jeyaram y col.,
escrito ( Alippi y Aguilar, 1998). Imprimaciones universales 27f (5´AGAGTT
2011 ; López y Alippi 2007, 2008 ; Manzano et al., 2003; Vaerewijck
TGATCMTGGCTCAG 3 ′) y 1492r (5´ TACGGYTACCTTGTTACGACTT
et al., 2001; Vardhan y col., 2011 ; Wu et al., 2006 ). Sin embargo, estos
3 ') descrito por Yu et al. (2013) fueron empleados. Se llevaron a cabo PCR
Los estudios se han centrado en la diferenciación de un número limitado de
en un volumen final de 25 μl según un protocolo descrito previamente
especies o grupos específicos aislados de diversos nichos ecológicos.
(Yu y col., 2013). Después de la amplificación del producto de PCR de aproximadamente
https://translate.googleusercontent.com/translate_f
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Viabilidad de utilizar RFLP de genes de ARNr 16S amplificados por PCR para la diferenciación rápida de aislados de bacterias formadora…
A la luz de las consideraciones anteriores, el objetivo de este estudio
Aproximadamente 1492 pb, se incubaron submuestras de 2 μl con endonucleasas
fue evaluar la viabilidad de utilizar RFLP de rRNA 16S amplificado por PCR
Rsa I, Hae III, Alu I, Hinf I, Taq I y Cfo I, de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
gen (s) mediante el uso de cebadores universales 27f / 1492r para un bajo costo, rápido
especificaciones (Promega®, CABA, Buenos Aires, Argentina). RFLP analizado
cribado para una diferenciación principalmente del complejo de esporas aeróbicas
La lisis se realizó por electroforesis en un gel de agarosa al 1.6% a 70 V para
formando bacterias a partir de la miel.
2 h. Se analizaron todos los aislamientos enumerados en la Tabla 1 .
3
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AC López y AM Alippi
Revista de métodos microbiológicos 165 (2019) 105690
Tabla 2
Alu I, Cfo I, Hae III, Hin fI, Rsa I y Taq I y patrones RFLP obtenidos en
Números de acceso de secuencias seleccionadas de ARNr 16S y genomas completos de
silico coincidió con los obtenidos experimentalmente cuando el (los) gen (es) del ARNr 16S
Tipo de cepas (T) utilizadas para análisis y comparaciones in silico .
las secuencias eran casi de longitud completa (> 1400 nucleótidos) (Tablas 3 y 4).
Son
La secuenciación del gen ARNr 16S proporciona resultados de alta calidad en
Número de acceso
Número de acceso
Gen de ARNr 16S
genoma completo
NR_118950.1
FN597644
Bacillus anthracis ATCC14578 T
AE016879
GCA_000007845.1
análisis, particularmente en el caso de bacterias formadoras de esporas aeróbicas
Bacillus atrophaeus JCM 9070 T
AB021181
GCA_001584335.1
(Logan y col., 2009).
Bacilo badius ATCC 14574 T
X77790.1
JXLP01000009
Bacillus cereus ATCC 14579 T
AF290546.1
AE016877
Bacillus circulans ATCC 4513 T
AY724690.1
AY724690
Bacillus clausii DSM 8716 T
X76440.1
CP019985
se observaron cuando las longitudes de secuencia eran <1400 nt ( Tablas 3 y 4).
Bacillus cytotoxicus NVH 391 T
CP000764
GCA_000017425.1
Por ejemplo, las cepas de B. amyloliquefaciens xx y mv35 mostraron diferencias
Bacillus coagulans ATCC 7050 T
AB271752.1
CP009709
encias en las bandas de firma obtenidas in silico para enzimas de restricción
Bacilo firmus NBRC 15306 T
NR_112635.1
BCUY01000205
Bacillus flexus NBRC 15715 T
NR_024691.1
BCVD01000224
Bacillus licheniformis ATCC 14580 T
NR_074923.1
AE017333
Bacillus mojavensis RO-H-1 T
JH600280
GCA_000507105.1
y B. megaterium cepa m435 para Alu I, y B. pumilus cepas m350 y
Bacillus megaterium ATCC 14581 T
NR_112636.1
JJMH01000057
m116 para Cfo I ( Tablas 3 y 4 ). Estas discrepancias in silico fueron solo
Bacillus mycoides ATCC 6462 T
NR_115993.1
ACMU01000002
encontrado cuando las secuencias analizadas eran inferiores a 1350 pb. Nunca-
Bacillus paralicheniformis KJ-16 T
KY694465
GCA_001042485.2
Bacillus pumilus ATCC 7061 T
NR_043242.1
ABRX01000007
Bacillus pseudomycoides DSM 12442 T
ACMX01000133
GCA_000161455.1
patrón para cada enzima de restricción cuando se prueba experimentalmente
Bacillus safensis FO-36b T
ASJD01000027
GCA_003097715.1
(Cuadro 4 ). Jeyaram et al. Han informado resultados similares . (2011)
Bacilus siamensis KCTC 3613 T
AJVF01000043
GCA_000262045.1
cuando examinaron cepas pertenecientes al grupo B. subtilis para
Bacilo simple NBRC 15720 T
NR_042136.1
BCVO01000086
Bacillus subtilis IAM 12118 T
NR – 112116.2
ABQL01000001
Bacillus tequilensis KCTC 13622 T
AYTO01000043
GCA_000507145.1
Bacillus thuringiensis ATCC 10792 T
D16281.1
ACNF01000156
gen de ARNr usando cebadores universales 27f / 1492r seguido de restricción
Bacilo toyonensis BCT-7112 T
CP006863
GCA_000496285.1
digestión usando Alu I, Cfo I, Hae III, Hin fI, Rsa I y Taq I, claramente
Bacilo vallismortis DV1 -F-3 T
JH600273
N/A
especies diferenciadas estrechamente relacionadas. Dentro de toda la colección analizando
Bacillus velezensis CR-502 T
AY603658
GCA_001461825.1
Bacilus xiamenenis HYC-10 T
AMSH01000114
GCA_000300535.1
Brevibacillus borstelensis NRRL NRS-
AB112721
GCA_003710865.1
Brevibacillus brevis NBRC 15304 T
AB271756.1
GCA_003385915.1
(Cuadro 4) y nos permitió distinguirlo de otros estrechamente relacionados
Brevibacillus laterosporus DSM 25 T
NR_112212.1
CP017705
Lysinibacillus fusiformis ATCC 7055 T
NR_112569.1
GCA_003049525.1
bacterias reportadas en la miel y de otras especies dentro de B. subtilis
Lysinibacillus sphaericus NBRC
NR_112627.1
GCA_002982115.1
Paenibacillus alvei DSM 29 T
AJ320491
GCA_000293805.1
B. mycoides, B. pumilus, B. thuringiensis y Br. borstelensis, respectivamente
Paenibacillus apiarius NRRL NRS-
NR_118834.1
GCA_002161865.1
que mostró patrones de restricción de Alu I específicos de la especie ( Tabla 5 ). Cuando
NR_118956.1
GCA_002003265.1
KT363749.1
GCA_002007765.1
Paenibacillus polymyxa ATCC 842 T
AJ320493.1
AFOX01000032
Rummeliibacillus stabekisii KSC-SF6g T
DQ870754.1
N / Aa
identificación bacteriana, dependiendo de la calidad de la secuencia. Como
Bacillus amyloliquefaciens ATCC
23350 T
1438 T
ATCC 9545 T
ATCC 13537 T
a
de cepas de referencia deben utilizarse para comparaciones y filogenia
Nuestros resultados corroboraron este criterio ya que al comparar RFLP
patrones obtenidos tanto in silico como experimentalmente, algunas diferencias
Alu I y Taq I ( Tabla 3 ), mientras que no se detectaron diferencias en un gel
(Cuadro 4). Se observó una situación similar para la cepa LPcer1 de B. cereus
Sin embargo, las cepas pertenecientes a la misma especie mostraron un RFLP único.
enzimas de estricción Rsa I y Cfo I.
En el presente estudio, un RFLP simple mediante amplificación por PCR del 16S
lizados aquí, se detectaron un total de 88 patrones de restricción para todos los
endonucleasas de restricción probadas ( Tabla 5 y Fig.1). Por ejemplo, el
grupo (Tabla S1). Se obtuvieron resultados similares para B. badius , B. cereus
sensu stricto, B. circulans, B. clausii, B. coagulans, B. firmus, B. megaterium,
15095 T
Paenibacillus larvae subsp. pulvifaciens
calidad; una secuencia casi completa (> 1400 nt, <0,5% de ambigüedad)
Se encontró que el patrón de restricción Alu I de B. licheniformis era único
818 T
Paenibacillus larvae subsp. larvas
Las secuencias de genes de ARNr 16S en bases de datos públicas son a veces de baja
utilizando Cfo I, ocho patrones de restricción específicos de especies únicos para B. cereus
sensu stricto, B. megaterium, B. mycoides, B. thuringiensis, Br. borstelensis,
Se observaron L. fusiformis, L. sphaericus y R. stabekisii, respectivamente.
(Cuadro 5 ). En el caso de Hae III, se obtuvieron nueve patrones únicos para
N / A: No aplica.
B. badius, B. circulans, B. clausii, B. coagulans, B. firmus, Br. laterosporus,
P. alvei, P. apiarius y P. polymyxa ( Cuadro 5). Cuando se usa Hinf I, 10
Se detectaron patrones únicos para B. badius, B. cereus sensu stricto, B.
circulans, B. clausii, B. coagulans, B. firmus, P. alvei, P. larvae subsp.
2.3. Análisis in silico de secuencias de genes de ARNr 16S
larvas, P. larvae subsp. pulvifaciens y R. stabekisii. Al usar Rsa I,
Se obtuvieron nueve patrones únicos para B. amyloliquefaciens, B. coagu-
Veintiséis especies diferentes pertenecientes a 5 géneros diferentes de
lans, B. licheniformis, P. alvei, P. apiarius, P. larvae subsp. larvas, P. larvae
Se analizaron las bacterias formadoras de esporas reportadas en la miel. In silico RFLP
subsp. pulvifaciens , P. polymyxa y R. stabekisii. Finalmente, al probar
El análisis se realizó utilizando endonucleasas Rsa I, Hae III, Alu I, Hin fI,
Taq I, se visualizaron nueve patrones únicos para B. circulans, B. coagulans,
Taq I y Cfo I, respectivamente. Un total de 94 fragmentos de restricción teóricos
B. firmus, fr. laterosporus, P. alvei, P. apiarius, P. larvae subsp. larvas, P.
Los patrones de ment se obtuvieron utilizando el software http: //nc2.neb.
larvas subsp. pulvifaciens y P. polymyxa.
com / NEBcutter2 /.
Probamos treinta y nueve secuencias de ARNr 16S de cultivos tipo
En el caso de grupos estrechamente relacionados, es decir , B. cereus y B. subtilis
(Bağcıoğlu et al., 2019 ; Fan et al., 2017, Guinebretière et al., 2013 ;
extraído de NCBI GenBank ( Tablas 2 y 3) y cincuenta y nueve ARNr 16S
Dunlap y col., 2016 ; Hutsebaut y col., 2006; Haque y Russel, 2005 ;
secuencias de cepas obtenidas de muestras de miel previamente
Jeyaram y col., 2011 ; Manzano et al., 2003; Shaver y col., 2002 ; Vilas-
portadoAlippi y Abrahamovich, 2019; Bartel et al., 2018; Minnaard
Boas et al., 2007), la técnica descrita aquí nos permitió diferenciar
y Alippi, 2016 ) (Tablas 1 y 3).
identificar especies estrechamente relacionadas. Como especies dentro de B. cereus
grupo reportado en miel ( B. cereus sensu stricto, B. mycoides y B.
thuringiensis ) se pueden separar utilizando AluI ( Tabla 5 y Fig.2 A) o
https://translate.googleusercontent.com/translate_f
4/12
4/9/2021
Viabilidad de utilizar RFLP de genes de ARNr 16S amplificados por PCR para la diferenciación rápida de aislados de bacterias formadora…
3. Resultado y discusión
Cfo I (Tabla 5 y Fig.2 B). B. cereus sensu stricto, B. thuringiensis y B.
mycoides mostraron distintos fragmentos Alu I de aproximadamente 600 pb (Fig.1 A, carril
Para determinar si los amplicones específicos de la especie de Bacillus,
C y Fig. 2 A, carril 1); 593 pb (Fig. 1A, carril L y Fig. 2A, carriles 3 y
Brevibacillus, Lysinibacillus, Rummeliibacillus, y Paenibacillus cepas
4) y 550 pb (Fig. 1A, carril J y Fig. 2A, carril 2), respectivamente. En
de miel , se realizaron digestiones de restricción con
Además, cuando se utiliza Cfo I, B. cereus sensu stricto mostró un distintivo
4
Página 5
AC López y AM Alippi
Revista de métodos microbiológicos 165 (2019) 105690
)
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sobre
I
Taq
907-359-214-50.
907-359-147-6.
891-292.
819-359-107
909-499-34.
771-541-138-62
771-528-138-45
771-540-138-41
771-484-129-9-6
772-465-127
771-223-138-10
771-483-425
770-541-122-31-14
561-409-380-120-35
561-408-380-120-8
535-380-374-120
908-534-35
904-312-232-39
582-500-467
500-408-359-168-33
500-359-176-51
908-573-48
907-507-6
545-488 771-541-138-11
771-506-138-6
905-359-173-44
906-359-147-6
906-359-38-38
892-359-145.
906-33-26
882-359-145
896-572-45-9
500-407-359-110-33
500-407-359-147-66
771-542-138-35.
(continuado
GeneBank.
I
Rsa
501-466-406-99.
501-437-406-75.
501-443-406-59.
501-406-343-35
439-406-354-146-68-18-11.
495-406-355-146-110
478-406-355-146-97
444-406-355-149-106.
439-406-355-146-53.
422-407-355-146-34
443-406-293.
420-406-355-146-52
438-406-357-146-111-18-11
433-406-355-146-130-19-11-5
409-406-355-146-70-20-11
406-368-355-146-104-19-11
491-406-357-149-146
438-406-357-146-101-18-11
451-406-357-146-140-18-11
501-435-406-96-19-11
503-453-406-102-19-11
438-406-357-146-110-18-11
438-406-357-146-74-18-11
405-357-146-112-11-2
444-406-355-146-110
439-406-355-146-75
501-436-406-91
501-407-406-75-19-11
468-467-406
501-416-406-73.
463-406-96
470-406-96
446-406-356-146-139-18-11
501-446-406-134-19-11
501-407-406-75-19-11
468-406-355-146-111
de
secuencias
ARNr
I
16S
Hinf
605-372-316-154-25.
606-372-287-129-25.
605-372-293-114-25.
605-372-193-90-25
975-319-123-25
977-345-165-25
977-328-172-25
977-324-164-25.
977-289-108-25
978-272-89-25
824-293-25
977-270-105-25
607-351-318-166-25-20
790-372-318-25
730-373-289-25
764-372-248-25
979-366-204
547-371-318-156-60-25
978-331-195-25
605-372-315-151-25
605-372-333-155-25-4
978-318-165-25
978-288-129-25
866-167 977-294-165-25
977-289-130-25
605-371-287-146-25
605-371-287-128-25
605-371-319-25-21
605-371-267-128-25.
371-314-25-25
605-314-25-25
917-275-194-60-51-25
605-372-326-189-25
605-372-287-130-25
977-318-166-25
publicado
sobre
basado
I
Taq
y
I,
sitio
III
Hae
Rsa
599-457-289-105-22.
599-457-260-81-22.
599-457-266-65-22.
599-457-166-41-22
564-365-292-91-74-34-2.2
565-457-291-117-34-22.
565-457-301-103-34-22
565-460-297-112-34-22
565-457-262-59-34-22
566-457-212-40-34-33-22
565-266-255-34-22
565-457-243-58-34-22
438-406-357-146-111-18-11
627-264-216-208-85-78-22-5
567-264-217-184-85-78-22
601-264-216-143-85-78-22
404-367-236-155-92-85-76-44
564-459-213-107-44-34-34-22
598-459-226-146-78-22
599-457-288-102-22
599-457-306-108-22
598-459-200-120-78-22
598-459-183-80-78-22
459-319-137-118
565-457-267-116-34-22
565-457-262-81-34-22
598-457-260-97-22
598-457-260-79-22
598-429-292-22
598-457-240-79-22
598-287-58-22
598-459-240-79-22
479-458-221-145-85-78-34-22
599-457-269-140-22
599-457-260-81-22
556-457-291-117-34-22.
fI,
Hin
III,
Hae
I,
reconocimiento
4 pb
a
con
Director de Finanzas
I,
Alu
enzimas
I
por
Director de Finanzas
869-426-235.
869-359-191
869-165-149.
869-319-97
352-345-336-223-182-2-2.
586-394-346-182-2-2.
569-381-346-182-2-2
585-393-346-182-2-2
530-346-337-182-2-2
513-347-318-182-2-2
534-351-182-71-2-2
511-346-336-182-2-2
392-348-336-216-182-2-2
414-346-337-214-182-6-2-2-2
354-346-338-193-182-2-2
388-346-337-182-152-2-2
385-348-336-222-182-2-2
395-348-336-222-182-2-2
433-348-245-236-182-101-2-2
380-346-337-219-182-2-2
388-346-337-237-182-2-2
531-350-348-182-2-2
528-358-348-182-2-2
396-348-181-77-27-2-2
535-394-346-182-2-2
530-359-346-182-2-2
867-385-229
868-359-191
868-250-223
868-357-171.
747-218
900-250-223
423-347-336-230-182-2-2
869-342-218
869-359-191
559-395-346-182-2-2
restricción
seis
generado
con
pares)
base adquirido
(en
bandas
Talla
I
Firma
Alu
430-265-207-201-186-173-68.
430-265-207-186-173-134-24.
430-207-187-186-173.
430-265-207-186-173-94
429-392-206-186-176-53
599-224-186-174-169-81-58-21
599-224-186-174-156-64-58-21
599-224-186-174-168-60-58-21
599-224-186-174-112-79-9
600-398-186-93-58-21-8
601-224-174-114-29
599-224-186-174-111
824-265-170-84-56-50-38
454-419-218-186-88-86-54
419-394-219-186-88-85-26
428-419-218-186-88-70
616-473-209-174-77
824-425-124-53-51
615-265-209-199-88-86-67
823-265-210-141-73-33
823-265-163-141-69-33
615-265-209-134-86-54
615-265-209-123-88-86-24-10
388-265-209-123-48
552-224-186-174-169-58-47-30-21
552-224-186-174-134-58-47-25-21
428-265-207-186-160-88-85-62
429-265-207-186-134-88-85-24
429-265-207-186-88-85-56-25
429-265-207-186-132-88-85-4
429-186-126-88-85-51
429-265-186-130
615-463-208-88-85-63
430-265-207-186-173-130-51
430-265-207-186-173-134-24
599-224-186-174-170-58-54-21
fragmentos
restricción
de
https://translate.googleusercontent.com/translate_f
5/12
4/9/2021
Viabilidad de utilizar RFLP de genes de ARNr 16S amplificados por PCR para la diferenciación rápida de aislados de bacterias formadora…
predicción
T
T
amyloliquefaciens
23350
3
Especies
T
434
T
badius cereus
14574 14579
11778
T
T
T
circula clausii
4513
8716
T
T
T
coagulanos
firmus flexo
licheniformis megaterio
15306 15715 14580
7050
14581
T
T
mycoides
6462
pumilus
7061
T
T
simplex subtilis
15720
12118
T
thuringiensis
10792
Bacilo
ATCC
m39-m287b-m163b-m164b-m291b
mv35xx Bacilo
ATCC
Bacilo
ATCC
ATCC
m6c-mv33
LPcer1
m387MexB
MexC
Bacilo
ATCC
Bacilo
DSMFr231
m448b
Bacilo
ATCC
Bacilo
NBRC
Bacilo
NBRC
Bacilo
ATCC
mv55-mv68
Bacilo
ATCC
m327m435Bacilo
ATCC
m336Bacilo
ATCC
m330-m288-m339-m354-m357-m358
mv41aA-m363-m414-m360-mv49bmv74mv81m350m116
Bacilo
NBRC
Bacilo
YO SOY
m392-cm45-m191-m13-m347-329-334
Bacilo
ATCC
Mesa
Teórico
5
Página 6
AC López y AM Alippi
Revista de métodos microbiológicos 165 (2019) 105690
I
Taq
772-494-137-8
771-269-138-7
499-395-357-202-33
499-395-303-202-9
499-395-320-202-35
894-339-202-35
894-275-202-6
879-562-45-29
908-506-8908-562-45
908-505-6789-568-120-50
789-504-120-9
645-528-260-56
788-473-120-49-7
789-515-120-28
701-513-120
789-570-120-42
904-531-14
904-508-10
I
Rsa
440-406-356-146-63
440-406-339
412-400-355-146-119-19-11-9
415-398-355-146-74-19-11
424-405-355-146-101-19-11
454-405-355-146-110
425-405-355-146-46
503-448-406-129-18-11
503-411-406-73-18-11
503-415-406-66-18-11
503-409-406-72-18-11
484-340-170-146-144-137-91
443-340-235-170-146-73-15
596-526-311-34-22
489-405-344-146-38-15
462-405-344-146-80-15
462-405-344-146-80-15
476-405-342-147-136-15
434-406-357-146-101-18-11
409-406-357-146-75-18-11
I
Hinf
sitio
978-290-118-25
870-290-25
1001-263-183-39
1001-263-129-15
1001-252-156-41-9-2
1001-304-165
1001-275-101
978-328-184-25
978-291-128-25
978-295-121-25
978-289-127-25
1167-335-25
1103-294-25
801-338-325-25
1072-332-25-8
919-313-195-25
919-313-195-25
799-370-327-25
893-339-156-85
893-314-130-85
III
Hae
566-457-263-69-34-22.
565-301-263-34-22
598-457-177-134-44-34-22
598-457-173-80-44-34-22
598-457-199-107-44-34-22
457-410-199-188-116-78-22
457-410-188-170-78-52-52
598-459-223-135-78-22
598-459-186-79-78-22
598-459-190-78-72-22
598-459-184-78-78-22
1124-308-73-22
1133-267-22
596-526-311-34-22
286-247-235-231-215-123-78-22
286-247-240-231-208-123-78-22
286-247-240-231-208-123-78-22
689-288-222-222-44-34-22
598-459-209-70-44-37-34-22
598-459-184-70-44-34-22-11
reconocimiento
4 pb
a
con
enzimas
I
Director 531-347-347-182-2-2
de Finanzas
531-346-182-122-2-2
412-346-337-181-175-31-2-2
358-346-337-181-151-31-1-1
385-346-337-208-181-2-2
394-346-337-181-177-31-2-2
346-337-330-181-148-31-2-2
413-348-336-232-182-2-2
357-348-336-195-182-2-2
400-348-336-232-182-2-2
356-348-336-193-182-2-2
421-346-336-239-181-2-2
357-346-336-198-181-2-2
348-344-336-242-181-34-2-2
348-336-324-244-181-2-2
366-348-336-217-181-2-2
364-348-336-181-101-2-2
423-346-336-231-181-2-2
382-360-348-182-165-8-2-2
380-359-348-182-161-8-2-2
restricción
seis
con
adquirido
bandas
I
Firma
Alu
600-224-186-174-122-58-26-21
599-224-186-174-162-26
403-229-210-200-98-81-33-4
403-212-207-205-189-81-74-33-4
425-403-212-161-159-46-43-12
452-403-212-181-179-46-33
403-370-212-161-152-46-33
615-246-209-207-174-64
615-209-207-190-174-27
615-216-209-207-174-64.
615-209-207-189-174-25
461-419-216-186-157-88
419–216-186-116-88
587-422-186-160-88-46
637-364-186-163-73-14
637-406-186-135-74-14
637-404-186-73-20-14
419-390-216-186-88-87-72-62
615-215-209-207-86-85-32
615-209-207-192-86-85
larvas
.
.pulvifaciens
subsp
subsp
apiarius larvas
larvas
)
T
borstelensis brevis
T
stabekisii
T
laterosporus fusiforme
T
https://translate.googleusercontent.com/translate_f
sphaericus
T
alvei
T
polymyxa
T
6/12
4/9/2021
Viabilidad de utilizar RFLP de genes de ARNr 16S amplificados por PCR para la diferenciación rápida de aislados de bacterias formadora…
T
continuado
(
3
NRS-1438
Especies
15304
T
25
7055
15095
T
29
NRS-1438
9545
B-14154
13537
T
842
mv50b
m395
Brevibacillus
NRRL
RC-m348
Brevibacillus
NBRC
Brevibacillus
DSMlat169-lat170-lat171
Lisinibacilo
ATCC
mv119
Lisinibacilo
NBRC
m533-LMDZ
Paenibacillus
DSMmv82-m420-m291a
Paenibacillus
NRRL
Paenibacillus
ATCC
Paenibacillus
NRRL
ATCC
Paenibacillus
ATCC
Rummeliibacillus
KSC-SF6g
mv111
Mesa
6
Página 7
AC López y AM Alippi
Revista de métodos microbiológicos 165 (2019) 105690
)
página
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sobre
I
Taq
907-359-147 910-500
771-540-138 770-541-122 561-408-380-120
910-535
904-312-232 500-359-176
910-500 771-540-138
907-359-147 500-359-176 771-540-138
499-395-323-202
499-395-323-202
894-275-202 910-500
910-500 789-504-120
continuado
(
I
Rsa
501-437-406 438-406-354-146
444-406-355-149106
438-406-357-146
409-406-355-146
491-406-357-149146
438-406-357-146
503-453-406-102
438-406-357-146
439-406-355-146
501-407-406 501-407-406 440-406-356-146
405-398-355-146
425-405-355-146
425-405-355-146
503-410-406 503-410-406
443-340-235-170146
sitio
I
Hinf
I.
Taq
reconocimiento
y
I,
4 pb
a
Rsa
I,
con
606-372-287-130
975-319-123 977-324-164 607-351-318-166
764-372-248 979-366-204 547-371-318-156
606-372-287-130
978-288-130
978-289-130606-372-287-130
606-372-287-130
978-288-130
1001-263-1291001-263-1291001-263-129978-288-130 978-288-130
1100-294
III
Hinf
III,
enzimas Hae
600-457-260 564-365-292 565-460-297-112
438-406-357-146111
600-264-216-143
404-367-236-155
564-459-213-107
600-457-260
598-457-173
565-460-297-112
600-457-260 600-457-260 565-460-297-112
598-457-173 598-457-173 457-410-188-170
598-457-173 598-457-173
1133-267
Hae
I,
restricción
Director de Finanzas
I,
seis
Alu
con
I
Director de Finanzas
869-359-191 352-345-336-223182
585-393-346-182
395-348-336-216182
354-346-338-193182
395-348-336-222182
395-348-336-222182
388-346-337-237
571-424-348-182
535-394-346-182
868-359-191 869-359-191 531-347-347-182
358-346-337-181151
385-346-337-208181
395-348-336-216182
415-350-336-232182
360-350-336-190
420-350-335-232182
con
adquirido
digesto
pb
bandas
I
1490
de
Firma
Alu
430-265-210-186170
430-390-205-186170
600-224-186-170
824-265-170 428-420-220-190.
620-470-200-170
824-425-125 823-265-210-170
615-265-210-170
552-224-186-170
430-265-210-186
430-265-210-186170
593-220-186-170
400-210-190 425-403-210-160
425-403-210-160
615-210-200-170
615-210-200-170
420-390-220-190
fragmento
ARNr
16S
Amplificado por PCR
a
de
pares)
mv41aA-m363-m414-m360-mv49b-mv74-mv81-
base
(en
Talla
fragmentos
-434LPcer1-m387-MexB-MexC
restricción
T
https://translate.googleusercontent.com/translate_f
-mv50b-m395
borstelensis brevis
T
-m330-m288-m339-m354-m357-m358
laterosporus fusiforme
sphaericus
alvei
7/12
4/9/2021
Viabilidad de utilizar RFLP de genes de ARNr 16S amplificados por PCR para la diferenciación rápida de aislados de bacterias formadora…
amyloliquefaciens
badius
4
cereus
circula
11778-m6c-mv33
4515
0196
clausii
coagulanos firmus
35670
8247
detectable
Especies
Bacilo
m39-m287b-m163b-m164b-m291b-mv35-xx
Bacilo
CCT
Bacilo
ATCC Bacilo
ATCC
Bacilo
Fr231-m448b-BcIENT
Bacilo
ATCC Bacilo
ATCC
licheniformis
1001-mv55-mv68
megateriomycoidespumilus
subtilis
thuringiensis
15304
B
B-939-m327-m435
10206-m336-m425
7061
B-543-m392-cm45-m191-m13-m347-329-334
10792
m350-m116
Bacilo
NRRL
Bacilo
NRRL
Bacilo
ATCC
Bacilo
ATCC
Bacilo
NRRL
245-m533-LMDZA
B-383-mv82-m420-m291a
Bacilo
ATCC
Brevibacillus
RC-m348Brevibacillus
NBRC Brevibacillus
LAT169-LAT170-LAT171
Lisinibacilo
mv119 Lisinibacilo
ATCC
Paenibacillus
NRRL
Mesa
Gel
7
Página 8
AC López y AM Alippi
Revista de métodos microbiológicos 165 (2019) 105690
Cuadro 5
Patrones de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) de amplificación por PCR
Genes de ARNr 16S entre las especies aeróbicas formadoras de esporas utilizadas en este estudio.
Especies
I
Taq
I
Rsa
487-339-234-170
489-405-344-146
462-405-344-146
476-405-342-147136
434-406-357-146101
sitio
I
Hinf
800-338-325 1072-332
920-313-195 800-338-325 893-314-130
reconocimiento
4 pb
a
con
III
enzimas Hae
Patrón obtenido con enzima de restricción:
645-528-260 788-473-120 701-513-120 789-570-120 910-500
596-526-311 286-247-235-231215
286-247-240-231215
689-288-222 598-457-173
Alu yo
Cfo I
Hae III
Hinf yo
Rsa I
Taq I
Bacillus amyloliquefaciens
A
A
A
A
A
A
Bacilo badius
B
B
B
B
B
B
Bacillus cereus sensu stricto
C
C
C
C
C
C
Bacillus circulans
D
D
D
D
B
D
Bacilo clausii
mi
B
mi
mi
D
mi
Bacillus coagulans
F
D
F
F
mi
F
Bacilo firmus
GRAMO
D
GRAMO
GRAMO
B
GRAMO
Bacillus licheniformis
H
mi
A
A
F
H
Bacillus megaterium
I
F
H
H
B
B
Bacillus mycoides
J
GRAMO
C
H
B
C
Bacillus pumilus
K
A
A
A
GRAMO
A
Bacillus subtilis
A
A
A
A
GRAMO
H
bacilo turingiensico
L
H
C
H
C
C
Brevibacillus borstelensis
METRO
I
H
I
D
I
Brevibacillus brevis
norte
mi
H
I
H
I
Brevibacillus laterosporus
norte
D
I
I
H
J
Lysinibacillus fusiformis
O
J
H
H
I
B
Lysinibacillus sphaericus
O
K
H
H
I
B
Paenibacillus alvei
PAG
L
J
J
J
K
Paenibacillus apiarius
Q
B
K
K
K
L
Paenibacillus larvae subsp.
R
B
L
L
L
METRO
R
B
L
METRO
METRO
norte
Paenibacillus polymyxa
PAG
L
METRO
K
norte
O
Rummeliibacillus stabekisii
O
METRO
H
norte
O
B
Total
18
13
13
14
15
15
larvas
Paenibacillus larvae subsp.
pulvifaciens
restricción
seis
con
I
Director de Finanzas
352-345-336-220182
352-345-336-220182
352-345-336-220182
420-350-335-232180
380-360-350-180160
fragmento de aproximadamente 585 pb (Figura 1B, carril C y Fig.2B, carril 1), mientras que B.
adquirido
thuringiensis y B. mycoides mostraron distintos fragmentos C fo I de aproximadamente
531 pb (Fig. 1B, carril H, y Fig. 2B, carril 3) y 535 pb (Fig. 1B, carril G,
bandas
y Fig. 2B, carril 2), respectivamente. Es interesante señalar que todos
las especies pertenecientes al grupo B. cereus presentan una Taq I distinta
I
Firma
Alu
590-420-186-160
640-400-186 640-400-186 420-390-220-190
615-215-210-200
patrón (C) diferente al resto de Bacillus y parientes de
fuentes de colmena ( Tabla 4 y Fig.1F, patrón C). Miembros de este grupo
mostró un alto grado de similitud con solo 7-9 nucleótidos dispersos
diferencias en la secuencia del gen del ARNr 16S ( Ash et al., 1991 ; Daffonchio
et al., 1998; Wu et al., 2006 ), estas diferencias fueron suficientes para permitir
Identificación por PCR-RFLP en el presente estudio. Además, probamos in silico
el resto de especies del grupo, es decir , B. anthracis, B. cytotoxicus, B.
pseudomycoides y B. toyonensis y pudieron discriminar entre
ellos utilizando Cfo I (Tabla S2). Manzano y col. (2003) encontró diferencias
entre estas especies mediante el uso de la digestión enzimática de gyrB por Sau3A I,
mientras que Daffonchio et al. (1988) no encontraron diferencias aparentes en su
análisis del ARNr 16S-23S ITS. En estudios previos, encontramos diferentes
diferencias entre B. cereus y B. mycoides con un ensayo de PCR-RFLP utilizando
Cebadores específicos de bacilo U1 / U2 seguidos de digestión con Alu I o Hae III
(Alippi et al., 2002).
Además, dentro del grupo de B. subtilis estrechamente relacionado , la combinación
de los patrones de restricción Alu I y Taq I o Rsa I obtenidos para B. subtilis, B.
amyloliquefaciens, B. pumilus y B. licheniformis nos permitieron diferenciar
identificarlos dentro del grupo y a partir de los generados por el resto de
las especies probadas y reportadas en la miel (Tabla 5 , Fig.1A patrones A, H,
y K). Por ejemplo, un fragmento de 825 pb después de la digestión con Alu I fue
larvas
10367
pulvifaciens
subsp.
subsp.
encontrado en todas las cepas de B. licheniformis analizadas, mientras que está ausente en el resto de los
grupo ( Tabla 4 y Fig.1A, patrón H). Además, cepas de B. licheniformis
carecía de un fragmento de 430 pb que estaba presente en el resto del grupo
)
stabekisii
apiarius
continuado
larvas
T -PL36
larvas
polymyxa
T -SAG290-SAG
https://translate.googleusercontent.com/translate_f
(Tabla 4 y Fig.1A, patrón H). Por otro lado, las cepas de B. pumilus
carecía de un fragmento de Alu I de 170 pb presente en el resto del grupo
(Tabla 4 y Fig. 1A, patrón K). Cuando se usa Taq I, las cepas de B.
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Viabilidad de utilizar RFLP de genes de ARNr 16S amplificados por PCR para la diferenciación rápida de aislados de bacterias formadora…
29575
(
4
Especies
9545
13537
B-510
subtilis y B. licheniformis mostraron un patrón distintivo (H) diferente de
el patrón (A) observado en las cepas de B. pumilus y B. amyloliquefaciens
(Tabla 4 y Fig.1 F). Además, lospatrones de restricción de Rsa I obtenidos permitieron
Paenibacillus
ATCC Paenibacillus
ATCC Paenibacillus
ATCC Paenibacillus
NRRL Rummeliibacillus
mv111
Mesa
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Fig. 1. Patrones de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) de genes de ARNr 16S amplificados por PCR encontrados entre todos los aislamientos aeróbicos formadores de esporas analizados
( n = 80) digeridos con (A) Alu I, (B) Cfo I, (C) Hae III, (D) Hinf I, (E) Rsa I y (F) Taq I, respectivamente. (A) Alu I: Carril MM: Marcador de tamaño molecular en escalera de 100 pb
(InbioHighway®, Tandil, Buenos Aires, Argentina) (el tamaño se indica a la izquierda en pb). Carriles: A, B. amyloliquefaciens m39; B, B. badius CCT 0196; C, B. cereus m6c; D,
B. circula ATCC 4515; E , B. clausii Fr231; F, B. coagulans ATCC 35670; G, B. firmus ATCC 8247; H, B. licheniformis mv55; I, B. megaterium m327; J, B. mycoides m425;
K, B. pumilus m330; L, B. thuringiensis mv50b; M, Br. borstelensis RC; N, Br. laterosporus LAT170; O, L. sphaericus m533; P, P. alvei m291a; Q, P. apiarius ATCC 29575; R,
P. larvae subsp. larvas PL36. (B) Cfo I: Carril MM: Marcador de tamaño molecular en escalera de 100 pb (InbioHighway®, Tandil, Buenos Aires, Argentina). Carriles: A, B. amyloliquefaciens
m39; B, B. badius CCT 0196; C, B. cereus ATCC11778; D, B. circula ATCC 4515; E, B. licheniformis mv68; F, B. megaterium m435; G, B. mycoides m425, H , B.
thuringiensis ATCC10792 T ; Yo, fr. borstelensis m348; J, L. fusiformis mv119; K, L. sphaericus LMDZA; L, P. alvei mv82; M, R. stabekisii mv111. (C) Hae III. Carriles: MM:
Marcador de tamaño molecular en escalera de 100 pb (InbioHighway®, Tandil, Buenos Aires, Argentina) (el tamaño se indica a la izquierda en pb); A, B. amyloliquefaciens m163b; B, B. badius
CCT 0196; C, B. cereus mv33; D, B. circula ATCC 4515; E, B. clausii Fr231; F, B. coagulans ATCC 35670; G, B. firmus ATCC 8247; H, B. megaterium m327; Yo, fr.
laterosporus LAT170; J, P. alvei m420; K, P. apiarius ATCC 29575; L, P. larvae subsp. larvas PL36; M, P. larvae subsp. pulvifaciens ATCC13537 T . (D) Hinf I. Carriles: MM,
Marcador de tamaño molecular en escalera de 100 pb (InbioHighway®, Tandil, Buenos Aires, Argentina); A, B. subtilis m191 ; B, B. badius CCT 0196; C , B. cereus LPcer1; D, B. circulans
ATCC 4515; E, B. clausii Fr231; F, B. coagulans ATCC 35670; G, B. firmus ATCC 8247; H, B. thuringiensis ATCC10792 T ; Yo, fr. laterosporus LAT169; J, P. alvei m291a; K, P.
apiarius ATCC 29575; L: P. larvae subsp. larvas PL36; M, P. larvae subsp. pulvifaciens ATCC13537; N, R. stabekisii mv111. (E) Rsa I: MM: marcador de tamaño molecular 100 pb
escalera (InbioHighway®, Tandil, Buenos Aires, Argentina) (el tamaño se indica a la izquierda en pb); carril A, B. amyloliquefaciens m39; B, B. badius CCT0 196; carril C, B. cereus
m6c; D, B. clausii Fr231; E, B. coagulans ATCC 35670; F, B. licheniformis mv68; G, B. pumilus m360; H, Br. laterosporus LAT169; I, L. fusiformis mv119; J, P. alvei mv82;
K, P. apiarius ATCC 2957; L, P. larvae subsp. larvas PL36; M, P. larvae subsp. pulvifaciens ATCC13537 T ; N, P. polymyxa NRRLB-510; O, R. stabekisii mv11. (F) Taq I:
Carriles: MM, marcador de tamaño molecular en escalera de 100 pb (InbioHighway®, Tandil, Buenos Aires, Argentina), A , B. amyloliquefaciens mv35; B, B. badius CCT0196; C, B. cereus
m387; D, B. circula ATCC 4515; E, B. clausii m448b; F, B. coagulans ATCC 35670; G, B. firmus ATCC 8247; H, B. subtilis m347; Yo, fr. borstelensis RC; J, Br. laterosporus
LAT171; K, P. alvei m420; L, P. apiarius ATCC 29575; M: P. larvae subsp. larvas PL36; N, P. larvae subsp . pulvifaciens SAG 290; O, P. polymyxa NRRL B-510.
para diferenciar B. subtilis (G) y B. licheniformis (F) de B. amy-
con Alu I, Hae III, Hinf I y Taq I (Tabla 4 y Fig.1Carriles A, C, D y F
loliquefaciens (A) y B. pumilus (A) ( Cuadro 5 y Fig. 1 E). Similar respuesta
D y G, respectivamente); B. clausii mostró Alu I, Hae III, Hinf I y
Los resultados fueron observados por Jeyaram et al. (2011) con un ensayo PCR-RFLP
Patrones de Taq I ( Tabla 4 y Fig.1A, C, D y F, carriles E); B. coagulans
utilizando cebadores fD1 / rD1 seguido de una restricción con Rsa I o Cfo I.
también mostró patrones de Alu I, Hae III, Hinf I, Rsa I y Taq I (Tabla 4 y
Sin embargo, Wu et al. (2006) encontraron algunas limitaciones al intentar dis-
Figura 1A, C, D, E y F, carriles F, F, F, E y F, respectivamente), y finalmente,
tinguish entre los miembros del grupo B. subtilis y también tres especies
Las cepas de B. megaterium mostraron patrones únicos de Alu I y Cfo I (Tabla 4 y
en el grupo de B. cereus mediante el uso de restricción de ADN ribosómico amplificado
Fig. 1A, línea I y Fig.1B, carril F). Wu observó resultados similares
Análisis (ARDRA) de amplicones de PCR obtenidos con cebadores BeK1. Sobre
et al. (2006) con aislamientos de B. badius, B. clausii y B. coagulans para
por otro lado, cuando se prueban in silico, todas las especies pertenecientes a B.
Alu I y Taq I.
subtilis que no se han reportado en la miel, la combinación de
Alu I, Cfo I, Rsa I y Taq I nos permitieron diferenciarlos (Tabla S1).
Dentro del resto de las especies de Bacillus , B. badius mostró Alu I único ,
https://translate.googleusercontent.com/translate_f
Al analizar especies de Brevibacillus , Br. borstelensis, fr. brevis y fr.
laterosporus mostró patrones únicos de Alu I, Taq y Hae III respectivamente
que nos permitió diferenciarlos del resto de esporas aeróbicas
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Viabilidad de utilizar RFLP de genes de ARNr 16S amplificados por PCR para la diferenciación rápida de aislados de bacterias formadora…
Patrones de Hae III y Hinf I ( Tabla 4 y Fig.1 A carril B, Fig.1 C, carril B,
formadores encontrados en la miel ( Tabla 5 ). Además, las tres especies pueden ser diferentes
y Fig.1D, carril B); B. circulans y B. firmus mostraron patrones distintos
diferenciados entre ellos mediante el uso de Cfo I (Cuadro 5). Fue previamente
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Declaración de intereses en competencia
Ninguno.
Expresiones de gratitud
Esta investigación fue apoyada por la Agencia Nacional de Investigaciones
Científicas y Tecnológicas (ANPCyT, Argentina, Beca No. PICT 20172014). ACL es miembro de la Carrera de Investigación Científica del CONICET
(CCT La Plata, Argentina), y AMA es Miembro del Comité Científico
Carrera Investigadora del CIC (Prov. Bs. As.), Argentina.
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en miel por PCR-RFLP. (A): electroforesis en gel de un ARNr 16S amplificado por PCR
fragmento de gen de 1492 pb digerido con Alu I. Carriles: M, marcador de tamaño molecular
Escalera de 100 pb (InbioHighway®, Tandil, Buenos Aires, Argentina) (el tamaño es
indicado a la izquierda en bp); 1, B. cereus m6c; 2, B. mycoides m425; 3, B. thur-
catión de Bacillus y especies relacionadas aisladas de muestras de miel. En t. J. Alimentos
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fragmento del gen de ARNr 16S amplificado de 1492 pb digerido con Cfo I. Carriles: M,
análisis de fragmentos de estricción de genes que codifican ARNr 16S. Apl. Environm. Microbiol.
Marcador de tamaño molecular en escalera de 100 pb (InbioHighway®, Tandil, Buenos Aires,
Argentina) (el tamaño se indica a la izquierda en pb); 1, B. cereus m387; 2, B. mycoides
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informó que fr. brevis y fr. laterosporus se puede separar usando
Taq I ( Wu et al., 2006). Por lo que sabemos, no hay insinuaciones previas.
formación sobre patrones RFLP para Br. borstelensis .
En el caso de Lysinibacillus reportado en la miel, pudimos diferenciar
diferenciar la especie L. sphaericus de L. fusiformis utilizando Cfo I
( Tabla 5 y Fig.1B, patrones J y K, respectivamente). Con respecto a R.
stabekisii, patrones de restricción únicos con Cfo I, Hinf I y Rsa I fueron
obtenido ( Tabla 5 y Fig. Fig. 1Patrón B M, Fig.1 Patrón D N, y
Figura 1E patrón O). Hasta donde sabemos, este documento es el primer informe de
diferenciación de R. stabekisii por PCR-RFLP.
Por otro lado, especies de Paenibacillus reportadas en colmenares
fuentes, incluida la miel ( n = 6), se pueden separar utilizando Taq I o
Rsa I. Se informó anteriormente que una combinación de siete restricciones
endonucleasas ( Alu I, Msp I, Hae III, Hin fI, Cfo I, Rsa I y Taq I) y espeLos cebadores específicos U1 / U2 podrían separar 25 especies diferentes de Paenibacillus
entre ellos excepto en el caso de P. borealis y P. macquariensis
( Alippi et al., 2002 ).
Wu y col. (2006) desarrollaron un protocolo PCR-ARDRA utilizando Bacebadores específicos de cillus B-K1F / B-K1R para amplificación por PCR y dos
enzimas de restricción ( Alu I y Taq I) para diferenciar 15 cepas de referencia
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licheniformis mediante huellas dactilares masivas MALDI-TOF. Microbiol de alimentos. 33, 235–242.
diferenciar especies estrechamente relacionadas dentro de B. subtilis y B. cereus
grupos y algunas especies de Paenibacillus y Bacillus .
En conclusión, hemos encontrado que un ensayo de PCR-RFLP utilizando universal
cebadores 27f / 1492r y una combinación de tres enzimas de restricción,
Alu I, Cfo I y Taq I, fue adecuado para distinguir 26 especies diferentes
de
Bacillus, Brevibacillus, Lysinibacillus, Rummeliibacillus y
Paenibacillus. El método es simple y se puede utilizar para una preselección.
y aislar la diferenciación de las especies aeróbicas formadoras de esporas, que
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