PERFIL DE TESIS EVALUACIÓN DE BIOADSORCIÓN Y POTENCIAL DE BIORREMEDIACIÓN DE METALES PESADOS EN BACTERIAS AISLADAS DE SUELOS SALINOS DEL ALTIPLANO NORTE Y CENTRAL BOLIVIANO AREA: MICROBIOLOGÍA SUBAREA: BIOTECNOLOGÍA TESISTA: ANDREA IRENE SILVA CLAROS ASESORES: Ph.D. ERICK V. FERRUFINO GUARDIA M.Sc.. PAOLA V. AYALA BORDA COLABORADORES: Ph.D. JAVIER F. MOLINA PIMENTEL 1. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS Y JUSTIFICACIÓN El suelo es el mayor componente de todos los ecosistemas terrestres, y es la base de todos los recursos naturales dado que soporta toda la vida terrestre. A pesar de su aparente resistencia, el suelo es propenso a la degradación debido a su mal manejo y mal uso en la agricultura y de forma industrial (Sayara, 2010). La degradación de suelos es un término colectivo que describe la pérdida de productividad, lo cual es resultado de la erosión del suelo, el incremento de la salinidad, pérdida de estructura y contaminación, etc. La formación del suelo es lenta por lo tanto debe ser considerado un recurso no renovable. El periodo de tiempo de recuperación, y el costo convierten en este una opción no deseable (Squires & Glenn, 2005). Los metales pesados son contaminantes de amplio rango, que deben considerarse como una preocupación ambiental ya que no son degradables y por lo tanto muy persistentes (Syed & Chintala, 2015). Los metales pesados (Cd, Hg, Pb, Cu, Ni, Sb, Bi) tienen la capacidad de provocar cambios evolutivos debido a sus efectos dañinos. Son potencialmente contaminantes devastadores ya que contaminan el aire, el agua y la tierra. El manejo inadecuado de los materiales y residuos peligrosos ha generado a nivel mundial, un problema de contaminación de los suelos y cuerpos de agua. Entre las más severas contaminaciones destacan las que se produjeron y todavía se producen por metales pesados porque tienden a bioacumularse (Coello, 2011). La contaminación por metales pesados puede originarse tanto por fuentes antropogénicas y naturales. Actividades como la minería, operaciones de fundición y la agricultura han contaminado amplias áreas del mundo (Roozbahani et al., 2014). En primera instancia, los metales pesados inciden en la corteza terrestre de forma natural en las rocas, suelos y sedimentos atrapados en forma estable. El comportamiento químico de estos contaminantes es controlado por la composición del suelo y las propiedades del suelo (Ahemad & Malik, 2011). La contaminación a suelos por fuentes antropogénicas puede ser: fuentes industriales, que se deben mayormente a fertilizantes orgánicos e inorgánicos, particularmente los fertilizantes que tiene niveles variantes de Cd, Cr, Ni y Pb, otras fuentes pueden ser, lodos de aguas residuales, las aguas de riego y pesticidas, otras fuentes son las operaciones mineras que emiten diferentes metales pesados dependiendo del tipo de minería. Por ejemplo, las minas de carbón son fuentes de As y Cd, lo cual enriquece los suelos cerca del campo minero de forma directa o indirecta (Ahemad & Malik, 2011). La industria minera boliviana ha seguido ciclos de producción sujetos a factores externos e internos como la caída y subida del precio de metales en mercados internacionales y la falta de tecnologías para la explotación y recuperación metalúrgica entre otros. Muchos de los sitios de minería han sido cerrados hace 20 años, y en su mayoría permanecen como focos de contaminación, provocando la disminución de la capacidad agrícola del suelo (Vásquez, 2017). El deterioro del recurso suelo en el Altiplano Boliviano por la contaminación de metales pesados es muy preocupante, ya que este aspecto junto a otros factores como el cambio climático, condiciones socioeconómicas, etc. están favoreciendo la desertificación y la disminución de la capacidad productiva de amplias zonas de esta región, creando una serie de problemas ambientales (daños en la fauna y la flora), económicos y sociales (Orsag, 2009). Según estudios realizados por Chambi & Orsag & Niura (2012) los suelos de parcelas agrícolas en la tierras circundantes al Lago Poopó muestran presencia de metales pesados como Pb, Cd, Zn y As que superan los límites máximos permisibles en concentraciones totales, como consecuencia del proceso puntual de contaminación por inundación con relave de mina respecto a las parcelas agrícolas, concluyendo que en dicha zona existe arrastre de partículas por acción del viento y del agua de los desmontes de mina expuestos a la intemperie muy cercanos a esa zona. Para mitigar la contaminación de metales pesados en suelos, existen algunos tratamientos y métodos como estrategia. Estas estrategias están disponibles en forma de precipitación química, filtración, intercambio de iones, tratamiento electroquímico, tecnología de membrana, adsorción en carbón activo, evaporación, etc. estos procesos no son económicos ni efectivos cuando la concentración del ion de metal es demasiado baja (Wilde & Beneman, 1993). Estos métodos tienen desventajas como la remoción parcial del metal, requerimientos de reactivos y energía requerida y la producción de lodos tóxicos (Ahalya et al., 2003). Comparado con los métodos mencionados, una alternativa es la remediación de contaminantes mediante el uso de organismos o materia orgánica, los cuales tienen ventajas por el bajo costo y sin contaminación secundaria. La biorremediación es el uso de organismos vivos, principalmente microorganismos, para degradar contaminantes ambientales en formas menos tóxicas. Las estrategias de biorremediación tienen a menudo más beneficios que estrategias tradicionales, debido a que pueden ser implementadas in situ. Los microorganismos son conocidos como los agentes principales para los procesos de biorremediación microbiana. La capacidad que estos microorganismos tienen depende en su mayoría de la comunidad microbiana selectiva, así como los grupos estructurales y funcionales de los compuestos tóxicos. Los microorganismos pueden ser nativos del área contaminada o pueden ser aislados y trasladados al sitio contaminado (Kensa, 2011). Existen varios mecanismos y estrategia en la biorremediación como la bioadsorción, interacción metal-microorganismo, bioacumulación, biomineralización, biotransformación, y bioblanqueamiento (Jindal, 2017). La bioacumulación es definida como el consumo de tóxicos por células vivas y el transporte dentro de ellas, es un proceso dependiente del crecimiento, mediado sólo por células vivas (Malik, 2004). La bioadsorción puede ser definida como la habilidad que tiene un material biológico para enlazar y concentrar iones seleccionados u otras moléculas, es un fenómeno pasivo de retirar metales de un medio (Abbas et al., 2014). El proceso de bioadsorción es posible por biomasa viva y muerta (Brady et al., 1994). Los microorganismos remueven metales pesados de los suelos usando químicos para su crecimiento y desarrollo. Son capaces de disolver metales y reducir u oxidar metales en transición. Los diferentes métodos usados por los microorganismos para restaurar el ambiente son: oxidación, enlace, inmovilización, volatización y transformación de metales pesados (Jindal, 2017). La habilidad que tienen ciertas bacterias de adsorber y/o acumular metales pesados ha sido ampliamente investigada. Por ende, los microorganismos naturales, tanto nativos como foráneos, pueden ser utilizados para la biorremediación de metales pesados (Prescott et al., 2002). Los microorganismos halófilos y halotolerantes son candidatos adecuados para los procesos de biorremediación de metales pesados debido a que poseen increíbles propiedades, como ser la alta concentración de aniones y cationes, estos microorganismos tienen una carga neta negativa, así permitiendo que atrapen iones en su superficie celular. Adicionalmente su pared provee un ambiente tipo esponja para iones. Finalmente, los componentes intracelulares retienen una gran mayoría de los iones absorbidos. Por lo tanto, las bacterias halófilas no solo tienen ventaja al tolerar las altas concentraciones de sal de forma natural, sino que también son tolerantes a otros elementos que serían tóxicos para otros microorganismos (Massadeh et al., 2005; Amoozegar et al., 2012). Recientemente, la resistencia a metales pesados y oxaniones es un rasgo que se ha encontrado en microorganismos halófilos (p.ej. Halomonas, Pseudoalteromonas) (Amoozegar et al., 2012). El presente trabajo propone el uso de microorganismos autóctonos aislados de suelos del Altiplano Boliviano en la biorremediación de suelos contaminados con metales, con este fin, será realizada la caracterización y evaluación de estos microorganismos sobre el grado de tolerancia a la presencia de los metales Pb, Cd y Zn. De esta manera, se obtendrá información relevante acerca de estos microorganismos, su funcionamiento y su potencial uso en el campo de la biorremediación. JUSTIFICACIÓN Globalmente, la contaminación ambiental está incrementando de manera acelerada a causa de un crecimiento poblacional sin medida, industrialización, urbanización y actividades antropogénicas. Entre varios contaminantes, que afectan el medio ambiente, los metales pesados se encuentran entre los más peligrosos en el mundo tanto para la salud humana como también para el medio ambiente, debido a su fácil dispersión, en los suelos, afluentes y como partículas en el aire. Entre las principales causas de esta contaminación se pueden mencionar operaciones industriales como fundición, minería, forja de metales, y combustibles fósiles. Así mismo, metales pesados como Zinc, Cobre, Cadmio, Plomo, Mercurio y Niquel han sido reportados como los contaminantes más tóxicos sobre el medio ambiente (Naja & Volesky, 2009). La minería es la segunda industria de extracción por detrás de los hidrocarburos, y desde los tiempos de la colonia Bolivia ha sido considerado un país minero. Pese a las legislaciones existentes sobre el medio ambiente la contaminación por metales pesados es un tema muy preocupante y vigente en Bolivia y muy pocos esfuerzos se han llevado a cabo para la remediación de la misma. En regiones mineras como Potosí y Oruro se ha visto de forma persistente la presencia de metales pesados tanto en suelos como en aguas, la preocupación surge a la cercanía con poblados, estudios han confirmado la presencia de metales pesados en tierras de cultivos y en ríos cuyas aguas se utilizan para consumo (referencia?). En el Altiplano Norte y Central se han podido encontrar microorganismos que prosperan en altas concentraciones de sal, además de la presencia de metales pesados. La capacidad que tienen ciertos microorganismos de tolerar altas concentraciones de sal no es común, y se ha estudiado su relación con la capacidad de tolerar y acumular elementos traza, por lo tanto, estos microorganismos pueden presentar un potencial biorremediador de metales pesados. Existen métodos convencionales de tratamiento para remover contaminantes los cuales pueden ser físicos o químicos, sin embargo, dichos métodos presentan problemas y desventajas tanto para el ambiente como la salud humana. Actualmente existen estudios enfocados en resolver el problema de la contaminación de suelos por metales pesados utilizando microorganismos, los cuales pueden tener propiedades de acumular dichos contaminantes. Esta estrategia de descontaminación es parte de la biorremediación. Esta nueva tecnología tiene como objetivo degradar y/o asimilar los metales pesados presentes en el suelo, lo cual tiene muchas ventajas sobre los métodos convencionales ya que en primer lugar es amigable para el medio ambiente, económicamente de bajo costo y por último al tratarse de agentes autóctonos puede tener un impacto regenerativo. En Bolivia existen diversos ecosistemas donde microorganismos extremófilos, particularmente halófilos pueden encontrarse, el Altiplano Boliviano que está caracterizado por sus suelos salinos, al mismo tiempo es la región que alberga la mayor cantidad de actividad minera, por lo tanto, la presencia de los microorganismos que se encuentran en dicha zona puede ser beneficiosa, por sus características halotolerantes o halófilas, son considerados candidatos potenciales en el proceso de biorremediación de los metales pesados. 2. HIPÓTESIS DEL TRABAJO - Bacterias halófilas aisladas de suelos del Altiplano Norte y Central Boliviano son capaces de remover metales pesados (Cd, Pb, Zn) de ambientes contaminados mediante la bioadsorción. 3. OBJETIVOS DEL TRABAJO 3.1 OBJETIVO GENERAL - Evaluar la capacidad de bioadsorción de metales pesados en cepas bacterianas aisladas de suelos del Altiplano Norte y Central Boliviano. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS - Determinar la concentración mínima de inhibición (MIC) de las cepas bacterianas aisladas a metales pesados (Pb, Cd, Zn). - Establecer y optimizar el porcentaje de adsorción de metales pesados mediante experimentos de biosorción en un sistema Batch. - Establecer la cinética de adsorción de los metales pesados por cepas bacterianas. - Determinar las isotermas de adsorción de Langmuir y Freundlich para las cepas bacterianas con mayor rendimiento de bioadsorción 4. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1 METODOLOGÍA a. Descripción del área de estudio Se establecieron como área de estudio los suelos salinos que se encuentran en las orillas del Salar de Uyuni y Salar de Coipasa (entre estos dos salares se encuentra la franja tradicionalmente productora de quinua real, el inter salar). A demás las planicies aluviales como las pampas de Toledo, las orillas Sur y Sur-Este del lago Poopó que tienen suelos salinos y en casos contaminados por la actividad minera. Las localidades establecidas dentro del área de estudio son: Colchani y Candelaria de Viluyo (Uyuni, Coroma, Potosi), Tahua, Llica (D. Campos, Potosi), Jirira (L. Cabrera, Oruro), Escara (Oruro) biogeograficamente la zona de muestreo se encuentra en la Provincia Biogeográfica Altiplánica, en el Sector Altiplánico Norte y Central, del Distrito Biogeográfico del Poopó Desaguadero y Uyuni respectivamente ambos se encuentran en el piso bioclimático Orotropical con un Bioclima Xérico de Ombrotipo Seco superior e inferior respectivamente. Los puntos de muestreo serán determinados según la zonificación de la densidad de cultivos, realizado en los cultivos de Quinua (Chenopodium quinoa), Cañawa, Cauchi (Suaeda foliosa) y muestreo en cuadrantes de la vegetación. b. Colecta de muestras Las muestras de sustrato serán colectadas a una profundidad de 22cm, será realizada una limpieza previa del área de colecta, se realizará una perforación en V. Las muestras serán depositadas en tubos falcon estériles de 50 ml, botellas o bolsas según sea vea pertinente por la naturaleza de la muestra (suelo, agua, sedimento), deberán ser transportados en una bolsa estéril dentro de una conservadora con etiquetas con datos pasaporte necesarios. c. Trabajo de laboratorio Aislamiento, caracterización y determinación de salinidad preliminar Aislamiento de cepas bacterianas Las muestras de suelo obtenidas de la colecta se las inoculará en matraces Erlenmeyer de 250 mL en medio líquido TSB con una concentración de 5 % de NaCl (p/v), una vez obtenido crecimiento mediante dilución seriada se inoculará las últimas tres diluciones en placas Petri con medio sólido TSB a 5 % de NaCl (p/v) y 2% agar (p/v) mediante sembrado en superficie para observar la diversidad microbiana por muestra en cada dilución se aislará los microorganismos diferenciables de las cajas previas mediante siembra en estría, procurando sembrar y obtener un microorganismo por placa. Caracterización macroscópica, microscópica y bioquímica Pruebas macroscópicas y microscópicas Una vez aislados de forma definitiva y constante, los microorganismos se caracterizarán tanto de forma macroscópica como microscópica. Una vez aislados, usando el contador de colonias y estereomicroscopio se observará características como forma de la colonia, tamaño, color, y rasgos de la superficie. Para la caracterización microscópica se realizará una tinción diferencial, Para la tinción diferencial se usa la tinción de Gram, para catalogarlas en Gram-positivas y Gram-negativas así igual su forma celular se podrá diferenciar mediante el uso del microscopio óptico. Pruebas bioquímicas Entre las pruebas bioquímicas a ser realizadas, se realizará la prueba de la catalasa, para la cual se tomará una muestra de cada cepa y se verá la reacción con peróxido de hidrógeno, siendo la presencia de efervescencia como positivo y su ausencia como negativo para la presencia de dicha enzima. Así la prueba de la oxidasa se llevará a cabo mediante un reactivo de oxidasa (para-amino-N-dimetil-anilina) el cual al ser puesto en tiras de papel junto con una muestra bacteriana de ser positiva se teñirá azul. Se realizarán cuatro pruebas bioquímicas adicionales en las cepas bacterianas al finalizar el trabajo para profundizar su caracterización, tales como Lysine Iron Agar (LIA), Triple Sugar Iron (TSI), Motility Indol Ornitine (MIO) y Citrato. Determinación de tolerancia de las bacterias a la salinidad (NaCl) Para determinar la concentración óptima de sal para el crecimiento de los microorganismos se determinará el MIC (minimal inhibitory concentration), a lo cual los microorganismos serán cultivadas a diferentes concentraciones de sal (NaCl) Inicialmente la prueba de tolerancia a sal se trabajará con cinco concentraciones de NaCl (0, 5, 10, 15 y 20 % p/v) en medio sólido TSB 2% agar en placas Petri, estas, serán divididas en cuadrantes y se evaluará el crecimiento de los microorganismos en 24 y 48 horas. Serán evaluados los parámetros de crecimiento y coloración para determinar si el microorganismo crece óptimamente a las diferentes concentraciones sometidas 1. Determinación de la concentración máxima de tolerancia (MTC) de las cepas bacterianas de metales pesados (Pb, Cd, Zn). Para las pruebas de máxima concentración tolerable (MTC), se evaluará a los metales Pb, Zn, Cd, tanto de forma individual como en conjunto. Se pondrá en medio de cultivo de agar nutriente con la concentración de NaCl establecida como la óptima. Los microorganismos serán sometidos a cinco concentraciones iniciales (20, 50, 100, 150 y 200 ppm) de los tres metales pesados mencionados anteriormente. Será realizado un ajuste en el rango de concentraciones de acuerdo a la tolerancia observada en cada microorganismo. 2. Optimización de adsorción de metales mediante experimentos de biosadsorción en un sistema Batch. Los factores que afectan el porcentaje adsorbente y la capacidad de acumulación de las cepas bacterianas serán estudiados en sistema Batch. Inicialmente será preparado un pre-cultivo en un matraz Erlenmeyer de 500 ml que contenga 300 ml caldo nutriente, 5% de NaCl. La cepa bacteriana será inoculada y puesta en agitación 200rpm durante 16 horas. Todos los experimentos Batch serán llevados a cabo con una suspensión de microorganismos provenientes del pre-cultivo, en matraces Erlenmeyer de 100 ml, con 50 ml de solución, para dilucidar las condiciones óptimas: pH (5, 6, 6.5, 7, 8), el tiempo de contacto (1, 2, 6, 8 h), la temperatura (25, 30, 37 °C). De forma paralela, serán realizados experimentos control sin microorganismos para evitar confusión entre bioadsorción y posible precipitación de metal. Los experimentos serán realizados en triplicado para cada metal. Porcentaje de adsorción de metales pesados. Las cepas tolerantes a los tres metales pesados se inocularán en 50 ml de caldo nutriente con 2% de NaCl en matraces Erlenmeyer de 100ml y se pondrán en agitación (200 rpm) hasta obtener una densidad óptica de 0.6 (λ=600nm para actividad enzimática pareja), los cultivos serán transferidos a tubos Falcon de 50 ml, los cuales serán centrifugados a 6000 rpm por 15 minutos, se desechará el sobrenadante. El pellet resultante será re-suspendido en una solución salina al 0.85% y se transferirá 50 ml en un matraz de 100ml, se añadirá 50 ppm de metal, se dejará en agitación (200 pm) y a las 10 horas de cultivo se transferirá a un tubo Falcon de 50 ml y serán centrifugadas a 6000rpm por 15 minutos, el sobrenadante se filtrará y luego pasará por análisis de metales mediante AAS (Espectrofotómetro de absorción atómica), el pellet se re-suspenderá en 5 ml de agua desionizada y será mezclado con el doble de volumen de HNO3. Seguidamente será realizada una digestión ácida para eliminar la materia orgánica, las mezclas serán llevadas a una estufa en baño maría a 100 °C hasta que el volumen de la mezcla vuelva al volumen inicial de 5 ml. Mediante papel filtro el extracto será filtrado para remover cualquier material insoluble y colectado en un matraz volumétrico para ser diluido y enrazado a 25ml. Posteriormente será analizado el extracto total de metal pesado por AAS. 3. Cinética de bioadsorción e Isotermas de Langmuir y Freundlich. Utilizando los resultados de tiempo de contacto se realizarán las pruebas para determinar la cinética de adsorción de las bacterias con respecto a los tres metales pesados por separado en concentración constante de 50ppm. Se evaluará en lapsos de tiempo cómo las cepas seleccionadas adsorben los metales para luego mediante los resultados determinar el modelo (pseudo primer orden o pseudo segundo orden) que sigue. Las isotermas de adsorción de Langmuir y Freundlich son comúnmente utilizados para modelar estudios de bioadsorción basados en concentración de metales. Los biosorbentes (cepas bacterianas) serán suspendidas en soluciones que contengan los metales pesados por separado en cinco concentraciones (60, 70, 80, 90 y 100 ppm). La concentración de células en la solución será según absorbancia (600nm). Las condiciones de adsorción (temperatura, pH, tiempo de contacto) serán idénticas a la de los experimentos en sistema Batch. Después de estar en incubación, muestras de las soluciones serán medidas para analizar la concentración de metales en el pellet porAAS. Las isotermas de Langmuir y Freundlich se realizarán de acuerdo a la cinética de bioadsorción con las cepas que demuestren llegar al equilibrio con mejor rendimiento de adsorción. Para determinar las isotermas de adsorción serán evaluados diferentes modelos de Langmuir y Freundlich según los resultados obtenidos de las pruebas. Análisis de datos De los datos obtenidos de las pruebas y tratamientos se realizará una prueba de ANOVA y ANOVA de contraste, de dos vías donde se medirá el porcentaje de adsorción de los metales pesados, en base a la cepa utilizada, la concentración de los cuatro metales pesados y las respectivas interacciones. Las variables dependientes para este trabajo son las diferentes concentraciones de metales pesados, los metales pesados en si (Pb, Zn, Cd), las variables independientes son los aislados de microorganismos cuantificados mediante su biomasa viva. En el presente proyecto, la respuesta experimental se medirá en función a la bioadsorción de los metales pesados en los aislados microbianos 4.2 MATERIALES Material de campo Bolsas estériles Tubos Falcon de 50mL estériles Pala Picota Cámara fotográfica GPS Cuaderno de campo Material de laboratorio Cajas petri de 90x80mm Medio de cultivo TSB Medio de cultivo TSA Agar bacteriológico Cloruro de sodio NaCl Agar Nutriente Caldo Nutriente Ácido Nítrico Nitrato de Plomo Cloruro de Zinc Nitrato de Cadmio Tubos falcon de 50mL Asas Asas Drigalsky Parafilm Autoclave Hornilla Espectrofotómetro de luz visible (UV-V) Espectrofotómetro de absorbancia atómica (AAS) Cabina de flujo Laminar Incubadora Balanza analítica (±0,1mg) Micropipeta de 1000µL Micropipeta de 200µL Micropipeta de 5 mL Tips de 1 mL Tipos de 0,2mL Tips de 5 mL Tubos ependorff de 1,5mL Tubos Falcon de 50mL pH-metro Matraz Erlenmeyer 100, 250, 500, 1000 mL Matraz aforado 25, 50, 100, 500 mL Vaso de precipitado 100, 150, 250, 500 mL Probeta de 50, 100, 250, 500 mL Estufa Platform Shaker 5. DURACIÓN Y CRONOGRAMA El trabajo tendrá una duración de 10 meses aproximadamente. Ver más detalladamente el cronograma de actividades en el Anexo 1. 6. PRESUPUESTO ITEM Material de campo Material laboratorio de APORTE C. APORTE TOTAL BIOTENCOLOGÍA PROPIO 1041.67$ 30$ 1071.67$ 4340.37$ 325$ 4665.37$ Material de Gabinete - 200$ 200$ Transporte y viáticos 1332.61$ 50$ 1382.61$ TOTAL 6714.65$ 675.80$ 7308.45$ 4. BIBLIOGRAFÍA - Abbas, S & I, Ismail & T, Mostafa & A, Sulaymon. 2014. Biosorption of Heavy Metals: A Review. Journal of Chemical Science and Technology. Vol 3 (4). Cairo, Egipto. Pp 74102. - Ahemad, M & A, Malik. 2011. Bioaccumulation of Heavy metals by Zinc Resistant Bacteria Isolated from Agricultural Soil Irrigated with Waste Water. Bacterial Journal. Aligarh, India. Pp 1-10. - Ahalya, N & T, Ramachandra & R, Kanamadi. 2003. Biosorption of Heavy Metals. Research Journal of Chemistry and Environment. Vol 7 (4). Dharwad, India. 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