Principales biomuléculas

Parte I: PRINCIPALES BIOMOLÉCULAS
I/ Los Aminoácidos y los Péptidos:
A/ LOS AMINOÁCIDOS:
1 Generalidades:
Los aminoácidos, aislados por primera vez en el siglo XIX, forman las
proteínas al asociarse linealmente.
Poseen un carbono central, con H, NH2 (amino), COOH (carboxilo) y una
cadena lateral R variable.
La región cte de los aa es siempre polar: presenta un grupo ácido con carga
negativa, y uno básico con carga positiva: NH3+ – CH – COOLos aminoácidos se diferencian por su cadena R.
Sólo 20 aminoácidos conforman las proteínas recién sintetizadas y son
codificados por el ADN. Después de maduración, las proteínas pueden presentar
más de 100 aa distintos, todos derivados de los 20 iniciales (EJ; Prolina >
Hydroxiprolina).
Los 20 aa iniciales se clasifican, entre otros, como -aminoácidos: Ambos
grupos, amino y carboxilo, se encuentran en posición . Reciben el nombre de aa
proteicos.
Muchos aa no proteicos son también vitales. Por ejemplo la -Alanina es un
importante neuroransmisor.
2 Aminoácidos proteicos:
Por las propiedades de su radical R podemos clasificarlos en 4 grupos:
Los aa NO POLARES son aquellos cuyo R no es polar, ni tiene carga:
 Alanina (Ala; A)
 Valina (Val; V)
 Leucina (Leu; L)
 Isoleucina (Ile; I)
 Prolina (Pro; P)
 Fenilalanina (Phe; F)
 Triptófano (Trp; W)
 Metionina (Met; M)




Los Aa POLARES pueden ser de tres tipos en función de su carga.
SIN CARGA, pueden ser básicos con grupos alcohol (OH) o tiol (SH):
Glicina, Glicocola (Gly; G)
Serina (Ser; S)
Treonina (Thr; T)
Cisteína (Cys; C)
1








Tirosina (Tyr; Y)
Asparagina (Asm; N)
Glutamina (Gln; Q)
CON CARGA NEGATIVA, son ácidos:
Aspartato (Asp; D)
Glutamato (Glu; E)
CON CARGA POSITIVA, son básicos:
Lisina (Lys; K)
Arginina (Arg; R)
Histidina (Hys; H)
3 Propiedades especiales de aa proteicos:
Gly es el aa más pequeño; Su R es un átomo de H. Se duda de su
naturaleza; ¿polar, o no polar?
Pro es el único aa que no tiene su grupo amino libre: se encuentra unido a R
por una estructura de ciclo pentagonal. Otros aa tienen ciclos aromáticos en R.
Solamente dos aa contienen un átomo de azufre: Met (tioeter) y Cys (tiol).
Todos los aminoácidos, salvo Gly, presentan en el C central del grupo
constante un centro quiral, produciendo efectos ópticos de polarización de la luz.
A diferencia de los glúcidos naturales todos de la serie D, los aa proteicos
son siempre de la serie L (L-aa), polarizando la luz en un ángulo positivo.
Todos los aa tienen propiedades espectroscópicas: absorven luz UV. Se
puede obtener con un colorímetro su absorvancia. MAX=220nm; para aa con cilos
aromáticosMAX=260nm.
4 Reactividad:
Carboxilo
+ Alcohol
+ Amina
+ Reductor
+ descarboxilación
Amina
+ Aldehído
+ Ninhidrina
> Ester
> Amida
> Alcohol
> Amina
> Imina
R – C = N – R’
> Fuerte oxidación
Esta última reacción es utilizada para confirmar la presencia de aa en
laboratorio, gracias a la aparición de un compuesto coloreado. No aparece en el
caso de Pro, puede aparecer una mancha amarillenta.
Todos los aa presentan propiedades acido – base. En función del pH
fisiológico, los grupos amino, carboxilo y otros grupos polares pueden
encontrarse o no ionizados. Por ello los aa se comportan como ácidos o bases,
respondiendo a las leyes de Bronsted y Lowry.
2
5 Propiedades ácido/base de los aminoácidos:
Cada ácido tiene su base conjugada y viceversa. Por ello se determina Ka,
cte de disociación del ácido en el punto en el que se alcanza el equilibrio entre
acido y base.
Ka = [Base] [H+] / [Ácido]
pKa = -log Ka
pH = -log [H+]
ECUACIÓN DE HENDERSON – HASSELBACH:
pH = pKa + log ([Base] / [Ácido])
Los grupos se disocian por orden decreciente de acidez. Un aminoácido
presenta siempre por lo menos dos grupos con actividad ac/base (amino y
carboxilo), con Ka propia para cada grupo.
A pH muy bajo, todos los grupos están protonados al máximo: COOH,
+
NH3 .
A medida que lo hacemos aumentar los grupos se disocian: El 50% de un
grupo se ha disociado ya cuando pH = pKa. Los estados de ionización se prosiguen
ordenadamente.
A pH elevado todos los grupos de han disociado: COO-, NH2.
EJEMPLO: Alanina.
COOH – CH – NH3+ COO- – CH – NH3+
CH3
CH3
[Ala +]
COO- – CH – NH2
CH3
[Ala 0]
pH = pKa1
50% [Ala +]
50% [Ala 0]
[Ala -]
pH = pKa2
50% [Ala 0]
50% [Ala -]
Podemos visualizarlo en un gráfico de las concentraciones en función del
pH:
 En los puntos donde la curva es vertical, sólo se encuentra una especie (Ala
+, Ala 0 o Ala -)
 En los valles, pH = pKa, y las concentraciones entre las dos especies son
iguales (pKa1, pKa2).
Conociendo el pH, podemos calcular en cada punto el estado de equilibrio
de las especies gracias a la ecuación de Henderson – Hasselbach.
El punto isoeléctrico pI es la media de los pK de equilibrio de [aa 0].
3
Si pH = pI, se encuentra la especie con carga neta nula.
Si pH < pI, carga neta +.
Si pH > pI, carga neta -.
EJEMPLO: Alanina;
pI= (pKa1 + pKa2) / 2 = 6,61
Los aminoácidos ácidos y los básicos presentan una curva con cuatro
regiones verticales y tres mesetas, pues tienen cuatro formas y tres pKa.
Los aa ácidos tienen dos mesetas (pK) con pH < 7. Las especies presentes
son: [aa +], [aa 0], [aa -], [aa 2-].
Los aa basicos tienen dos mesetas (pK) con pH > 7. Las especies presentes
son: [aa 2+], [aa +], [aa 0], [aa -].
Hys presenta una meseta central casi neutra (pH = 6).



6 Solución tampón:
Se trata de soluciones capaces de captar H+ y OH- neutralizando cambios
de pH.
Se forma por una alta concentración de ácido débil en sus dos formas
(acido + base conjugada), al 50%.
Para obtener un tampón con aa debe seleccionarse el aa cuyo pK a sea más
próximo al pH dado para la solución. (Caso ideal: pKa = pH).
A/ LOS PÉPTIDOS:
1 Generalidades:
Cortas cadenas de aminoácidos unidos linealmente. Algunos, no codificados
por el ADN, suelen derivar de la hidrólisis de proteínas y de otros péptidos, por la
acción de enzimas Proteasas.
Los dipéptidos se forman por dos aa. Por ejemplo, la insulina es un
dipéptido no derivado de proteína.
Los oligopéptidos se forman de menos de 20 aa.
Los polipéptidos son los péptidos más grandes. Incluyen a las proteínas.
Las uniones entre los aa son uniones covalentes que se producen entre el
grupo carboxilo del primer aa y el grupo amino del siguiente.
El péptido presenta por lo tanto polaridad: El primer aa presenta solo un
grupo amino libre: el amino terminal a-t. El último aa tiene sin embargo un único
grupo carboxilo libre: el carboxilo terminal c-t.
2 El enlace peptídico:
Se trata de un enlace covalente y rígido. Al producirse por ataque nucleófilo,
se desprende una molécula de agua.
4
NH2 – CH – COOH
R’
+
NHH – CH – COOH
R’’
NH2 – CH – CO – NH – CH – COOH
R’
R’’
+ H2O
El CO que queda del grupo COOH presenta un doble enlace. Al unirse con
el grupo amino del siguiente, el carbono reparte el doble enlace con la siguiente
proporción: 60 % C=O; 40 % C=N.
Este enlace doble entre C y N hace del enlace una unión rígida sin
propiedad de giro, a diferencia de los otros enlaces N – C y C – C.
Este enlace no es termodinámicamente favorable, y no suele darse
espontáneamente.
3 Propiedades de los péptidos útiles para valoración:
Los péptidos presentan propiedades ópticas, desplazando como los aa
proteicos el angulo de la luz polarizada.
También presentan propiedades químicas que permiten poner en evidencia
su presencia: la reacción de Binnet, exclusiva para proteínas y peptidos. En
presencia de los amino terminal, las sales de cobre producen color. La
intensidad del color es proporcional a la cantidad de péptidos.
Al igual que los aa que los conforman, los péptidos se comportan como
ácidos y bases.
4 Propiedades ácido/base de los péptidos:
Solo mantienen sus propiedades ac/base los grupo a-t, c-t, y aquellos
grupos de R ionizables.
Ala no tiene grupos ionizables en R, por lo tanto AlaAlaAla tiene los mismos
grupos ionizables que Ala, y su curva tendrá el mismo numero de mesetas y pKs.
Ala:
AlaAlaAla:
NH2 – CH – COOH
R
NH2 – CH – CO – NH – CH – CO – NH – CH - COOH
R
R
R
Sin embargo, los valores de esos pK cambian: Cuantos más aa hay de por
medio, más separados se encuentran los grupos  ionizables. En el caso de Ala,
pKa1 = 2,35; para AlaAla, pKa1 = 3,12; y en el caso de AlaAlaAla, pKa1 = 3,39.
La fuerza del grupo ácido carboxílico disminuye visiblemente.
Según aparecen en R más grupos ionizables, se añaden más mesetas a las
dos básicas (a-t y c-t).
AlaAlaLysAla:
5
NH2 – CH – CO – NH – CH – CO – NH – CH – CO – NH – CH – COOH
R
R
R
R
NH2
En el caso de varios aa iguales con grupos ionizables en R, todos ellos se
desprotonarían de golpe con el mismo pH. Ejemplo: LysLysLysLys tendría, al igual
que Lys, tres mesetas. Sin embargo, en la meseta correspondiente a NH2 de R, se
desprotonarían los grupos de 4 en 4, no de 1 en 1.
Para calcular el pI de un péptido tenemos que tener en cuenta esto último
como coeficiente.
Glu
Ala
Lys
Lys
NH2
COOH
COOH
R
NH2
NH2
pH BAJO
P 3+:
NH3+
COOH
COOH
R
NH3+
NH3+
pKa1
P 2+:
NH3+
COOCOOH
R
NH3+
NH3+
pKa2
P +:
NH3+
COOCOO-
R
NH3+
NH3+
pKa3
P 0:
NH2
COOCOO-
R
NH3+
NH3+
pKa4
P 2-:
NH2
COOCOO-
R
NH2
NH2
pH ALTO
6
En este caso encontramos cuatro pKs y cuatro mesetas en la curva (y no
cinco), pues los dos NH2 de R de Lys se desprotonan de un mismo paso.
Para el calculo de pI, es decir, el valor de pH para el cual hay 100% de [P
0], debemos utilizar pKa3 y pKa4, sin olvidar que [P +] ha de ser el doble de [P 2-]:
(P +) = 2(P 2-)
pI = (pKa3 + pKa4 – (log 2)) / 2
5 Oligopéptidos con actividad biológica:
No suelen ser de origen proteico.
Ala libre es de por sí un neurotransmisor:
NH3+ – CH2 – CH2 – COOH
Ala:
(Grupo carboxilo en ).
Carnosina: Ala_Hys.
Anserina: Ala_N-3-metil-His. Se encuentra como tampón ac/base en el
músculo.
Glutatión: Glu_Cys_Gly. Muy abundante en todos los seres vivos. Unión
Glu-Cys especial, mediada por el carboxilo del R de Glu, no por el -carboxilo.
NH3+ – CH – CH2 – CH2 – CO – NH – CH – CO – NH – CH2 – COOCOOR’
SH
El grupo tiol puede reaccionar reduciendo otra proteína. En ese caso queda
oxidado y pierde su protón. Dos moléculas de glutatión oxidadas pueden quedar
unidas por un puente disulfuro. Esta forma está presente en eritrocitos: mantiene el
hierro en forma ferrosa evitando que se oxide. Evita también la oxidación en otros
tipos celulares, por ejemplo, evitando enfermedades neurodegenerativas.
R’1 – S – S – R’2
Muchos Antibióticos son oligopéptidos o derivados de aa con uniones
particulares, como la Penicilina, Gramicidina S o Bacitracina A.
Gramicidina S:
Leu – D-Phe – Pro – Val – Orn
Orn – Val – Pro – D-Phe – Leu
Penicilina:
S
R – CO – NH – CH – CH
CH3
C
CH3
CO – N
C
COOH
Cys
Val
7
Muchos importantes péptidos son Hormonas, como, por ejemplo, la insulina
y el glucagón, de efectos contrarios, secretados en el páncreas, que controlan el
metabolismo de hidratos de carbono y lípidos. También lo son Serotonina,
Dopamina, Estamina o Adrenalina.
6 Los Neuropéptidos:
Son la mayor familia de péptidos con actividad biológica. Se forma de más
de 100 tipos de peptidos.
Los neuropéptidos (NP) se encuentran en el sistema nervioso. Pueden ser
neurotransmisores o tener diversas funciones moduladoras como transmisión
peptidérgica.
Los NP controlan y modulan el apetito, la agresividad, el dolor o la
memoria.
Endorfinas y Encefalinas se oponen a la transmisión del dolor. Son los
péptidos opioïdes u opiaceos. Presentan receptores en las mbrs de neuronas,
comunes a los de la morfina, produciendo el mismo efecto. (Morfina no es un NP).
Se relacionan con la acupuntura y también con el sistema inmune.
Las encefalinas son oligopéptidos: Tyr Gly Phe Leu; Tyr Gly Phe Met.
Las endorfinas presentan mayores pesos moleculares.
Muchos importantes neuropéptidos son hormonas secretadas en el eje
Hipotálamo-Hipófisis. Reciben el nombre de Factores de Liberación y controlan
toda la producción endocrina de nuestro cuerpo, como GnRH, hormona liberadora
de gonadotropinas, que controla los ciclos sexuales.
8
II/ Introducción a las Proteínas:
A/ Estructura de las proteínas:
1Generalidades de las proteínas:
Son polipéptidos, algunos de muy gran tamaño, cuya existencia se debe a
su síntesis por un ribosoma, bajo control de la información genética.
Su estudio y analisis son muy complejos. Han comenzado con las técnicas
de análisis con Rayos X.
La configuración de una proteína es la conformación debida a sus enlaces.
Si la configuración cambia la molécula es distinta, como en el caso de la
estereoisomería (L – D).
La conformación de una proteína cambia cuando giran sus enlaces, en
función de las interacciones entre sus aminoácidos, sin que cambie la molécula.
Una proteína puede cambiar constantemente de conformación.
EJEMPLO: Priones:
Cambio Conformacional
PrPC
Forma normal
PrPSc
Forma agresiva
Si por una mutación cambia o desaparece un aa, la prot puede perder sus
propiedades naturales. Algunas posiciones de aa se presentan invariables a lo
largo de la evolución.
2 Niveles estructurales:
Las proteínas presentan distintos niveles estructurales. El tipo de estructura
depende en gran medida de su tamaño.
Estructura primaria: Secuencia linear de aa, de n-t a c-t. Sirve para predecir
estructuras superiores.
Estructura secundaria: Ángulo y disposición de los aa respecto a los aa
colindantes. Algunas estructuras, como hélice o laminar, se repiten
frecuentemente en distintas proteínas.
Estructura terciaria: Plegamiento total en el espacio del conjunto de aa,
generalmente de aspecto globular. No todas las proteínas presentan este tipo de
estructura, descubierta con Rayos X.
Estructura cuaternaria: Asociación de varios polipéptidos proteicos en un
polímero. Solo en algunos casos. Por ejemplo, homodímeros o heterodímeros.
Cada nivel estructural es determinante sobre el siguiente.
Se habla de Proteínas Oligoméricas cuando estas forman un polímero por
enlaces de fuerza débil, como los puentes disulfuro.
Las proteínas de estructura secundaria también son llamadas Proteínas
Fibrosas. Son estructurales de los tejidos y poco solubles en agua. Presentan
diagramas sencillos de Rayos X.
9
Las proteínas de estructuras terciaria o cuaternaria también son llamadas
Proteínas Globulares. Son hidrosolubles pues al plegarse sobre sí mismas pueden
presentar en superficie sus regiones más hidrofílicas.
Las Estructuras Supersecundarias son secuencias de estructuras secundarias
que se repiten frecuentemente en proteínas globulares formando dominios
estructurales localizados. Por ejemplo, laminar; hélice; laminar…, o bien,
laminar; codo; laminar; codo…
3 Principales estructuras secundarias;Hélice:
Hélice es una de las estructuras más repetidas y muy estable. Puede
conformar proteínas fibrosas como las queratinas, o encontrarse en cierto
porcentaje en proteínas globulares.
En vista transversal se observa como un cilindro hueco que expone hacia el
exterior las cadenas R hidrofóbicas.
Longitudinalmente se presenta como una estructura helicoidal dextrógira
(que gira naturalmente a la derecha), pues siendo los aa de la serie L es
termodinámicamente más favorable.
Se forman, cada cuatro aminoácidos, enlaces de hidrógeno intracatenarios
entre O y N:
R’1 – O – H – N – R’2
Estos enlaces estabilizan notablemente la estructura secundaria limitando la
libertad de giro en los enlaces covalente simples de los aa.
Pro nunca se encuentra en hélice, pues su amino se encuentra unido a
R y no puede formar el enlace intracatenario: Rompería la cadena cambiando su
dirección, en una estructura llamada codo.
El poder rotatorio de la hélice depende de la rotación de cada aa + el valor
de rotación de la propia hélice. Por su forma la hélice tiene actividad óptica propia
+D.
Varios aa con grandes R no se encuentran cercanos en la hélice, pues no
cabrían.
Varios aa con igual pH fisiológico tampoco se encuentran cercanos en estas
estructuras, pues debido a su carga habría repulsión entre ellos y la hélice perdería
su valor rotatorio.
Por ejemplo, Lys Lys Lys o Glu Glu Glu. Cuando baja el pH, aparecen en
poli-Lys cargas que se repelen rompiendo la hélice. Ocurre lo mismo con poli-Glu
al aumentar el pH.
Hélice no siempre se puede deducir de la estructura primaria.
En ciertas condiciones de temperatura y humedad se pueden estirar las
hélices cambiando su estructura, como en el caso de la seda.
4 Principales estructuras secundarias;Laminar:
También llamada estructura en hoja plegada. Se observa como cadenas de
aa apiladas en un plano.
La estructura se estabiliza por medio de enlaces de hidrógeno
intracatenarios entre c-t y a-t de las cadenas.
10
Las cadenas pueden asociarse de forma paralela o antiparalela, siendo la
antiparalela la más estable pues presenta los átomos de N y C que han de unirse,
más cerca uno del otro.
Paralelo:
R
H
O
R
– N – CH – C – N – CH – C – N – CH – C –
H
O
R
H
O
O
R
H
O
R
H
– C – N – CH – C – N – CH – C – N – CH – C – N –
H
O
R
H
O
Antiparalelo:
R
H
O
R
– N – CH – C – N – CH – C – N – CH – C –
H
O
R
H
O
O
H
R
O
H
– C – CH – N – C – CH – N – C – CH – N –
R
O
H
R
Estas estructuras pueden formar proteínas fibrosas y también se encuentran
en cierta proporción en algunos dominios de proteínas globulares, como la
inmunoglobulina.
5 Principales estructuras secundarias; Codos:
Los Codos son estructuras secundarias formadas principalmente por Pro y
Gly.
Estas estructuras cambian la dirección inicial de la cadena debido al enlace
especial de Pro, cuyo a-t está unido a R. Se estabiliza por la formación de un
enlace de hidrógeno intracatenario.
El giro se produce a la derecha por ser termodinámicamente más estable.
En el caso exclusivo del colágeno, se puede formar de Hidroxiprolina.
11
CH2
Pro
CH2
CH2 –
O
CH – C – N – CH2
H
N
C=O
C=O
Gly
H–N
CH
CH
R1
R2
B/ Proteínas Fibrosas:
1 Las Queratinas:
Proteína fibrosa insoluble de secuencias muy repetidas de hélice, unidas
en estructuras superiores.
Tres hélices unidas longitudinalmente forman una protofibrilla. Varias de
estas últimas se unen en microfibrillas, varias de las cuales forman las
macrofibrillas.
Las macrofibrillas de distintos tipos de Queratinas se encuentran sobre todo
en las uñas y en el pelo.
Los enlaces laterales entre las hélices es mediado por puentes disulfuro
resultantes de la oxidación del tiol de Cys. Es el motivo por el que el pelo quemado
huele a sulfuro.
Cada tipo de Queratina tiene distinta proporción de Cys.
Cuanto más Cys presente, más puentes se forman y más rígida y quebradiza
será la fibra (%Cys (UÑAS, PEZUÑAS) >22).
Cuanto menos Cys presente, más flexible será la fibra (%Cys (PIEL, LANA, PELO) =
10).
2 El Colágeno:
Proteína fibrosa insoluble de secuencias muy repetidas de Hélices de
Colágeno, unidas en estructuras superiores.
Es una estructura también muy frecuente en tegumentos, ligamentos y
tendones en todos los animales.
Se forma principalmente de:
 33% Gly
 13% Pro
 4-OH-Pro
(Hidroxiprolina, Hyp)
 Lys
 5-OH-Lys
(Hyl)
12
Hyp y Hyl derivan de Pro y Lys respectivamente durante la maduración de la
proteína. Requiere la acción de Peroxidasas, y de la presencia de ácido ascórbico
y vitamina C.
Su plegamiento secundario forma una Hélice de Colágeno, levógira (hacia
la izquierda) debido al giro de Pro facilitado por Gly, y abierta dejando los R hacia
el exterior.
Existen 12 tipos de Hélice de Colágeno conocidas. En algunos también se
encuentra Cys.
El Tropocolágeno es la unidad fundamental de las Fibras de Colágeno. Se
trata de la unión longitudinal de tres Hélices de Colágeno, generalmente del mismo
tipo, que se retuercen una sobre las otras formando un cable firme y resistente.
La estabilidad del Tropocolágeno depende de las fuerzas de WW y de los
puentes de hidrógeno que se forman entra Hyp y Pro próximas.
Algunas Hexosas e Hidratos de Carbono se unen a Hyl de Tropocolágeno,
por medio de puentes de H, estabilizando la estructura.
Los Tropocolágenos se asocian entre sí formando estructuras superiores. Se
asocian unos con otros de manera ordenada, en estructura cabeza – cola.
Esta estructura se estabiliza por la formación de enlaces covalentes entre Lys.
Estos enlaces muy firmes mantienen y dan resistencia a nuestros cuerpos.
Con el tiempo van aumentando las uniones covalentes, haciendo el colágeno
más rígido y quebradizo, y menos elástico.
Desaminación oxidativa: Reacción mediada por la enzima Lisina Oxidasa
del grupo amino de R de Lys:
AMINA
R – CH2 – NH2
Desaminación oxidativa
ALDEHÍDO
R – CH2 – CHO
Por medio de esta reacción se forman dobles enlaces covalentes que
estabilizan la estructura general del colágeno. En concreto se une una Lys con
amino a otra oxidada y desaminada:
Lys
Hyl
R1 – NH – CH – CO – R2
(CH2)3
N
CH
(CH2)3
R1 – NH – CH – CO – R2
La síntesis de las hélices es realizada por los Ribosomas.
Después de maduración, están listas para ensamblarse de tres en tres. Otros
polipéptidos abundantes en Cys, los Pteropéptidos, colaboran en el correcto
ensamblaje, uniéndose en los extremos y luego rompiéndose y separándose.
13
Finalmente aparecen las estructuras superiores, que se forman directamente
en su lugar definitivo.
Proteína poco nutritiva por su alta concentración en Gly e incompleta su
poca variedad de aa.
Patología genética: Ausencia de Pteropéptidos. Animal no se puede tener en
pie.
Otras patologías: Artritis, Cirrosis hepática.
B/ Las Proteínas Globulares:
1Generalidades:
Solo algunas proteínas presentan estructura terciaria y/o cuaternaria. Se
denominan Proteínas Globulares.
Estas proteínas son solubles en disolventes polares. Se pueden encontrar en
el interior Car y en la MEC.
Muchas son de muy gran tamaño. Fueron fáciles de descubrir por ello.
Los R hidrofóbicos suelen encontrarse escondidos en el interior de la
estructura globular de la proteína, exponiéndose las regiones hidrofílicas hacia el
exterior.
La estructura supersecundaria es determinante en la estructura globular.
Algunas de estas proteínas presentan hasta 80% de dominios hélice y
laminar, al igual que Codos. La Albumina, por ejemplo, se forma básicamente
de esas tres estructuras secundarias.
Los Dominios Globulares son unidades muy señaladas de plegamiento,
como subconjuntos morfológicos dentro de la proteína globular.
Algunos de estos dominios están relacionados con Dominios Funcionales,
cuando presentan actividad catalítica.
Los Centros Activos son dominios estructurales y funcionales que son
activados o desactivados por medio de cambios conformacionales.
Las proteínas que cumplen varias funciones suelen tener varios dominios
estructurales y varios centros activos. En este caso varias conformaciones pueden se
funcionales.
2 Plegamiento de las proteínas globulares:
Pueden formarse distintos tipos de enlaces entre los aa a la hora de
estabilizar las proteínas en su estructura terciaria y cuaternaria.
El propio H2O estabiliza y fuerza el plegamiento espontáneo de la proteína
por el efecto hidrofóbico, escondiendo los R.
Debido al efecto hidrofóbico, los aa polares se encuentran generalmente en
la superficie, y los apolares en el interior de la proteína.
Prot + H2O = Aumento de la entropía
14
Pueden formarse puentes de hidrógeno intracatenarios, entre átomos
electronegativos: – O – H – O – u – O – H – N –. Son enlaces débiles que
estabilizan el plegamiento.
También pueden formarse, entre dos Cys, puentes disulfuro.
Una proteína puede plegarse de múltiples formas distintas. Influye tanto la
estructura primaria como los posibles cambios conformacionales.
En concreto una proteína de sólo 100 aa tendría 3100 posibilidades de
plegamiento. Tarda 10-13 segundos en probar una posibilidad. Por lo tanto:
tiempo de plegamiento = 10-13 . 3100 = 1,6.1027 años
Estos datos aclaran que una proteína no puede probar todas las
conformaciones posibles, y que debe plegarse rápida y definitivamente.
Este plegamiento controlado y directo recibe el nombre de estructura nativa.
Las Chaperoninas son proteínas que intervienen en el plegamiento,
ejerciendo como molde y acelerando el proceso.
Un pequeño cambio en el plegamiento de la proteína globular es tan
importante como un cambio en su estructura primaria. El paso de PrPC a PrPSc, por
ejemplo, depende de un pequeño cambio conformacional en un dominio
localizado.
Se puede hacer una predicción grosera del plegamiento de una proteína a
partir de su estructura primaria, por medio de la estructura supersecundaria.
EJEMPLO:
Arg Arg Arg Arg Ala Val Lys Ala Val Ser Pro Gly Val Pro Gly Gly Ala Ala Gly
?
h ol
Codo
h ol
Algunas mutaciones puntuales pueden no afectar al plegamiento de la
proteína. Por ejemplo, un cambio Asp > Glu no afecta pues ambos aa son polares
con carga negativa.
3 Desnaturalización de las proteínas globulares:
Hace referencia a un cambio en la estructura nativa de la proteína que
repercute en su actividad biológica.
En una proteína cuaternaria, la ruptura del polímero es causa de
desnaturalización, aunque se conserve la estructura terciaria.
En una proteína globular monomérica, un cambio conformacional que
impida la actividad biológica normal es causa de desnaturalización.
Algunos pequeños cambios no son causa de desnaturalización, por ejemplo,
la mutación puntual Asp > Glu.
En ocasiones es conveniente desnaturalizar las proteínas con el fin de
estudiar su estructura. Se puede lograr por diversas técnicas:
 Aumento de temperatura.
 Cambios de pH.
15
Aumento de fuerza iónica (FI).
Utilizando agentes desnaturalizantes, como lejía o detergentes.
Algunas proteínas resisten los cambios de temperatura, pH y FI
Mediante cambios de pH o utilización de algunos agentes desnaturalizantes,
la desnaturalización de las proteínas es reversible.
En el caso de detergentes, como SDS, la región polar se introduce en la
proteína globular, quedando las cabezas hacia el exterior. Esto modifica las
fuerzas de WW.
La desnaturalización se puso de manifiesto gracias a la Ribonucleasa. El
plegamiento de esta proteína es estabilizado por puentes disulfuro entre Met. Por
acción de alcohol y urea los enlaces se rompen. Posteriormente, en presencia de
O2, se forman nuevos enlaces distintos a los de la estructura nativa, quedando la
proteína inactiva. Ambos cambios son reversibles.


16
III/ Técnicas de purificación y análisis de proteínas:
A/ Preparación de muestras:
1 Homogeneización:
Previo al estudio de una proteína se debe localizar en el organismo que la
sintetiza. Lograremos purificarla conociendo sus propiedades biológicas, químicas
y físicas.
Una vez localizadas las células se procede a la homogeneización. Una vez
extraídas se procede a su ruptura. Se pueden utilizar diversas técnicas como la
batidora, ultrasonidos o el choque osmótico.
Para evitar la desnaturalización de las proteínas, se utiliza una solución
tampón, con baja temperatura y fuerza iónica.
El tejido queda triturado, y sus componentes homogeneizados.
2 Técnicas de Purificación de proteínas:
Las técnicas de purificación no son específicas para una proteína exclusiva.
Sirve para separar proteínas de una muestra en función de un criterio.
Las proteínas con valores iguales para el criterio empleado no se separan.
La conveniente combinación de técnicas de purificación permite purificar
una proteína deseada.
B/ La centrifugación:
1 Generalidades:
La técnica se utiliza para separar los componentes de una muestra en
función de su Coeficiente de Sedimentación S (Unidad Svedberg), el cual depende
del peso y la forma de cada partícula.
Para ello, la Centrifugadora es una máquina que somete las muestras a una
fuerza centrífuga, que depende de la gravedad y sobre todo de las revoluciones
por minuto.
Las Ultracentrífugas son las centrifugadoras más fuertes.
Los tubos con las muestras se colocan en el Rotor de la centrifugadora.
Existen varios tipos de Rotor en función de su inclinación, y de si esta es o no
variable.
El ángulo facilita y hace más efectiva la centrifugación. Si es muy inclinado
el tubo puede derramarse.
El tiempo al que se somete la muestra a fuerzas centrífugas también es
responsable de la situación final de los componentes.
2 La Centrifugación Diferencial:
Permite separar los componentes de la muestra, realizando una
centrifugación fraccionada y aplicando una fuerza cada vez superior.
17
En función de la proteína que deseamos analizar elegimos uno u otro
precipitado.
Si deseamos estudiar la fracción soluble de la muestra podemos centrifugar
directamente a 100 000 g.
MUESTRA HOMOGENEIZADA
Centrifugación a 100 g
Precipitado
Células no trituradas
SOBRENADANTE
Centrifugado a 4 000 g
Precipitado
Núcleos, Cloroplastos
SOBRENADANTE
Centrifugado a 15 000 g
Precipitado
Mitocóndrias
SOBRENADANTE
Centrifugado a 30 000 g
Precipitado
Lisosomas
SOBRENADANTE
Centrifugado a 100 000 g
Precipitado
Microsomas
Sinaptosomas
Ribosomas
SOBRENADANTE
Fracción Soluble
3 Centrifugación en Gradiente de Densidad:
Se crea un gradiente de densidad en el tubo en el que se centrifuga la
muestra. Suele utilizarse una disolución de sacarosa en agua, más concentrada
cuanto más cerca del fondo del tubo.
La muestra se coloca en la superficie. Después de centrifugado, cada
componente cesa su sedimentación cuando alcanza el estrato cuya densidad
coincida con la suya propia.
Se suele utilizar para separar orgánulos. Los orgánulos seleccionados
pueden ser marcados con enzimas marcadoras para asegurar en que estrato se
encuentra.
4 Ultracentrifugación analítica:
Se utiliza para el análisis de muestras, no su purificación. Es una técnica
muy cara de realizar, pues se precisa de una centrifugadora especial.
18
Sirve para obtener datos como, por ejemplo, el peso molecular (PM) de una
proteína, o la pureza de una muestra determinada.
Se debe trabajar con muestras de proteínas ya purificadas.
Se emplea un haz de luz para medir la Absorbancia de rayos UV (AUV) y/o
el índice de refracción del medio (n), para deducir el PM de la proteína.
C/ Precipitación, Liofilización y Dialisis:
1 Precipitación isoeléctrica fraccionada:
Es el tipo de precipitación fraccionada más común. Depende de la
solubilidad de las proteínas en función de su pI.
Cuando pH = pI la solubilidad de las proteínas es mínima pues son menos
polares. Tienden entonces a formar agregados y precipitar.
Cuando pH < pI hay repulsión entre cargas +.
Cuando pH > pI hay repulsión entre cargas -.
Haciendo variar el pH favorecemos los distintos pI de cada tipo de proteina
por separado. Podemos hacer precipitar así las distintas proteínas a distintos pH,
en función de su pI.
2 Precipitación fraccionada por eliminación del agua de solvatación:
Cada proteína necesita determinada cantidad de agua de solvatación. Al
eliminarse en agua de solvatación se facilita la unión entre las propias proteínas,
que precipitan.
Añadiendo determinadas sales como Sulfato amónico (SO4(NH4)2), hacemos
disminuir el agua se solvatación. Otras sales, como NaCl o KCl, ayudan a hacer las
proteínas más solubles en el agua.
Podemos
hacerlo
fraccionadamente,
si
aumentamos
la
[Sal]
progresivamente.
Según los tipos de proteínas pierdan su agua de solvatación propia, irán
fraccionando y podremos separarlas, generalmente para desecharlas y añadir más
sales hasta que obtenemos el precipitado que deseamos.
[Proteína]OSM disminuye a lo largo de las precipitaciones fraccionadas.
3 Dialisis:
Esta técnica suele emplearse para separar las proteínas purificadas de las
sales que se encuentran en solución contaminando la muestra.
Se emplea una Bolsa de Dialisis con microporos. En función de su tamaño
dejarán pasar a unas moléculas, y a otras no.
Se introduce la muestra en una bolsa, y la bolsa en un recipiente con mucho
agua distilada. La sal sale de la bolsa y el agua entra, hasta que las
concentraciones osmolares se igualan.
Se puede cambiar la bolsa a un nuevo recipiente con agua pura. Repitiendo
la técnica se elimina una cantidad considerable de sales.
19
Se puede utilizar, con el mismo fin, la ultrafiltración, sistema de filtración con
poros y embudo.
4 Liofilización:
En una muestra poco concentrada, elimina el agua sin dañar las proteinas.
Hay varios métodos.
Realizar una congelación rápida de la muestra seguida de Sublimación al
vacío, o Evaporación al vacío. Obtenemos polvo proteico.
Se puede realizar en concentración con geles, utilizando una bolsa de
Diálisis en un recipiente con gel que absorben la humedad.
D/ Cromatografía:
1 Generalidades:
Técnica de purificación y analítica. Puede separa los componentes en
función de distintos criterios:
 De Reparto: de su solubilidad.
 De Adsorción: de su polaridad. >DE INTERCAMBIO IONICO: de su carga.
 De Permeabilidad: de su tamaño.
 De Afinidad: de su especificidad biológica.
2 Cromatografía de Reparto:
Esta técnica suele utilizarse con aa. Se utilizan técnicas de tinción para
poder visualizar su situación durante el experimento.
Se puede realizar en placa fina o en columna. Se utilizan dos disolventes no
miscibles:
 La fase estacionaria está inmóvil en la placa o columna.
 La fase móvil se desplaza sobre la estacionaria.
En función de su afinidad por cada una de las fases, los componentes de la
muestra quedarán anclados en la fase estacionaria, o de desplazarán con la fase
móvil.
La separación de los componentes depende de su afinidad por una u otra
fase, y no de su tamaño.
3 Cromatografía de Adsorción, de Intercambio Iónico:
Esta técnica suele utilizarse para estudiar péptidos y pequeñas proteínas.
Se utilizan columnas con mallas de resinas cargadas eléctricamente,
llamadas Intercambiadores Iónicos. Las cargas son proporcionadas por
determinados productos que se unen fijamente a la malla de resina.
Se diferencian dos tipos:
 Intercambiador aniónico, con cargas +. pH inicial bajo.
 Intercambiador catiónico, con carga -. pH inicial alto.
Haciendo variar el pH, logramos que las proteínas caigan progresivamente,
en función de su pI.
20
Con un pH inicial extremo, todas las proteínas cargadas quedan retenidas.
Según hacemos variar el pH, las proteínas son liberadas ordenadamente, cuando
su pI = pH del medio.
En lugar de variar el pH, se puede hacer variar la [Sal] aumentando la
fuerza iónica de la columna.
EJERCICIO: ¿Cuál es el orden de obtención de los componentes de la siguiente
muestra, por la técnica de Cromatografía de Intercambio Aniónico?
MUESTRA:
pI
Quimiotripsinógeno
9,4
Hemoglobina
7,0
Lisozima
4,1
Ovoalbumina
4,9
EJERCICIO: Realizamos un análisis de una muestra con tres proteínas idénticas, que
sólo se diferencian por un aminoácido: A (Glu), B (Val) y C (Lys). Por la técnica de
Cromatografía de Intercambio Aniónico, obtenemos tres fracciones a: pH = 4,5; pH
= 7; y pH = 7,5.
¿Cuál es el pI de cada una de las proteínas?
4 Cromatografía de Permeabilidad:
Separa los componentes de una muestra en función de su tamaño o su
masa. Permite obtener el PM de las proteínas.
Se utilizan columnas con polímeros de resinas; algunos con textura de gel,
como los polímeros de glucosa. Se trata de partículas independientes formadas por
fibras poliméricas.
Estas partículas se hinchan en contacto con agua o con la fase móvil, y
pueden absorber compuestos de la muestra en función de su tamaño.
Las proteínas que pueden atravesar la resina salen de la columna por orden
de peso molecular, de mayor a menor: No es una filtración sino una cromatografía.
Se pueden recuperar por separado con un colector de fracciones.
En función del tamaño del poro de la resina, aquellas proteínas que son
demasiado grandes quedan retenidas en la superficie de la columna. En este
sentido, se asemeja a una filtración.
Debemos realizar un calibrado de la columna. Se realiza una recta de
calibrado de la siguiente relación:
log PM / Ve
-
Tenemos:
 V0: Volumen de exclusión, o de los intersticios entre partículas de gel.
 Vi: Volumen interno de las partículas de gel.
 Vt: Volumen total del lecho cromatográfico.
21
Vt = V0 + Vi

KD: Coeficiente de reparto; proporción de Vi que le resulta accesible a una
molécula del soluto (Para soluto de gran tamaño = 0).
KD = VACCESIBLE / Vi

Ve: Volumen de elución de un soluto. Viene dado por la expresión:
Ve = V0 + KD.Vi
EJERCICIO: ¿Cuál es el orden de obtención de los componentes de la siguiente
muestra, por la técnica de Cromatografía de Permeabilidad?
MUESTRA:
PM
Quimiotripsinógeno
25 000
Hemoglobina
64 000
Lisozima
14 000
Ovoalbumina
44 000
EJERCICIO: Se realiza una Cromatografía de Permeabilidad de una proteína, y
después de la misma proteína en presencia de SDS. Previamente se realiza el
calibrado de la columna, y se obtiene:
PM
Ve
12 400
206
25 000
184
44 000
165
68 000
153
240 000
115
330 000
106
670 000
90
Experimentando esta técnica con la proteína muestra, obtenemos los siguientes
resultados:
Ve
(mL)
- SDS
131
+ SDS
152
Realizar gráfico de calibrado.
¿Cuál es el PM de la proteína en cada caso?
¿Qué podemos deducir de la proteína por los resultados?
SOLUCIÓN:
PM(- SDS) = 140 000 g.mol-1
PM(+ SDS) = 74 000 g.mol-1
La proteína es de estructura cuaternaria: Se trata de un homodímero. SDS desnaturaliza y rompe el
polímero.
22
EJERCICIO: Se realiza una Cromatografía de Permeabilidad de una proteína,
después de la misma proteína en presencia de SDS, y finalmente en presencia de
SDS y Metanol.
Calculamos los PM de los resultados obtenidos: Un pico en el primer caso, un pico
en el segundo y dos picos en el tercero.
PM
(g.mol-1)
200 000
- SDS
- Metanol
+ SDS
- Metanol
+SDS
+Metanol
50 000
35 000
15 000
¿Qué podemos deducir de la proteína por los resultados?
SOLUCIÓN:
La proteína es un homotetrámero de PM = 200.000. SDS lo rompe en cuatro subunidades de PM =
50.000. Cada subunidad es un heterodímero. metanol rompe las dos subunidades básicas de PM
= 35.000 y PM = 15.000.
5 Cromatografía de Afinidad:
Es una técnica muy compleja y selectiva. Permite aislar totalmente una
proteína enzima en un único paso: rendimiento muy alto.
Separa las proteínas por su especificidad biológica, gracias a la formación
del complejo Enzima – Sustrato, responsable de la formación de un Producto:
S+E
ES
E+P
Se realiza en una columna con una resina específica, que debe ser
fabricada para el estudio de la proteína en cuestión. La resina incluye un sustrato
por el que la proteína enzima estudiada presenta afinidad.
Durante la cromatografía se forma el complejo ES. Los restos eluyen y la
proteína queda fijada en la columna.
D/ Electroforesis:
1 Generalidades:
Técnica de purificación y analítica. El criterio empleado es la carga de las
partículas de la muestra.
La movilidad de las partículas es proporcional a su carga y a la resistencia
que opone la fase estacionaria.
23
Se crea sobre un gel hidratado un campo electromagnético, gracias a dos
polos: - Cátodo; + Ánodo.
Las proteínas, en función de su carga, son arrastradas hacia uno u otro
polo.
2 Electroforesis de zona:
Se utiliza para purificar proteínas. Suele realizarse sobre un gel de Agar o
Poliacrilamida (antes se usaba papel) colocado sobre un vidrio refrigerado. La
muestra se coloca en una pequeña zona central.
En cada extremo del gel se coloca una cubeta con una solución tampón: una
con el ánodo y otra con el cátodo. El gel y la solución tampón se conectan con
papeles.
En función de su carga + o -, la partícula presenta movilidad negativa (hacia
el cátodo) o positiva (hacia el ánodo) respectivamente.
El peso y tamaño de las partículas modifica la velocidad a la que se
desplazan sobre la fase estacionaria.
En función del valor absoluto de su carga, la proteína alcanzará movilidad
nula en el punto en el que encuentra su pI. Los cambios de pH del gel modifican la
movilidad.
3 Electroforesis en geles de Poliacrilamida - SDS (PAGE-SDS):
Esta es una técnica analítica, que al igual que la ultracentrifugación analítica
y la cromatografía de permeabilidad, nos permite obtener el PM de los monómeros
de cada proteína.
Se realiza en presencia de agente desnaturalizante SDS, de manera que los
polímeros se separan. Además la carga de las proteínas queda solapada por las
cargas negativas de SDS.
Las proteínas-SDS se depositan sobre el gel en la región del cátodo. Todas
tienden a desplazarse hacia el ánodo debido a la carga de SDS.
Una vez realizada la técnica, las proteínas deben ser teñidas o sino pasarán
desapercibidas en el gel. La muestra purificada no puede recuperarse.
Para teñir las proteínas, estas son transferidas del gel a una membrana de
Nitrocelulosa, gracias a una cubeta de transferencia. En la membrana las proteínas
son mucho más fáciles de tratar.
A menudo se utilizan técnicas de tinción por Inmunotransferencia, basadas
en la especificidad del complejo Ac-Ag.
24
EJERCICIO: Trabajamos con Proteína X, PM = 140.000 g.mol-1: Realizamos
primero la técnica de Electroforesis PAGE-SDS, y posteriormente PAGE- SDS con
 metanol. Obtenemos los resultados siguientes. ¿Qué podemos deducir?
67.000
43.000
30.000
20.000
g.mol-1
 metanol
+  metanol
Proteína patrón
SOLUCIÓN:
Con SDS obtenemos una única banda alrededor de PM = 67.000 g.mol-1. La proteína es un
homodímero: 70.000 x 2 = 140.000 g.mol-1.
Con SDS y  metanol obtenemos sin embargo dos bandas distintas, a 30.000 y 40.000
g.mol-1 aproximadamente. Cada monómero de la estructura cuaternaria está formado a su vez por
dos heterodímeros.
EJERCICIO: Realizamos una electroforesis PAGE, luego PAGE-SDS:
- SDS:
300.000 g.mol-1
+ SDS: 100.000 g.mol-1 y 50.000 g.mol-1
¿Qué podemos deducir?
SOLUCIÓN:
Se trata sin duda de una proteína de estructura cuaternaria; un heteropolímero. Sin
embargo hay varias opciones: Dos subunidades de 100.000 g.mol-1 y dos de 50.000 g.mol-1, ó;
Una subunidad de 100.000 g.mol-1 y cuatro de 50.000 g.mol-1.
25
D/ Otros métodos:
1 Cálculo del pI de las proteínas:
El cálculo del pI de un péptido se calcula teniendo en cuenta los grupos
polares presentes, no aa por aa.
EJEMPLO; Ribonucleasa:
GRUPOS CARGADOS
COOH
NH2
Asp + Glu
Tyr
Hys
Lys
Arg
Número
1
1
10
6
4
10
4
pKa
4,7
7,8
4,7
9,9
6,5
10,2
12,0
Cuando la proteína R está protonada al máximo, tienen carga los
gruposNH2 (1), Hys (4), Lys (10) y Arg (4): 19 +.
R19+
pH:
R8+
4,7
R4+
6,5
R3+
7,8
R39,9
R1310,2
R1712,0
Podemos deducir el pI de la proteína, pues corresponde al pH en el que esta
presenta carga neta nula: R3+ > R0 > R3-. Por lo tanto:
Para pKa = pH = 9,9 ; 50 % [R3+], 50 % [R3-] = R0
pI = 9,9
2 Cálculo de resultados de purificación:
Homogeneizado
Precipitado
DEHE
Cromatografía


%.
mg de
Proteína
Actividad
encimática
Actividad
específica
Pasos de
purificación
Rendimiento
%
91.400
3.260
64,3
6,2
40.000
21.100
14.800
11.500
0.4
6.5
230
1860
14,8
523
4.205
100
53
37
29
Actividad Encimática de la muestra = UE
Actividad específica (AE); solo de nuestra enzima, en nuestra muestra AE =
UE/Mb de proteína.
Obtenemos una proteína purificada 4.205 veces, con un rendimiento de 29
26
IV/ Las Proteínas:
A/ Clasificación de las proteínas:
1Por su composición:
Proteínas simples: Sólo se forman de aminoácidos.
Proteínas conjugadas: Se forman de aa y grupos prostéticos unidos
fuertemente a la estructura primaria de la proteína.
Las apoproteínas son proteínas conjugadas. Por ejemplo, la Mioglobina y la
Hemoglobina.
2 Por su estructura:
Proteínas Fibrosas: Con estructura limitada primaria o secundaria. Por
ejemplo, Queratinas y Colagenos.
Proteínas globulares: Plegadas en estructuras terciarias o cuaternarias.
3 Por su función:
Las funciones de las proteínas son muy diversas.
Reserva: Almacenan sustancias. Por ejemplo, la mioglobina almacena O2.
Transporte: Transportan sustancias, generalmente sustancias no miscibles
con agua a través del torrente sanguíneo. Por ejemplo, la hemoglobina transporta
O2 .
Catalítica: Las proteínas que catalizan reacciones de sustancias, algunas
espontáneas acelerándolas, y otras permitiendo que se produzcan, reciben el
nombre de Enzimas. Son siempre globulares.
Contráctil: Por ejemplo Actina, Miosina, Tubulina.
Defensora o Inmune: Anticuerpos.
Tóxica: Toxinas, como Votox o Glicina.
Señales: Hormonas.
Receptores: Proteínas transmembrana, transductoras de señales.
Estructurales: Colágeno, Actina, Tubulina, Querantina, Agrecanes…
Transportadora:
Canales,
Transportadores
y
Bombas
iónicas
transmembrana.
Anticongelantes, de Unión Celular, …
B/ Relaciones estructura – función:
1 Generalidades:
Todas las proteínas presentan una estrecha relación entre su estructura y su
función.
Esta relación es patente por la afinidad que todas las proteínas
presentan por ciertos sustratos en un dominio de unión (secuencia concreta de aa):
Se trata de los Ligandos:
27
Proteína + Ligando
-
KD: Constante de disociación.
PL
KD = [P].[L] / [PL]
2 Técnica experimental de cálculo de KD:
Se realiza una Diálisis. Utilizamos una bolsa cuyo poro permite solo la
salida de L libre.
Se introduce en la bolsa una solución de [P] y [L] conocidas.
La bolsa se coloca en un recipiente con agua destilada. Sabemos que
EXT
[L] INICIAL = 0. Medimos [L]EXTFINAL y calculamos la constante de disociación.
3 Fracción de ligando unido (%):
Se trata de la parte de ligando que se encuentra unida a la proteína, es
decir la Saturación de la proteína.
-
: Fracción de ligando unido.
 = [PL] / ( [P] + [PL] )
-
KA se define como constante de afinidad. Se trata del inverso de KD:
KA = [PL] / [P].[L]
-
Por lo tanto,  = KA .[P].[L] / ( [P] + KA .[P].[L] ), es decir:
 = KA .[L] / ( 1 + KA .[L] )
-
En el caso de una proteína dímero, con dos lugares de unión para ligandos:
P+L
PL + L
pK1 o pK2
PL2
pK3
Si se trata de un homodímero, los dos dominios de unión son idénticos y pK 1
= pK2.
A menudo la unión del primer ligando provoca un cambio conformacional
en la proteína, dificultando o facilitando la unión del segundo.
Si el primer ligando no cambia la conformación de la proteína (pK3 = pK1 o
pK2 en función de dónde se ha unido el primer L), entonces:
 = ([PL] + 2[PL2] ) / ( [P] + [PL] + [PL2] )
28

KA

/ [L]
n = 2 (dímero)
n: nº de corte, correspondiente al nº
de L que puede unir la proteína.
n


 = n.KA.[L] / ( 1 + KA .[L] )
/ [L] = 2.KA - .KA

Generalmente la unión del primer ligando modifica la conformación de la
proteína: Se dice que hay Interacción.
3 Fracción de ligando unido teniendo en cuenta la interacción:
 = n.KA.[L]C / ( 1 + KA .[L]C )
-
C es el coeficiente de Hill:
 C = 1; No hay interacción.
 C > 1; Hay interacción positiva.
 C < 1; Hay interacción negativa.

En caso de interacción positiva, se favorece la unión del nuevo ligando. Es el
caso más frecuente de interacción:
/ [L]
[L]
[L]
nu







n



-
En caso de interacción negativa, se desfavorece la unión del nuevo ligando:
29
[L]





/ [L]









n
En estos casos podemos identificar n gracias a la curva, pero no KA, pues en
caso de interacción es solo un promedio.
Si el ligando es un gas, se utiliza la presión parcial del gas en lugar de 
para realizar la curva.
C/ Las Apoproteínas:
1 Generalidades, el grupo Hemo:
Hemoglobina y Mioglobina son dos proteínas conjugadas; Apoproteínas. Su
grupo prostético recibe el nombre Hemo, al encontrarse unidas a este reciben el
nombre de Holoproteínas.
El grupo Hemo posee un átomo de hierro Fe central. Éste tiene seis
posiciones de combinación: Cuatro de ellas unen el Fe a cuatro átomos de N del
grupo.
Cuando Hemo se encuentra unido a una de estas proteínas, una posición de
combinación del Fe se une fuertemente a una Hys de la proteína: Hys proximal
(F8), que tira de Fe hacia ella.
Hys distal bloquea la última posición de combinación del Fe, reservándola
para el O2 y evitando la unión con otras sustancias.
Durante la oxigenación, la proteína cambia de conformación; El átomo de
Fe se desplaza hacia el plano Hemo, arrastrando Hys proximal la cual queda
menos inclinada.
O2
Desoximioglobina
Mb
Oximioglobina
MbO2
El Hierro no se oxida formando Óxido de Hierro gracias a la protección
proteica.
Se forma Hierro Oxigenado: El grupo Hemo sujeta el átomo de O2, pero
puede soltarlo cuando la concentración en el tejido es baja.
30
2 La Mioglobina:
La Mioglobina es una proteína globular monomérica, formada por una
cadena con 8 tramos hélice. No hay interacción.
Su función es retener y reservar el O2 del cuerpo. Tiene un lugar de unión en
su único grupo Hemo.
 = [MbO2] / ( [Mb] + [MbO2] )
 = KA.[O2] / ( 1 + KA .[O2] )
La proteína se satura rápidamente en un medio con alta p(O2).
tiende a absorver y acumular el gas.
Se define p50 como la presión p(O2) a la que la proteína se satura
es decir, a la que [Mb] = [MbO2]. Para la Mioglobina, p50 = 1 Torr
fotocopia).
Cuanto menor es p50, mayor es la afinidad de la proteína por su
Al ser inverso a KA, utilizamos KD para realizar el cálculo;
Siempre
al 50 %,
(Gráfico
ligando.
 = (1/KD ).pO2 / ( 1 + pO2/KD ), es decir:
 = pO2 / ( KD + pO2 )
-
Para pO2 = p50;  = 0,5 = p50 / ( KD + p50 ), es decir:
p50 = 0,5 KD + 0,5 p50
KD = p50
 = pO2 / ( p50 + pO2 )
3 La Hemoglobina:
Se trata de una proteína globular de estructura cuaternaria. En concreto se
trata de un homotetrámero (n = 4).
Cada monómero que lo forma es similar a una proteína de Mioglobina, y
posee un grupo Hemo. Por lo tanto en total hay 4 grupos Hemo, y cuatro lugares
de unión al O2, uno por subunidad.
Las subunidades presentan interacción positiva, es decir, C > 1 (C = 2,8).
Para el caso de la Hb, p50 = 26 Torr. Es mucho mayor que en el caso de la
Mioglobina, por lo que presenta una afinidad mucho menor.
Gracias a estas propiedades, la Hb se caracteriza por liberar O2 cuando
hay poca presencia en el medio, y absorberlo en tejidos donde hay una alta
concentración, generalmente los pulmones.
31
Existen varios tipos de Hb, en función de los tipos de Subunidades. Estas
subunidades presentan ligeras diferencias, pero guardando siempre similitud a la
Mb. Hb se encuentra en los Eritrocitos.
 Hb A:
2 + 2
(Normal)
 Hb F:
2 + 2
(Sangre materna – Fetal)
 Hb A2:
2 + 2
(Patológica en altas concentraciones)
La diferencia entre los tipos de subunidades depende de cambios de aa en
posiciones no críticas. No implican grandes cambios. Hay 9 posiciones invariables
entre todos los seres vivos con Mb y Hb.
Al separar las subunidades, su afinidad por el sustrato aumenta, igualando
la de la Mb. Pierde sin embargo la capacidad transportadora.
La Hb es sintetizada en los reticulocitos del tejido hematopoyético, y es
liberada a la sangre en los Eritrocitos.
Es una proteína imprescindible en organismos de gran tamaño, pues es
capaz de absorber el O2 de los pulmones, pero también de liberarlo en los tejidos
alejados que necesitan respirar, como músculos o SN.
Tenemos, en este caso:
 = KA.pO2C / ( 1 + KA.pO2C )
 + . KA.pO2C = KA.pO2C
;
 = KA.pO2C.(1-)
log ( / (1-)) = log KA + C.log pO2
C = 2,8
C=1
[L]
Log ( / (1-))
nu
C=1
log pO2
La pendiente cambia. Tanto el primer como el último oxígeno tienen una
única posibilidad de unión, por ello la pendiente es C = 1.
La pendiente cambia para los oxígenos segundo y tercero, cuya unión es
favorecida y acelerada por la interacción positiva.
Debido a los cambios conformacionales, según se unen más O2, KA se hace
cada vez mayor, de tal manera:
 KA1 = 0,133.
 KA4 = 40.
32
Cuanto menor es p50, mayor es la afinidad de la proteína por su ligando.
Al ser inverso a KA, utilizamos KD para realizar el cálculo;
 = pO2C / ( KD + pO2C )
-
Para pO2 = p50;  = 0,5 = p50C / ( KD + p50C ), es decir:
KD = p50C
 = pO2C / ( p50C + pO2C )
EJERCICIO: Calcular  de Mioglobina en los pulmones y en los tejidos. Calcular 
de Hemoglobina en los pulmones y en los tejidos sin tener en cuenta C. Calcular 
de Hemoglobina en los pulmones y en los tejidos teniendo en cuenta la
cooperatividad. ¿Qué podemos deducir?
pO2(PULMÓN) = 100; pO2(TEJIDOS) = 20 ; p50(Mb) = 1; p50(Hb) = 26 ; C(Hb) = 2,8
SOLUCIÓN:
Para Mb:
PULMON = 99 %
TEJIDOS = 95 %
PULMON
Para Hb sin C:

= 79 %
TEJIDOS = 40 %
PULMON
TEJIDOS
Para Hb con C: 
= 98 %

= 36 %
Mb tiene mayor afinidad pues reserva oxígeno mientras Hb lo transporta hasta lugares donde
escasea. C de Hb aumenta su capacidad de absorber en pulmón y liberar en tejidos.
D/ La Hemoglobina:
1 Cambios conformacionales:
Como vimos, la Mb sufría un cambio conformacional entre sus estados
MbO2 y Mb. Ocurre algo similar en el caso de Hb.
Lógicamente, los cambios conformacionales que se producen en Hb al
recibir los primeros átomos de oxígeno modifican la proteína facilitando la entrada
de los siguientes.
En concreto, el desplazamiento de la Hys proximal del Hemo que ha
recibido el oxígeno se desplaza y tira de la cadena de aa, modificando la
estructura cuaternaria por la rotura de enlaces secundarios.
La rotura de 8 enlaces iónicos es responsable del paso de la forma tensa T a
la relajada R, los dos únicos estados posibles.
33
FORMA T:
1
ENLACES
que intervienen en el
cambio conformacional
2
+
1
+
+
+
+
+
2
O2
O2
FORMA R:
at

1
+
ct
-
+
+
-
ct
at
2
+
ct
+
ct
1
+
+
+
+
+
+
-
2
+
-
En conformación R, el agua podría llegar hasta el Fe II y transformarlo en Fe
III y dejando el grupo Hemo inutilizable. Otras moléculas, como CO, pueden
dañar el grupo. Por ello la posición de Hys distal protectora es fundamental.
Se considera la Hb Proteína Alostérica, pues posee dominios de unión para
otras partículas.
En el caso de la Hb Fetal, las pequeñas diferencias entre las subunidades  y
 la hacen menos estable en su forma R, ante todo debido al cabio Hys 143 () >
Ser. Se dificulta además la unión de 2,3-BPG.
Una mutación en Leu 143 () es responsable de la disociación de
subunidades.
2 Influencia del pH en la conformación de la Hemoglobina:
El pH modifica la afinidad de la Hb por el oxígeno. En concreto, al
aumentar el pH del medio, la afinidad disminuye.
Los protones se unen a la proteína disminuyendo su afinidad, pero sin
anularla. Se deben unir por lo tanto a un dominio distinto que el oxígeno.
34
H+ son considerados Inhibidores Alostéricos de la proteína. Se acumulan
primero los enlaces Hys – Asp internos de la subunidades  (en dibujo, enlaces en
forma de asa), cuando se sobrepasa el pI de Hys y queda protonada. Reforzando
estos enlaces refuerzan la forma T.
Si sigue aumentando el pH, H+ se acumula en los enlaces at – ct, protonando
los grupos amino y reforzando los enlaces. Esto estabiliza aún más la forma T,
dificultando la entrada de oxígeno.
3 Otros Efectores Alostéricos:
H+ no es el único efector alostérico de la Hb. Entre ellos se ecuentran
también el CO2, o el 2,3-BPG.
El CO2 es un inhibidor, con un sitio de unión en Hb distinto al del oxígeno,
pero es menos frecuente (10-20 %) que H+.
El dióxido de carbono se unen en los extremos at de , estabilizando la
forma T:
R – NH – COO4 El 2,3-Bifosfoglicerol:
2,3-BPG es sintetizado a partir de precursores en el interior de eritrocitos.
Es un inhibidor alostérico de Hb, que actúa como intermediario durante la
glicólisis, o formación de Glucógeno a partir de Glucosa.
GLUCOSA
1,3-BPG
GLICOLISIS
MUTASA
(Retrocontrol)
2,3-BPG
El paso de 1,3-BPG a 2,3-BPG es controlado por la enzima Mutasa.
Al producirse una disminución de la presión en el medio, disminuye también
pO2, produciendose el denominado mal de alturas.
Tras un periodo de adaptación, este mal es superado sin problemas, al
regularse correctamente la síntesis de Mutasa, haciendio disminuir la
concentración de 2,3-BPG.
La sangre almacenada no libera el O2 tan fácilmente, y parece presentar
mayor afinidad. Esto se debe a la degradación del 2,3-BPG.
5 Inhibidores No Alostérico:
El Monóxido de Carbono es un inhibidor no alostérico de la Hb, pues se une
al mismo dominio de unión que el oxígeno, bloqueándolo. Se une al Fe con 200
veces más afinidad que O2.
35
Cuando CO se une a Fe lo hace definitivamente, pero aumenta también la
afinidad de los otros grupos Hemo, como lo haría el propio O2.
Cuando se el primer CO, estabiliza la forma R de la proteína. Cuando hay 4
grupos CO unidos, la proteína queda inutilizable.
En condiciones normales, una persona no fumadora presenta 0,3 % de Hb
con CO.
El Óxido Nítrico NO es otro inhibidor no alostérico de Hb se une a Fe, como
el oxígeno, pero en la forma T.
Cuando se une NO, unido a su vez a Glutatión, actúa como vasodilatador,
facilitando la entrada del oxígeno a los tejidos, y la salida del dióxido de carbono.
6 Importancia de la presencia de Inhibidores:
La presencia de unos u otros efectores de la Hb en los tejidos o en los
pulmones facilitan su función en cada órgano.
En los tejidos, se encuentran grandes cantidades de 2,3-BPG, H+ y CO2, que
se unen a Hb facilitando la liberación del oxígeno. También se une NO-Glutatión,
activando la vasodilatación.
H+ y CO2 son transportados hasta los pulmones y liberados allí, donde Hb se
carga de nuevo de oxígeno.
7 Patologías de la Hemoglobina:
Suelen derivar de la síntesis anómala de los monómeros.
Anemia Falciforme: Se produce en la subunidad  una mutación puntual Glu
> Val de una posición externa en forma T. Este cambio facilita la unión de Hb en
fibras. Los eritrocitos se deforman debido a estas fibras tornando falciformes y
perdiendo elasticidad, y se atascan en los capilares. Evitan la proliferación del
parásito de la Malaria.
Talasemia: talasemia o talasemia, malformaciones en cadena  o 
respectivamente, impiden la correcta acción de Hb.
EJERCICIO:
1/ Enumerar las principales diferencias entre Hemoglobina y Mioglobina.
2/ ¿Cual es el efecto de los siguientes acontecimientos en la afinidad Hemoglobina
– O2 ?
1. Disociación de Hemoglobina en subunidades.
2. Aumento de [CO].
3. Aumento de [CO2].
4. Disminución del pH.
5. Cambio de Hys 143 () por Ser.
6. Mutación en Leu 143 ().
3/ ¿Qué Hys son fundamentales en la funcionalidad de la Hemoglobina, y por
qué?
36
SOLUCIÓN:
1/ Función: Hb transporta, menos afinidad, Mb acumula. Subunidades: Hb 4, Mb 1. Hb
con cooperación. Hb proteína alostérica
2/
1. Aumenta.
2. Aumenta.
3. Disminuye.
4. Disminuye.
5. Disminuye.
6. Aumenta.
3/ Hys proximal sujeta Hemo. Hys distal impide otras uniones en Fe como H 2O. Otras Hys
median uniones e interacciones entre subunidades y con los inhibidores.
37
IV/ Los Enzimas:
A/ Generalidades en Encimología:
1Introducción:
Todos los pasos de todos los procesos metabólicos están catalizados por
enzimas, y la capacidad catalítica se considera, junto con la capacidad de
autorreplicación, una de las características fundamentales de la vida.
Existen dos métodos generales mediante los cuales puede acelerarse la
velocidad de una reacción química. Uno de ellos es la elevación de la
temperatura; el otro consiste en utilizar un catalizador.
El catalizador se combina con los reactantes de modo transitorio
activándolos, produciendo un estado de transición de menor energía que en la
reacción no catalizada. Una vez formados los productos el catalizador queda
libre, y puede ser de nuevo utilizado.
La especificidad de las enzimas es muy importante para los seres vivos.
Cada célula contiene varios cientos de miles de compuestos diferentes, y existen
muchas combinaciones posibles entre las reacciones químicas que estos
compuestos pueden experimentar.
Las enzimas cuidan de que tengan lugar, de manera específica, aquellas
reacciones que son esenciales e indispensables para que la célula viva.
Todas las enzimas (salvo Ribosomas) son Proteínas Globulares. Presentan un
dominio de unión 3D de aminoácidos llamado Centro Activo, de conformación
especial para unión y catálisis de un sustrato.
El centro activo es responsable de la alta especificidad biológica de las
enzimas.
2 Nomenclatura y clasificación de las Enzimas:
Muchas enzimas han sido designadas añadiendo el sufijo -asa al nombre
del sustrato, es decir, la molécula sobre la cuál ejerce su actividad catalítica. Por
ejemplo, la ureasa cataliza la hidrólisis de la urea, y la arginasa cataliza la
hidrólisis de la arginina a urea y ornitina.
Otras enzimas han recibido su nombre en función del tipo de reacción que
catalizan; así la Gliceraldehído-3P-deshidrogenasa cataliza la oxidación del la
Gliceraldehído-3P.
Incluso, algunas se conocen de hace mucho tiempo y mantienen su nombre,
sin dar información alguna del sustrato o la reacción que catalizan, como por
ejemplo, tripsina.
Estos son los seis principales grupos de enzimas conocidos en la actualidad:
1. Oxido-reductasas (reacciones de oxido-reducción).
2. Transferasas (transfieren grupos funcionales).
3. Hidrolasas (reacciones de hidrólisis).
4. Liasas (reacciones de adición a los dobles enlaces).
38
5. Isomerasas (reacciones de isomerización).
6. Ligasas (formación de enlaces con consumo de ATP).
3 Los Cimógenos:
Un Cimógeno es un tipo de enzima que se activa al separarse una parte de
la molécula, bien por acción de otra enzima o por un cambio en el medio en que
se encuentra, por ejemplo, un aumento de la acidez.
Muchos cimógenos son enzimas proteolíticas o Proteasas, que se sintetizan,
almacenan y liberan en una forma molecular inerte (sin actividad). Así se evita la
digestión de la propia enzima y de proteínas circundantes.
En el páncreas, además de la secreción de insulina por los islotes de
Langerhans, se producen varias secreciones digestivas, que suelen ser cimógenos.
Las enzimas pancreáticas incluyen: -amilasa, Tripsina, Quimotripsina,
Elastasa, Carboxipeptidasas, Aminopeptidasas, Lipasas y Nucleasas.
Las enzimas pancreáticas son cimógenos que requieren pH alcalino al ser
sintetizadas. Por ello el páncreas secreta líquido acuoso bicarbonatado de elevado
pH.
La presencia de ácidos grasos y péptidos en el quimo intestinal estimula la
secreción pancreática de enzimas.
Al llegar al duodeno, el alto pH del medio activa estos cimógenos que
comienzan a romper péptidos, ácidos nucleicos y lípidos, de forma que puedan ser
absorbidos por el tejido.
Tripsina es un cimógeno que se activa al llegar al duodeno, debido a su
bajo pH, cambiando su conformación. La presencia de Tripsina permite la
transformación de los otros cimógenos del duodeno.
Tripsinógeno
Proelastasa
Quimotripsinógeno
Procarboxipeptidasa
Tripsina
Elastasa
Quimotripsina
Carboxipeptidasa
4 Las proteasas:
Las proteasas catalizan la ruptura de proteínas en péptidos.
Se dividen en cuatro grupos: Serinproteasas, Cisteínproteasas,
Aspartilproteasas y metaloproteasas. Sus centros activos incluyen, respectivamente,
Ser, Cys, Asp y átomo metálico.
Las Serinproteasas son una gran familia de enzimas, generalmente
cimógenos.
39
Incluyen, entre otras, Tripsina, Quimotripsina y Elastasa, del duodeno,
Pepsina del estómago, y otras proteasas del torrente sanguíneo, responsables de la
coagulación sanguínea, como la Trombina.
B/ Complementaridad Enzima – Sustrato:
1 Modelos de complementaridad Enzima – Sustrato:
El Modelo de Llave – Cerradura de Fisher es el modelo elemental. Según este
modelo, el centro activo presenta una estructura rígida que encaja perfectamente
con el sustrato.
Tiene estereoespecificidad, pues la enzima solo reconoce un estereoisómero.
Este modelo, sin embargo, no contempla los efectos del Alosterismo.
El Modelo de Acoplamiento, o Ajuste Inducido, de Koshland, saca punta al
modelo de Fisher y se adapta mejor a la realidad.
Según este modelo el centro activo es una estructura flexible que sólo que
definida rígidamente cuando se produce la unión E – S.
Al aproximarse S a E, E sufre cambios conformacionales determinantes para
la orientación de los grupos del centro activo. Sólo al producirse estos cambios, E y
S son perfectamente complementarios.
2 Interacciones de complementaridad entre Enzima y Sustrato:
Intervienen varias fuerzas en la unión entre la E y su S. La mayoría de los
enlaces que se forman se deben a las fuerzas iónicas.
Los puentes de H son las uniones más comunes. Son uniones direccionales:
En función del ángulo  formado entre las uniones Dador–H y Aceptor–H, la unión
será más o menos fuerte.
DADOR
H
ángulo 
ACEPTOR
En concreto, cuanto mayor es el ángulo , más débil será la fuerza de
unión.
Las f WW son muy débiles. Adquieren importancia cuando E y S son
estrictamente complementarias como propone el modelo Llave – Cerradura, y se
aproximan un gran número de átomos.
Algunas E sufren fuertes modificaciones al unir el sustrato. Por ejemplo
Carboxipeptidasa, cuyo ct se rompe durante la unión.
40
EJEMPLO:
RIBONUCLEASA
PANCREÁTICA
Ser – OH
SUSTRATO
Thr – OH
-
En casos raros, se forman algunos enlaces covalentes E – S.
3 Factores que afectan a las interacciones Enzima – Sustrato:
El disolvente H2O es una molécula polar, que establece puentes de
hidrógeno intracatenarios. De este modo debilita las interacciones E – S, y acentúa
las interacciones entre grupos apolares.
Cuando tiene lugar la unión E – S, se excluye el agua de la región del centro
activo.
Efecto de Proximidad: Al aproximarse a la E, el S se orienta adecuadamente
de manera a unirse correctamente al centro activo, debido a fuerzas
electromagnéticas.
Los aa del centro activo de la enzima participan en la unión y catálisis de S
a través de mecanismos ácido/base, por ataques nucleófilos - electrófilos
El efecto de proximidad y la participación directa de los aa del centro activo
son los principales responsables de la eficacia catalítica de una enzima.
En algunos casos el ataque nucleófilo al S conlleva formación de enlaces
covalentes E – S.
4 Los Cofactores:
Se trata de factores que afectan a las interacciones ApoE – S.
Son, en concreto, grupos cuya unión a la proteína es necesaria para su
activación catalítica, provocando cambios conformacionales. Pueden ser iones
metálicos, o moléculas orgánicas no proteicas.
Las Apoenzimas son la parte proteica de algunas enzimas que necesitan
estar unidas a un cofactor para configurar correctamente su centro activo.
Apoenzima + Cofactor
Holoenzima
La Holoenzima presenta actividad catalítica.
Las Metaloenzimas precisan la unión coordinada covalente de iones
metálicos a su cadena de aa para ser activas catalíticamente. Por ejemplo, en el
caso del grupo Hemo, el ión Fe se encuentra unido a un grupo prostético (cofactor
que se une covalentemente).
Los Coenzimas son aquellos cofactores que son moléculas orgánicas.
Aportan grupos esenciales para la catálisis, no presentes en la Apoenzima. A
menudo tienen una parte vitamínica.
41
Las coenzimas suelen ser modificadas durante la reacción, pero recuperan
su estado inicial al terminar esta.
3 Parámetros externos que afectan a las interacciones Enzima – Sustrato:
La temperatura afecta a la actividad catalítica en forma de cmpana de
Gauss:
 TOPTIMA Suele hallase alrededor de 40 ºC.
 TELEVADA: Las proteínas se desnaturalizan.
 TBAJA: El movimiento de las partículas se reduce.
El pH puede afectar también a la actividad de las proteínas, en función de
su pI. Cada E tiene un pH óptimo distinto (Ejemplo: Pepsina del estómago pHOPTIMO
= 2 ; Arginasa pHOPTIMO = 10).
C/ Cinética de las Reacciones Encimáticas:
1Generalidades de Cinética Encimática:
La cinética encimática es el estudio de la velocidad de las reacciones
catalizadas por enzimas.
El estudio de la cinética encimática se utiliza para el estudio de la
especificidad de las encimas, su mecanismo de acción y el estudio de las rutas
metabólicas.
En análisis clínicos, se utilizan para la detección de patologías relacionadas
con alteraciones de velocidad enzimática, como en el caso de las Transaminasas.
Reacción Reversible: Mientras progresa la reacción, lo hace también la
reacción inversa, haciendo decaer la velocidad.
S + E
ES
E + P
Al agotarse el S, la velocidad de la reacción decae.
Si la E es inestable, o se encuentra en medios inapropiados, se vuelve
inactiva y la velocidad decae.
En algunos casos el P inhibe la reacción, y según aumenta su concentración
la velocidad decae.
2 Medida de la velocidad de una reacción encimática (V):
Puede medirse tanto como la desaparición progresiva del Sustrato, o la
aparición progresiva del Producto.
Para medir sus concentraciones, utilizamos las diversas propiedades
químicas y físicas del S, o el P, como por ejemplo, la absorbancia.
Se selecciona la longitud de onda más absorbida por la sustancia estudiada,
y se calibra el colorímetro. Finalmente se mide la absorbancia en el tiempo durante
el transcurso de la reacción.
42
Dado que V decae por diversos motivos, en cinética encimática se trabaja
con V0.
V
(Abs S)
V0
t



V0 varía cuando lo hace la concentración de S inicial:
Si [S] inicial es bajo, V0 es bajo.
Cuanto mayor sea [S] mayor será también V0.
En función de la cantidad de E, se alcanza el estado de saturación cuando
[S] es muy elevado: Se alcanza entonces V0 MAX.
V0 MAX
SATURACIÓN
V0
[S]INICIAL
3 Ecuación de velocidad de Michaelis – Mentel:
Se define KM (mol-1; M), constante de Michaelis – Mentel, como la [S] para la
cual V0 = VMAX/2.
KM depende del pH y la temperatura del medio, pero no de [E]. VMAX
depende de los tres factores.
KM nos da una idea inversa de la afinidad de la E por su S, es decir, a
mayor KM menor afinidad.
43
V0
VMAX = a
VMAX
2
KM = b
[S]
La evolución de V0 en función de [S]INICIAL forma, como hemos visto, una
hipérbole. Por lo tanto:
y = a.x / (x + b)
De aquí, substituyendo (a) por VMAX, (b) por KM, y (x) por [S], obtenemos la
ecuación de Michaelis – Mentel:
V0 = VMAX.[S] / ([S] + KM)
KM y VMAX se determinan experimentalmente. Se puede hacer con la
hipérbole V0/[S] de Michaelis – Mentel, pero suele utilizarse la expresión de
Lineweaver – Burk.
4 Ecuación de velocidad de Lineweaver – Burk:
Esta ecuación es la inversa de la ecuación Michaelis – Mentel. Se utiliza
para obtener KM y VMAX con más facilidad. Con la hipérbole se necesitan altas [S],
y resulta más difícil de trabajar.
1/V0 = ([S] + KM) / VMAX.[S]
-
El modelo se ajusta al de una función lineal, tal que: y = a.x + b:
1/V0 = (KM/VMAX).(1/[S]) + (1/VMAX)
1 / V0
KM / VMAX
1 / VMAX
1 / [S]
44
5 Deducción de la ecuación por el mecanismo de la reacción:
El mecanismo simple del modo de acción de una enzima presenta tres
reacciones parciales, cada una con su constante cinética:
K1
S + E
K2
ES
E + P
K-1
KM = K-1 + K2 / K1
Suponemos que el equilibrio K1 se establece rápidamente, siendo entonces
K2 el paso limitante de la velocidad de la reacción. Entonces tenemos:
V0 = K2.[ES]
ahí:
Por lo tanto, en condiciones de saturación: V0 = VMAX y [ES] = [E]INICIAL. De
VMAX = K2.[E]INICIAL
La ecuación de velocidad se deduce por medio de dos hipótesis: La hipótesis
de Brigs – Haldane o Estado Estacionario, o la hipótesis del Equilibrio Rápido.
6 Hipótesis de Brigs – Haldane o Estado Estacionario:
[ES] alcanza un equilibrio constante, es decir, es constante y por lo tanto la
velocidad de formación es igual a la velocidad de desaparición.
VFORMACIÓN = K1.[ES].[S]
VDESAPARICIÓN = K-1.[ES] + K2.[ES]
KEQ = [E].[S] / [ES]
-
Teniendo en cuenta que [E] = [E]INICIAL – [ES]:
KEQ = ([E]INICIAL – [ES]).[S] / [ES]
KEQ = ( [E]INICIAL.[S] / [ES] ) – [S]
KEQ + [S] = [E]INICIAL.[S] / [ES]
-
Teniendo en cuenta que [ES] = V0 / K2:
KEQ + [S] = K2.[E]INICIAL.[S] / V0
45
KEQ + [S] = K2.[E]INICIAL.[S] / V0
-
Recordando que, en condiciones de saturación, VMAX = K2.[E]INICIAL:
KEQ + [S] = VMAX.[S] / V0
-
Obtenemos la ecuación de Michaelis – Mentel:
V0 = VMAX.[S] / ([S] + KEQ)
6 Hipótesis del Equilibrio Rápido:
La transformación de ES en P es mucho más lenta que la disociación de ES
en S, es decir, K2 es mucho menor que K-1. Se trata en realidad de un caso
particular de la primera hipótesis, donde se considera K2 despreciable.
Se define en este caso KS como constante de disociación.
KS = K-1 / K1
KS = [E].[S] / [ES]
Por el mismo proceso de Brigs – Haldane, obtenemos también la ecuación
de Michaelis – Mentel:
V0 = VMAX.[S] / ([S] + KS)
7 Conceptos importantes en cinética encimática:
La Unidad de Actividad Encimática es la [E] que cataliza la transformación
de un mol de sustrato, en un minuto, a 25 ºC y en condiciones óptimas de
actividad.
La Actividad Específica de una enzima coincide con las unidades de
actividad encimática por mg de proteína.
El Número de Recambio es el número demol de sustrato transformado en P
por unidad de tiempo y de mg de enzima, cuando esta se encuentra saturada por
el sustrato, es decir, VMAX / [E]INICIAL. Coincide aproximadamente con K2, y se
llama también Constante Catalítica.
La Eficacia Catalítica es K2 / KM. No nos da una idea de la eficacia de la
enzima.
La Fracción de Moléculas de Enzima Unidas a Sustrato se obtiene dividiendo
V0 y VMAX, y es por lo tanto igual a [S] / (KM + [S]).
46
D/ La Inhibición Encimática:
1Generalidades:
La actividad encimática suele verse inhibida por diversas sustancias, por
procesos específicos.
Estos procesos pueden ayudarnos a obtener información sobre el mecanismo
de las reacciones catalizadas, los grupos funcionales del centro activo de la
enzima, o los mecanismos de acción de las drogas.
Ante un inhibidor, se produce la reducción de la actividad encimática.
Las inhibiciones pueden ser de varios tipos, los principales son:

Inhibición Irreversible:
E+I
EI

Inhibición Reversible:
E+I
EI
Si sometemos EI a Diálisis, desaparece el fenómeno de la inhibición solo en
caso de ser reversible. En este caso se produce un equilibrio rápido entre E y EI. El
grado de inhibición está relacionado con [I] y KEQ.
A su vez, dentro de las inhibiciones reversibles se encuentran tres tipos de
inhibidores: Inhibidores Competitivos, Inhibidores No Competitivos e Inhibidores
Acompetitivos.
2 Inhibición Irreversible:
E e I se unen covalentemente, o de modo muy fuerte, de tal manera que no
existe disociación.
Estos inhibidores se utilizan como arma química, o en insecticidas para los
cultivos.
Por ejemplo, Acetilcolinesterasa hidroliza Acetilcolina en uniones neuromusculares después de la sinapsis. Sin su inhibición, la excitación muscular
permanecería constante.
3 Inhibición Reversible Competitiva:
En este caso S e I, estructuralmente similares, compiten por el centro activo
de la enzima, por lo que la inhibición desaparece ante exceso de sustrato.
E + S
+
I
ES
E + P
Ki: Constante de inhibición (de disociación de EI)
EI
Ki = [E].[I] / [EI]
47
Al aumentar Ki, disminuye la afinidad de E por I.
Basándonos en la recta de Lineweaver – Burk, al aumentar [I], aumenta la
pendiente de la recta KM / VMAX, pero VMAX se mantiene constante:
SIN I
CON I
1 / VMAX
- 1 / KM
- 1 / KM’
Se define KM’ como KM aparente en presencia de un inhibidor competitivo.
Se puede deducir experimentalmente con la recta de Lineweaver – Burk, sirviendo
para el calculo de Ki.
KM’ = KM.(1+ [I]/Ki)
-
Ajustándolo a la ecuación de Lineweaver – Burk:
1/V0 = (1/VMAX) + (KM/VMAX).(1 + [I]/Ki).(1/[S])
4 Inhibición Reversible No Competitiva:
No hay similitud entre S e I, y sus dominios de unión en E son distintos.
E + S
+
I
ES
E + P
+
I
Ki
EI + S
Ki
ESI
En este caso KM se mantiene constante, pero VMAX cambia, cambiando
también la pendiente de la curva KM / VMAX.
48
SIN I
CON I
1 / VMAX’
1 / VMAX
- 1 / KM
Se define VMAX’ como VMAX aparente en presencia de un inhibidor no
competitivo. Se puede deducir experimentalmente con la recta de Lineweaver –
Burk, sirviendo para el cálculo de Ki.
VMAX’ = VMAX / (1+ [I]/Ki)
-
Ajustándolo a la ecuación de Lineweaver – Burk:
1/V0 = (1/VMAX).(1 + [I]/Ki) + (KM/VMAX).(1 + [I]/Ki).(1/[S])
-
Este tipo de inhibición no desaparece ante exceso de S, ni se revierte.
4 Inhibición Reversible No Competitiva:
Es un caso muy raro, en el que I sólo se une al complejo ES ya formado.
E + S
ES
+
I
E + P
Ki
ESI
En este caso cambian tanto KM como VMAX, pero la pendiente de la recta se
mantiene constante, es decir: KM‘ / VMAX‘ = KM / VMAX.
49
SIN I
CON I
VMAX’ = VMAX / (1+ [I]/Ki)
-
y
KM’ = KM.(1+ [I]/Ki)
Ajustándolo a la ecuación de Lineweaver – Burk:
1/V0 = (1/VMAX).(1 + [I]/Ki) + (KM/VMAX).(1/[S])
-
Al aparecer un exceso de sustrato la reacción no se revierte ni desparece.
E/ Regulación de la Actividad Encimática:
1Actividad Encimática del Metabolismo:
En la célula viva, se encuentra una compleja red de reacciones metabólicas
catalizadas encimáticamente, que reciben el nombre de Metabolismo.
Se distinguen dos tipos de rutas metabólicas:
 Rutas Metabólicas de Biosíntesis (anabolismo).
 Rutas Metabólicas Degradativas (catabolismo).
La vida de una célula depende de su metabolismo. La coordinación y
regulación precisa y perfecta de esta red de reacciones es vital para ella.
Existen rigurosos sistemas de control del conjunto de reacciones , que
comprueban que se lleven a cabo las necesidades de las células vivas.
Las enzimas, responsables del correcto funcionamiento metabólico, deben
por lo tanto tener:
 Localización subcelular específica: Permite la separación física de las
distintas rutas metabólicas.
Por ejemplo, para los ácidos grasos, las rutas de biosíntesis suelen tener
lugar en el citosol, mientras que las degradativas suceden en la matriz
mitocondrial.
Las Rutas Indirectas sirven para salvar la barrera física impuesta a los
metabolitos por los sistemas membranosos. Los sistemas lanzadera transforman el
metabolito de forma que pueda atravesar la membrana, y luego recuperar su
conformación nativa.
 Regulación de su concentración: Se controla rigurosamente tanto la síntesis
como la degradación de las encimas. Tiene lugar en el caso de enzimas
inducibles: En el caso de E constitutivas [E] es constante.
50
Las enzimas inducibles sólo aparecen cuando son necesarias para la célula.
Después se degradan.
En procariontes los operones (conjuntos de proteínas) ven inducida su
síntesis de forma conjunta.
 Regulación de su actividad encimática: Es el modo más rápido de control
sobre las rutas metabólicas. Se puede producir por medio de distintos
mecanismos:
1. Alosterismo.
2. Equilibrios polimerización/despolimerización.
3. Modificación covalente reversible.
4. Activación proteolítica, o modificación covalente irreversible (caracteristica
de proteasas; E digestivas y de coagulación sanguínea).
2 Regulación Alostérica:
Se produce por medio de la unión de un efector alostérico a una enzima que
afecta al metabolismo, provocando un cambio conformacional.
El efector puede ser un activador, en cuyo caso aumenta la afinidad de E
por su S. También puede ser un inhibidor, haciendo disminuir la afinidad de E por
su S.
Mientras la cinética ecimática normal tiene forma hiperbólica de Michaelis –
Mentel, en el caso de una encima con cinética alostérica tiene forma sinusoidal:
[L]
V0
nu
[S]
Las enzimas alostéricas son proteínas globulares con varias subunidades, y
múltiples dominios de unión y centros activos.
Los pequeños cambios en [S] suponen grandes cambios en la velocidad de
la reacción. Son muy sensibles a S.
Los pequeños cambios en [A] (C del efector alostérico) suponen grandes
cambios en la velocidad de reacción.
Si se trata de un activador, desplaza la curva sinusoidal hacia la izquierda.
Si es un inhibidor, la desplaza a la derecha. De modo que, para una [S]
constante, en presencia de activadores VMAX, y en presencia de inhibidores, VMIN.
Se obtienen actividades encimáticas muy distintas.
51
La Retroinhibición, o Inhibición Feed-Back, es muy frecuente en rutas
metabólicas complejas. El último producto de la ruta inhibe alostéricamente a las
enzimas que catalizan las primeras etapas.
Por ejemplo, Aspartato Transcarbamilasa tiene subunidades catalíticas con
centros activos, y subunidades reguladoras con dominios de unión para efectores
alostéricos, separadas. ATP es un activador, que favorece la forma relajada del
centro activo. CTP es, sin embargo, un inhibidor que favorece el estado tenso.
3 Regulación de Equilibrios polimerización/despolimerización:
Tiene lugar en el caso de proteínas oligoméricas que sólo presentan su
actividad íntegra en su forma polimérica. Por ejemplo, Acetil Coenzima
Carboxilasa, responsable de la síntesis de ácidos grasos.
En algunos casos hay estados intermedios de actividad parcial:
ACTIVO
PARCIALMENTE
ACTIVO
2
INACTIVO
2
+2
4 Regulación por modificación reversible:
Se basa en el cambio conformacional provocado por la inserción covalente
de un pequeño grupo en la cadena R de un aa de la enzima. Esto puede provocar
la activación o la desactivación de la enzima.
Generalmente se trata de la inserción de un grupo P (fosfato) o fosforilación
en un aa Ser, Thr o Tyr. Suele proceder de una molécula de ATP.
Las proteínas Kinasa suelen catalizar la inserción de P. Suelen activar la
enzima. Se distinguen dos grupos de kinasas:
 Serina-treonina kinasas.
 Tirosina kinasas.
Las proteínas Fosfatasas catalizan la liberación del grupo P, por hidrólisis.
Suelen desactivar la enzima.
La Adenilación es otro grupo frecuentemente insertado para activar enzimas.
Se inserta un AMP
5 Regulación por activación proteolítica:
Las enzimas, pasad un tiempo de actividad, comienzan a destruirse por
autodigestión.
Se producen rupturas proteolíticas irreversibles que además conllevan
cambios conformacionales.
Se trata principalmente de las Serinproteasas de coagulación y digestión.
Los cimógenos del duodeno son activados encimáticamente por un activador
común: la Tripsina.
52
F/ Isoenzimas y Agrupaciones de Enzimas:
1 Las Isoenzimas:
Se trata de las distintas formas que puede presentar una misma forma
encimática.
Presentan distinta cinética y afinidad, distintos genes que las codifican,
distinta expresión genética en cada tejido, y disitnta presencia en los orgánulos
subcelulares.
Por ejemplo, Lactato Deshidrogenasa cataliza las transformaciones entre
Piruvato y Lactato, acoplándose la reacción a la hidrólisis de NADH. Presenta 5
isoenzimas, de tipos M y H:
 LDH M4
(múculos, hígado): En el músculo cataliza el paso P > L. El
Lactato es el producto final de la degradación de la glucosa en el músculo.
En el hígado cataliza L > P. Se debe a su sensibilidad a la relación
NADH/NAD+, baja en el hígado y alta en el músculo.
 LDH M3H (otros)
 LDH M2H2 (cerebro, riñón)
 LDH MH3 (otros)
 LDH H4
(corazón): Calatiza el paso L > P, evitando que el Lactato se
acumule.
Una misma isoenzima puede catalizar su propia reacción en un sentido u
otro, influida por las condiciones del medio, como por ejemplo, la relación
NADH/NAD+.
Se puede encontrar en un mismo tejido distintas isoenzimas separadas en
distintos compartimentos. Por ejemplo, las enzimas que catalizan los cambios de
conformación de proteínas y metabolitos para que puedan hacer rutas indirectas
atravesando membranas físicas.
2 Agrupaciones Multienzimáticas:
Sistemas formados por varias enzimas asociadas, de manera a obtener el
mayor rendimiento energético posible. Hay tres tipos de complejos:
Los Agregados Multienzimáticos, son varias enzimas asociadas en un único
complejo. Varios intermediarios de secuencias de reacciones cercanas en rutas
metabólicas pueden así permanecer unidas covalentemente.
Las Enzimas Asociadas a la Membrana celular, si están implicadas en la
misma ruta metabólica suelen encontrarse ordenadas en función de su
participación en la ruta en la membrana.
Las Enzimas Multifuncionales son enzimas con distintas actividades
enzimáticas en una misma proteína.
Las agrupaciones multienzimáticas confieren una serie de ventajas:
 La unión de un efector puede modificar la actividad catalítica de todo el
complejo.
 La agrupación disminuye la difusión de los metabolitos, y el tiempo de
transición, haciendo disminuir el gasto energético de una ruta.
53
V/ Nucleósidos y Nucleótidos:
A/ Introducción:
1 Funciones de los Nucleótidos:
Presentan vario tipos de funciones en biología:
 Genética: Componentes fundamentales de Ácidos Nucleicos.
 Energética: Moléculas portadoras de Energía; la acumulan y transportan.
 Metabólica: Algunos son Coenzimas o Intermediarios Activados para rutas
de biosíntesis, como por ejemplo UPD-Glucosa > Glucógeno, o CDPDiacilglicerol > Fosfoglicéridos.
 Transmisión de señales celulares: Mensajeros intracelulares, o segundos
mensajeros.
2 Estructura general de nucleósidos y nucleótido:
Los nucleósidos y nucleótido resultan de la unión de determinados
componentes fundamentales:
Un Azúcar Pentosa:
 -D-Ribosa, en el caso de los ribonucleótidos.
 -2-desoxi-D-Ribosa, en el caso de los desoxirribonucleótidos.
Una Base Nitrogenada (BN):
 Purina: Dos ciclos. (A, G...).
 Pirimidina: Un ciclo (C, T, U…)
Recibe el nombre de Nucleósido la unión Pentosa + BN.
La unión de estos dos compuestos se produce mediante un enlace Nglucosínico entre el C1 del azúcar y N1 (Pirimidina) o N9 (Purina).
Recibe el nombre de Nucleótido la unión Nucleósido + grupo fosfato.
Esta última unión se suele producir entre el C5 (también C2 y C3) y un OH del
grupo P. Se desprende una molécula de agua.
3 Nomenclatura:
Nucleósidos:
 Utilizamos el prefijo Desoxi- si el azúcar es -2-desoxi-D-Ribosa.
 Seguido, el nombre de la BN: -Guan-, -Aden-, -Cit-, -Tim-.
 Finalmente, utilizamos el sufijo –osina en purinas, e –idina en pirimidinas.
EJEMPLOS: Guanosina, Desoxiadenosina, Citidina, Desoxitimidina.
Nucleótidos:
 Partimos del nombre del nucleósido.
 A continuación se pone el número del Carbono del azúcar que media la
unión (5’, 3’…).
 Finalmente se indica el número de grupos fosfato unidos: monofosfato,
Difosfato, Trifosfato.
Suele emplearse un tipo de nomenclatura por iniciales.
54
EJEMPLOS:
Adenosina-5’-Monofosfato (AMP)
Adenosina-5’-Trifosfato (ATP)
Desoxiguanosina-5’-Monofosfato (dGMP)
4 Principales tipos de Nucleótidos:
Los nucleótidos nucleicos son aquellos que se encuentran en los ácidos
nucleicos como componentes básicos. Encontramos dos tipos:
 Desoxirribonucleótidos-5’-monofosfato, componentes básicos del DNA
(dAMP, dGMP, dCMP, dTMP).
 Ribonucleótidos-5’-monofosfato, componentes básicos del RNA (AMP, GMP,
CMP, UMP).
Se pueden encontrar en ácidos nucleicos, o libres con su grupo P ionizado a
pH fisiológico.
Los ciclos de la BN y la pentosa forman un ángulo casi recto.
Sus espectros UV característicos son ( = 250-280nm). Pueden separarse y
analizarse fácilmente por cromatografía de intercambio iónico, pues OH de P se
hidroliza a O-.
El grupo P terminal en posición  o  se puede separar por acción
encimática o por calefacción en clorhídrico. El grupo P en  no se puede separar.
Muchos otros nucleótidos no nucleicos tienen una importancia en las células
vivas:
 Energía biológica (ATP, GTP).
 Intermediarios activados metabólicos (ADP, GDP).
 Coenzimas (NADH/NAD+).
 Segundos mensajeros (AMPc, GMPc).
B/ Nucleótidos no nucleicos:
1 Nucleótidos Difosfato (NDP) y Trifosfato (NTP):
A menudo, los NDP actuan como intermediarios activados en rutas de
biosíntesis, como la síntesis del gucógeno o de fosfatidil colina.
Los NTP son los transportadores universales de energía gracias al enlace del
tercer grupo P. Durante su hidrólisis se libera una gran cantidad de energía.
ATP + H2O
ADP + Pi
ATP + H2O
AMP + PPi (pirofosfato)
Para ambas reacciones: G0 = -7,3 kCal/mol. Por ello, otras reacciones
metabólicas no espontáneas pueden acoplarse a esta hidrólisis, y utilizarla como
fuente de energía de activación.
55
2 El Coenzima Nicotinamida Adenina Difosfato (NAD+/NADH):
Se trata de un dinucleótido, con dos ribosas y dos grupos P que median la
unión. Una ribosa está unida a Adenina mientras la otra se une al grupo
Nicotinamida.
Nicotinamida es la parte vitamínica del coenzima.
Es un coenzima común a Oxidoreductasas, como por ejemplo, Lactato
Deshydrogenasa (LDH) o Malato Deshydrogenasa (MDH).
El grupo Nicotinamida puede captar 2e- y 1H+ del Sustrato en su C4,
diferenciándose las formas oxidada y reducida. Es un coenzima fundamental en
rutas de metabolismo Redox:
Reducción
NAD+ + 2H+ + 2e- + S
NADH + H+ + P
OX
RED
En su forma reducida, NADH presenta dos picos de absorbancia en lugar
de uno: A  = 260 nm y  = 340 nm. Esta particularidad es empleada para el
estudio de cinética encimática.
Patología: Peladra; deficiencia de nicotinamida. Es necesario un aporte
exógeno de triptófano en los alimentos para su síntesis:
Hidrólisis de aa
Trp
Nicotinamida
El NADP+/NADPH sólo se diferencia del NAD+/NADH por poseer un grupo
P unido en C2 de la Ribosa de Adenina.
Durante la respiración, NADH se oxida cediendo sus electrones.
NADPH al oxidarse ejerce de Poder Reductor en numerosas reacciones de
biosíntesis, como la de ácidos grasos y esteroides.
3 El Coenzima Fosfato de Riboflavina (FMN, Flavin Mono Nucleotido):
No se trata de un auténtico nucleósido, pues carece de Ribosa. En su lugar
se encuentra Ribitol.
Isoaloxacina (tres ciclos) se unen por medio de N al ribitol, formando la
Riboflavina (vit B 2), parte vitamínica. El grupo P se une en el extremo libre del
ribitol.
El grupo Riboflavina puede captar 2e- y 2H+ del Sustrato en sus dos N,
diferenciándose las formas oxidada y reducida. Es un coenzima fundamental en
rutas de metabolismo Redox:
Reducción
FMN + 2H+ + 2eOX
FMNH2
RED
56
Es un coenzima propia de Deshidrogenasas Dependientes de Flavina, de las
cadenas respiratorias.
4 El Coenzima A (CoA):
Es un coenzima que actúa como transportador de grupos Acilo, gracias al
átomo de azufre del extremo Tiol.
Su estructura es similar al nucleótido ADP, pero formado por Ribosa-3’fosfato (en total, 3 grupos P). Unido al P en  se encuentra un ácido pantoténico, y
finalmente el grupo -mercaptoetilamina con SH extremo.
El ácido pantoténico es su parte vitamínica. Este coenzima adquiere un
papel fundamental en el metabolismo.
R – COO- + HS – CoA
ACILO
TIOL
R – CO – S – CoA
TIOESTER
La Acetil CoA es un punto común de la degradación de moléculas por el
Ciclo de Krebs, en plantas y microorganismos:
CH3 – CO – S – CoA
5 Nucleótidos cíclicos:
Al elevarse su concentración en el citosol celular, AMP cíclico (cAMP) y GMP
cíclico (cGMP) ejercen el papel de segundos mensajeros en la transducción de
señales celulares, implicando cambios metabólicos.
cAMP y cGMP provienen de ATP y GTP por la acción de las enzimas
Adenilato Ciclasa y Guanilato Ciclasa respectivamente. Se desprende pirofosfato.
La reacción se produce ante la llegada de una señal externa.
ADENILATO CICLASA
ATP
cAMP + PPi
GUANILATO CICLASA
GTP
cGMP + PPi
cAMP está relacionado con la transducción de señales por receptores
transmembrana asociados a proteínas G.
Una hormona activa el receptor, el cual activa la proteína G separando la
subunidad .
La subunidad  activa la Adenilato Ciclasa anclada a la membrana, y
[cAMP] aumenta.
La unión de dos cAMP en la subunidad reguladora de proteínas kinasas
puede activarlas o desactivarlas, regulando así la transcripción de ciertos genes, y
con ello el metabolismo.
57
C/ Los Ácidos Desoxirribonucleicos (DNA):
1Generalidades:
En 1869 Miesher aisla por primera vez en la historia Ácidos Nucleicos:
cromosomas (DNA) de leucocitos. Logra aislarlos rompiendo las células con
Clorhídrico, rompiendo los núcleos con tratamiento alcalino, y extrayendo el
precipitado: lo llamó Nucleína.
El Cromosoma es una larga macromolécula filamentosa formada por un alto
número de ácidos desoxirribonucleicos, unidos por enlaces fosfodiester entre
Desoxirribosas (en C5 y C3) y Fosfatos:
5’ libre
5’-Desoxirribosa-3’
BN
– P – 5’-Desoxirribosa-3’ – P – 5’-Desoxirribosa-3’
BN
BN
3’ libre
Presenta una parte constante o esqueleto, formada por desoxirribosas y
fosfatos, y una parte variable, formada por las cuatro BN, púricas o pirimidínicas.
La secuencia de BN contiene la información genética.
Los DNA están polarizados por su esqueleto de Ribosa-Fosfato. Por
convenio, la primera desoxirribosa tiene su grupo 5’ libre, mientras la última tiene
el 3’ libre.
2 Estructura 3D del DNA:
Watson y Crick ganaron el Premio Nobel en 1962 al descubrir la estructura
3D del B-DNA, gracias a estudios mediante Rayos X.
En su estructura 3D, el DNA está formado por dos cadenas acopladas
antiparalelamente. Las uniones entre las dos cadenas están mediadas por las BN.
Sus secuencias de BN son complementarias, de forma que siempre se une
una purina con una pirimidina, más concretamente A-T y C-G.
5’
3’
3’
5’
Las cadenas se enrollan espontáneamente dextrógira y helicoidalmente. Las
BN se encuentran apiladas en el interior de la hélice.
Los puentes de H entre las BN mantienen la estructura helicoidal del DNA. La
unión purina-pirimidina se descubrió al calcular la distancia de separación entre
las cadenas (10,85 A), donde no caben dos purinas, pero sobra espacio para dos
pirimidinas. Hay elevada especificidad en los enlaces A-T (2 puentes de H) y C-G
(tres puentes de H, unión más fuerte).
La Tautomerización es el desplazamiento del H+ que refuerza los puentes de
H. Estos puentes se establecen entre un grupo dador de H y un grupo aceptor.
58
GRUPOS ACEPTORES:
CETO:
IMINO:
R
GRUPOS DADORES:
C
O
R
C
N
H
R
GRUPOS DADORES:
ENOL:
AMINO:
R
H
C
R
OH
R
C
N
H
Los restos hidrofóbicos de las BN crean en el medio celular Efectos
Hidrofóbicos, por lo que tienden a colocarse espontáneamente en el interior de la
estructura, afectando a la estabilidad del DNA.
Entre la BN se establecen fuerzas de WW. Al haber un grandísimo número
de BN, estas fuerzas también afectan a la estabilidad del DNA.
Algunos casos son motivos de inestabilidad, como la repulsión entre grupos
Fosfodiester a pH = 7 (Cargas -). Se encuentran neutralizadas por iones Mg2+
unidas al esqueleto del DNA.
3 Tipos estructurales del DNA:
B-DNA es el la estructura del DNA en condiciones fisiológicas normales,
descrita por Watson y Crick.
En este tipo estructural, los enlaces N-glicosílicos entre las BN no son
diametralmente opuestos, por lo que se distinguen dos surco de distintos tamaños:
El surco mayor (12 A) y el surco menor (6 A).
Es una estructura flexible, plegable, y resistente a ataques mecánicos.
Origina los DNA circulares de bacterias, virus y plastos.
Puede Superenrrollarse: proporciona mayor empaquetamiento. El
desenroscado facilita la Transcripción.
En eucariontes se enrolla describiendo una Superhélice levógira alrededor
de complejos proteicos formados por Histonas: Los Nucleosomas. Varios
Nucleosomas forman un Collar de Perlas, que se compacta en Cromatina. La
acción de un Armazón Cromosómico proteico estructura finalmente los
Cromosomas.
A-DNA fue descubierto por análisis con Rayos X. Es más grueso y más
corto. Son fibras deshidratadas. Presentan un surco mayor más profundo y
59
estrecho, y uno menor superficial y ancho. 1 vuelta de hélice = 11 BN. Caso de
RNA de doble hélice, o híbridos DNA-RNA.
Z-DNA presenta grupos P en Zig-Zag. Hélice levógira termodinámicamente
no favorable. Surco mayor convexo, surco menor profundo. 1vuelta de hélice = 12
BN. Se descubrió gracias a un Hexanucleótido formado por C y G:
CGCGCG
GCGCGC
En Z-DNA, G se dispone SIN (BN y pentosa del mismo lado del enlace), y C
se dispone ANTI (Viceversa).
4 Desnaturalización y Renaturalización del DNA:
La doble hélice de DNA se disocia localmente con frecuencia, permitiendo
así la transcripción. La Desnaturalización del DNA es la disociación completa de
ambas hebras, o transición hélice – cadena. Se rompen los puentes de H.
Desnaturalización térmica o fusión del DNA: se logra por aumento de la
temperatura. TFUSION o TM es la T a la que se disocia la mitad de la hélice.
Se utiliza la colorimetría, pues al desnaturalizarse, la absorbancia del DNA
aumenta considerablemente, a una longitud de onda concreta. La  óptima para
estas medidas en el ADN es = 260 nm. Este fenómeno se llama Efecto
Hipercrómico. En concreto, las BN desapareadas absorben 37% más que
apareadas.
Se realiza una Curva de Fusión (Abs260 en función de T) para obtener la TM.
Se ha observado que TM depende de la [CG] de las hebras. Cuanto mayor es [CG],
más estable es la hélice, lo cual es lógico al establecerse tres puentes de H entre C y
G, y solo dos entre A y T.
Se puede lograr la renaturalización del ADN haciendo descender
lentamente la temperatura, hasta descender a una T fisiológica normal. Las hebras
se reasocian correctamente. Este proceso se llama Templado.
D/ Los Ácidos Ribonucleicos (RNA):
1 Generalidades:
Los RNA fueron descubiertos y aislados pr primera vez posteriormente al
descubrimiento de los DNA, por Hoppe – Seyler. Fueron extraídos de levaduras.
Posteriormente de plantas y bacterias.
En 1914 Feulger utiliza colorantes específicos para RNA y DNA,
comprobando la coexistencia de ambos tipos de moléculas en la mayoría de las
células.
Se trata de una larga molécula de Ribonucleótidos unidos por enlaces
Fosfodiester en 3’ y 5’. Presenta un esqueleto constante de Ribosas – Fosfato, y una
región variable con BN. La estructura de una hebra es similar a la del DNA.
Las principales diferencias RNA/DNA son:
60
Ribosas (Impiden la formación de B-RNA) / Desoxirribosas.
Monocatenarias (bicatenarios, Híbridos DNA-RNA) / Doble Hélice.
A-RNA (en caso de bicatenarias e híbridos) / B-DNA, A-DNA, Z-DNA.
Urácilo (U) / Timina (T).
Reactivo / Estable.
El grupo OH en 2’ de la Ribosa impide la formación de B-RNA: El tipo
estructural B es el más estable. Estos OH promueven la reactividad química del
RNA y permiten interacciones entre zonas alejadas de la molécula.
Por ello RNA es más inestable, y no adquiere las proporciones del DNA, ni
sus funciones de estabilidad y conservadurismo genético.
En las cadenas monocatenarias de RNA suelen producirse emparejamiento
de bases dando lugar e estructuras llamadas Orquilla y Bucle.





2 Principales tipos de RNA:
RNA mensajero (mRNA) transporta la información genética transcrita del
DNA del núcleo, al citosol. Sirve como plantilla para la traducción por el ribosoma.
Participa por lo tanto en la expresión de la información genética.
RNA ribosómico (rRNA) es la parte constitutiva del Ribosoma: Constituye el
75% del cuerpo del Ribosoma.
RNA transferente (tRNA) transporta los aa y los incorpora a las proteínas
durante su síntesis, interaccionando con el molde de mRNA.
RNA heterogéneo nuclear (hnRNA) es en eucariontes el precursor de mRNA
maduro. Es llamado también RNA transcrito primario.
RNA pequeño nuclear (snRNA) es en eucariontes un pequeño ácido
ribonucleico que se incorpora a una proteína que desempeña un importante papel
el la maduración del hnRNA al mRNA maduro.
3 Las Nucleasas:
Se trata de un grupo de enzimas, dentro de las Serinproteasas, capaces de
hidrolizar los enlaces fosfodiester del RNA, y de las hebras de DNA.
Están presentes en los lisosomas de la mayoría de las células en todos los
organismos vivos.
Son liberadas por el páncreas al tubo digestivo, donde catalizan la digestión
de los ácidos nucleicos.
Se distinguen Ribonucleasas y Desoxirribonucleasas en función del tipo de
ácidos nucleicos que hidroliza.
Se distinguen, en función de la región del ácido nucleico en la que llevan a
cabo su acción:
 Endonucleasas: En posiciones externas.
 Exonucleasas 5’: En los extremos 5’.
 Exonucleasas 3’: En los extremos 3’.
Se distinguen también por el tipo de nucleótido que originan:
 Tipo a: Rompen antes del P originando un 5’-Monofosfato Nucleósido.
 Tipo b: Rompen después del P originando un 3’-Monofosfato Nucleósido.
61
Las Endonucleasas de Restricción tienen alta especificidad, pues reconocen
una corta secuencia de BN antes de realizar el corte. Sólo hidrolizan dichas
secuencias.
Fueron descubiertas en bacterias, durante la década de 1970. Se nombran,
por este orden, en función del género, especie y cepa de la bacteria que los
sintetiza. Se asignan números romanos para diferenciarlas.
EJEMPLO:
Eco R I (E. coli, cepa R)
62
VI/ Procesos Moleculares de la Expresión de la Información
Genética:
A/ La Replicación del DNA:
1 Generalidades:
La replicación de la información genética es fundamental, previamente a la
Mitosis y la Meiosis. Permite el paso de cromosomas de una a dos cromátidas.
La replicación exacta del DNA permite su transferencia fiel a siguientes
generaciones de células, e incluso organismos.
El proceso se basa en la especificidad en el emparejamiento de BN (A-T; CG): Conociendo la secuencia de una de las cadenas, se puede deducir la cadena
complementaria.
Watson y Crick descubrieron que, durante la replicación, cada una de las
cadenas actúa como molde para la síntesis de su cadena complementaria.
Las DNA – Polimerasas son el grupo de enzimas que catalizan la síntesis de
DNA, dirigidas por una cadena molde. Necesitan detectar la presencia de un
Fragmento Cebador con OH en 3’ de la cadena molde para iniciar la síntesis.
La síntesis tiene lugar de 5’ hacia 3’. Se utilizan como precursores
desoxirribonucleótidos trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP).
2 Experimento de Meselson & Stahl:
La propuesta de Watson y Crick suponía que se trata de un Proceso
Semiconservativo: Se conserva una cadena parental, que se utiliza para la síntesis
de la complementaria.
El experimento de Meselson y Stahl demuestra la naturaleza
Semiconservativa del proceso. Trabajaron con E. coli.
Cultivaron la generación parental en un medio cuya fuente de N era 15NH4+.
Las bacterias incorporaron entonces átomos de N radiactivos en sus ácidos
nucleicos. Los ácidos nucleicos radiactivos podían detectarse por su elevada .
Durante los siguientes ciclos celulares, cultivaron las generaciones hijas en
medios cuya fuente de N era 14NH4+, no radiactivo.
Observaron después del primer ciclo celular, se observaba un único pico de
 media. Después del segundo ciclo observaron dos picos de , uno intermedio y
otro de moléculas no radiactivas.
Este experimento, que pudo realizarse gracia a las distintas densidades de
14
15
N y N, confirmó que el proceso de replicación es semiconservativo.
3 Generalidades de Replicación del DNA en procariontes:
DNA – Polimerasa I se encarga de la replicación y procesos de reparación.
Su cinética es de 16-20 Nucleótidos/segundo.
DNA – Polimerasa II se encarga exclusivamente de reparaciones durante la
replicación del DNA. SU cinética es 2-5 N/s.
63
DNA – Polimerasa III se encarga de la replicación durante la elongación de
la nueva cadena. Su cinética es 250 – 1000 N/s. Se trata de un polímero
asimétrico, con un núcleo central con tres subunidades:  (elongación), 
(exonucleasa 3’) y . Tiene otras subunidades, como  (abrazaderas).
Las tres DNA – Pol presentan actividad exonucleasa 3’, lo que les concede la
propiedad de reparar sus propios errores durante la replicación.
DNA – Pol I tiene además actividad exonucleasa 5’ fundamental para
eliminar los Fragmentos Cebadores.
La replicación se inicia en el punto Origen (Ori C) de origen, en el DNA
circular. Es un proceso Bidireccional: se forman dos Orquillas de Replicación que se
desplazan desde O en sentidos contrarios.
En cada Orquilla de Replicación, hay replicación continua en una de las
hebras, la Cadena Conductora (de 5’ a 3’), y discontínua en la complementaria, o
Cadena Retardada (de 3’ a 5’); en esta última los fragmentos discontinuos reciben
el nombre de Fragmentos de Okazaki.
La formación de estos fragmentos de Okazaki en la Cadena Retardada es
lógica teniendo en cuenta que DNA – Pol sintetizan siempre de 5’ a 3’, y dado que
ambas cadenas son antiparalelas: En la hebra complementaria (Retardada), DNA –
Pol actúa en sentido contrario al sentido de abertura de la Orquilla.
Tanto en el fragmento continuo como en cada fragmento de Okazaki, la
síntesis comienza por un fragmento cebador de RNA, sintetizado por una Primasa
(DNA – Pol especializada).
Las dos Orquillas de Replicación se encuentran en el polo opuesto a Ori C
terminando la replicación del plásmido.
4 Etapas de Replicación del DNA en procariontes:
1. El DNA circular se encuentra inicialmente superenrollado. Se produce el
desenrollamiento de 245 pares de BN en Ori C.
 DNA-A (tetrámero ATPasa) reconoce y desenrolla en Ori C 13 pares
de BN.
 DNA-B y DNA-C reconocen el complejo DNA – DNA-A. DNA-B
helicasa, con ayuda de 6 enzimas DNA-C desenrollan la hélice.
2. DNA-A se disocia del complejo, DNA-B prosigue el desenrollamiento. El
desenrollamiento se produce por superenrollamiento negativo, inducido por
DNA-Girasa (Tropoisomerasa II) que elimina las tensiones que estabilizan el
superenrollamiento positivo.
3. La proteína SSB (Single Strand Binding) mantiene estabilizadas las cadenas
desenrolladas, uniéndose a ellas.
4. La enzima Primasa lee la cadena molde, reconociendo y sintetizando los
fragmentos cebadores de RNA: Forma el complejo Primosoma.
5. DNA Pol III se une a 3’ libre del cebador e inicia la síntesis de DNA o
elongación (contínuo, o fragmentos de Okazaki).
 Las subunidades abrazaderas se unen a la hebra molde de DNA.
64
La subunidad exonucleasa 3’ detecta y corrige los errores recién
producidos en la nueva hebra.
 Una misma DNA Pol III en cada orquilla de replicación cataliza las
síntesis de las cadenas Conductora y Retardada. (Hipótesis Bucle).
 La polimerización tiene lugar por el ataque Nucleófilo del OH unido
en 3’ terminal, al trifosfato de 5’ del NTP, que al polimerizar pasa a
NMP.
6. DNA Pol I entra en acción. Tiene tres subunidades con actividad enzimática:
 Exonucleasa 5’: Elimina los fragmentos cebadores en 5’ del DNA.
 Polimerasa 5’ > 3’ Rellena los huecos de los fragmentos cebadores
con DNA. Desplaza las muescas.
 Exonucleasa 3’: Corrige los errores recién cometidos en la síntesis.
7. La enzima DNA – Ligasa une los fragmentos de DNA de las hebras
fragmentadas, devolviendolas a la normalidad.
HIPÓTESIS: Se forma un Bucle en la Cadena Retardada (ver fotocopia)
permitiéndose la lectura y síntesis simultánea de ambas cadenas, de 5’ a 3’. Por
ello DNA – Pol III es un polímero asimétrico. Al terminar una fragmento de Okazaki
se suelta un bucle y se forma uno nuevo en el siguiente fragmento cebador.

5 La Replicación del DNA en eucariontes:
Es un proceso similar al de la replicación del DNA en procariontes, pero
más complejo. En eucariontes se presenta un DNA más largo y más compactado.
Presenta, al igual que en procariontes, una síntesis contínua y una
discontinua sincronizadas.
Se encuentran varios puntos de origen de replicación a lo largo de un
cromosoma, que coinciden presuntamente con sus puntos de unión al citoesqueleto.
Durante la Replicación activa hay numerosas Orquillas de Replicación, pero
estas avanza más lentamente que en procariontes.
Los fragmentos de Okazaki son más cortos. El proceso de síntesis,
eliminación y relleno de fragmentos cebadores es similar al caso de procariontes.
Se conocen cinco tipos de DNA Pol:
  DNA Polimerasa: Replica y repara la hebra retardada.
 DNA Polimerasa: Subordinada a , repara errores en la hebra retardada.
  DNA Polimerasa: Mitocondrial.
  DNA Polimerasa: Replica y repara la hebra conductora.
  DNA Polimerasa ha sido descubierta recientemente.
6 Mecanismos de Reparación de la Replicación del DNA:
Existen distintos tipos de lesiones del DNA que suceden con frecuencia
durante la replicación, pues al separarse las hebras pierden estabilidad.
Las Enzimas Reparadoras rastrean la hebra de DNA en busca de errores
continuamente.
65
La Fotodimerización de dos TMP adyacentes es una de las lesiones más
frecuentes. Se produce ante rayos UV, que pueden dar lugar cáncer.
La incorporación de un dímero de Timina unido por dos puentes de H
impide la correcta replicación del DNA. Se inicia todo un mecanismo de detección
y reparación en procariontes:
1. La Escinucleasa (con actividad endonucleasa) corta el fragmento que incluye
el dímero en la hebra replicada.
2. DNA Pol I sintetiza el DNA correspondiente al hueco, y DNA ligasa
incorpora el fragmento reparado en la hebra replicada.
En procariontes y algunos eucariontes se encuentra DNA fotoliasa, que
absorbe los rayos UV. Con la energía de un fotón rompe un dímero de Timina en
BN originales.
La Desaminación Hidrolítica es otra lesión frecuente del DNA. Se trata de la
substitución de grupos Amino por grupos Ceto. Transforma los NMP, por ejemplo,
transforma A en Hipoxantina, G en Xantina, y C en U.
La DNA Glicosilasa rompe los enlaces N-Glicosílicos de la BN modificada.
Las endonucleasas cortan el fragmento que contiene la BN modificada. Finalmente
entran en acción DNA Pol I y DNA ligasa.
Existen muchos factores del medio que influen en la modificación de BN,
como las radiaciones ionizantes, el oxígeno radiactivo, las reacciones oxidantes, o
pérdidas espontáneas de BN.
B/ La Transcripción; del DNA al mRNA:
1 Generalidades:
La Transcripción es un proceso fundamental de la expresión de la
información genética. La información contenida en un fragmento del DNA
cromosómico, que recibe el nombre de Gen, es capaz de atravesar la membrana
nuclear en forma de mRNA, en busca de un Ribosoma que realice la Traducción.
RNA Polimerasa es la enzima responsable de llevar a cabo el proceso de
Transcripción de los genes. Sintetiza los RNA siempre de 5’ a 3’.
Para su acción, requiere de la presencia de precursores activados NTP (ATP,
GTP, CTP y UTP), la presencia de Mg2+, y un molde de DNA, generalmente
dicatenario.
2 La Transcripción en procariontes:
RNA Pol es la principal enzima relacionada con la Transcripción en
procariontes. Coactua con proteínas moduladoras de su actividad. Lee la hebra de
3’ a 5’ (sintetizando mRNA de 5’ a 3’).
La cadena leída recibe el nombre de Hebra Antisentido, pues es
complementaria a la secuencia de RNA, y complementaria a la otra hebra que
recibe el nombre de Hebra Molde (no leída).
Las funciones de RNA Pol son numerosas:
66
1. Localiza los Centro de Iniciación o Promotores.
2. Separa localmente las hebras de DNA en el punto +1, donde se inicia la
Transcripción de la hebra antisentido.
3. Selecciona el NTP adecuado.
4. Cataliza la formación de enlaces fosfodiester por ataques nucleófilos.
5. Localiza las Señales de Terminación de la transcripción.
RNA Pol se forma de seis subunidades:
  (2 subunidades) reguladoras y responsables de la Iniciación de la
Transcripción. Forman parte del núcleo central de la proteína.
  se encarga de llevar a cabo la iniciación y elongación. Forma
parte del núcleo central.
 ’ es la subunidad abrazadera que se une al molde de DNA. Forma
parte del núcleo central.
  localiza el Promotor, lugar en que se inicia la elongación.
  de funciones desconocidas.
El proceso de Transcripción transcurre en tres etapas: Iniciación, Elongación
y Terminación.
3 Desarrollo de la Transcripción en procariontes:
La primera etapa del proceso es la Iniciación. El inicio del gen es reconocido
y RNA Pol se une al molde de DNA.
1. Reconocimiento del Promotor o secuencia de iniciación. Una de las más
conocidas es TATA box. Es reconocido por la subunidad  de RNA Pol. Se
encuentran en el extremo 5’ de cada gen, pudiendo abarcar unos 40 pares
de BN.
EJEMPLO: TATA box:
-35
-10
+1
TTGACA-------------------TATTAT-----(A o G)
2. Una vez localizado el punto +1 donde se inicia la Transcripción del gen, se
forma el complejo llamado Burbuja de Transcripción.
Para la formación de este complejo, en el que interviene RNA Pol y DNA, el
DNA es parcialmente desnaturalizado en 18 pares de BN, o 1,6 vueltas de hélice.
La burbuja se une inicialmente desde el punto -10, y sobrepasa el +1.
3. Se forma el primer corto fragmento de RNA que forma un híbrido DNARNA. Este híbrido cuenta unas 10 BN.
4. Al terminar de formarse el fragmento iniciador de RNA, se produce un
cambio conformacional en RNA Pol, y la subunidad  se disocia,
permitiendo el desplazamiento de la enzima por el molde.
La segunda etapa recibe el nombre de Elongación. Durante esta etapa, RNA
Pol recorre la hebra Antisentido transcribiendo la información del gen.
67
La Burbuja de Transcripción se desplaza a lo largo de la hebra de DNA,
pero tanto su longitud como la del híbrido DNA-RNA que se forma tras su paso son
constantes
La subunidad  de RNA pol cataliza la formación de los enlaces fosfodiester
de los nucleótidos incorporados, de forma similar a la replicación del DNA,
cambiando T por U.
Cuando RNA Pol se desplaza, el DNA rota en su interior, y se crean
tensiones que ralentizan la velocidad de la burbuja de Transcripción. Las
Tropoisomerasas rebajan dichas tensiones.
La última etapa es la Terminación. Tiene lugar de un modo muy selectivo, al
igual que la Iniciación.
En el DNA, el final de los genes está marcado por determinados Fragmentos
Pausa, donde disminuye notablemente la velocidad de Transcripción.
En estos fragmentos pausa hay numerosas señales de terminación:
Secuencias Palindrómicas de A y T, que al ser transcritas forman en el RNA
estructuras en Orquilla o Bucle, con fuertes uniones C-G.
NUS A permanece durante la elongación unido a RNA Pol, evitando la
asociación de la subunidad . Facilita el reconocimiento de las señales de
terminación.
EJEMPLO: Secuencia Palindrómica de terminación:
-------CGGCG---------CGCCGUUUUUUUUUUUU
Al girar 180º la hebra, las secuencias en verde son complementarias y quedan
unidas por numerosos puentes de H.
Producidas estas estructuras en Orquilla, el híbrido DNA-RNA queda
desestabilizado, y la Burbuja de Transcripción se disocia.
Una ristra de U al final de las señales de liberación facilita la liberación del
RNA desestabilizando más el híbrido, siendo la unión U-A más débil.
La proteína  detecta las señales de terminación que no son reconocidas por
RNA Pol.
También interviene el factor  pero su función es aún desconocida.
4 La Transcripción en Eucariontes:
Es, de nuevo, un proceso similar pero algo más complejo. Intervienen tres
tipos de RNA Polimerasas:
 RNA Pol I: En genes de rRNA (18S, 5,8S, 28S).
 RNA Pol II: En genes de mRNA para traducción a proteínas.
 RNA Pol III: Genes para snRNA, tRNA y rRNA (5S).
Además de estas, existen otras en mitocondrias y cloroplastos.
68
Todos los RNA transcritos primarios de eucariontes necesitan sufrir un
Proceso de Maduración antes de poder ser considerados activos y alcanzar su
conformación definitiva.
Se distinguen tres tipos de maduración de RNA transcrito primario:
1. Eliminación de Secuencias: Pueden ser secuencias externas de 5’ o 3’
necesarias para iniciación y terminación. También pueden ser Intrones;
secuencias internas que no contienen información necesaria para prteínas.
2. Adición de Secuencias No Codificadas: Por ejemplo, la adición en tRNA de
CCA.
3. Modificaciones Covalentes: La más frecuente es la metilación de las BN. En
ocasiones también metilación de las ribosas en 2’.
Casos de Metilaciones:
Ribosa
2’-O-Metilribosa
A
6-Dimetiladenina
U
T
Dihidrouridina
Ribotiuridina
Pseudouridina
La maduración aumenta la estabilidad del RNA y le permite adquirir su
estructura activa.
En tRNA se eliminan la secuencia guía en 5’ y la secuencia poli-U en 3’.
También es eliminado un intrón de 14 BN. Se añade la secuencia CCA,
indispensable para la unión de los aa que serán incorporados a proteínas.
En la baceria E. coli si tiene lugar la maduración del RNA transcrito
primario. Una misma molécula de RNA, cargada de intrones, dará lugar después
de maduración a tRNA, rRNA 16S, rRNA 23S y rRNA 5S.
En algunos casos, como E. coli, los propios intrones catalizan su
eliminación.
LA MADURACIÓN EN E. COLI
Exón
Intrón
MADURACIÓN
rRNA 16S
tRNA
rRNA 23S
rRNA 5S
69
Posteriormente a la eliminación de intrones, los exones suelen ser
empalmados. Este proceso de Splicing es catalizado por encimas específicas. Finalmente se forma una caperuza CAP en el extremo 5’ del RNA, que
protege ante ataques de exonucleasas, y puede ser reconocido por los Ribosomas
en el citosol.
El primer nucleótido en 5’ del RNA es un NTP. Por acción de una Fosfatasa
pierde su P en . Después se produce una Guanilización a costa de GTP. G queda
unido por medio de tres grupos P al extremos 5’ del mRNA, antes de que éste
pueda abandonar el núcleo celular.
B/ La Traducción; del mRNA a las Proteínas:
1 Generalidades:
Se trata del proceso de Biosíntesis de Proteínas, y es por lo tanto también un
proceso fundamental para toda célula viva.
Se utiliza el molde de mRNA que transporta la información de un gen. En
concreto, la secuencia de BN (4 elementos) determina el orden de la secuencia de
-L-aa proteicos (20 elementos).
Debido a la diferencia en el número de elementos, 1 codón = 3 BN = 1 aa.
Varios codones distintos pueden codificar un mismo aa.
La traducción de un lenguaje al otro se realiza respetando el Código
Genético Universal, que es idéntico en, prácticamente, todos los seres vivos.
tRNA transporta los aa que van a ser incorporados al péptido (aminoaciltRNA). Tiene un papel de intermediario en la Traducción.
rRNA entra en juego formando una parte constitutiva de los Ribosomas;
maquinaria necesaria para la Traducción.
2 Estructura del tRNA:
tRNA juega como intermediario entre Molde y Proteína. Presenta una
estructura en Hoja de Trébol. Muchas regiones de la molécula son complementarias
y se unen facilitando y estabilizando el plegamiento (50%).
Se trata de una única cadena de RNA, de unas 73-93 BN.
Presenta una Cola con los extremos 5’ y 3’ donde se produce la unión del
aminoácido. Presenta además tres Lazos no apareados en estructuras de orquilla y
también un pequeño Brazo Adicional Variable no apareado.
En el extremo 5’ se encuentra una caperuza CAP de guanina. En el extremo
3’ se produce siempre la unión de la secuencia CCA, que permite la unión del aa
en OH de 3’ de A (raramente en 2’ de C)
En algunas BN puntuales se produce Metilación (modificación covalente).
Por ejemplo, la transformación U > T impide el apareamiento quedando libre para
otra interacción.
La metilación concede carácter hidrofóbico en ciertos fragmentos que
pueden interaccionar con proteínas o Ribosomas.
70
Las regiones apareadas suelen determinar la estructura de la molécula. Las
regiones no apareadas adquieren papeles funcionales; son las siguientes:
 Extremo 3’ terminal unido a Secuencia CCA donde se une el aa.
 Lazo TC: Las BN T y  proceden de la Metilación de U.
 Lazo Anticodón, Formado por 7 BN, posee en situación central las 3 BN
complementarias al codón cuyo aa es transportado en 3’-CCA.
 Brazo Adicional Variable (l variable)
 Lazo DHU (DiHidroUridina; UH2): Varias BN U son metiladas
transdormándose en D (UH2).
Las modificaciones covalentes que tienen lugar en determinadas BN está
relacionado con el desapareamiento de BN de las regiones que las incluyen.
EJEMPLO: Lazo Anticodón:
(A’: Purina Modificada)
-C-U-X-Y-Z-A’-AANTICODÓN
El lazo anticodón, y concretamente las 3 BN del anticodón, interaccionan
con el molde de mRNA al que son complementarias, concretamente con el codón.
La estructura 3D del tRNA es distinta. Las regiones de BN apareadas giran
en doble hélice desplazando los lazos.
El resultado final es una molécula en forma de L, con el lazo anticodón en
un extremo, y 3’-CCA en el otro. La cola del tRNA que incluye el extremo 3’
terminal no interacciona con otras regiones, y presenta bastante flexibilidad.
Rich y Klug descubrieron que algunas BN no apareadas presentan
interacciones tipo terciario, forzando la aparición de la estructura L. También está
implicado en estas interacciones el esqueleto de Ribosa-P.
3 La Activación de Aminoácidos:
Se da este nombre a la formación del enlace 3’-CCA – aa. Esta unión es
imprescindible para la biosíntesis de proteínas, pues los aa son incapaces de
reconocer el molde de mRNA.
NH3+ – CH – CO – P-A-P-C-P-C – tRNA
R O
La formación de los enlaces peptídicos es, como vimos anteriormente,
desfavorable termodinámicamente. La situación se revierte cuando el aa es activado
por el tRNA.
En 1957, Zamecnik y Hoagland descubrieron que el proceso de activación
de los aa es catalizado por enzimas Aminoacil-tRNA-Sintetasas (Sintasas, sin ATP).
El proceso tiene lugar en dos etapas:
1. Se produce la unión del aa con el fosfato en  de ATP. Se forma aa-AMP.
Se consume además del ATP, la energía de PPi a 2Pi.
71
2. Se forma la unión aa-tRNA catalizada por las Aminoacil-tRNA-Sintetasas.
Se desprende el AMP.
Las Aminoacil-tRNA-Sintetasas son altamente específicas a la hora de
relacionar cada aa con su tRNA. Existe al menos una para cada aa. Son capaces
de corregir errores.
4 La Unión Anticodón – mRNA:
A pesar del cambio de T por U, mRNA es una réplica exacta de la
información genética del DNA, que viaja hasta los Ribosomas donde podrá ser
traducida a proteína.
Como hemos visto, esta traducción es realizada por los tRNA respetando un
código genético universal en todos los organismos, excepto mitocondrias,
cloroplastos y algunos protozoos.
Gamow descubrió en 1955 que los tripletes de BN o Codones corresponden
a uno de los 20 aa concreto.
Hay 64 posibles tripletes, por lo cual cada triplete corresponde a un aa,
pero un aa puede ser codificado por distintos tripletes: el código está Degenerado.
EJEMPLOS:



Ser:
Gly:
Lys:
6 codones sinónimos.
4 codones sinónimos.
2 codones sinónimos.
Tres de los tripletes, UAA, UGA y UAG, son codones STOP, o señales de
terminación.
El codón iniciador AUG es reconocido por un tRNA iniciador (tRNAi)
especial que transporta siempre formil-Met.
Además de servir como triplete iniciador, AUG marca la Pauta de Lectura,
pues define en toda la secuencia de aa donde comienza cada codón. Cualquier
desplazamiento en un número no divisible por 3 cambiaría todos los codones y,
radicalmente, la proteína.
Las interacciones Codón – Anticodón se producen por emparejamiento de
las BN según las normas de Watson y Crick, pues en codón y anticodon las BN se
disponen de forma antiparalela.
Posición Flexible o de Balanceo: Se trata de la posición 3’ del codón (5’ de
anticodon), que recibe este nombre debido a que las BN no siempre coinciden en
esta posición.
Por ello algunos tRNA pueden unirse a varios codones, cuando la posición
de balanceo no coincide, mientras las dos primera BN lo hacen. Estos codones son
los Codones Sinónimos.
72
EJEMPLO:
GCA
GCC
GCU
Posición Flexible 5’
Anticodón
I (Inosina)
U, G
A, C
Ala – tRNA
Anticodón: CGI (I = Inosina)
Nº Codones sinónimos
3
2
1
Posición 3’ Codón que
puenen unirse
A, C, U
U,G
C o A respectivamente
En algunos casos los codones sinónimos no comparten sus 2 primeras BN,
por ejemplo AGA y CGU que codifican Arg.
En estos casos, los aa son transportados por distintas moléculas de tRNA,
con distintos anticodones, que reciben el nombre de Isoaceptores.
5 La maquinaria esencial para la síntesis de proteínas; Los Ribosomas:
Los Ribosomas, además de una serie de proteínas son, junto con tRNA,
esenciales para que la Traducción pueda tener lugar.
Entre las proteínas encontramos:
 Factores de Iniciación (IF).
 Factores de Elongación (EF).
 Factores de Terminación (RF).
Los Ribosomas son moléculas derivadas de la combinación de rRNA y
Proteínas Ribosómicas. En Eucariontes se encuentran al 50%, mientras en
Procariontes se forman de 2/3 de rRNA y 1/3 de proteínas.
Los Ribosomas se forman de dos Subunidades, una grande y una pequeña.
Las hebras de rRNA presentan numerosas regiones helicoidales por
apareamiento de BN. También presentan numerosos repliegues y lazos. Son
proteínas flexibles y deformables que constituyen el armazón donde se enzamblan
las distintas Proteínas Ribosómicas.
El Ribosoma de Procariontes tiene un coeficiente de sedimentación de 70S,
un diámetro de 200 Amstrongs y una masa de 2700 kDaltons. Sus subunidades
son de 30S y 50S:
 30S se forma de rRNA 16S y Proteínas (21).
 50S se forma de rRNA 23S, rRNA 5S y Proteínas (34).
6 Funcionalidad de los Ribososmas:
El Ribosoma es, en conjunto, un complejo catalítico que desempeña
numerosas reacciones durante la Biosíntesis de Proteínas:
 Aproxima los Reactivos y los orienta correctamente.
73
Alinea el molde de mRNA.
Participa en la selección del codón iniciador AUG.
Controla la fidelidad de la Traducción.
Interviene en la Terminación y la liberación del material.
Siempre lee el molde de mRNA de 5’ a 3’, realizando la síntesis proteica de
a-t (NH3+) a c-t (COOH).
Para descubrir el orden de síntesis de los péptidos se utilizaron reticulocitos
de conejo, que sintetizan activamente hemoglobina:
1. Se añaden aa marcados radiactivamente.
2. Detención: Se eliminan los aa marcados antes del tiempo de síntesis de una
cadena completa de Hg.
3. Aislamiento de las proteínas.
Las cadenas que pudieron terminar su síntesis durante el corto pulso de aa
marcados presentaban radiactividad en su extremo c-t.
Pudieron demostrarlo también utilizando Péptidos Sintéticos. Conociendo los
aa codificados se pudo identificar cual de ellos presenta su grupo  amino (o
carboxilo) libre:




AAA = Lys
AAC = Asn
DESPLAZAMIENTO DEL RIBOSOMA
5’
AAA (AAA)n AAC
3’
NH3+-Lys – (Lys)n – Asn-COOH
7 La Síntesis de Proteínas en Procariontes:
Un molde puede dar lugar a varia proteínas, y tener varios lugares de
Iniciación precedidos por secuencias ricas en Purinas.
Dado que el mRNA se Transcribe de 5’ a 3’, mismo sentido de lectura que el
Ribosoma, en procariontes el molde mRNA puede comenzar a ser leído según es
sintetizado.
Hay de hecho un estrecho acoplamiento en el tiempo y en el espacio de la
Transcripción y la Traducción, que debido a la membrana nuclear no podría tener
lugar en Eucariontes, lo cual permite la maduración del mRNA.
Un mismo mRNA puede ser Traducido por varios Ribosomas a la vez. Este
conjunto de Ribosomas se llama Polisoma.
7.1La Iniciación:
Participan IF1, IF2 e IF3.
tRNA iniciador (tRNAi) es siempre el primer tRNA que se une, que
corresponde al codón iniciador AUG, marcando la Pauta de Lectura.
74
Siempre lleva unido formil-metionina (f-Met) (radical formilo en NH3+). No
es el mismo que transporta normalmente Met.
En algunos casos el codón iniciador puede ser GUG (Val)
1. Disociación de las dos subunidades del Ribosoma.
2. IF3 se une a 30S evitando la reasociación con 50S. Facilita la colocación del
molde y colabora en la colocación del tRNAi.
3. IF2 unido a GTP se une a 30S y reconoce tRNAi, situándolo en el lugar que
le corresponde.
4. IF1 se une a 30S colaborando con IF3 e IF2.
5. Se produce la colocación del molde de mRNA en 30S. Una secuencia rica
en Purinas del rRNA 16S se aparea con la hebra molde de mRNA.
6. IF2 reconoce AUG y lo coloca en el lugar del Ribosoma en el que debe
interaccionar con el Anticodón de tRNAi.
El resultado de este proceso recibe el nombre Complejo de Iniciación 30S.
Se forma de rRNA 30S, molde de mRNA, tRNAi con f-Met y Factores de Iniciación.
7. Se desprende IF3 pudiendo asociarse la subunidad 50S.
8. Se produce la hidrólisis de GTP de IF2, desprendiéndose entonces IF2 e IF3.
El resultado final del proceso es el Complejo de Iniciación 70S. Se forma de
rRNA 30S, rRNA 50S, molde de mRNA, y tRNAi con f-Met. La Pauta de Lectura
queda marcada.
7.2 La Elongación:
Participan EF Tu, EF Ts y EF G (o Translocasa).
Los lugares A (aminoacil) y P (peptidil) de 50S del Ribosoma juega un papel
fundamental en la biosíntesis de proteínas. En ellas se unen respectivamente, el
aminoacil-tRNA nuevo y el peptidil-tRNA.
El lugar E (vacío) ha sido descrito recientemente. Presuntamente alberga los
tRNA que acaban de ceder su aa al péptido.
1. EF Tu Selecciona el siguiente aminoacil-tRNA y lo coloca en el lugar A en
función del codón expuesto. Hidroliza GTP.
2. EF Ts cataliza el intercambio GDP > GTP en EF Tu para dejarlo activado
ante la llegada del nuevo codón. En un primer paso EF Tu pierde su GDP. A
continuación EF Tu y EF Ts con GTP forman un dímero. Finalmente EF Tu es
liberado activo, con GTP.
3. Peptidil Transferasa cataliza la unión de c-t de f-Met con a-t del nuevo aa.
Esta enzima forma parte de 50S, y cataliza el ataque nucleófilo de NH3+ a
COO- sin gasto energético.
EJEMPLO: Peptidil-tRNA:
NH3+ – f-Met – CO – NH – Arg – COO – ACC - tRNA
a-t
3’
5’
75
4. Se produce la Translocación del molde, que avanza un codón. Interviene EF
G o Translocasa, que hidroliza GTP:
 Peptidil-tRNA libera el péptido y es arrastrado al lugar E.
 Aminoácil-tRNA recibe la unión del péptido con el aa que
transportaba, siendo arrastrado al lugar P.
 El lugar A queda vacío y expone un nuevo codón. Se repite el
proceso desde el paso 1.
La síntesis de toda la Estructura Primaria de una Proteína tiene lugar por la
repetición de este proceso, codón tras codón.
7.3 La Terminación:
Participan RF1, RF2 y RF3. Forman dímeros pudiendo reconocer distintas
Señales de Terminación:
Dímero
RF1 – RF3
RF2 – RF3
Señal de Terminación que reconoce
UAA ; UAG
UAA ; UGA
Al reconocer una Señal de Terminación, estos dímeros modifican Peptidil
Transferasa, de forma que cambia su actividad y cataliza la liberación del péptido,
hidrolizando GTP.
Terminada la síntesis, los componentes son liberados, y las subunidades se
disocian de nuevo. IF3 se une directamente a 30S, manteniéndola lista para una
nueva Traducción.
7.4 Balance Energético:
Procesos que consumen Energía Celular
Activación de los aa
Activación de los aa
Iniciación: IF2
Elongación: EF Tu
Elongación: EF G
Terminación: RF3
Enlaces ricos en energía consumidos
durante la Traducción
1 ATP por aa
1 PPi por aa
1 GTP por proteína
1GTP por codón (o aa)
1 GTP por codón (o aa)
1 GTP por proteína
8 La Síntesis de Proteínas en Eucariontes:
En este caso, un molde de mRNA da lugar a una única proteína. Hay una
única señal de iniciación no precedida por secuencia rica en purinas.
Los Ribosomas son de mayor tamaño, 80S. Las subunidades son:
 40S: rRNA 18S y Proteínas.
 60S: rRNA 28S, rRNA 5,8S, rRNA 5S y Proteínas.
76
-
Existen numerosos Factores que intervienen en la Traducción:
 9 Factores de Iniciación (Incluído IF3).
 3 Factores de Elongación (EF 1 EF 1 ,  y EF 2, corresponden
respectivamente a EF Tu, EF Ts y EF G).
 Un único factor de terminación (RF).
tRNAi no lleva unido f-Met sino Met, pero es igualmente distinto a los otros
tRNA que unen Met normalmente.
El péptido recién sintetizado incluye Secuencias Señal que determinan su
destino final en las células y los tejidos. Después de ser reconocidas, estas
secuencias son eliminadas durante la Maduración.
9 Las Rutas de Transporte de proteínas en Eucariontes:
Veremos el caso de las proteínas lisosómicas, de membrana celular, y de
secreción a la matriz extracelular.
Contienen una secuencia de 20 aa en a-t que determina su destino final, y
que no aparece en su estructura madura.
La señal, una vez sintetizada, es reconocida por las SRP (partículas
receptoras de señales).
SRP tiene Receptores en la membrana del RE, y arrastra a la proteína con el
Ribosoma y el molde de mRNA, formándose el REr.
Estos receptores se encuentran cercanos a Riboporinas integrales de
membrana del REr, por donde las proteínas pueden penetrar al orgánulo según son
sintetizadas por el Ribosoma.
Una vez finalizada la síntesis, Peptidasa Señal rompe la Secuencia Señal en
el interior del RE.
La proteína pasa al Aparato de Golgi donde es modificada, clasificada, y
enviada a su destino final en el tejido a través de:
 Gránulo de Secreción.
 Pre-Lisosoma.
 Membrana celular.
10 El Plegamiento de las Proteínas en Eucariontes:
La proteína necesita sufrir un Proceso de Maduración donde los aa son
modificados, de manera a poder obtener el correcto plegamiento.
Este proceso se inicia durante la Traducción y se completa al liberarse la
cadena.
A menudo este plegamiento es retardado por las Proteínas Tutoras
(Chaperonas (ATPasas lentas) y Chaperoninas), que evitan contactos erroneos y
deshacen enlaces inadecuados entre los aa de la propia proteína u otros
compuestos del medio.
Hsp, Proteína de Choque Térmico, acompaña a las proteínas durante su
plegamiento.
Hps 70 participa además en el envío de proteínas del citosol a la matriz
endocondrial (interior mitocondrial).
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Tiene receptores en la membrana de la mitocóndria, cercanos a canales que
permiten el paso controlado de péptidos.
Finalmente se produce el plegamiento en la Matriz Endocondrial.
11 Maduración de las Proteínas:
Existen varios tipos de maduración de proteínas. Algunos pasos de la
maduración son constantes:
Siempre tiene lugar la eliminación de Met (f-Met en procariontes) poco
después del comienzo de la síntesis.
Siempre tiene lugar la eliminación de Secuencias Señal cuando ha sido
completado el proceso de transporte de la Proteína a su destino.
Las modificaciones que afectan al plegamiento y la conformación de las
proteínas se clasifican en dos grandes grupos:
11.1 Modificación de aminoácidos:
Unión de substituyentes en los aa:
 Acetilación (en a-t o R de Lys) (En histonas).
 Carboxilación (en R de Asp o Glu) (Glu en Protrombina).
 Fosforilación (en R de Ser, Tyr o Thr) (Regulador de la actividad proteica).
 Hidroxilación (en R de Pro o Lys) (En colágeno: Hyp, Hyl).
 Metilación (en R de Lys y Glu).
Glucosilación o unión de glúcidos formándose un polisacárido, frecuente en
proteínas de membrana (Glucocalix) y de secreción (Agrecanes):
 Unión a través de O (en R de Ser y Thr).
 Unión a través de N, enlaces N-Glicosílicos (en Asp).
Modificación por lípidos: Aumenta la hidrofobicidad de la proteína y por lo
tanto su anclaje a la membrana lipídica (en a-t, Ser, Thr y Cys):
 Acilación: Por ácidos grasos.
 Prenilación: Por Terpenos.
Formación de puentes disulfuro entre dos Cys.
Unión de Grupos Prostéticos, como por ejemplo, Hemo.
Adenilación.
ADP-Ribosilación.
Sulfatación.
11.2 Procesamiento Proteolítico:
Cambios en la actividad de la proteína por su conformación.
Puede tener lugar por activación de proenzimas proteolíticas, como el caso
de la Tripsina y cimógenos digestivos.
También se da el caso de activación de precursores de hormonas peptídicas
por Proteólisis Irreversible, como por ejemplo, el caso de la Insulina:
Se sintetiza Preproinsulina. Al llegar al RE, es eliminado el primer péptido
señal de secreción por proteólisis, quedando Proinsulina.
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Alcanza el AG donde tiene lugar la segunda proteólisis y se obtiene la
proteína Madura: Insulina. Es secretada al torrente sanguíneo.
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