Ingeniería en Biotecnología Biometría Proyecto Final Tema: Evaluación in vitro de la especie Pseudomona putida como alternativa de control frente a Moniliophtora roreri, causante de moniliasis en el cacao (Theobroma cacao L) Integrantes: - Cando Karen - Córdova Mauricio - Sevilla Fredy - Ulloa Esteban Grupo 3, Nivel 7 Fecha de Entrega: 12-07-2021 1. PROBLEMÁTICA El cacao es un cultivo de gran relevancia económica, social y ambiental, constituyéndose en una especie primordial del sistema agroforestal campesino de muchas regiones. Sin embargo, existen varios factores que afectan la calidad y producción de los granos de cacao, siendo las enfermedades la principal limitante. Entre estas se destaca la moniliasis, causada por el hongo Moniliophthora roreri, como la enfermedad más severa para los países hispanohablantes de Latino América (Suárez & Hernández, 2010). De ecuador se ha informado perdidas que van desde el 16 hasta el 80% y aun mas con promedios que fluctúan de 20 al 30%. de la producción, lo cual depende de la severidad del ataque del patógeno, las condiciones medio ambientales y las condiciones de manejo del cultivo (Ayala & Navia, 2010). Los efectos de la enfermedad a menudo están asociados con pérdida de la fuente de ingresos para el productor y el abandono de la plantación, con la consecuente conversión de la zona en áreas menos sustentables desde el punto de vista ambiental, pérdida de hábitat para la vida silvestre, fragmentación de áreas arboladas y erosión de los suelos (Sánchez, Jaramillo, & Ramírez, 2015). Problema central de investigación: La moniliasis causada por el hongo Moniliophtora roreri causante de moniliasis, responsable de la perdida de alrededor del 50% al 80% del cultivo. Causas Consecuencias Protocolos de prevención contra las Pérdida económica en el productor a causa moniliasis ineficientes que permiten la de cacaos contaminados con moniliasis. propagaciónde esporas de Moniliophtora roreri. Técnicas de control mal aplicadas no Diseminación de esporas permiten aislar los primeros inóculos de de Moniliophtora roreri, a Moniliophtora roreri y por ende contaminadas por malas prácticas de control diseminación del patógeno. y prevención. plantas no Falta de capacitación a los agricultores para Baja producción de cacao de calidad por la efectuar un manejo óptimo en estadios contaminación de moniliasis. iniciales de infección de moniliasis. Tabla 1. Causas y consecuencias en base al problema central de investigación. 3. ANTECEDENTES Debido a la preocupación de la inocuidad alimentaria y la necesidad de preservar el medio ambiente, una de las herramientas del manejo integrado de enfermedades que ha adquirido particular relevancia es el control biológico. La búsqueda de agentes de biocontrol se basa en el hecho que muchos productos agrícolas no son destruidos completamente por enfermedades debido a la presencia natural de organismos capaces de reducir el efecto nocivo de la enfermedad (Acebo & Rodríguez, 2016). La producción y procesamiento del cacao en el Ecuador involucra aproximadamente a 100.000 familias, entre pequeños y medianos productores. La superficie cultivada de cacao en el país es de 500.000 hectáreas, repartidas en 16 provincias, pertenecientes a la región Amazónica, del Litoral y las estribaciones de la cordillera de los Andes. De la superficie Nacional el 8.86% corresponde a la región Norte Amazónica con 44.300 hectáreas, de las cuales el 83% es cacao nacional y el 17% son otros tipos de cacao (Pico, Calderón, Fernández, & Díaz, 2012). En la región amazónica de Ecuador las provincias de Sucumbíos, Orellana, y Napo, reportan una pérdida de más del 40% de la producción de cacao, es decir 8.000 toneladas de cacao, lo que representa 20 millones de dólares por año (Paredes, 2016) En Costa Rica, Ecuador y Perú se ha intensificado la investigación que va desde la evaluación de bacterias del género Bacillus, Pseudomonas y Leuconostoc formuladas en suspensión líquidas y sólidas para el control de Moniliophthora roreri (Estrella & Cedeño, 2012) El control biológico, comprende la selección, uso y aplicación de organismos, sus metabolitos o subproductos con el objeto de reducir poblaciones de patógenos (o plagas), por debajo del nivel de daño que sería económicamente aceptable o eliminar los efectos dañinos en las plantas o sus productos causados por organismos fitopatógenos (Acebo & Rodríguez, 2016). Pruebas in vitro demostraron que aislamientos de Bacillus subtilis, Pseudomonas cepacia y Pseudomonas putida inhibían la germinación de esporas y el crecimiento del micelio de Moniliophtora roreri. Un eficiente control de la moniliasis y buena producción de cacao se logra mediante el uso de biopesticidas. 4. JUSTIFICACIÓN La importancia de la producción de cacao en Ecuador se evidencia además en que es el cultivo permanente con mayor superficie destinada para su producción, cubriendo un poco más de 31% de la superficie del país dedicada a cultivos permanentes (que totalizaba 1.57 millones de hectáreas en 2014). De las 487 mil Ha de cacao existentes en 2014, 82% era producción exclusiva de cacao y 18% correspondía a cacao asociado con otros cultivos. Al observar la evolución de la superficie sembrada de cacao en el país se aprecia una significativa tendencia creciente, particularmente acelerada entre 2004 y 2011 (Acebo & Rodríguez, 2016). En muchas ocasiones, es afectado por una serie de patógenos que causan varias enfermedades, entre los que se destacan los hongos, siendo los responsables de ocasionar pérdidas en los cultivos hasta alrededor de un 80 %; uno de ellos es el hongo Moniliophtora roreri, responsable de causar la enfermedad moniliasis, esta es considerada como una grave amenaza en la producción eficiente y económica del cultivo del cacao (Briones, 2014). Es por esto, que es necesario buscar alternativas que ayuden a incrementar los rendimientos por unidad de superficie, métodos que ayuden a prevenir muchas de las causas de pérdida, y mejorar el tratamiento frente a patógenos que pongan en riesgo cultivos de producción y al mismo tiempo sean amigables con el medio ambiente, que no representen un riesgo para quienes lo usan y que además sean asequibles. 5. OBJETIVOS 5.1. Objetivo General: Evaluar el control biológico mediante ensayos in vitro del cultivo del cacao (Theobroma cacao L) frente a la moniliasis (Moniliophthora roreri). 5.2. o Objetivo Especifico Preparar la especie Pseudomona putida mediante el correcto mecanismo de aislamiento y recolección. o Aislar el patógeno Moniliophthora usando un correcto método de desinfección y recolección de la muestra. o Determinar el mejor resultado para su control biológico al cultivo del cacao ((Theobroma cacao L), mediante los diferentes ensayos. 6. MARCO TEÓRICO 6.1. Pseudomonas Pseudomonas es un género de bacilos rectos o ligeramente curvados, Gram negativos, oxidasa positivos, aeróbicos estrictos aunque en algunos casos pueden utilizar el nitrato como aceptor de electrones. Algunos miembros del género son psicrófilos, mientras que otros sintetizan sideróforos fluorescentes de color amarillo-verdoso con gran valor taxonómico. Es común la presencia de plásmidos y no forman esporas. Este género es uno de los más proclives a la degradación de compuestos orgánicos, especialmente cepas de la especie Pseudomonas putida. El amplio potencial catabólico de los componentes del género viene dado en muchos casos por la presencia de determinantes plasmídicos y transposones autotransmisibles (Hidalgo & Cullell, 2017). 6.2. Pseudomonas putida La Pseudomonas putida es una bacteria que vive en suelos y aguas, y en ocasiones también se puede encontrar viviendo en la rizosfera de las plantas (la zona del suelo alrededor de la raíz), con las que se asocia en relación simbiótica. En esta asociación mutualista, la planta proporciona nutrientes a la bacteria y ésta, a su vez, puede movilizar nutrientes para la planta o protegerla frente a patógenos y plagas (Hidalgo & Cullell, 2017). 6.3. Obtención La bacteria obtiene de la raíz nutrientes que no puede obtener en el suelo y proporciona a su vez otros nutrientes a la planta mediante la degradación de componentes presentes en el suelo, tales como nitratos y fosfatos. Además, otra función conocida de esta bacteria es la de ser un Agente de Control Biológico (BCA por sus siglas en inglés). Esto quiere decir que al instalarse esta bacteria en las raíces de las plantas se evita la aparición de otras bacterias y hongos perjudiciales para éstas por el principio de competencia (Hidalgo & Cullell, 2017). 6.4. Modo de acción Las cepas de Pseudomonas putida pueden colonizar los sistemas de raíces de un gran número de plantas, estableciéndose y persistiendo en la rizosfera a una densidad celular relativamente alta (Molina et al, 1998; Ramos et al, 2002; Duque et al, 2013). Las cepas de esta especie también pueden adherirse a la superficie de las plantas y formar biopelículas en ellas, lo que facilita la colonización y confiere resistencia a los estreses bióticos y abióticos (YousefCoronado et al., 2008). Las especies de Pseudomonas se consideran bacterias capaces de adaptarse y sobrevivir en diferentes nichos ecológicos. Esta capacidad puede explicarse por sus genomas grandes, que a menudo superan los 6 Mb (Molina, 2014). Entre sus principales mecanismos de resistencia a antibióticos destacan las bombas de tipo RND. Estas bombas están formadas por tres proteínas que crean un canal desde el interior celular hasta el exterior, lo que permite a la bacteria la extrusión al medio externo de los compuestos nocivos. De las 21 bombas de tipo RND que presenta la cepa DOT-TIE, las principales bombas de extrusión son las llamadas TtgABC, TtgDEF y TtgGHI. TtgABC es la bomba fundamental en la extrusión de antibióticos, mientras que TtgDEF y TtgGHI son las encargadas de la expulsión de disolventes desde el interior de la célula hacia el medio. TtgABC está regulada por TtgR, mientras que TtgDEF y TtgGHI están reguladas por TtgV. Ambos reguladores se sintetizan constitutivamente reprimiendo la expresión de los genes de las bombas. En presencia de efectores, el represor sufre un cambio conformacional y de esta forma se libera del promotor de las bombas, lo que permite incrementos en los niveles de expresión de los genes y un aumento concomitante de la resistencia de la bacteria al cofactor o agente inductor (Molina, 2014). 7. Metodología y Propuesta de desarrollo 7.1. Preparación de Pseudomona putida Las cepas de Pseudomonas putida pueden ser aisladas de la rizosfera de plantas de arroz de la variedad J-104 sembradas en el área experimental del Instituto de Investigaciones del Arroz sobre suelo Gley Vértico Crómico-Nodular Ferruginoso. Las mismas se identificaron mediante el sistema API 20 NE y se conservaron en medio Luria Bertani (LB) con glicerol al 40% a una temperatura de -20ºC. Este cultivo se conserva en medio Papa Dextrosa Agar (PDA) (Biocen) a 28oC. (Narovis Rives, 2009) 7.2. Obtención de Moniliophthora roreri 7.2.1 Toma de muestras. Se realiza la selección de muestras en cada zona afectada con los síntomas de Moniliophthora roreri. Las mazorcas de cacao deben ser recolectadas y conservadas en bolsas de manila a temperatura ambiente. 7.2.2 Aislamiento. Se utilizó el método de desinfección superficial de la mazorca en alcohol al 40% un minuto y posteriormente, con hipoclorito de sodio al 1% durante un minuto. Se frotó la mazorca, y luego se lavó con alcohol y flameó. Después de esta desinfección, se cortaron pequeños trozos y se desinfectaron con hipoclorito al 1% durante un minuto y se transfirieron a medio PDA. Las placas se mantienen a 28° C. El último método aplicado es una modificación de los anteriores donde los aislamientos se realizaron a partir de mazorcas infectadas por Moniliophthora roreri tomando trozos de 2 cm x 2cm, los cuales se lavan con agua para más tarde ser expuestos a agentes desinfectantes como hipoclorito de sodio al 2,5 y 3%, durante 2 minutos, y alcohol al 60% durante 3 minutos. Posteriormente se sembraron cuatro trozos en caja Petri en medio (PDA) con un tiempo de incubación de 10 días a 28° C. 7.2.3 Toma de datos Luego de 10 días de incubación, se espera que exista crecimiento micelial. Para de determinar el porcentaje de inhibición del crecimiento micelial (variable dependiente) se utilizará la siguiente ecuación: % 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 = ( 𝑅1 − 𝑅2 ) 𝑥100 𝑅1 R1= crecimiento radial del hongo en la placa control R2=crecimiento radial del hongo en interacción con quitosano Diseño Experimental 7.2.4 Se empleará un DCA con diseño de Análisis Factorial 2x2x2. En este análisis se aplicarán tres factores, y dos niveles por cada factor; donde el factor 1 es el origen del Pseudomona putida, el factor 2 son las concentraciones de Pseudomona putida, y el factor 3 es el medio de cultivo utilizado para el inóculo. No se tomará en cuenta la placa control pues únicamente nos ayudará a medir la diferencia de inhibición. 7.2.5 Datos experimentales Se presenta la matriz de tratamientos en la tabla 2, para evaluar el efecto inhibitorio del Pseudomona putida frente a Moniliophtora roreri en medios de cultivo mediante un diseño factorial 2x2x2. TRATAMIENTOS Factor 1 Factor 2 Factor 3 Origen de Pseudomona spp. Concentraciones Medios de cultivo Agua Suelo 106 cel/mL 5x108 cel/mL PDA PDA + sulfato de estreptomicina O1 O2 C1 C2 M1 M2 Tabla 2. Se muestra de manera detallada las variables y factores a tomar en cuenta. Tratamientos Tratamiento 1 2 3 4 5 6 7 8 Origen O1 O1 O1 O1 O2 O2 O2 O2 INTERACCIÓN Concentración C1 C1 C2 C2 C1 C1 C2 C2 Medio de cultivo M1 M2 M1 M2 M1 M2 M1 M2 Tabla 3. Muestra el ordenamiento de los tratamientos en función de las interacciones entre factores. Diseño de campo O1C1M1 O1C1M2 O2C2M2 O1C2M1 O2C1M1 O2C2M1 O2C1M2 O1C2M2 O1C2M1 O1C2M2 O2C2M1 O1C1M1 O2C1M2 O2C2M2 O2C1M1 O1C1M2 O1C1M2 O2C1M1 O2C1M2 O2C2M2 O1C2M2 O1C2M1 O2C2M1 O1C1M1 7.2.6 Ensayo de respaldo Como ensayo de respaldo se aplicará un DCA con diseño de parcelas divididas. En este análisis se aplicarán tres variedades de cacao existentes en Ecuador (Criollo, Forastero y Trinitario), afectadas con el hongo Moniliophtora roreri o presentes en cultivos susceptibles; y dos productos, donde el producto 1 es el Pseudomona putida obtenida por medio del agua y el producto 2 Pseudomona putida obtenido por medio del suelo. Cabe recalcar que este diseño es aplicado con fines investigativos directamente en campo. Datos experimentales Variedad Variedad 1 Variedad 2 Variedad 3 Variedad 1 Variedad 2 Variedad 3 Producto I II III Producto1 Producto1 Producto1 Producto2 Producto2 Producto2 - - - Tabla 4. Diseño DPD con su respectivo ordenamiento entre variedades y productos. Se presenta el DPD en la tabla 3, para evaluar el % de severidad del Pseudomona putida frente a Moniliophtora roreri en medios de cultivo de plantas de cacao donde variedades es el factor limitante. 8. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES El proyecto tendrá una duración máxima de 2 meses. La obtención de Pseudomona putida está prevista para ser realizada en la primera semana de trabajo, tanto la preparación, y aislamiento constan de periodos de tiempo bastante prolongados que pueden llevarse a cabo en una semana completa. La obtención de la muestra del hongo, su cultivo y repiques se realizarán las 2 semanas siguientes después de haber conseguido el Pseudomona putida. Los antibiogramas para medir la inhibición de este hongo por parte del Pseudomona putida serán incubados durante 10 días en los que se espera el crecimiento micelial de Moniliophtora roreri. En la primera semana del mes 2 se realizará la toma de datos y se procederá con la resolución del análisis estadístico respectivo. Actividades MES SEMANA Preparación de Pseudomona putida Obtención de Moniliophthora roreri Toma de muestra vegetal contaminada Elaboracion de medios PDA Desarrollo del fitopatógeno Repiques en PDA Antibiograma con Pseudomona putida 1 1 2 3 4 1 2 2 36 horas 1 hora 2 horas 120 horas 168 horas Antibiograma en PDA con Pseudomona putida Toma de datos Recolección de datos Análisis de datos Resolución del diseño experimental 168 horas 2 horas 3 horas 9. PRESUPUESTO: Las cepas de Pseudomonas putida pueden ser aisladas de la rizosfera de plantas de arroz de la variedad J-104 sembradas en el área experimental del Instituto de Investigaciones del Arroz sobre suelo Gley Vértico Crómico-Nodular Ferruginoso. Con respecto a la obtención del hongo Moniliophtora roreri se piensa aislar de un cultivo de cacao en el cual se informe y se confirme la presencia de monoliasis, además, se trabajará en los laboratorios de la Universidad Politécnica Salesiana. Los materiales que serán adquiridos para este proyecto incluyen: cajas Petri, vasos de precipitación, agar PDA y sulfato de estreptomicina. Entre los equipos que se emplearán se encuentran: el agitador mecánico, licuadora doméstica marca Oster 3 velocidades, para la esterilización de los materiales se utilizará una autoclave marca MMM de modelo Ecocell, vitrina de extracción de gases y vernier digital marca Gearwrench para el proceso de evaluación de inhibición antifúngica. 3 4 PRODUCTO CANTIDAD PRECIO/U Producción de materia prima Aplicación Cajas Petri Agar Papa Dextrosa Sulfato de estreptomicina 30 500 g 10 g 2 1 2.64 Total TOTAL 412.3 60 90 26.64 588.94 10. BIBLIOGRAFÍA Acebo, & Rodríguez. (2016). ESPAL. Obtenido de Industria de Cacao: https://www.espae.espol.edu.ec/wp-content/uploads/2016/12/industriacacao.pdf Ayala, & Navia. (2010). Manejo Integrado de Moniliasis. Obtenido de https://www.dspace.espol.edu.ec/bitstream/123456789/10404/1/Art%C3%ADculo.pdf Bettiol, W., Rivera , M., & Mondino, P. (2014). control biológico de plantas en Ámerica y el Caribe . 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