manual hongos

SERIE DE NORMAS TÉCNICAS N.º 44
CARATULA PROCEDIMIENTO.indd 1
IDENTIFICACIÓN DE LOS PRINCIPALES HONGOS OPORTUNISTAS CAUSANTES DE MICOSIS HUMANAS
Instituto Nacional de Salud
Jirón Cápac Yupanqui 1400, Lima 11, Perú
Apartado Postal 471, teléfono: (0511) 471-9920 Fax: (0511) 471-0779
Correo electrónico: [email protected]
Página web: www.ins.gob.pe
MINISTERIO DE SALUD
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Y
TÉCNICAS DE LABORATORIO PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE LOS PRINCIPALES
HONGOS OPORTUNISTAS CAUSANTES
DE MICOSIS HUMANAS
SERIE DE NORMAS TÉCNICAS N.º 44
Lima, 2007
14/9/07 14:44:11
MINISTERIO DE SALUD DEL PERÚ
MINISTRO
Dr. Carlos Vallejos Sologuren
VICEMINISTRO
Dr. José Calderón Yberico
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
JEFA
Dra. Patricia J. García Funegra
SUBJEFE
Dr. Rubén Espinoza Carrillo
CENTRO NACIONAL DE
SALUD PÚBLICA
Director General
Dr. Luis Fuentes Tafur
CENTRO NACIONAL DE
PRODUCTOS BIOLÓGICOS
Directora General
Dra. Silvia Pessah Eljay
CENTRO NACIONAL DE
ALIMENTACIÓN Y NUTRICIÓN
Directora General
Mg. María Inés Sánchez-Griñán
CENTRO NACIONAL DE
CONTROL DE CALIDAD
Director General
Q.F. Alberto Valle Vera
CENTRO NACIONAL DE
SALUD INTERCULTURAL
Director General
Dr. Neptalí Cueva Maza
CENTRO NACIONAL DE SALUD
OCUPACIONAL Y PROTECCIÓN
DEL AMBIENTE PARA LA SALUD
Director General
Dr. Luis Santamaría Juárez
COMITÉ EDITOR
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
PRESIDENTE
Dr. César Cabezas Sánchez
MIEMBROS
Dr. Pedro Álvarez Falconí
Blg. Ana Barrientos Tejada
Q.F. Rosario Belleza Zamora
Dr. Zuño Burstein Alva
Dra. Patricia Caballero Ñopo
Dr. Walter Curioso Vilchez
Dr. Manuel Espinoza Silva
Ing. Fernando Farfán Rocha
ASISTENTE EDITORIAL
Lic. Melissa Daga Caycho
RETIRA DE CARATULA PROCEDIMIENTO1 1
Dr. Claudio Lanata de las Casas
Dr. Percy Mayta Tristán
Mg. Mercedes Ochoa Alencastre
Mg. Graciela Rengifo García
Dr. Miguel Salcedo Luna
Blg. Silvia Seraylan Ormaechea
Dr. Javier Vargas Herrera
Q.F. Diana Vergara Nuñez
CORRECTOR DE ESTILO
Daniel Cárdenas Rojas
14/9/07 14:49:21
MINISTERIO DE SALUD
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Y TÉCNICAS
DE LABORATORIO PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE LOS PRINCIPALES
HONGOS OPORTUNISTAS CAUSANTES
DE MICOSIS HUMANAS
Elaboración:
Miriam Guevara Robles
Bióloga
Laboratorio de Micología
Centro Nacional de Salud Pública
Instituto Nacional de Salud
Flor Urcia Ausejo
Bióloga
Laboratorio de Micología
Centro Nacional de Salud Pública
Instituto Nacional de Salud
José Casquero Cavero
Biólogo. Magíster en Microbiología.
Laboratorio de Micología.
Centro Nacional de Salud Pública
Instituto Nacional de Salud
Lima, 2007
Manual de Procedimiento.indd 1
14/9/07 14:40:21
Los autores agradecen a Alida Navarro Mariñas por su valiosa colaboración.
Catalogación hecha por el Centro de Documentación e Información del INS
Guevara Robles, Miriam; Urcia Ausejo, Flor y Casquero Cavero, José
Manual de procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación
de los principales hongos oportunistas causantes de micosis humanas /
Elaborado por Miriam Guevara Robles : Flor Urcia Ausejo y José Casquero
Cavero. -- Lima: Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, 2007.
100 p. : 21 x 14,5 cm. -- (Serie de Normas Técnicas; 44)
1. MICOSIS 2. INFECCIONES OPORTUNISTAS 3. CANDIDA ALBICANS
4. ASPERGILLUS FUMIGATUS 5. CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS
6. TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO
I. Guevara Robles, Miriam
II. Urcia Ausejo, Flor
III. Casquero Cavero, José
IV. Instituto Nacional de Salud (Perú)
V. Perú. Ministerio de Salud
ISBN: 978-9972-857-62-1
ISSN 1607 – 4904
Hecho el Depósito Legal en la Biblioteca Nacional del Perú N.º: 2007-08290
© Ministerio de Salud, 2007
Av. Salaverry cuadra 8 s/n, Jesús María, Lima, Perú
Teléfono: (511) 431-0410
Telefax: 01 – 3156600 anexo 2669
Página Web: www.minsa.gob.pe
© Instituto Nacional de Salud, 2007
Cápac Yupanqui 1400, Jesús María, Lima, Perú
Teléfono: (511) 471-9920 Fax 471-0179
Correo electrónico: [email protected]
Página Web: www.ins.gob.pe
Publicación aprobada con R.J. N.º 356-2007-J-OPD-INS
Se autoriza su reproducción total o parcial, siempre y cuando se cite la fuente
Forma de citación sugerida:
Guevara M, Urcia F, Casquero J. Manual de procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas causantes
de micosis humanas. Lima: Instituto Nacional de Salud; 2007. Serie de Normas
Técnicas N.º 44.
Manual de Procedimiento.indd 2
14/9/07 14:40:21
Índice
Índice
INTRODUCCIÓN.
5
SECCIÓN 1: GENERALIDADES.
7
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
OBJETIVO.
CAMPO DE APLICACIÓN.
REFERENCIAS.
DEFINICIONES.
RESPONSABILIDADES.
9
9
9
12
14
SECCIÓN 2: PROCEDIMIENTOS PARA OBTENCIÓN, TRANSPORTE Y
CONSERVACIÓN DE MUESTRAS.
15
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
MUESTRA
MUESTRA
MUESTRA
MUESTRA
MUESTRA
MUESTRA
MUESTRA
DE
DE
DE
DE
DE
DE
DE
SANGRE PARA HEMOCULTIVO.
ORINA PARA CULTIVO.
BIOPSIA.
ESPUTO Y SECRECIONES BRONQUIALES.
CATÉTER INTRAVASCULAR
EXUDADO PERICATÉTER.
LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO.
SECCIÓN 3: PROCEDIMIENTOS PARA EL DIAGNÓSTICO
MICOLÓGICO.
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
EXAMEN DIRECTO (KOH, TINTA CHINA,
COLORACIÓN GIEMSA, COLORACIÓN GRAM).
CULTIVO DE MUESTRA DE SANGRE.
CULTIVO DE MUESTRA DE ORINA.
CULTIVO DE BIOPSIA.
CULTIVO DE CATÉTER Y EXUDADO DE PERICATÉTER.
CULTIVO DE ESPUTO Y SECRECIONES BRONQUIALES.
CULTIVO DE LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO.
SECCIÓN 4: IDENTIFICACIÓN DE PRINCIPALES LEVADURAS.
4.1
4.2
Manual de Procedimiento.indd 3
IDENTIFICACIÓN DE Candida albicans, Candida no
albicans, Rhodotorula rubra, Trichosporon spp,
Geotrichum spp y Cryptococcus neoformans
IDENTIFICACIÓN DE Malassezia furfur
17
18
19
20
22
22
23
25
27
28
29
30
31
32
32
35
56
14/9/07 14:40:21
SECCIÓN 5: IDENTIFICACIÓN DE PRINCIPALES HONGOS
FILAMENTOSOS.
59
IDENTIFICACIÓN DE Aspergillus fumigatus, A. flavus,
A. niger, Fusarium solani, Scedosporium apiospermum,
Mucor spp. Rhizopus oryzae y Absydia corymbifera. 61
ANEXOS
73
ANEXO A
TÉCNICA DE LISIS CENTRIFUGACIÓN.
75
ANEXO B
PREPARACIÓN DE REACTIVOS.
77
ANEXO C
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO.
83
ANEXO D
CLAVE N.º 1 :
CLAVE N.º 2 :
CLAVE PARA IDENTIFICAR
Trichosporon spp.
CLAVE MORFOLÓGICA PARA
IDENTIFICAR Geotrichum spp.
92
CLAVE N.º 3 : CLAVE FISIOLÓGICA PARA
IDENTIFICAR Geotrichum spp.
92
ANEXO E
FLUJOGRAMA DE IDENTIFICACIÓN N.º 1.
Trichosporon spp. y Geotrichum spp.
TABLA N.º 1: CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS Y
FISIOLÓGICAS DE PRINCIPALES
LEVADURAS DE IMPORTANCIA
EN SALUD PÚBLICA.
TABLA N.º 2: CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS
DE PRINCIPALES LEVADURAS DE
IMPORTANCIA EN SALUD PÚBLICA.
TABLA N.º 3: CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS DE
Malassezia furfur y M. pachidermatis
CAUSANTES DE INFECCIÓN SISTÉMICA.
TABLA N.º 4: CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS
PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES
DETrichosporon sp.
TABLA N.º 5: CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS DE
ESPECIES DE Geotrichum sp.
TABLA N.º 6: CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS
DE LAS PRINCIPALES ESPECIES DE
Aspergillus sp.
91
93
ANEXO F
Manual de Procedimiento.indd 4
96
97
98
99
99
100
14/9/07 14:40:21
Introducción
Introducción
Durante la última década se ha observado un incremento
de las enfermedades micóticas, sobre todo las de tipo
oportunista, ello ha significado la aparición de nuevas
formas clínicas de micosis así como localizaciones o
presentaciones no habituales, además de la presencia
de nuevas especies fúngicas consideradas antiguamente
como no patógenas pero que excepcionalmente producían
enfermedad en individuos inmunodeprimidos.
Diversos factores han permitido la aparición de infecciones
emergentes: cambios poblacionales y sus patrones de
costumbres, avances tecnológicos y desarrollo económico
de algunos países, que ha permitido la generalización
de tratamientos médicos quirúrgicos invasivos, con
supervivencia de enfermos que difícilmente superaban
procesos patológicos y que favorecen el desarrollo
de micosis sistémicas; incremento de viajes inter y
transcontinentales, nuevos mecanismos de adaptación
de algunos microorganismos que conlleva a la aparición
de resistencia a los antifúngicos e infección por VIH.
Actualmente se reconocen entre 300 y 400 especies
de hongos causantes de micosis sistémicas, las cuales
constituyen un pequeño porcentaje del total de más de
100 000 especies catalogadas. Por todo ello se prefiere
mencionar un “comportamiento oportunista” por parte
del hongo, debido a que los patógenos primarios al
infectar a individuos inmunosuprimidos, se comportan
con mayor agresividad, originando infecciones sistémicas,
diseminadas, de evolución aguda y mal pronóstico.
En este tipo de micosis es necesario considerar al binomio
huésped – parásito. Las infecciones oportunistas se
producen cuando los mecanismos de defensa específicos
e inespecíficos del hospedero son ineficaces, mientras que
las sistémicas o diseminadas se producen cuando fallan
los mecanismos celulares de defensa en los neutrófilos.
La mayoría de las micosis oportunistas siguen siendo
Manual de Procedimiento.indd 5
14/9/07 14:40:22
ocasionadas por las especies clásicas: Candida albicans,
Aspergillus fumigatus, Cryptococcus neoformans. Sin
embargo, por las razones expuestas anteriormente han
emergido nuevos hongos oportunistas.
El Instituto Nacional de Salud como entidad técnica
normativa en procedimientos de laboratorio pone a
disposición del personal del sector, el MANUAL DE
PROCEDIMIENTOS Y TÉCNICAS DE LABORATORIO PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE LOS PRINCIPALES HONGOS CAUSANTES
DE MICOSIS OPORTUNISTAS, cuyo objetivo es establecer los
procedimientos de laboratorio para la identificación de las
principales especies de levaduras y hongos filamentosos
pertenecientes a los géneros: Candida spp., Rhodotorula
rubra, Geotrichum spp., Trichosporon spp., Cryptococcus
neoformans, Malassezia furfur, Aspergillus spp., Fusarium
solani, Scedosporium apiospermum, Mucor spp., Rhizopus
oryzae y Absidia corymbifera.
Este documento técnico representa el esfuerzo del personal
del laboratorio de micología de la institución.
Manual de Procedimiento.indd 6
14/9/07 14:40:22
Sección 1
Generalidades
Manual de Procedimiento.indd 7
14/9/07 14:40:22
Manual de Procedimiento.indd 8
14/9/07 14:40:22
GENERALIDADES
1.1. OBJETIVO
Establecer los procedimientos de laboratorio para realizar el aislamiento e identificación de los principales hongos emergentes y reemergentes de importancia médica como: Candida albicans y C. no albicans, Cryptococcus neoformans, Rhodotorula rubra, Geotrichum spp.,
Trichosporon spp., Aspergillus spp., Malassezia furfur, Scedosporium
apiospermum, Mucor spp., Rhizopus oryzae, Fusarium solani y Absidia
corymbifera.
1.2. CAMPO DE APLICACIÓN
El presente manual es aplicable a las entidades que conforman el
sistema nacional de la red de laboratorios.
1.3. REFERENCIAS
1.3.1.
Instituto Nacional de Salud. Manual de procedimientos
de laboratorio para la obtención y envío de muestras
(I). Lima: Instituto Nacional de Salud; 1995. Serie de
Normas Técnicas N.º 15.
1.3.2.
Instituto Nacional de Salud. Bioseguridad en laboratorios
de ensayo, biomédicos y clínicos. 3ra ed. Lima: Instituto
Nacional de Salud; 2005. Serie de Normas Técnicas
N.º 18.
1.3.3.
Instituto Nacional de Salud. Manual de procedimientos
bacteriológicos en infecciones intrahospitalarias. Lima:
Instituto Nacional de Salud; 2001. Serie de Normas
Técnicas N.º 28.
1.3.4.
Negroni R, Guelfand L. Manual de procedimientos para
laboratorios de micología médica. Acta Bioquímica
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 9
14/9/07 14:40:22
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
Clínica Latinoamericana 1999 – Suplemento 1. Buenos
Aires: Federación Bioquímica de la Provincia de Buenos
Aires; 1999.
1.3.5.
Campbell M, Stewart J. Processing of individual
specimens. En: The Medical Mycology Handbook. New
York: John Wiley & Sons; 1980. p. 139 - 40.
1.3.6.
Koneman E, Roberts G. Micología. Práctica de laboratorio.
3ra ed. Buenos Aires: Editorial Médica Panamericana;
1992.
1.3.7.
Pemán J, Martín-Mazuelos E, Rubio-Calvo MC. Guía
práctica. Identificación y diagnóstico en micología
médica. Revista Iberoamericana de Micología; 2001.
1.3.8.
Arango M, Castañeda E. Micosis humanas. Procedimientos
diagnósticos. Exámenes directos. Bogotá: Corporación
para Investigaciones Biológicas e Instituto Nacional de
Salud; 1995.
1.3.9.
Ballesté R, Salvatella R. Manual de toma de muestra para
estudio bacteriológico, parasitológico y micológico.
Selección, recolección, conservación y transporte.
Montevideo: Departamento de Laboratorio Clínico.
Hospital de Clínicas. Facultad de Medicina; 2004.
1.3.10. López Martínez R, Méndez L, Hernández F, Castañón R.
Micología médica. Procedimientos para el diagnóstico
de laboratorio. Mexico DF: Editorial Trillas; 1995.
1.3.11.
Torres – Rodriguez, J. Nuevos hongos patógenos
oportunistas emergentes. Rev. Iberoam. Micol. 1996.
13: S30 – S38.
1.3.12. Hazen K. New and emerging yeast pathogens. Clin
Microbiol Rev 1995; 8(4): 462-78.
1.3.13. Sullivan D, Coleman D. Minireview Candida dubliniensis:
Characteristics and Identification. J Clin Microbiol 1998;
36(2): 329-34.
1.3.14. Fridkin S, Jarvis W. Epidemiology of nosocomial fungal
infections. Clin Microbiol Rev 1996; 9(4): 499-511.
1.3.15. Casquero J, Zurita S. Manual de procedimientos de
laboratorio para el diagnóstico de micosis oportunistas
10
Manual de Procedimiento.indd 10
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:40:22
Sección 1
y profundas. Lima: Instituto Nacional de Salud; 1997.
Serie de Normas Técnicas N.º 23.
1.3.16. Hoog GS, Guarro J, Gené J, Figueras MJ. Atlas clinical of
fungi. 2nd ed. Reus: Universitat Rovira I Virgili; 2000.
1.3.17. San Juan R, Berenguer J, Aguado JM. Hongos filamentosos
emergentes: Scedosporium [documento en internet].
España; 2004. Disponible en: www.seimc.org/control/
revi_Mico/pdf/Honemerg.pdf
1.3.18. Crespo V, Ojeda A, Vera A, Crespo A, Sánchez F.
Aislamiento e identificación de Malassezia spp. en
pitiriasis versicolor, dermatitis seborreica y piel sana.
Rev Iberoam Micol 199; 16: 16-21.
1.3.19. Giusiano GE. Malassezia. Estado del conocimiento y
perspectivas en su estudio. Rev Argent Microbiol 2006;
38(1): 41-48.
1.3.20. Guillot J, Guého E, Lesourd M, Midgley G, Chévrier
G, Dupont B. Identification of Malassezia species. A
practical approach. J. Mycol Med 1996; 6: 103-10.
1.3.21. Guého E, Midgley G, Guillot J. 1996. The genus
Malassezia with description of four new species. Antonie
van Leeuwenhoek 1995; 69: 337-55.
1.3.22. Haley L, Callaway C. Laboratory methods in medical
mycology. Atlanta: U.S. Department of Heath, Education
and Welfare. Public Health Service. CDC; 1978.
1.3.23. Bodey G. Candidiasis. Pathogenesis, diagnosis, and
treatment. 2nd ed. New York: Raven Press; 1993.
1.3.24. Laszlo A, Weyer K, Barrera L, Balandrano S, Ridderhof
J, Smithwick R, et al. Baciloscopía directa de BAAR. Un
programa de capacitación para laboratorios. Atlanta:
OMS/UICTER/CDC/OPS/INDRE/APHL; 2000.
1.3.25. Canelo C. Determinación de las variedades neoformans
y gattii en cepas de Cryptococcus de origen clínico
conservadas en el Instituto Nacional de Salud. [Tesis
para optar el titulo profesional de biólogo con mención
en microbiología y parasitología]. Lima: Universidad
Nacional Mayor de San Marcos; 1999.
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 11
11
14/9/07 14:40:23
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
1.4. DEFINICIONES
1.4.1.
Hemocultivo: cultivo microbiológico de la sangre.
1.4.2.
Levadura: hongo unicelular redondeado u ovoide que se
reproduce sexual o asexualmente.
1.4.3.
Hongo: organismo eucariote que pertenece al reino fungi.
1.4.4.
Hifas cenocíticas: hifas no septadas o no tabicadas.
1.4.5.
Hifas: elemento estructural fundamental de los hongos,
puede ser unicelular como las levaduras o pluricelular
adoptando la forma de filamento septado o aseptado. El
conjunto de hifas forma el micelio.
1.4.6.
Cápsula: envoltura hialina y gelatinosa que rodea a una
célula, formada generalmente de polisacáridos.
1.4.7.
Candidiasis diseminada: infección producida por el género Candida que se expande a diversos órganos.
1.4.8.
Blastoconidia: conidio holoblástico que se produce en
forma solitaria, sincronógena o en cadenas.
1.4.9.
Pseudomicelio: conjunto de pseudohifas.
1.4.10. Tubo germinativo: primordio hifal a partir de un conidio.
1.4.11. Clamidoconidio: conidio tálico, redondo de pared gruesa y
de gran tamaño, producido por modificación de una célula
hifal preexistente, considerada de reproducción o de resistencia. También se le denomina como clamidospora.
1.4.12. Artroconidias: conidio tálico producido por fragmentación de la hifa y que se libera por un proceso de rexólisis
o de esquizólisis.
1.4.13. Hongos filamentosos: hongos de aspecto algodonoso
que en general se desarrollan como saprofitos.
1.4.14. Macroconidia: el mayor de dos tipos de conidios producidos de la misma manera por el mismo hongo. Este
conidio presenta un tamaño mayor de cinco micras y
que generalmente tiene septos.
1.4.15. Fiálide: estructura conidiógena generalmente en forma
de botella en la cual se producen los conidios en forma
12
Manual de Procedimiento.indd 12
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:40:23
Sección 1
basípeta; el primer conidio es holoblástico y los siguientes son enteroblásticos.
1.4.16. Conidio: propágulo originado por un proceso de reproducción asexual.
1.4.17. Conidióforo: hifa especializada sobre la cual se originan
directa o indirectamente los conidios.
1.4.18. Esclerote: masa densa de hifas o pseudoparénquimas
que forma una unidad reproductora.
1.4.19. Métula: rama estéril situada debajo de las fiálides en los
géneros Aspergillus sp. y Penicillium sp.
1.4.20. Esporodoquio: estructura análoga a los apotecios, pero
productora de conidios.
1.4.21. Dematiáceo: hongo provisto de pigmento marrón oscuro o negro, perteneciente a la familia dematiaceae.
1.4.22. Anélide: célula conidiógena generalmente en forma de
botella, caracterizada por presentar una cicatriz en forma de anillo después de cada conidiación.
1.4.23. Esporangióforo: hifa especializada portadora de un esporangio.
1.4.24. Esporangio: estructura generalmente vesiculosa que
contiene a las esporangiosporas.
1.4.25. Apófisis: parte abultada de un esporangióforo inmediatamente por debajo de la columnela.
1.4.26. Estolón: hifa horizontal al sustrato, presente en los mucorales, que comunica a dos esporangióforos y de la
cual se pueden originar los rizoides.
1.4.27. Rizoide: rama corta y delgada de un talo semejante a
una raíz vegetal.
1.4.28 Rexólisis: con referencia a la secesión conidial, ruptura circuncisial de la pared celular por debajo del septo
basal del conidio. La ruptura puede resultar por tensión
mecánica, actividad litica, enzimótica o ambas.
1.4.29 Esquizolisis: proceso enzimático de separación conidial
conidio-célula conideógena o conidio-conidio, a través
de la fisión de un septo doble.
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 13
13
14/9/07 14:40:23
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
1.4.30
Holoblástico: reproducción asexual por blastoconidiosque
involucra a toda la fúngica a través de un proceso blástico.
1.4.31 Enteroblástico: conidio producido por un proceso blástico en donde sólo participa la pared del hongo.
1.4.32 Reproducción asexual: multiplicación celular por mitosis y que en los hongos da por resultado la producción
de conidios.
1.4.33 Apotecio: ascocarpo abierto plano o en forma de copa.
1.5. RESPONSABILIDADES
1.5.3.
La Jefatura del INS, aprueba el presente MANUAL DE
PROCEDIMIENTOS Y TÉCNICAS DE LABORATORIO PARA
LA IDENTIFICACIÓN DE LOS PRINCIPALES HONGOS OPORTUNISTAS CAUSANTES DE MICOSIS HUMANAS, mediante
resolución jefatural.
1.5.4.
La Oficina General de Información y Sistemas, supervisa
la elaboración, revisión y actualización del presente procedimiento.
1.5.5.
El director general del CNSP, supervisa la aplicación del
presente procedimiento en la unidad orgánica a su cargo.
1.5.6.
El director ejecutivo de la dirección ejecutiva de enfermedades transmisibles cumple y hace cumplir lo establecido en este procedimiento.
1.5.7.
El personal profesional y técnico del laboratorio de micología del CNSP, elaboran el presente procedimiento.
1.5.8.
Autorizada la publicación e impresión del presente
procedimiento, la DG – CNSP, difundirá el documento
a los integrantes del sistema nacional de la red de
laboratorios.
1.5.9.
Los responsables de los establecimientos de salud son
los encargados de disponer, supervisar y designar al
personal calificado para aplicar las disposiciones establecidas en el presente procedimiento.
1.5.10. El personal designado debe de aplicar las instrucciones
contenidas en el presente procedimiento.
14
Manual de Procedimiento.indd 14
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:40:23
Sección 2
Procedimientos
para obtención,
transporte y
conservación de
muestras
Manual de Procedimiento.indd 15
14/9/07 14:40:23
Manual de Procedimiento.indd 16
14/9/07 14:40:23
PROCEDIMIENTOS PARA
OBTENCIÓN, TRANSPORTE Y
CONSERVACIÓN DE MUESTRAS
Un adecuado proceso de obtención de especímenes clínicos permitirá el establecimiento definitivo del diagnóstico por parte del laboratorio al recuperar e identificar al agente etiológico. Todas las muestras
deben de transportarse en recipientes herméticos que impidan la contaminación del personal y medio ambiente en caso de derrame.
2.1. OBTENCIÓN, TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN DE MUESTRA DE SANGRE PARA HEMOCULTIVO
2.1.1.
Revisar el “Manual de procedimientos de laboratorio para la
obtención y envío de muestras (I)”. Serie de Normas Técnicas N.º 15. 2da ed. 1997. Capítulo II. 2.2 Procedimiento de
obtención de sangre mediante uso de jeringa, p. 17 – 9.
2.1.2.
Considerar las medidas de asepsia al obtener la muestra, para evitar contaminaciones en los hemocultivos.
2.1.3.
En el caso de adultos recoger de dos a tres muestras
de 8 a 9 mL de sangre venosa de diferentes punciones
y separadas por 30 minutos o una hora entre sí. En el
caso de niños, obtener un sólo espécimen de 1 a 5 mL,
en lactantes 1 a 2 mL y neonatos de 0,5 a 1 mL.
2.1.4.
La técnica de extracción en el sistema de lisis centrifugación es similar, pero hay que considerar las especificaciones del fabricante. Para los niños, existen comercialmente tubos pediátricos (Isolator 1,5®).
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 17
17
14/9/07 14:40:24
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
2.1.5.
Obtenida la muestra de sangre, ésta debe de ser inoculada de inmediato en el sistema de hemocultivo que el
laboratorio trabaja.
2.2. OBTENCIÓN, TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN DE MUESTRA DE ORINA PARA CULTIVO
2.2.1.
Revisar el “Manual de procedimientos bacteriológicos en
infecciones intrahospitalarias”. Serie de Normas Técnicas N.º 28. Sección 3.3. Obtención de muestra de orina
para cultivo.
2.2.2.
Se recomienda colectar en un recipiente de boca ancha,
con tapa rosca y estéril un volumen no menor a 10 mL
hasta 20 a 25 mL para un adecuado estudio micológico.
2.2.3.
El paciente debe retener la orina por lo menos tres horas. La primera parte de la micción se elimina, por contener flora de arrastre de la porción distal de la uretra,
de la misma forma desechar la parte final, por su escaso
contenido microbiano.
Se recoge la parte media de la micción matinal, la más
representativa del estado de las vías urinarias y la más
idónea para el cultivo.
Este tipo de procedimiento lo realiza el paciente, quien
previamente debe de realizar la limpieza de sus genitales con agua y jabón.
2.2.4.
En el caso de los varones deben de retraer el prepucio y
las mujeres separar los labios para evitar contaminación
exógena.
2.2.5.
En el caso de que la obtención de muestra se realice a
través de la instalación de un catéter o sonda vesical,
realizarlo previa higiene del meato uretral y genitales
externos. Este método de obtención es el adecuado
cuando se sospecha de candidiasis urinaria. Sin embargo, se debe de considerar que ello implica cierto peligro
de sobreinfección de vías altas y producción de microtraumas especialmente en el varón.
18
Manual de Procedimiento.indd 18
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:40:24
Sección 2
Se emplea la sonda vesical cuando no se obtienen resultados por los anteriores métodos o cuando se desea
corroborar un diagnóstico.
En pacientes con sonda permanente, la muestra se obtiene por punción aséptica de la sonda, nunca de la bolsa recogida.
2.2.6.
Para obtener la muestra de lactantes se debe usar una
bolsa colectora estéril la cual se coloca en los genitales
manteniéndola hasta la micción. No olvidar realizar la
higiene de la zona incluyendo la región anal.
Si no se produce la micción dentro de los 30 minutos
posteriores a la colocación de la bolsa, ésta debe de ser
sustituida. La micción puede ser facilitada con la ingesta
de líquidos. Este tipo de muestra no es adecuada para el
diagnóstico de candiduria.
2.2.7.
La obtención de muestras a través de punción o aspiración suprapúbica se indica en lactantes cuando no es posible conseguirla a través de otro método, pero está contraindicada en pacientes con problemas de hemostasia.
Después del aseo, antisepsia y anestesia local, se punciona directamente la vejiga. Cualquier hallazgo microbiológico tiene valor.
2.2.8.
Las muestras genitourinarias deben de procesarse inmediatamente después de obtenidas debido a que el rápido desarrollo de las levaduras a temperatura ambiente
puede dar una falsa concentración en la muestra. Si no
se puede proceder con el análisis, refrigerar la muestra
por un máximo de 12 horas.
2.3. OBTENCIÓN, TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN DE MUESTRA DE BIOPSIA
2.3.1.
Se realiza en el quirófano o consultorio bajo las más
rigurosas reglas de asepsia.
2.3.2.
Obtenida la muestra, ésta se divide en dos porciones
(1mm cada una), una es colocada en un recipiente estéril
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 19
19
14/9/07 14:40:24
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
con tapa de rosca conteniendo solución salina isotónica
estéril para el examen micológico y la otra en formol al
10% en solución salina buferada para histopatología.
La muestra para el estudio micológico debe de ser remitida de inmediato al laboratorio. Sin embargo, de no
ser procesada al momento, conservar a 4 ºC por dos a
cuatro horas.
2.4. OBTENCIÓN, TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN DE MUESTRAS DE ESPUTO Y SECRECIONES BRONQUIALES.
2.4.1.
Debido a que las muestras de esputo pueden contener
Mycobacterium tuberculosis, se deben adoptar precauciones al momento de su emisión para minimizar el riesgo de contagio:
-
A veces los pacientes con TBC van al laboratorio para
la toma de muestra de esputo, por ello nunca tome
la muestra dentro del laboratorio. Es más seguro tomarla fuera de este para evitar la generación de aerosoles.
-
Debe preferirse la expectoración espontánea (esputo) como muestra de estudio para el diagnóstico de
laboratorio de micosis broncopulmonares. Este es
un espécimen representativo y puede repetirse sin
inconvenientes. Sin embargo, tiene la desventaja de
arrastrar microorganismos colonizantes de boca y
faringe.
Para pacientes que no pueden expectorar fácilmente se
puede usar la nebulización con solución salina hipertónica o con ayuda de fisioterapia para inducir la salida del
esputo.
La utilidad diagnóstica del esputo se medirá de acuerdo
con su calidad valorada en función del número de leucocitos polimorfonucleares-PMN (más de 25 PMN) y células
epiteliales (menos de diez células por campo) presentes
en la muestra.
20
Manual de Procedimiento.indd 20
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:40:24
Sección 2
2.4.2.
Indicar al paciente que se realice la higiene bucal con
cepillo y pasta dental, complementariamente hacer enjuagues con agua y bicarbonato de sodio (una cucharada sopera de bicarbonato de sodio en un litro de agua
hervida que luego se entibia). Emitir la muestra en frasco estéril y de boca ancha.
Las muestras deben de transportarse al laboratorio en
un plazo no mayor a dos horas desde su obtención.
Una vez recibido el espécimen en el laboratorio se deberá procesar de inmediato o en su defecto conservar en
refrigeración a 4 ºC hasta por cuatro a seis horas.
Para tener un mejor diagnóstico se recomienda procesar
tres muestras diferentes de esputo, siendo lo ideal cinco
especímenes emitidos en días sucesivos.
2.4.3.
El lavado broncoalveolar (LBA) se obtiene por fibrobroncoscopía, reduciendo la presencia de contaminantes de
boca y vías respiratorias superiores. El LBA se considera
significativo cuando el recuento de células epiteliales
planas es inferior a 1% y se observa predominio de macrófagos alveolares o células inflamatorias.
Una vez recibido el espécimen en el laboratorio se deberá procesar de inmediato o en su defecto conservar en
refrigeración a 4 ºC por cuatro a seis horas.
2.4.4.
El aspirado bronquial se obtiene mediante un fibrobroncoscopio, se aspira secreciones del árbol bronquial, previa colocación de 5 a 10 mL de suero fisiológico.
El aspirado esta indicado cuando el volumen de líquido
recuperado en el lavado broncoalveolar es insuficiente y
existe sospecha de infección fúngica pulmonar.
Una vez recibido el espécimen en el laboratorio se deberá procesar de inmediato o en su defecto conservar en
refrigeración a 4 ºC por cuatro a seis horas.
2.4.5.
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 21
El cepillado bronquial se obtiene a través de un fibrobroncoscopio, introduciendo a través de él un cepillo
con el que se frotan las paredes, permitiendo obtener
21
14/9/07 14:40:24
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
muestras con una elevada proporción de células descamadas de las paredes del árbol bronquial.
Hay que considerar que la muestra no se encuentra protegida por lo que puede contaminarse al pasar por el
canal del broncoscopio. Se emplea para el diagnóstico
citológico. No es una muestra recomendada para el estudio de infecciones fúngicas.
2.5. OBTENCIÓN, TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN DE MUESTRA DE CATÉTER INTRAVASCULAR.
2.5.1.
Desinfectar con alcohol la zona cutánea alrededor de la
inserción del catéter.
2.5.2.
Retirar el catéter.
2.5.3.
Asépticamente, cortar 5 cm del extremo distal e introducir en un contenedor estéril con tapa rosca.
2.5.4.
Rotular y enviar al laboratorio.
2.5.5.
Procesar de inmediato, conservando a temperatura ambiente por 15 minutos. De lo contrario, conservar a 4 ºC
por un máximo de 24 horas, en este caso sumergir la
muestra en solución salina estéril.
2.6. OBTENCIÓN, TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN DE MUESTRA DE EXUDADO DE PERICATÉTER.
2.6.1.
Obtener la muestra pasando una torunda en una zona
de 2 cm alrededor de la inserción del catéter.
2.6.2.
Introducir la torunda en un medio de transporte (solución salina estéril 0,85%).
2.6.3.
Rotular y enviar al laboratorio.
2.6.4.
Procesar de inmediato, conservando a temperatura ambiente por 15 minutos. De lo contrario, conservar la
muestra a 4 ºC por un máximo de 24 horas.
22
Manual de Procedimiento.indd 22
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:40:25
Sección 2
2.7. OBTENCIÓN, TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN DE MUESTRA DE LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO.
2.7.1.
Desinfectar la zona por punzar con yodopovidona al 2%.
2.7.2.
El médico debe de realizar la punción en los espacios
intervertebrales L3 – L4, L4 – L5 ó L5 – S1.
2.7.3.
Al llegar al espacio subaracnoideo, retirar el estilete y
dejar fluir libremente la muestra.
2.7.4.
Recoger un volumen mínimo del espécimen de 5 mL en
un tubo estéril con tapa rosca.
2.7.5.
Transportar al laboratorio a temperatura ambiente. De
no procesar de inmediato conservar a temperatura ambiente por un máximo de 24 horas, debido a que las
bajas temperaturas afectan principalmente a C. neoformans.
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 23
23
14/9/07 14:40:25
Manual de Procedimiento.indd 24
14/9/07 14:40:25
Sección 3
Procedimientos
para el
diagnóstico
micológico
Manual de Procedimiento.indd 25
14/9/07 14:40:25
Manual de Procedimiento.indd 26
14/9/07 14:40:25
PROCEDIMIENTOS PARA EL
DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO
Se describen básicamente dos tipos de estudios, el examen directo y el cultivo.
Para asegurar una recuperación de hongos a partir de muestras
clínicas, éstas deben de procesarse de inmediato mediante su inoculación sobre medios de cultivo.
3.1. EXAMEN DIRECTO
Este procedimiento no sustituye al cultivo. Brinda información
preliminar o presuntiva al ser una técnica rápida que puede ser útil al
clínico y en algunos casos llegar a ser diagnóstica.
Es así, que la presencia de hifas cenocíticas en pacientes con
cetoacidosis diabética puede ser de gran valor para iniciar tratamiento
contra posible mucormicosis.
Entre los principales exámenes directos tenemos:
3.1.1.
Hidróxido de potasio (KOH)
Disuelve rápidamente las células permitiendo digerir
material proteico, observando con mayor nitidez los elementos fúngicos, su efecto de clarificar puede incrementarse al calentar a la llama ligeramente la preparación.
Adicionalmente, se puede emplear colorantes para pigmentar la pared de los hongos y mejorar la visualización.
La observación de hifas, permite sugerir la presencia de
invasión micótica.
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 27
27
14/9/07 14:40:25
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
3.1.2.
Tinta china
Es un método de contraste. Permite visualizar la cápsula
de polisacárido de Cryptococcus neoformans, mediante
la presencia de un halo claro y nítido alrededor de la
levadura.
Existen artefactos (hematíes, burbujas de aire, leucocitos, gotas de grasa y partículas de talco) que pueden
interferir y confundir al analista.
La sensibilidad de la técnica es de 50% en pacientes sin
VIH y se puede incrementar hasta 88% en pacientes VIH
con meningitis criptococósica.
3.1.3.
Coloración Giemsa
Es de utilidad para el diagnóstico de histoplasmosis,
neumocistosis y otras micosis. Permite visualizar blastoconidias intracelulares al polimorfonuclear, como la
fase tisular del H. capsulatum.
3.1.4.
Coloración Gram
Es útil para observar blastoconidias y pseudomicelios de
las especies del género Candida, Malassezia y Cryptococcus, las cuales son Gram positivas con variaciones en
la intensidad de la coloración.
3.2. CULTIVO DE MUESTRA DE SANGRE
3.2.1.
En laboratorios pequeños que tienen un bajo flujo de
este tipo de muestras y no permite tener medios especiales es aceptable inocular 0,5 mL de sangre heparinizada directamente en la superficie de un medio de
cultivo.
Como medio de cultivo se debe emplear una botella bifásica que contenga 60 mL de caldo infusión cerebro
corazón y agar cerebro corazón.
Se inocula 10 mL de sangre en el medio bifásico, recibiendo ventilación a través de una aguja con tapón de
28
Manual de Procedimiento.indd 28
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:40:25
Sección 3
algodón, colocando el medio de cultivo en forma vertical. Se incuba a 30 ºC por 30 días.
Examinar en forma diaria, hasta observar el crecimiento
de microorganismos. Después de examinar diariamente
los cultivos, se debe de mezclar la fase líquida del medio
de cultivo con el agar.
3.2.2
Otro sistema de recuperación de hongos es el sistema
de lisis centrifugación, que tiene la capacidad de lisar
leucocitos sanguíneos con ulterior liberación al medio
de microorganismos fagocitados, pero para su correcta
realización hay que considerar las especificaciones del
fabricante (anexo A).
3.2.3
Para las técnicas automatizadas seguir las recomendaciones de los fabricantes de como inocular dos frascos
en cada extracción (aeróbico y anaeróbico), pero en caso
de niños emplear un frasco pediátrico por extracción.
El volumen de sangre inoculado por frasco es esencial
para incrementar la sensibilidad de la técnica.
3.3. CULTIVO DE MUESTRA DE ORINA
3.3.1
El urocultivo convencional es el método idóneo para el
estudio de infección del tracto urinario, permitiendo diferenciar cualitativa y cuantitativamente una contaminación de una candiduria significativa.
3.3.2
Inocular 1 ó 10 μL de orina no centrifugada en una placa
Petri que contenga agar sabouraud dextrosa con antibiótico (ASD).
3.3.3
Incubar a 35 - 37 ºC por 48 – 72 horas en aerobiosis.
3.3.4
En la infección del tracto urinario, el valor del recuento
de colonias en la orina no esta bien establecido. En general, se acepta que un recuento mayor a 10 000 UFC/mL,
indicaría infección urinaria o candidiasis diseminada, un
recuento inferior no es significativo de infección.
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 29
29
14/9/07 14:40:26
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
Algunos investigadores señalan que hay que valorar
cualquier recuento de levaduras como anormal y realizar
nuevamente el cultivo antes de descartar una infección.
En general, ante un cultivo positivo, se puede considerar
las siguientes situaciones:
-
Candiduria inferior a 1000 UFC/mL: generalmente
corresponde a ausencia de infección, con excepción
si la muestra fue obtenida por punción suprapúbica.
-
Candiduria entre 1000 y 10 000 UFC/mL: de significado clínico dudoso y puede resultar de una contaminación sobre todo si existe flora mixta.
En ciertos pacientes (niños, diabéticos, cateterizados), un recuento bajo puede ser de valor, sin embargo considerar una nueva muestra.
3.3.5
-
Candiduria entre 10 000 y 50 000 UFC/mL: sugiere la existencia de infección urinaria. La presencia
de leucocitos y clínica del paciente pueden ayudar a
valorar la candiduria. Al encontrar en el cultivo flora
fúngica mixta o asociada con bacterias, sospechar de
contaminación.
-
Candiduria superior a 50 000 UFC/mL: indica infección.
Agentes etiológicos diferentes al género Candida obliga
a la realización de recuentos de colonias y puede sembrarse inclusive el sedimento urinario.
3.4. CULTIVO DE BIOPSIA
3.4.1
Transvasar la muestra a una placa Petri estéril. Realizar
lavados con solución salina estéril con antibióticos (cloramfenicol al 0,05%).
3.4.2
Seccionar y triturar la muestra en trozos de 1 a 2 mm
con ayuda de pinza y bisturí estéril para obtener un espécimen homogeneizado.
30
Manual de Procedimiento.indd 30
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:40:26
Sección 3
3.4.3
Flamear al mechero cuatro láminas portaobjetos y en la
cara flameada realizar improntas para hacer examen en
fresco y coloraciones como Gram y Giemsa.
3.4.4
Inocular la muestra, sumergiéndola ligeramente en la
superficie del medio de cultivo agar Sabouraud dextrosa
(ASD). Incubar un tubo a temperatura ambiente y otro a
37 ºC. Controlar diariamente por un lapso de ocho semanas.
3.5. CULTIVO DE CATÉTER Y EXUDADO DE PERICATÉTER
3.5.1
Los métodos más empleados son las técnicas semicuantitativa de Maki y cuantitativa de Brum - Buisson.
3.5.2
La técnica semicuantitativa de Maki, consiste en:
Rodar cuatro veces con la ayuda de una pinza estéril
5 cm del segmento distal del catéter sobre la superficie
de las placas Petri conteniendo agar sangre y ASD.
3.5.3
La técnica cuantitativa de Brum – Buisson, consiste en:
-
Introducir el extremo distal del catéter, en un medio
de cultivo líquido.
-
Agitar en un vórtex durante un minuto.
-
Sembrar 50 μL en placas de agar sangre y ASD(1).
(1)
Incubación:
• Agar sangre: a 35 - 37 ºC, 72 h
• Medio liquido: a 35 - 37 ºC, 72 h
• ASA: a 30 ºC, para detectar el crecimiento de Rhodoturula spp., por 15 días
• Agar Sabouraud Dextrosa-palmitico 3%: a 35 - 37 ºC,
para permitir el crecimiento de Malassezia spp., por
15 días
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 31
31
14/9/07 14:40:26
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
Si se sospecha la infección por hongos filamentosos,
prolongar la incubación a 30 días.
3.6
3.7
CULTIVO DE ESPUTO Y SECRECIONES BRONQUIALES
3.6.1
Colocar la muestra de esputo en tubos de ensayo con
ASD y agar infusión cerebro-corazón. Emplear como mínimo seis tubos por muestra, tres de ellos se incubarán
a temperatura ambiente y los otros tres a 37 ºC. Los medios de cultivo deben de contener cloramfenicol 0,5g/L.
Evitar el uso de cicloheximida debido a que puede inhibir
el desarrollo de mohos, principalmente Aspergillus spp.,
Penicillium marneffei, y Cryptococcus neoformans.
3.6.2
El LBA se debe de colocar en recipiente estéril y con
tapa rosca. La muestra se centrifuga (1500 g ó 3000
rpm por 30 minutos) y a partir del sedimento se realiza
el cultivo.
3.6.3
El valor diagnóstico del hallazgo de los diferentes hongos es diverso. Son importantes los aislamientos de Paracoccidioides brasiliensis e Histoplasma capsulatum;
otros como Aspergillus spp. y Fusarium spp. tienen
valor cuando se les observa en el examen directo y se
les aísla en forma reiterada a partir de especímenes seriados. Finalmente, algunos hongos como Candida spp.
son considerados como causantes de infección respiratoria si son observados por histopatología de biopsias
o piezas quirúrgicas. Cryptococcus neoformans puede
causar micosis pulmonar principalmente en pacientes
VIH.
3.6.4
Los cultivos se deben controlar hasta 45 días.
CULTIVO DE LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO
3.7.1
32
Manual de Procedimiento.indd 32
La muestra se obtiene por punción lumbar, y luego es
depositada en un tubo de vidrio o frasco estéril con tapa
rosca. El volumen requerido para un adecuado diagnóstico de hongos debe ser de 5 mL.
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:40:26
Sección 3
3.7.2
Centrifugar la muestra a 1500 g ó 3500 rpm por 15
minutos. El sobrenadante puede ser empleado para realizar pruebas serológicas de detección de antígeno de C.
neoformans.
3.7.3
El sedimento debe ser sembrado sobre ASD o agar infusión cerebro corazón o agar semilla de girasol (agar
niger seed). Emplear de cuatro a seis tubos conteniendo
el medio de cultivo por muestra. Incubar a temperatura
ambiente y 37 ºC por cuatro semanas.
La proporción de resultados positivos aumentan en forma directamente proporcional al volúmen de muestra.
3.7.4
Lectura e interpretación de los cultivos
Durante la primera semana de incubación realizar las
lecturas a diario de los medios de cultivo, luego puede realizarse dos veces por semana hasta completar el
tiempo de incubación establecida.
Una vez realizado el aislamiento primario sembrar en
medios de cultivo selectivos para su tipificación.
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 33
33
14/9/07 14:40:26
Manual de Procedimiento.indd 34
14/9/07 14:40:26
Sección 4
Identificación
de principales
levaduras
Manual de Procedimiento.indd 35
14/9/07 14:40:26
Manual de Procedimiento.indd 36
14/9/07 14:40:27
IDENTIFICACIÓN DE
PRINCIPALES LEVADURAS
La taxonomía y epítetos binomiales son decididos por consenso,
pero cuando existen desacuerdos resultan múltiples nombres para el
mismo organismo. Esto parece ser que proseguirá debido a que muchas veces el teleomorfo de una levadura no es evidente, haciendo más
apropiado el nombre por su fase anamórfica.
El laboratorio de micología identifica levaduras que tienen significancia clínica. Para lo cual se dispone de múltiples sistemas bioquímicos rápidos; y también se deben seguir realizando sencillas pruebas
que son útiles en la identificación tales como: observar la micromorfología, producción de pigmento, asimilación de carbohidratos, producción de ureasa, susceptibilidad a la cicloheximida, desarrollo de
película, desarrollo a 37 y 42 ºC.
4.1
IDENTIFICACIÓN DE Candida albicans, C. glabrata, C.
parapsilosis, C. krusei, C. tropicalis, Rhodotorula rubra, Trichosporon spp., Geotrichum spp., Cryptococcus
neoformans.
4.1.1
Objetivo
Describir los procedimientos para la identificación de las
cepas de Candida albicans, C. glabrata, C. parapsilosis,
C. krusei, C. tropicalis, Rhodotorula rubra., Trichosporon spp., Geotrichum spp. Cryptococcus neoformans.
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 37
37
14/9/07 14:40:27
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
4.1.2
Campo de aplicación
Comprende la identificación de especies de Candida albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. krusei, C. tropicalis, Rhodotorula rubra, Trichosporon spp., Geotrichum
spp., Cryptococcus neoformans.
4.1.3
Consideraciones generales
a) Determinar si el aislamiento corresponde a una cepa
de Candida albicans, C. glabrata, C. parapsilosis,
C. krusei, C. tropicalis, Rhodotorula rubra, Trichosporon spp., Geotrichum spp., Cryptococcus neoformans.
b) El medio de cultivo que se emplea para el aislamiento
primario es el ASD con antibiótico.
Las colonias de levaduras son ligeramente abombadas o planas, de consistencia mantecosa, lisa o
rugosa, con olor agradable, tornándose pastosas a
medida que envejecen.
c) Las colonias de Rhodotorula rubra se caracterizan
por presentar pigmentos carotenoides que confiere
a la colonia un color naranja o rojo anaranjado.
d) Microscópicamente las células de Rhodotorula rubra
se encuentran dotadas de una fina cápsula visible al
examen directo con tinta china.
e) Microscópicamente las células de Cryptococcus neoformans se caracterizan por presentar una cápsula
de polisacárido visible al examen directo con tinta
china.
4.1.4
Identificación de especies del género Candida. Morfología de las colonias
Se caracterizan por presentar colonias cremosas de color blanco amarillento, lustrosas, poco elevadas y de
bordes bien definidos.
38
Manual de Procedimiento.indd 38
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:40:27
Sección 4
Desarrollo de C. albicans sobre agar sabouraud
dextrosa.
Desarrollo de C. glabrata sobre agar sabouraud
dextrosa.
a) Examen microscópico
Se observan células redondas u ovaladas de tres a
siete micras de diámetro, que se reproducen por
blastoconidias y forman pseudomicelio en la mayoría
de las especies.
b) Pruebas fisiológicas para identificación
Tubo germinativo
Permite diferenciar las especies de Candida albicans
de las no albicans.
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 39
39
14/9/07 14:40:31
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
Procedimiento
Suspender un inóculo de la cepa pura de Candida con
24 horas de desarrollo en 0,5 mL de suero humano o
de conejo. Incubar a 35 – 37 ºC por 2h y 30 min.
Colocar 2 ó 3 gotas de la suspensión en una lámina
portaobjeto y cubrir con lámina cubreobjeto y observar al microscopio con objetivo de 40X Interpretación: La prueba es positiva al visualizar una estructura elongada que se origina apartir de la levadura.
Realizar esta prueba empleando cepas controles en
paralelo a la cepa en estudio.
Control positivo:
Control negativo:
Tubo germinativo positivo.
Cepa de Candida albicans.
C. albicans.
C. glabrata.
Tubo germinativo negativo.
Cepa de Candida glabrata.
Desarrollo a 42 ºC
C. albicans y C. dubliniensis tienen comportamiento
fisiológico y morfológico similar y la prueba que los
va a diferenciar en el laboratorio de microbiología es
el desarrollo a 42 ºC en agar papa dextrosa.
Procedimiento
Sembrar la cepa aislada en tubo o placa Petri que
contenga agar papa dextrosa e incubar a 42 ºC por
48 horas.
40
Manual de Procedimiento.indd 40
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:40:33
Sección 4
Interpretación:
Positivo:
Negativo:
C. albicans.
C. dubliniensis
con desarrollo óptimo
sin desarrollo
Producción de clamidosporas, blastoconidias y
artrosporas.
Procedimiento
Sembrar la colonia en con estrías en paralelo sobre
el medio de cultivo (agar harina de maíz, agar arroz,
agar clamidospora).
Para la lectura colocar una lámina cubreobjeto estéril
sobre el área sembrada e incubar a temperatura ambiente por tres a cinco días.
Colocar la placa Petri al microscopio y sin retirar la lámina cubreobjeto observar con objetivo de 10X y 40X.
Control positivo:
Control negativo:
C. albicans.
C. glabrata.
Clamidospora de Candida albicans.
4.1.5
Identificación de Rhodotorula rubra.
a) Morfología de las colonias
Se caracterizan por ser de color rojo – anaranjado o
naranja, de aspecto cremoso o rugoso, brillante y de
superficie lisa.
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 41
41
14/9/07 14:40:34
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
Desarrollo de Rhodotorula rubra sobre agar Sabouraud dextrosa
después de 72 horas de crecimiento a temperatura ambiente.
b) Examen microscópico
Se observan levaduras redondas, ovoides de 2 – 6,5
micras de diámetro, en ocasiones forman pseudomicelio rudimentario, al examen directo con tinta china
se visualiza una fina cápsula.
Fina cápsula de Rhodotorula rubra visible al examen directo
con tinta china.
42
Manual de Procedimiento.indd 42
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:40:35
Sección 4
4.1.6
Identificación de Trichosporon spp.
a) Morfología de las colonias
Son de rápido desarrollo, liso, plegado, aterciopelado, ceroso, de color blanco – amarillento – crema. La
textura plegada es más prominente en el tiempo.
Desarrollo de Trichosporon spp. sobre agar Sabouraud
dextrosa después de 72 horas de crecimiento a 37 ºC.
b) Examen microscópico
Se visualiza artroconidias y blastoconidias. Las blastoconidias son unicelulares y de forma variable y nacen en brotes en los ángulos de las artroconidias. La
principal característica es la de presentar artroconidias usualmente en forma cúbica o de barril.
Artroconidias de Trichosporon sp. (objetivo de 100X).
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 43
43
14/9/07 14:40:38
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
4.1.7
Identificación de Geotrichum spp.
a) Morfología de las colonias
Son de crecimiento rápido, en el período de una semana presentan un color blanco – grisáceo, que posteriormente cambia a un color amarillento con aspecto ceroso, polvoriento a rugoso. La temperatura
óptima de crecimiento es 25 ºC, la mayoría de las
cepas no desarrollan o lo hacen débilmente a 37 ºC.
b) Examen microscópico
Se observa artroconidias unicelulares, en cadena,
hialinas que resultan de la fragmentación de hifas no
diferenciadas por fisión a través de un doble septo,
estas estructuras tienen forma rectangular y redondeada en los extremos, semejante a un barril. Carecen de blastoconidias, conidióforos y pseudohifas.
Artroconidias de Geotrichum spp. (objetivo de 100X).
4.1.8
Identificación de Cryptococcus neoformans.
a) Morfología de las colonias
Son mucoides y brillantes. Sobre el ASD desarrollan
un color blanco amarillento, son poco elevadas y de
bordes continuos, mientras que sobre el agar niger
seed (agar semilla de girasol) desarrollan un color
marrón.
44
Manual de Procedimiento.indd 44
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:40:39
Sección 4
Desarrollo de Cryptococcus neoformans sobre agar
Sabouraud dextrosa después de 72 horas de crecimiento a 37 ºC.
b) Examen microscópico
Levaduras redondas de 7 a 15 μm de diámetro, en
algunos casos pueden producir blastoconidias. Su
principal características es la de presentar una cápsula que la circunda, visible al examen directo con la
tinta china.
Control positivo:
Control negativo:
Cryptococcus neoformans.
Candida albicans.
Cápsula de polisacárido visible al examen directo con tinta
china (objetivo de 100X).
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 45
45
14/9/07 14:40:41
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
4.1.9
Identificación mediante criterios bioquímicos y enzimáticos
4.1.9.1
Asimilación de carbohidratos
Los patrones de asimilación de azúcares (glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa, galactosa y
rafinosa) permiten identificar las diferentes
especies de Candida spp, Rhodotorula rubra,
Trichosporon spp. y Geotrichum spp.
Interpretación:
Positivo: viraje del color del medio de cultivo
hacia el amarillo.
Glu Sac Mal Raf
Lac Gal
Ure
Características bioquímicas de
Rhodotorula rubra.
Glu
Lac
Sac
Gal
Mal
Raf
Características bioquímicas de
Candida albicans.
46
Manual de Procedimiento.indd 46
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:40:42
Sección 4
Negativo: no se produce viraje de color, permaneciendo el color del medio de cultivo en
morado o púrpura.
Remitirse al “Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnóstico de micosis oportunistas y profundas”. Serie de Normas Técnicas
N.º 23. Capítulo VI. 6.1 Identificación de Candida sp. 6.1.3 Asimilación de carbohidratos.
Glu
Lac
Sac
Gal
Mal
Raf
Características bioquímicas de Candida glabrata.
Leyenda:
Glu : glucosa
Gal : galactosa
Lac : lactosa
Mal : maltosa
4.1.9.2
Sac :
Raf :
Ure :
FP :
sacarosa
rafinosa
urea
formación de película
Auxonograma del carbono en placa
Se fundamenta en el empleo de diversos nutrientes hidrocarbonados o nitrogenados sobre
un medio sintético base, para observar el crecimiento selectivo de una levadura alrededor
de los nutrientes necesarios para su desarrollo.
Los medios de cultivo se comercializan deshidratados como medio base de levaduras, siendo los más usados:
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 47
47
14/9/07 14:40:44
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
-
Medio sin carbono: sulfato amónico (5g/1),
fosfato monopotásico (1g/1), sulfato de
magnesio (0,5g/1), agar (20g/1)
-
Medio sin nitrógeno: glucosa (20g/1), fosfato monopotásico (1g/1), sulfato de magnesio (0,5g/1), agar (20g/1)
Como fuente de carbono se pueden emplear
todos los azúcares y alcoholes. Como sustrato
nitrogenado se puede usar peptona, asparagina, úrea, sulfato de amonio, nitrato de potasio
y aminoácidos diversos.
Preparación de medios y reactivos
(ver anexo c)
Procedimiento
4.1.9.3
Verter en placa Petri 25 mL del medio base
a 50 ºC.
Agregar 1 mL de la suspensión de levaduras
(cultivo de tres días) a la escala N.º 1 de Mc
Farland. Homogeneizar.
Dejar solidificar el agar, colocar los discos
impregnados con los azúcares y distribuirlos a distancias razonables.
Incubar a 37 ºC por tres días y hacer la lectura.
Los halos de crecimiento alrededor de los
discos indican la asimilación del azúcar.
Producción de ureasa
Se basa en la capacidad de producir la enzima
ureasa, la cual desdobla la urea en dióxido de
carbono y amonio, incrementando el pH del
medio y produciendo un cambio de color rojo
– púrpura en el indicador rojo de fenol.
Procedimiento
-
48
Manual de Procedimiento.indd 48
Se utiliza el medio de Christensen, en el
cual se inocula una asada de la levadura en
estudio. Los medios se incuban a 37 ºC du-
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:40:44
Sección 4
rante 6 h o a temperatura ambiente durante
tres días.
Interpretación
La prueba se considera positiva cuando se alcaliniza el medio lo que produce un cambio de
color original (amarillo) a rosa o rojo.
Una reacción positiva a la prueba ureasa es sugestiva de pertenecer al género Cryptococcus,
la cepa de C. neoformans son productoras de
ureasa.
Urea (+)
Urea (-)
Positivo: Cryptococcus neoformans.
Negativo: Candida albicans.
4.1.9.4
Formación de película
Algunas especies de Candida, Geotrichum y
Trichosporon producen una película y gas sobre la superficie del medio de cultivo (caldo
Sabouraud).
Procedimiento
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 49
-
Inocular una asada de la colonia de levadura, en un tubo de vidrio que contenga caldo
Sabouraud.
-
Incubar a temperatura ambiente (25 ºC) por
tres días.
49
14/9/07 14:40:45
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
Interpretación
-
Se considerará como prueba positiva si se
produce una película sobre la superficie del
medio de cultivo.
Caldo negativo Caldo positivo
de C. albicans de C. tropicalis
4.1.9.5
Susceptibilidad a cicloheximida
Permite distinguir aquellas levaduras que son
resistentes o sensibles a la cicloheximida o actidione.
Procedimiento
-
Se realiza subcultivando la cepa sobre agar
micosel o agar micobiótico.
-
Incubar a temperatura ambiente por tres
días.
Interpretación
-
50
Manual de Procedimiento.indd 50
Cepas que se desarrollen sobre el medio de
cultivo se considerarán como resistentes.
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:40:46
Sección 4
Cepa resistente a
la cicloheximida
C. guillermondii
4.1.9.6
Cepa sensible a la
cicloheximida
C. tropicalis
Prueba de reducción del nitrato
La capacidad que tienen algunas cepas de levaduras de producir nitritos apartir de nitratos
(presencia de enzimanitrato reductasa Sc.)
Procedimiento
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 51
-
Coger con ayuda de un hisopo de algodón,
dos a tres colonias aisladas de un cultivo de
48 -72 h de crecimiento en cualquier medio
de cultivo habitual.
-
El hisopo inoculado se presiona con firmeza
contra el fondo de un tubo vacío para que
se desprendan los microorganismos contenidos en la fibra de algodón.
-
Incubar el tubo con el hisopo a 45 ºC por
diez minutos.
-
Sacar el hisopo y agregar al tubo, dos gotas
de alfa – naftlamida (reactivo A) y dos gotas
de ácido sulfanílico (reactivo B).
-
Reintroducir el hisopo en el tubo para que
absorba los reactivos.
51
14/9/07 14:40:47
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
Interpretación:
-
El desarrollo de un color rojo brillante en el
hisopo es positivo.
-
Negativo sólo cuando el hisopo retiene el
color de la colonia.
Positivo: Cryptococcus. albidus var albidus
Negativo: C. neoformans
4.1.9.7
Prueba de la fenoloxidasa
Capacidad de C. neoformans de formar un pigmento marrón o negro, denominado melanina,
a partir de compuestos difenólicos. La producción de este pigmento mediante la prueba de
la L – dopa – citrato férrico, es realizada por la
enzima fenoloxidasa.
La reacción positiva se evidencia con la producción de un pigmento marrón oscuro o negro
alrededor de la colonia de C. neoformans.
Procedimiento
-
Inocular una a dos colonias de la levadura
en estudio, sobre la superficie de cada cuadrado de papel Whatman N.º 1.
-
Incubar en cámara húmeda a 28 ºC de 3 a
18 h.
-
Para la producción de un pigmento marrón
o negro.
Interpretación
Positivo: Cryptococcus neoformans.
Negativo: Candida albicans.
4.1.9.8
Otras técnicas de identificación
4.1.9.8.1 Identificación bioquímica enzimática
Entre estas metodologías tenemos a
los medios de cultivo que emplean
52
Manual de Procedimiento.indd 52
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:40:47
Sección 4
sustratos cromogénicos que permiten el aislamiento e identificación de
algunas especies del género Candida. Entre los medios cromogénicos
comercialmente disponibles tenemos al: CHROMagar Candida, Cromogen albicans, Candida ID, Albicans ID2, CandiSelect, Fluoroplate
Candida, Agar SDCA - MUAG.
Se describen sistemas enzimáticos
que usan un sustrato cromogénico
para detectar las enzimas MUGAL
y PRO por lo que no requieren el
uso de lámpara ultravioleta, entre
ellos tenemos a Candida albicans
Screen, Murex C. albicans CA50.
También hay sistemas enzimáticos
disponibles que permiten la identificación rápida de C. albicans a partir
de una colonia desarrollada sobre
cualquier medio de cultivo convencional, éstos sistemas detectan una
o dos enzimas β - galactosaminidasa y L – prolina aminopeptidasa,
presentes sólo en C. albicans. Para
detectar estas enzimas los sistemas
comerciales pueden utilizar sustratos fluorogénicos y cromogénicos.
Entre otras metodologías de identificación se encuentran los sistemas
enzimáticos que emplean sustratos
fluorogénicos, requiriendo para ello
el uso de una lámpara ultravioleta
de 365 nm, es el caso del BactiCard
Candida.
El medio CHROM agar Candida, es
importante para identificar las especies del género Candida en función
de los colores como:
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 53
53
14/9/07 14:40:47
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
C. albicans, C. tropicalis, C. krusei y
C. slabrota.
Procedimiento
a
-
La siembra se realiza apartir de
cepas muestras biológicas y se
incuban a temperaturas de 30 a
37 ºC durante 48 horas.
Interpretación
b
-
C. albicans, son lisas y de color
verde esmeralda.
-
C. dubliniensis, de color verde
oscuro.
-
C. tropicalis colonia de color
azul oscuro con un halo púrpuramarron en el medio de cultivo.
-
C. krusei. colonias rugosa con
el centro rosado y el borde
blanco.
-
C. glabrota, colonia de color violeta morado.
c
Desarrollo de Candida albicans (a), Candida krusei (b) y Candida tropicalis (c) sobre
CHROM agar Candida.
54
Manual de Procedimiento.indd 54
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:40:50
Sección 4
4.1.9.8.2 Identificación por asimilación de
nutrientes
Existen diferentes sistemas de identificación semiautomatizados basados en paneles o galerías que
contienen los nutrientes, como por
ejemplo: Auxacolor, Uni – Yeast
- Tek, API 20 C AUX, Galeria ID
32C, Sistema Vitek.
Entre los sistemas automáticos tenemos: Sistema Vitek 2, Biolog YT MicroPlate, Rapid Yeast Identification
Panel MicroScan.
También hay sistemas de identificación rápida de levaduras mediante
pruebas bioquímicas y enzimáticas,
como: Rapid Yeast Plus System,
Fungiscreen 4H.
Api 20 CAUX
La galeria API 20 CAUX se compone
de 20 cúpulas con sustratos deshidratados que permiten realizar 19
pruebas de asimilación. Las cúpulas
se inoculan con un medio mínimo
semisólido y las levaduras sólo se
reproducen si son capaces de utilizar el sustrato correspondiente.
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 55
55
14/9/07 14:40:52
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
La lectura de estas reacciones se
hace por comparación con un control
de crecimiento y la identificación se
obtiene, a partir de un código numérico, mediante un catálogo analítico
o un programa informático.
4.1.9.8.3 Identificación mediante aspectos
inmunológicos
Estas metodologías permiten la rápida identificación de aislamientos
de C. albicans y C. krusei, mediante
aglutinación de partículas de látex,
usando anticuerpos monoclonales específicos para ambas especies. Entre
los kits disponibles tenemos a: Bichro
– látex albicans, krusei - color.
4.2
IDENTIFICACIÓN DE Malassezia furfur.
4.2.1
Objetivo
Describir los procedimientos para la identificación de
cepas de Malassezia furfur.
4.2.2
Campo de aplicación
Comprende la identificación de cepas de Malassezia
furfur.
4.2.3
Consideraciones generales
Las levaduras de Malassezia furfur por ser lipofílicas,
se desarrollan en medios de cultivo que contengan en
su composición aceites naturales u otras sustancias grasas, siendo el método más común el cultivo en ASD que
contiene cicloheximide o actidione y aceite de oliva, sin
embargo existen medios de cultivo alternativos como el
agar de Dixón que en su formulación incluye al glicerol
mono – oleato que estimula el crecimiento in vitro de la
levadura. La identificación se basa en comparar características morfológicas y fisiológicas.
56
Manual de Procedimiento.indd 56
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:40:52
Sección 4
4.2.4
Identificación de Malassezia furfur.
a) Morfología de las colonias
Se caracterizan por ser redondas de consistencia cremosa y de color blanco amarillento.
b) Examen microscópico
Se observa células globosas, elipsoidales a cilíndricas que se reproducen por gemación.
Aplicar el procedimiento descrito en el “Manual de
procedimientos de laboratorio para el diagnóstico de
micosis oportunista y profundas”. Serie de Normas
Técnicas N.º 23. Capítulo V. 5.1 Reactivos. 5.1.1 Hidróxido de Potasio.
4.2.4.1
Prueba de la catalasa
Consiste en determinar la presencia de la enzima catalasa.
Colocar una gota de peróxido de hidrógeno (agua
oxigenada) 10 vol. en una lámina portaobjeto y
agregar una suspensión de la levadura.
Positivo: presencia de burbujas.
Negativo: ausencia de burbujas.
4.2.4.2
Asimilación del tween 20, 40, 60 y 80.
Preparar soluciones de 0,1; 0,5; 1; 5 y 10% de
tween 20, 40, 60 y 80 en agar peptona glucosa
(1 y 2%) e incubar a 32 ºC por siete días.
El inóculo se prepara a una suspensión de 107
mL-1 en agua destilada estéril.
4.2.4.3
Desarrollo a diferentes temperaturas.
Se siembra la cepa en el agar de Dixón y se incuba a 32, 37 y 40 ºC durante siete días.
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 57
57
14/9/07 14:40:52
Manual de Procedimiento.indd 58
14/9/07 14:40:52
Sección 5
Identificación
de principales
hongos
filamentosos
Manual de Procedimiento.indd 59
14/9/07 14:40:53
Manual de Procedimiento.indd 60
14/9/07 14:40:53
IDENTIFICACIÓN DE
PRINCIPALES HONGOS
FILAMENTOSOS
5.1
IDENTIFICACIÓN DE Aspergillus fumigatus, A. flavus,
A. niger, Fusarium solani, Scedosporium apiospermum,
Mucor spp. Rhizopus oryzae y Absydia corymbifera.
5.1.1
Objetivo
Describir los procedimientos para la identificación de
las cepas de Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. niger,
Fusarium spp., Scedosporium apiospermum, Mucor spp.
y Rhizopus oryzae.
5.1.2
Campo de aplicación
Comprende la identificación de cepas de Aspergillus
fumigatus, A. flavus, A. niger, Fusarium sp., Scedosporium apiospermum, Mucor sp. y Rhizopus oryzae.
5.1.3
Consideraciones generales
Determinar si el aislamiento corresponde a una cepa de Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. niger, Fusarium spp. Scedosporium apiospermum, Mucor spp. o Rhizopus oryzae.
5.1.4
Identificación de Aspergillus fumigatus, A. flavus, y
A. niger.
5.1.4.1. Morfología de las colonias de Aspergillus fumigatus.
Las colonias desarrollan con rapidez sobre ASD
Czapek a 25 ºC.
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 61
61
14/9/07 14:40:53
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
La textura de las colonias es aterciopelada,
afelpada, vellosa o algo plegada, con margen
blanquecino o beige.
El color inicialmente es blanco virando en
aproximadamente siete días a un verde azulado por la producción de conidias. El reverso de
la colonia es incoloro.
Caracteristica macroscópica de A. fumigatus.
5.1.4.2. Características microscópicas de las colonias de Aspergillus fumigatus.
Presentan conidióforo corto, liso de hasta
300 μm de longitud y de 5 a 8 μm de diámetro,
vesícula de 20 a 30 μm de diámetro con fiálides (6 a 8 μm de largo), uniseriada, ocupando
2/3 de la vesícula.
Los conidios en cadenas forman una compacta
columna sobre la vesícula, son de color verde,
finamente rugosos, globosos o subglobosos y
de 2 a 3 μm de diámetro.
62
Manual de Procedimiento.indd 62
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:40:54
Sección 5
Caracteristicas microscópicas de A. fumigatus.
5.1.4.3
Morfología de las colonias de Aspergillus
flavus.
Las colonias desarrollan rápidamente sobre
ASD o agar Czapek a 25 y 37 ºC en cinco a siete
días. El color es verde – amarillo. La textura de
las colonias es pulverulenta con surcos radiales, rugosas o granulosas, ocasionalmente algodonosas en el centro o margen de la colonia.
El reverso de la colonia es incoloro.
Caracteristicas macroscópicas de A. flavus.
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 63
63
14/9/07 14:40:56
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
5.1.4.4
Características microscópicas de las colonias de Aspergillus flavus.
Los conidióforos no ramificados de pared gruesa, hialinos, rugosos, de ≥ 1 mm de longitud
y de 10 a 20 μm de diámetro. Las vesículas
son globosas o subglobosas de 10 a 65 μm de
diámetro produciendo fiálides uniobiseriadas
alrededor de la vesícula.
Los conidios son de color verde amarillentos,
lisos o finamente rugosos, esféricos o
subesféricos con un diámetro de 3,5 a 4,5
μm de diámetro. Los esclerotes pueden estar
presentes.
Caracteristicas microscópicas de A. flavus.
5.1.4.5
Morfología de las colonias de Aspergillus niger.
Colonias de rápido desarrollo sobre ASD o agar
Czapek a 25 y 37 ºC.
El color de las colonias al principio es blanco a
amarillo, luego es negro.
La textura de las colonias es granular. El reverso de la colonia es incoloro o crema.
64
Manual de Procedimiento.indd 64
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:40:57
Sección 5
Caracteristicas macroscópicas de A. niger.
5.1.4.6
Características microscópicas de las colonias de Aspergillus niger.
Los conidióforos son de pared lisa, hialina o pigmentada y miden de 1,5 a 3 mm de largo y de
15 a 20 μm de diámetro. La vesícula es globosa
con 50 - 100 μm de diámetro y produce fiálides
alrededor de ella. Las fiálides son biseriadas, las
ramas primarias miden 30 μm de largo y pueden
estar tabicadas, mientras que las secundarias
son cortas y miden 8 μm de longitud, a partir
de las cuales brotan los conidios, los cuales son
globosos y rugosos con 4 a 5 μm de diámetro,
de color castaño o marrón a negro.
Caracteristicas microscópicas de A. niger.
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 65
65
14/9/07 14:40:59
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
5.1.5
Identificación de Fusarium solani.
5.1.5.1
Morfología de las colonias.
Las colonias tienen un rápido desarrollo a 25
y 37 ºC (siete días). El color de las colonias es
blanco, crema, pardo claro o pardo rojizo mezcladas con zonas de color púrpura; raramente
en cepas de aislamientos clínicos pueden presentar masas mucosas verdes azuladas, formadas por macroconidias que nacen de esporodoquios.
La textura es algodonosa o lanosa. La colonia
puede ser inhibida por la cicloheximida.
Características macroscópicas de F.
solani.
5.1.5.2
Características microscópicas de las colonias
Se caracteriza por presentar conidióforos de
esporodoquios cortos, ramificados. Conidióforos de hifas aéreas generalmente no ramificados, muy largos, reducidos a una simple fiálide
más o menos cilíndrica, en cuyo ápice se puede
encontrar un conidio no desprendido.
66
Manual de Procedimiento.indd 66
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:41:00
Sección 5
Macroconidias en masas mucosas, hialinos,
mayormente con tres septos, ligeramente curvados, fusiformes, pero con extremos mas o
menos redondeados 28 – 50 x 4 – 6 μm. Microconidias en masas mucosas, hialinos, lisos,
generalmente unicelulares, pueden ser ligeramente curvados, elipsoidales o subcilindricos de 7 – 16 x 2,5 – 4,5 μm. Presencia de
clamidosporas terminales e intercalares, lisas
o verrugosas, parduzcas y de hasta 10 μm de
ancho.
Caracteristicas microscópicas de F. solani.
5.1.6
Identificación de Scedosporium apiospermum.
5.1.6.1. Morfología de las colonias.
Crecimiento moderadamente rápido a 25 ºC,
y también desarrollar a 40 ºC (siete días), de
color blanco y textura algodonosa, pero a medida que se incrementa la esporulación el color
cambia a gris o gris pardusco. El reverso de las
colonias es amarillo pálido a marrón oscuro o
negro dependiendo de la edad del cultivo.
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 67
67
14/9/07 14:41:01
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
Las cepas aisladas de muestras clínicas raramente desarrollan la fase sexual. Crece sobre
medios de cultivo que contienen clorhexidina.
Caracteristicas macroscópicas
de S. apiospermum.
5.1.6.2.
Características microscópicas de las colonias.
Células conidiógenas (anélides) casi cilíndricas, se desarrollan directamente sobre hifas
indiferenciadas o a partir de conidióforos escasamente ramificados. Los conidios se acumulan en masas mucosas sobre las anélides o
A
Caracteristicas microscópicas de S. apiospermum.
68
Manual de Procedimiento.indd 68
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:41:02
Sección 5
solitarios y sésiles desarrollándose de las hifas
del micelio, lisos, de color pardo amarillento,
ovales o elipsoidales (5 – 12 x 4 – 6,5 μm) con
la base truncada.
Presenta anillos hialinos acentuados (figura A).
5.1.7
Identificación de Mucor spp.
5.1.7.1. Morfología de las colonias.
Las colonias desarrollan rápidamente a 25 ºC,
cubriendo la superficie del medio de cultivo;
crecen pobremente a 37 ºC.
El color de las colonias es blanquecino al inicio,
con el tiempo cambia a marrón. El reverso de
la colonia es blanquecino. La textura es algodonosa.
Caracteristicas macroscópicas de Mucor spp.
5.1.7.2. Características microscópicas de las colonias.
Presentan hifas aseptadas y gruesas. Se caracteriza por presentar esporangióforos, esporangios. Carecen de apófisis, estolón y rizoides.
Las columnelas son hialina, siendo visibles si
el esporangio se encuentra intacto. Los esporangios son esféricos o redondos (50 – 300 μm
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 69
69
14/9/07 14:41:02
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
diámetro) y de color gris a negro, estando llenos de esporas.
Caracteristicas microscópicas de Mucor spp.
5.1.8
Identificación de Rhizopus oryzae.
5.1.8.1
Morfología de las colonias.
Colonias de crecimiento rápido a 37 ºC a los
cuatro días llegan a ocupar totalmente la placa
Petri. Inicialmente son blancas pero luego cambian a gris parduscas. No desarrollan a 45 ºC.
5.1.8.2
Características microscópicas de las colonias.
El micelio carece de septos. Presentan estolones y rizoides. Los esporangióforos no son
ramificados, tienen una longitud de 2 mm, generalmente están en grupos, formando verticilios en cuya base se sitúan los rizoides. Las
apófisis pueden estar presentes pero son poco
evidentes. Presentan esporangios esféricos
cuyo ancho es de 50 a 300 μm, los cuales son
de color gris pardusco a negro. La columela es
subesférica abarcando entre 50 a 70% del esporangio. Las esporangiosporas son angulares
y con estrías longitudinales, grisáceas, subes-
70
Manual de Procedimiento.indd 70
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:41:03
Sección 5
féricas o elipsoidales con dimensiones de 6 a
8 x 4 a 5 μm.
5.1.9
Identificación de Absidia corymbifera.
5.1.9.1
Morfología de las colonias.
Colonias que desarrollan rápidamente a los
cuatro días, incubando a 37 ºC, abarcando la
totalidad de la placa Petri. Son colonias de textura algodonosa y de color blanco a pardo.
5.1.9.2
Características microscópicas de las colonias.
Se caracteriza por presentar hifas aseptadas.
Desarrollan rizoides y estolones. Los esporangióforos nacen a partir de los estolones y entre
los rizoides, únicos o en grupo
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 71
71
14/9/07 14:41:03
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
72
Manual de Procedimiento.indd 72
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:41:03
Anexos
Anexos
Manual de Procedimiento.indd 73
14/9/07 14:41:03
Manual de Procedimiento.indd 74
14/9/07 14:41:04
ANEXO A
TÉCNICA DE LISIS CENTRIFUGACIÓN
1)
Emplear guantes estériles en todo el procedimiento.
2)
Desinfectar el tapón de goma del tubo Isolator 10 con alcohol yodado, sin inundar la cavidad. Dejar secar.
3)
Abrir el sistema vacoutainer y colocar la aguja al portatubos.
4)
Insertar el tubo Isolator 10 en el portatubos hasta la línea marcada.
5)
Localizar el área de venopunción y limpiar con algodón impregnado con alcohol al 70%.
6)
Repetir la limpieza, pero con algodón impregnado con yodo povidona al 2%. Dejar actuar por un minuto.
7)
No volver a palpar la vena.
8)
Realizar la venopunción.
9)
Empujar el tubo hasta el fondo del portatubos o hasta que la sangre fluya al interior del tubo.
10) Cuando se llene el tubo (10 mL) retirarlo del portatubo.
11) Invertir el tubo cuidadosamente por 4 ó 5 veces, facilitando la lisis
celular y evitar la coagulación de la sangre.
12) Retirar la aguja del portatubo y desechar apropiadamente.
13) Transportar al laboratorio en forma segura.
14) Procesar de inmediato, de lo contrario colocar el tubo a temperatura ambiente.
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 75
75
14/9/07 14:41:04
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
15) Centrifugar empleando rotores de 35º de inclinación a 3000 g por
30 minutos.
16) Retirar cuidadosamente los tubos de la centrífuga y colocarlos en
un gradilla, evitando la mezcla del sobrenadante y sedimento.
17) Desinfectar el tapón de goma con alcohol yodado, sin inundar la
cavidad. Dejar secar.
18) Colocar la gradilla en la prensa Isostat y cubrir cada tapón con una
cápsula estéril Isostat.
19) Colocar cada tubo con su cápsula, debajo de la prensa y empujar
rápidamente el asa de la prensa hacia abajo.
20) Colocar el asa en posición original y realizar la maniobra con cada
tubo.
21) Retirar la gradilla de la prensa.
22) A partir de aquí, se empleará una cabina de seguridad biológica.
23) Introducir la punta de una pipeta en el tubo a través de la membrana de la cápsula, manteniendo el tubo comprimido.
24) Introducir la pipeta hasta que el bulbo haga contacto con la cápsula.
25) Absorber cuidadosamente el sobrenadante.
26) Distribuir equitativamente el sedimento en placas Petri conteniendo agar Sabouraud dextrosa y con la punta de la pipeta sembrar en
zigzag.
27) Desechar la pipeta.
28) Colocar las placas sembradas hacia arriba a 35 ºC y a las 24 horas
se invierte su posición.
29) Examinar diariamente por siete días.
76
Manual de Procedimiento.indd 76
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:41:04
ANEXO B
PREPARACIÓN DE REACTIVOS
B.1
Hidróxido de potasio
•
Pesar:
-
B.2
Hidróxido de potasio
Agua destilada
10 g
100 mL
•
Mezclar para disolver totalmente el KOH.
•
Guardar a temperatura ambiente en frasco de color ámbar.
•
Se puede agregar glicerina al 10% para tener preparaciones
de mayor duración reduciendo la evaporación.
•
También se puede agregar dimetilsulfóxido (DMSO) al 40%
para reducir o eliminar la necesidad de calentar el preparado.
Tinta china
En una lámina portaobjeto colocar:
-
Tinta china
1 gota
Agua destilada o solución fisiológica 1 - 2 gotas
Emulsificar la muestra.
Colocar laminilla cubreobjeto.
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 77
77
14/9/07 14:41:04
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
B.3
Azul de lactofenol
Es empleado para examinar muestras obtenidas a partir de los
cultivos. El fenol mata al hongo, el ácido láctico es un agente
aclarante que preserva la estructura del hongo, la glicerina previene la desecación y el azul de algodón colorea la quitina y celulosa del hongo.
•
Solución A:
•
•
•
•
•
Fenol (cristales)
Acido láctico
Glicerina
Mezclar.
20 g
20 g
40 mL
Solución B:
• Azul de algodón
• Agua destilada
0,05 g
20 mL
Mezclar las soluciones A y B. Conservar a temperatura ambiente
hasta por seis meses.
B.4
Coloración giemsa
SOLUCIÓN CONCENTRADA DEL COLORANTE
•
Pesar:
• Giemsa en polvo
• Metanol
• Glicerina neutra
0,6 g
50,0 mL
50,0 mL
•
Pulverizar cristales del colorante antes de pesar.
•
Macerar el polvo en un mortero con 30 mL de glicerina.
•
Transferir la mezcla a un frasco limpio y completar el volumen de glicerina.
•
Colocar al baño María a 55 ºC por dos horas.
•
Utilizar 20 mL de alcohol para remover el colorante adherido
al mortero.
•
Retirar el frasco del baño María, dejar enfriar y adicionar el alcohol que fue usado para lavar el mortero y el resto del alcohol.
78
Manual de Procedimiento.indd 78
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:41:04
Anexos
•
Dejar madurar el colorante durante dos semanas y luego filtrar.
•
Guardar el filtrado en frasco ámbar.
SOLUCIÓN TAMPÓN pH 7,2
Na2HPO4
KH2PO4
Agua destilada
6,77 g
2,59 g
1L
SOLUCIÓN DE TRABAJO
Solución concentrada del colorante
Solución tampón
Mezclar la solución antes de usarla
B.5
2 mL
6 mL
Coloración gram
SOLUCIÓN DE CRISTAL VIOLETA
•
SOLUCIÓN A
Cristal violeta
Etanol
4,0 g
20,0 mL
Disolver el colorante en etanol y diluir la solución al 1:10 en
agua destilada.
•
SOLUCIÓN B
Oxalato de amonio
Agua destilada
0,8 g
80,0 mL
Disolver el oxalato en el agua destilada. Mezclar una parte de
la solución A con cuatro partes de la solución B.
•
SOLUCIÓN DE YODO (LUGOL)
Yodo
Yoduro de potasio
1g
2g
Disolver el yodo y el yoduro en 5 mL de agua destilada y
completar a un volumen de 240 mL con agua destilada.
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 79
79
14/9/07 14:41:05
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
•
CONTRACOLORANTE (COLORANTE DE FONDO)
Safranina O al 2,5% en alcohol al 95% 10 mL
Agua destilada 100 mL
B.6
•
Fijar el frotis con calor o metanol.
•
Agregar el cristal violeta. Dejar un minuto.
•
Lavar con agua.
•
Aplicar lugol. Dejar un minuto.
•
Lavar con agua.
•
Decolorar con etanol al 95% por 30 segundos.
•
Agregar Safranina O. Dejar por 10 segundos.
•
Lavar con agua y dejar secar.
•
Examinar al microscopio empleando los objetivos de 40X y
100X.
Reducción del nitrato
•
MEDIO 5X.
KNO3
NaH2PO4H2O
Na2HPO4
Solución de cloruro de benzalconio al 17%
Agua destilada
5g
11,7 g
1,14 g
1,2 mL
200 mL
Preparación
•
Rehidratar con agua destilada los componentes.
•
Calentar suavemente hasta disolver.
•
Distribuir en un frasco.
•
Autoclavar a 121 ºC por 15 minutos.
•
Dejar enfriar antes de su empleo y refrigerar (4 ºC a 10 ºC)
para su conservación.
Reactivos
•
Reactivo B
Acido sulfanílico
Acido acético 5M*
80
Manual de Procedimiento.indd 80
0,16 g
20 mL
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:41:05
Anexos
•
Reactivo A.
α - naftilamina
Acido acético 5M*
0,1 g
20 mL
*: El ácido acético 5M es preparado adicionando una parte
de ácido acético glacial a 25 partes de agua destilada.
B.7
Solución de L – dopa – citrato férrico.
•
Buffer fosfato
A. Fosfato de sodio dibásico.
Na2HPO4 (0,067 M)
Agua destilada
0,951 g
100 mL
B. Fosfato de potasio monobásico
KH2PO4 (0,067 M)
Agua destilada
0,912 g
100 mL
Se mezclan volúmenes iguales de A y B (pH final 6,8)
•
Solución de L – dopa (L – B – 3,4 - dihidroxifenilalanina)
Suspender la L – dopa en una a tres gotas de dimetilsulfóxido
Agregar agua destilada hasta alcanzar una concentración final de 3 mg/mL
•
Solución de citrato férrico.
Disolver el citrato férrico en agua destilada hasta alcanzar
una concentración de 1 mg/mL. Calentar suavemente hasta
disolver.
•
Solución de L – dopa - citrato férrico.
Solución de L – dopa
Solución de citrato férrico
Buffer fosfato
1 mL
0,5 mL
3,5 mL
Esta solución debe tener un color azul claro.
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 81
81
14/9/07 14:41:05
Manual de Procedimiento.indd 82
14/9/07 14:41:05
ANEXO C
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
C.1
AUXONOGRAMA DEL CARBONO EN PLACA (ASIMILACIÓN DE CARBOHIDRATOS)
Medio base: se usa como soporte de los discos de azúcares y
para observar el crecimiento de las levaduras para su posterior
identificación.
•
Pesar:
• Extracto de levadura
• Agar noble
• Agua destilada
0,67 g
20
g
1000 mL
•
Disolver los ingredientes en agua destilada.
•
Poner en ebullición por un minuto.
•
Autoclavar a 121 ºC por 15 minutos.
•
Conservar en refrigeración a 4 ºC.
Discos de azúcares para el auxonograma del carbono
•
Discos de papel filtro estéril de 5 mm de diámetro.
•
Carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa, galactosa y rafinosa); 20 g de cada uno.
•
Agua destilada 100 mL por carbohidratos.
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 83
83
14/9/07 14:41:05
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
Procedimiento
C.2
•
Disolver cada tipo de azúcar en 100 mL de agua.
•
Esterilizar por filtración.
•
Sumergir en las distintas soluciones de azúcares durante 24
horas.
•
Colocar los discos de papel en una placa Petri y colocar en
estufa a 37 ºC por 24 horas.
•
Guardar los discos en un frasco estéril de boca ancha.
AGAR ACEITE DE OLIVA
•
Pesar:
•
•
•
•
•
•
C.3
Agar Sabouraud dextrosa
Tween 80
Aceite de oliva
Vitamina A
Cloramfenicol
Agua destilada
6,5
2
2
10
0,5
100
g
mL
mL
gotas
g
mL
•
Disolver el agar Sabouraud dextrosa en agua destilada.
•
Agregar los demás ingredientes.
•
Esterilizar a 121 ºC por 15 minutos.
•
Almacenar a 4 ºC.
AGAR DE DIXON MODIFICADO
•
Pesar:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Extracto de Malta
Peptona
Agar
Buey de bilis disecada
Tween 40
Monooleato de glicerol
Acido oleico
Agua destilada
36
g
6
g
12
g
20
g
10
mL
2
mL
2
mL
1000 mL
Disolver los ingredientes por 15 minutos en un poco de
agua.
84
Manual de Procedimiento.indd 84
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:41:06
Anexos
C.5
C.6
•
Agregar el volumen restante y ebullir.
•
Autoclavar a 121 ºC por 15 minutos.
•
Repartir en tubos de vidrio estériles en posición de plano
inclinado.
CALDO SABOURAUD
•
Seguir las indicaciones proporcionadas por el fabricante.
•
Autoclavar a 121 ºC por 15 minutos.
•
Dispensar alicuota de 7,5 mL en tubo de vidrio estéril con
tapa rosca.
•
Almacenar a 4 ºC.
AGAR ARROZ
•
Pesar:
• Arroz
• Agar
• Agua destilada
C.7
200 g
15
g
1000 mL
•
Hervir el arroz durante 30 minutos.
•
Filtrar con gasa.
•
Completar al volumen final.
•
Agregar el agar.
•
Autoclavar a 121 ºC por 15 minutos.
•
Repartir en placa Petri estéril.
•
Conservar en refrigeración a 4 ºC.
AGAR HARINA DE MAÍZ
Se utiliza para la producción de seudohifas de levaduras del género
Candida y producción de clamidoconidios de C. albicans.
•
Composición:
• Harina de maíz
• Agua destilada
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 85
62,5 g
1500 mL
85
14/9/07 14:41:06
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
• Tween 80
• Agar
•
15
19
g
ml
Procedimiento:
• Disolver la harina de maíz en el agua destilada.
• Dejar reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
• Filtrar a través de papel filtro y reconstituir el anterior volumen.
• Añadir el agar.
• Añadir el tween 80,
• Esterilizar a 120 ºC durante 20 minutos.
C.7
AGAR PAPA DEXTROSA
Permite la observación de las levaduras a diferentes temperaturas.
•
Pesar:
•
•
•
•
•
C.8
Papa
Dextrosa
Agar
Agua destilada
200 g
10
g
20 g
1000 mL
Pelar y cortar la papa en trozos pequeños. Disolver la dextrosa en agua y agregar los demás ingredientes. Hervir 30
minutos y filtrar con gasa. Completar el volumen. Esterilizar
a 121 ºC por 15 minutos. Repartir.
AGAR MICOSEL O MICOBIÓTICO
Permite distinguir la susceptibilidad a la cicloheximida o actidione.
•
Seguir las indicaciones proporcionadas por el fabricante.
•
Autoclavar a 121 ºC por 15 minutos.
•
Dispensar en tubo de vidrio estéril y colocar en forma de
plano inclinado.
•
Almacenar a 4 ºC.
86
Manual de Procedimiento.indd 86
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:41:06
Anexos
C.9
AGAR CZAPEK – DOX
Se emplea para la identificación de Aspergillus spp y Penicillium
spp.
•
Pesar:
•
•
•
•
•
•
•
•
Sacarosa
Nitrato de sodio
Fosfato dipotásico
Sulfato de magnesio
Cloruro de potasio
Sulfato ferroso
Agar
Agua destilada
30
2
1
0.5
0.5
10
15
1000
•
Disolver por calor todos los ingredientes.
•
Colocar en ebullición por diez minutos.
•
Esterilizar a 121 ºC por 15 minutos.
•
Envasar.
g
g
g
g
g
mg
g
mL
C.10 AGAR SEMILLA DE GIRASOL (AGAR DE STAIB O AGAR
NIGER SEED)
El medio de cultivo contiene ácido cafeico contenido en el extracto
de la semilla de girasol (Guizzotia abbisinica) que permite detectar la enzima fenol oxidasa desarrollada por Cryptococcus neoformans. La reacción enzimática produce melanina, la cual es absorbida por la pared celular del hongo produciendo un color marrón.
•
Pesar:
•
•
•
•
•
Glucosa
Creatina
Agar
Cloramfenicol
Extracto de semilla de girasol
1,0
0,78
18,0
0,05
350
g
g
g
g
mL
•
Calentar hasta disolver. Distribuir 50 – 100 mL por frasco.
Autoclavar a 121 ºC por 15 minutos.
•
La preparación del extracto consiste en:
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 87
87
14/9/07 14:41:06
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
•
Pulverizar las semillas de girasol.
•
Pesar 70 g del pulverizado y suspenderlo en 350 mL de agua
destilada. Hervir. Filtrar con gasa. Autoclavar 15 minutos a
121 ºC. Mantener en refrigeración con cierre hermético.
•
En el momento de usar, fundir el medio y plaquear. Emplear
un control positivo de Cryptococcus neoformans, el cual desarrollará una pigmentación marrón y un control negativo de
Candida spp. que desarrollará de color blanco.
C.11 AGAR SABOURAUD DEXTROSA
Se le emplea para el aislamiento primario, identificación y mantenimiento de la mayoría de los hongos patógenos. Para mejorar la
inhibición bacteriana se puede adicionar cloramfenicol 0,5 g/L.
•
Pesar:
•
•
•
•
Peptona
Glucosa
Agar
Agua destilada
10 g
20 g
20 g
1000 mL
•
Disolver los ingredientes en el agua destilada.
•
Controlar el pH a 5,6.
•
Esterilizar a 121 ºC por 15 minutos.
•
Verter en tubos o placas.
C.12 MEDIO BASE PARA AZÚCARES
Se emplea para proporcionar los requerimientos nutricionales
para el desarrollo de levaduras.
MEDIO BASE
•
Pesar:
•
•
•
•
•
88
Manual de Procedimiento.indd 88
Peptona
Extracto de carne
Cloruro de sodio
Agar
Agua destilada
5g
1g
5g
15 g
990 mL
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:41:07
Anexos
• Púrpura de bromocresol
•
Disolver y autoclavar.
•
El pH final es de 5,6.
10 mL
INDICADOR
•
Pesar:
• Púrpura de bromocresol
• Hidróxido de sodio 0,01 N
•
0,1 g
18,5 mL
Diluir a 250 mL con agua destilada obteniendo una concentración al 0,04%.
AZÚCARES
•
Pesar 10 g de cada uno de los siguientes azúcares: glucosa,
lactosa, sacarosa, galactosa, maltosa y rafinosa.
•
Disolver en agua destilada estéril y esterilizar por filtración
(diámetro del filtro 0,2 um)
•
Concentración final de cada azúcar: 10%.
Mezclar cada azúcar con el medio base que se encuentra a 45–
50 ºC. Repartir en tubos de vidrio con tapa rosca. Controlar a
37 ºC por 24 horas.
C.13 AGAR INFUSIÓN CEREBRO CORAZÓN
Este medio de cultivo favorece la conversión de algunos hongos
dimórficos. Para la preparación seguir las recomendaciones proporcionadas por el fabricante.
C.14 AGAR UREA
Permite evidenciar la producción de ureasa por Cryptococcus
neoformans, algunas especies de Candida sp. Rodotorula spp. y
Trichosporon spp.
•
Pesar:
• Dextrosa
• Peptona
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 89
1g
1g
89
14/9/07 14:41:07
•
•
•
•
•
•
Cloruro de sodio
Monofosfato de potasio
Urea
Agar
Rojo fenol
Agua destilada
5
g
2
g
20
g
15
g
12
mg
1000 mL
•
Disolver la urea en 100 mL de agua destilada y esterilizar por
filtración.
•
Disolver los ingredientes restantes en 900 mL de agua destilada.
•
Esterilizar a 121 ºC por 15 minutos.
•
Enfriar hasta unos 45– 50 ºC.
•
Agregar la solución de urea en un área estéril.
Manual de Procedimiento.indd 90
14/9/07 14:41:07
ANEXO D
CLAVE N.º 1
CLAVE PARA IDENTIFICAR Trichosporon spp.
1 a.
Crecimiento con melibiosa
2.
1 b.
No crecen con melibiosa
3
2 a.
Tolerante a cycloheximida.................................... T. mucoides.
2 b.
No toleran la cycloheximida................................. T. cutaneum.
3 a.
Crecen con myo-inositol, no crecen con L-arabinosa..... T. inkin.
3 b.
Crecen con myo-inositol, crecen con L-arabinosa
4 a.
Colonias con escaso desarrollo, talo consistente de
4.
clampas de células merstemáticas...............................................
................................... Fisussuricella filamenta, T. asteroides.
4 b.
Colonias y microscopía
5 a.
Apresorio presente en microcultivo........................... T. ovoide.
5.
5 b.
Apresorio ausente en microcultivo
6 a.
Artroconidia en forma de barril; talos no meristemáticos............
6.
................................................................................... T. asahii.
6 b.
Artroconidias elongadas, o talos mersitemáticos........................
........................................................................... T. asteroides.
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 91
91
14/9/07 14:41:07
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
CLAVE N.º 2
CLAVE MORFOLÓGICA PARA IDENTIFICAR Geotrichum spp.
1 a.
Colonias que crecen rápidamente; hifas marginales
de 12 um de ancho, a menudo con ramificación
dicotómica........................................................... G. candidum.
1 b.
Colonias de moderado crecimiento; hifas marginales de 4 um de
ancho; sin ramificación dicotómica
2.
2 a.
Conidias simpodiales que se producen abundantemente desde
cicatrices ............................................................. G. capitaum.
2 b.
Conidias sympodiales ausentes............................. G. clavatum.
CLAVE N.º 3
CLAVE FISIOLÓGICA PARA IDENTIFICAR Geotrichum spp.
1 a.
Asimilan D – Xylosa...............................................G. candidum.
1 b.
No asimilan D - Xylosa
2 a.
Asimilan celobiosa, salicina y arbutina...................G. clavatum.
2 b.
No asimilan celobiosa, salicina y arbutina.............G. capitatum.
92
Manual de Procedimiento.indd 92
2.
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:41:07
ANEXO E
FLUJOGRAMA DE IDENTIFICACIÓN N.º 1.
Trichosporon y Geotrichum
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 93
93
14/9/07 14:41:07
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
MUESTRA CLÍNICA
AISLAMIENTO PRIMARIO
ASG-CAF
PRUEBA DEL TUBO
GERMINATIVO NEGATIVO
PRESENCIA DE HIFAS
AUSENCIA DE HIFAS
Conidióforos ausentes
Sólo blastoconidios
Artroconidios, hialinos,
presentes
•
•
•
Especies de Candida
Cryptococcus
Saccharomyces
Geotrichum spp.
Trichosporum spp.
Asimilación carbohidratos
fermentación
94
Manual de Procedimiento.indd 94
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:41:08
ANEXO F
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 95
95
14/9/07 14:41:08
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
TABLA N.º 1
CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS Y FISIOLÓGICAS DE
PRINCIPALES LEVADURAS DE IMPORTANCIA EN SALUD PÚBLICA
ESPECIES
TG CHL
TINTA
PH FP ART LEV 37ºC 42ºC
CHINA
SUSCEPTIBILIDAD
A LA
CICLOHEXIMIDA
Candida
albicans
+
+
-
+
-
-
+
+
+
Variable
Candida
dubliniensis
+
+
-
+
-
-
+
+
-*
Variable
C. tropicalis
-
-
-
+
+
-
+
+
C. glabrata
-
-
-
-
-
-
+
+
-
Sensible
C guillermondii
-
-
-
-
-
-
+
+
-
Resistente
C. kefyr
Sensible
-
-
-
-
-
-
+
+
-
Resistente
C. parapsilosis -
-
-
+
-
-
+
+
-
Sensible
C. krusei
-
-
-
+
+
-
+
+
-
Sensible
Geotrichum
capitatum
-
-
-
+
+
+
+
-*
-
Sensible
Rhodotorula
rubra
-
-
+
-
-
-
+
+
-
Variable
Cryptococcus
neoformans
-
-
+
-
-
-
+
+
Trichosporon
mucoides
-
-
-
+
+
+
+
+
Sensible
-
Resistente
(*) Reacciones variables
TG
CHL
FP
ART
:
:
:
:
Tubo Germinativo
Clamidosporas
Formación de película
Artroconidia
96
Manual de Procedimiento.indd 96
LEV
PH
42 ºC
37 ºC
:
:
:
:
Levaduras
Seudohifas/Hifas
Desarrollo a 42 ºC
Desarrollo a 37 ºC
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:41:08
Anexos
TABLA N.º 2
CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS DE PRINCIPALES LEVADURAS DE
IMPORTANCIA EN SALUD PÚBLICA
ESPECIES
GLU LAC SAC MAL GAL RAF URE
Candida
albicans
+
Candida
dubliniensis
+
C. tropicalis
+
C. glabrata
+
C guillermondii
C. kefyr
-
REDUCCIÓN
DE
FENOLOXIDASA
NITRATO
+
+
+
-
-
-
+
+
+
-
-
-
-
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
-
+
+
-
-
C. parapsilosis
+
-
+
+
+
-
-
-
C. krusei
+
-
-
-
-
-
-*
-
Geotrichum
capitatum
+
-
-
-
-
-
Cryptococcus
neoformans
+
-
+
+
+
+*
+
+
Rhodotorula
rubra
+
-
+
+
+/-
+
+
-
Trichosporon
mucoides
+
+
+
+
+
+
+*
-
GLU
GAL
LAC
URE
:
:
:
:
-
Asimilación de glucosa
Asimilación de galactosa
Asimilación de lactosa
Degradación de urea
-
MAL :
RAF :
SAC :
-
+
Asimilación de maltosa
Asimilación de rafinosa
Asimilación de sacarosa
(*) Reacciones variables.
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 97
97
14/9/07 14:41:09
98
Manual de Procedimiento.indd 98
+/-
M. pachydermatis
+
+
+
32 ºC
+
+
37 ºC
DIXON **
+
+
40 ºC
(*): Desarrollo sobre agar Sabouraud dextrosa sin suplemento lipídico.
(**): Desarrollo sobre agar de Dixón a 32, 37 y 40 ºC.
+
CATALASA
M. furfur
ESPECIES
ASG*
32 ºC
+
+
+
+
-
+
TWEEN TWEEN 40 TWEEN 20
80 0.1%
0.5%
10%
CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS DE Malassezia furfur y
M. pachydermatis CAUSANTES DE INFECCIÓN SISTÉMICA
TABLA N.º 3
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:41:09
Anexos
TABLA N.º 4
CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN
DE ESPECIES DE Trichosporon spp.
asahii
L- Arabinosa
Sorbitol
Melibiosa
Myo-inositol
37 °C
0,1 % Cycloheximida
Apresoria
cutaneum
+
+
+
-
+
+
+
+
-
inkin
mucoides
+
+
v
+
ovoides
+
+
+
+
+
+
-
v
v
+
+
TABLA N.º 5
CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS DE ESPECIES
DE Geotrichum spp.
candidum
capitatum
clavatum
Cellobiosa
-
-
+
D-Xylosa
+
-
-
Salicina
-
-
+
Vitamina libre
+
-
-
Arbutina
-
-
+
Crecimiento a 37 °C
v
+
+
INS-CNSP-44
Manual de Procedimiento.indd 99
99
14/9/07 14:41:10
100
Manual de Procedimiento.indd 100
Negro
A. niger
A. glaucus
Verde
amarillo
Rugosa
Verde
amarillo
A. flavus
Rugosa
Granular
Pulverulenta
Verde azul
oscuro
A. fumigatus
TEXTURA
COLOR
ESPECIE
COLONIA
Hemisférica
y muy
voluminosa.
(50 - 75 μm)
Lisos y largos
(6 mm)
1
2
Esféricas y
voluminosas.
(35 - 45 μm)
Rugosos
(2 mm)
Redonda y
columnar
1-2
Abultada.
(20 - 30 μm)
Lisos
(300 μm)
Liso
1
VESICULA
CONIDIÓFOROS
NUMERO
DE FILAS
DE FIALIDES
CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE LAS PRINCIPALES ESPECIES
DE Aspergillus spp.
TABLA N.º 6
Cleistotecio
OTRAS
ESTRUCTURAS
Procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas
Instituto Nacional de Salud
14/9/07 14:41:10
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Y TÉCNICAS
DE LABORATORIO PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE LOS PRINCIPALES
HONGOS OPORTUNISTAS CAUSANTES
DE MICOSIS HUMANAS se terminó
de imprimir en los talleres gráficos
de Fimart S.A.C. - Telf.: 424-0662
Av. Del Río 111 - Pueblo Libre
Lima - Perú
Manual de Procedimiento.indd 101
14/9/07 14:41:10
SERIE DE NORMAS TÉCNICAS N.º 44
CARATULA PROCEDIMIENTO.indd 1
IDENTIFICACIÓN DE LOS PRINCIPALES HONGOS OPORTUNISTAS CAUSANTES DE MICOSIS HUMANAS
Instituto Nacional de Salud
Jirón Cápac Yupanqui 1400, Lima 11, Perú
Apartado Postal 471, teléfono: (0511) 471-9920 Fax: (0511) 471-0779
Correo electrónico: [email protected]
Página web: www.ins.gob.pe
MINISTERIO DE SALUD
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Y
TÉCNICAS DE LABORATORIO PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE LOS PRINCIPALES
HONGOS OPORTUNISTAS CAUSANTES
DE MICOSIS HUMANAS
SERIE DE NORMAS TÉCNICAS N.º 44
Lima, 2007
14/9/07 14:44:11