PROYECTO CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA RIZOBIOS NATIVOS AISLADOS NÓDULOS TARWI

UNIVERSIDAD NACIONAL DE HUANCAVELICA.
(Creada por Ley N° 25265)
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
ESCUELA PROFESIONAL DE AGRONOMÍA
SUBVENCIÓN DE PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN PARA ESTUDIANTES DE
PREGRADO - PROGRAMA 066
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
LÍNEA DE INVESTIGACIÓN: SUELOS
“CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA DE RIZOBIOS NATIVOS
AISLADOS DE NÓDULOS DE TARWI (Lupinus mutabilis) EN LA
COMUNIDAD CAMPESINA DE PALMIRA BAJA DEL DISTRITO DE
ACORIA-HUANCAVELICA”
RESPONSABLES
:
-
CHILQUILLO QUISPE, Luz Marina
-
MACHUCA GALA, Roxana
ASESOR
: Mtro. Jesús Antonio Jaime Piñas
FECHA DE REGISTRO
: 20/09/2019
FECHA DE INICIO
: Octubre, 2019
FECHA DE CULMINACIÓN
: Mayo del 2020
HUANCAVELICA-PERÚ
2019
1
ÍNDICE
ÍNDICE ................................................................................................................................ 2
CAPITULO I ........................................................................................................................ 4
PROBLEMA ........................................................................................................................ 4
1.1.
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................4
1.2.
FORMULACIÓN DEL PROBLEMA....................................................................5
1.3.
OBJETIVOS: GENERAL Y ESPECÍFICOS .........................................................5
1.3.1.
1.3.2.
1.4.
OBJETIVO GENERAL ................................................................................................... 5
OBJETIVO ESPECIFICO:............................................................................................... 5
JUSTIFICACIÓN ............................................................................................5
CAPÍTULO II: MARCO TEÓRICO ...................................................................................... 7
2.1.
ANTECEDENTES ..........................................................................................7
2.2.
BASES TEÓRICAS ........................................................................................8
2.3.
HIPÓTESIS ................................................................................................. 15
2.4.
DEFINICIÓN DE TÉRMINOS .......................................................................... 15
2.5.
IDENTIFICACIÓN DE VARIABLES ................................................................. 16
2.5.1.
2.5.2.
2.5.3.
2.5.4.
2.6.
VARIABLE INDEPENDIENTE ....................................................................................... 16
VARIABLE DEPENDIENTE .......................................................................................... 16
VARIABLE INTERVINIENTE ........................................................................................ 16
VARIABLES A EVALUAR ............................................................................................ 16
DEFINICIÓN OPERATIVA DE VARIABLES. ..................................................... 17
CAPITULO III: METODOLOGÍA DE INVESTIGACIÓN .................................................... 18
3.1.
ÁMBITO DE ESTUDIO .................................................................................. 18
3.2.
TIPO DE INVESTIGACIÓN............................................................................. 18
3.3.
NIVEL DE INVESTIGACIÓN ........................................................................... 18
3.4.
MÉTODO DE INVESTIGACIÓN ...................................................................... 19
3.5.
DISEÑO DE INVESTIGACIÓN ........................................................................ 19
3.6.
POBLACIÓN, MUESTRA Y MUESTREO .......................................................... 20
3.6.1.
3.6.2.
3.6.3.
Población: .................................................................................................................. 20
Muestra: ..................................................................................................................... 20
Muestreo: ................................................................................................................... 20
3.7.
TÉCNICAS E INSTRUMENTOS DE RECOLECCIÓN DE DATOS .......................... 20
3.8.
PROCEDIMIENTO DE RECOLECCIÓN DE DATOS ............................................ 20
3.9.
TÉCNICA Y PROCESAMIENTO DE ANÁLISIS DE DATOS ................................. 23
2
CAPITULO IV: ASPECTO ADMINISTRATIVO ................................................................. 24
4.1.
POTENCIAL HUMANOS................................................................................ 24
4.2.
RECURSOS MATERIALES ............................................................................ 24
4.3.
PRESUPUESTO .......................................................................................... 25
4.4.
FINANCIAMIENTO. ...................................................................................... 25
4.5.
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES ................................................................ 25
BIBLIOGRAFÍA................................................................................................................. 27
ANEXO .............................................................................................................................. 30
3
CAPITULO I
PROBLEMA
1.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En la comunidad de Palmira baja – Acoria – Huancavelica cultivan como tarwi, maíz
arveja, haba, cebada etc. Por lo cual el uso constante del suelo mediante los cultivos,
desgastan y deterioran las condiciones físico químicas del mismo. Como consecuencia
de los procesos habituales de humificación y mineralización existentes en el suelo, se
puede establecer un balance entre ganancias y pérdidas de materia orgánica; Las
pérdidas se producen de forma natural, aunque su velocidad de desaparición depende
de las características del clima y de los suelos del lugar. Entonces los agricultores han
incluido a las leguminosas en sus rotaciones de cultivo debido a esta capacidad fijadora
en simbiosis con bacterias presentes en los nódulos y también el tarwi (Lupinus
mutabilis) es utilizado como abono verde son los mejores aliados para el
restablecimiento de la capacidad productiva de los suelos.
Por otro lado, el tarwi sea silvestre o domesticada, es una planta de interés por poseer
potencial nutritivo, medicinal, insecticida, ornamental, biocombustible, contribuye al
restablecimiento de suelos degradados y se emplea en biorremediación.
4
1.2. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
¿Cuáles son las especies de rizobios que nodulan en la raíz del cultivo de tarwi
(Lupinus mutabilis) en la comunidad Palmira baja - Acoria - Huancavelica?
1.3. OBJETIVOS: GENERAL Y ESPECÍFICOS
1.3.1. OBJETIVO GENERAL
Caracterizar morfológicamente rizobios nativos aislados de nódulos de tarwi (Lupinus
mutabilis) en la comunidad campesina de Palmira baja del distrito de AcoriaHuancavelica.
1.3.2. OBJETIVO ESPECIFICO:
 Aislar los rizobios de nódulos radicales de Lupinus mutabilis.
 Caracterizar morfológicamente las bacterias de tarwi (Lupinus mutabilis) en la
comunidad campesina de Palmira baja del distrito de Acoria-Huancavelica.
 Seleccionar los rizobios que forman nódulos en la raíz del cultivo de tarwi
(Lupinus mutabilis).
1.4. JUSTIFICACIÓN
Científico
La presente investigación permitirá conocer las bacterias de rizobios nodulados en la
raíz del cultivo de tarwi Lupinus mutabilis, para poder generar protocolos validados
para el estudio de otras leguminosas de interés agropecuario.
Socioeconómico
El mundo muestra que requiere con urgencia alimentos producidos sin residuos
químicos para una alimentación SANA, cuyas bases de producción se encuentra en
las chacras o terrenos andinos, por lo que es de urgencia contribuir en generar
propuestas sostenibles a fin de lograr mejores ingresos por la venta de las cosechas
saludables y además de reducir los gastos que ocasionan al agricultor por la compra
de los fertilizantes sintéticos.
Ambiental
5
La leguminosa, como abono vivo, se convierte en una especie con grandes cualidades
para la recuperación del suelo o restablecimiento de la fertilidad natural de las chacras
en la región, por tanto, contribuirá en el ahorro de energía fósil (petróleo), así como
también en la reducción de la contaminación del medio ambiente.
1.5. LIMITACIONES
6
CAPÍTULO II: MARCO TEÓRICO
2.1. ANTECEDENTES
El tarwi (Lupinus mutabilis), es una leguminosa utilizada como alimentos desde los
tiempos incaicos, se caracteriza por contener altos porcentajes de proteína y grasa,
fijar nitrógeno atmosférico en el suelo, tener sabor amargo debido al contenido de
alcaloides y ser adaptable a diversidades climáticas con mínimas exigencias del suelo.
(Bertha-carita, 2015).
(camarena, 2012) El lupino establecido como abono verde e incorpora al estado de
floración, entre 36 a 66 t/ha de abono verde, ó 7 a 11,69 t/ha de materia seca y, aporta
entre 288,4 a 501,12 kg de N por ha. Convirtiéndose de esta manera en una alternativa
agroecológica.
Las leguminosas del género Lupinus tienen como simbionte común al grupo dominante
del género Bradyrhizobium, (sin embargo, utilizando secuencias del gen 16S rRNA se
han encontrado otros géneros bacterianos como simbiontes de Lupinus, con una
identidad del 99%, entre ellos: Microvirga zambiensis strain WSM3693 ( (Banasiewicz,
2016). Asimismo, en nódulos de Lupinus montanusse se han identificado tres géneros
de bacterias: Rhizobium sp., Pseudomona ssp. y Brevibacillus sp. y no se identificaron
al género Bradyrhizobium sp ; igualmente, se ha confirmado la nodulación de Lupinus
albus por Ochrobactrum lupini (Willems, 2006)
En el distrito de Corongo - Ancash, en diez especies del género Lupinus L.
subtomentosus C.P. Sm, L. mutabilis Sweet., L. brachypremnon C.P Sm, L. carazensis
Ulbr., L. lindleyanus J. Agardh, L. affmutabilis, L. eriocladus Ulbr, L. aridulus C.P. Sm,
L. weberbaueri Ulbr., L. paniculatus Desr (P., 2010). Reportó sus correspondientes
bacterias simbióticas, siete de las cuales pertenecen al género Bradyrhizobiumy tres a
Mesorhizobium.
Igualmente ( (Arone, 2013)al evaluar las bacterias endosimbiontes en nódulos
radiculares de Medicago hispida mediante el gen 16S rRNA y otros, genes como atpD,
7
glnII, recA y nodC encontró como endófitos a los géneros Kaistia, Pseudomonas,
Achromobacter, Stenotrophomonas, Xhanthomonas, Sphyngopyxis, Duganella y
Rheinheimera. Estos resultados muestran que el análisis de la comunidad bacteriana
dentro de los nódulos es esencial para mejorar nuestro conocimiento sobre las
poblaciones bacterianas endófitas como un paso previo para estudiar las actividades y
aplicaciones de endófitos en la agricultura.
2.2. BASES TEÓRICAS
2.2.1. El cultivo de tarwi.
Según (Jacobsen, 2006) el tarwi es una leguminosa que fija nitrógeno (100
kg/ha), restituyendo la fertilidad del suelo cultivado en el área andina desde
épocas preincaicas, se desarrolla en valles templados y aéreas alto andinas.
Conocido con el nombre común: Aymara: tauri (Bolivia); quechua: tarwi, tahuri
(Bolivia, Perú), chuchus muti (Cochabamba, Bolivia); chocho, chochito (Ecuador
y norte de Perú); Castellano: altramuz, lupino, chocho; Ingles: Andean lupine,
pearl lupin.
El lupino o altramuz es de gran interés ecológico y agronómico, por ser una de
las que más N fija en el suelo, repercutiendo muy positivamente sobre la
agricultura y el medio ambiente, constituyéndose una de las mayores promesas
de la agricultura sostenible. Su capacidad de crecer en suelos contaminados con
metales pesados permite considerarla como una potencial planta
fitorremediadora (Antón et al., 2006).
2.2.2. Taxonomía de tarwi.
Según (Rodriguez, 2009). La clasificación taxonómica del tarwi es la
siguiente:
División
: Embriofitas sifonógamas
Sub División
: Angiosperma
Clase
: Dicotiledóneas
Sub Clase
: Arquiclamídeas
8
Orden
: Rosales (Fabales)
Familia
: Leguminosas (Fabaceae)
Sub familia
: Papilionoideas (Faboideae)
Tribu
: Genisteas
Género
: Lupinus
Especie
: mutabilis
Nombre Científico
: Lupinus mutabilis Sweet.
Nombre Común
: Tarwi, tahuri, Chocho, Altramuz, lupino.
2.2.3. Morfología.
El tarwi es una planta generalmente anual, de crecimiento erecto y que puede
alcanzar de 0.8m hasta más de 2m en las plantas más altas (Camarena, 2012).
2.2.3.1. Raíces y nódulos
La raíz, que como en toda planta desempeña un rol de sostén y de
conducción de la savia desde el suelo hasta los demás órganos, se
caracteriza por ser gruesa y pivotante, el aspecto más sobresaliente es
la alta cantidad de nódulos que tiene la raíz, pesando unos 50 g por
planta, las raíces se asocian con bacterias llamadas Rhizobium spp.,
que pueden fijar nitrógeno del aire y que aportan entre 40 y 80 kg/ha de
nitrógeno al año (Tapia, 2007).
Citado por (Araujo, 2015), reporta que como toda leguminosa, el tarwi
tiene una raíz pivotante vigorosa, ramificada, leñosa y poco profunda.
Presenta múltiples ramificaciones y gran cantidad de raicillas y pelos
radicales. En el Perú, las plantas de tarwi muestran generalmente en
sus raíces primarias un gran número de nódulos que son bacterias
nitrificantes llamadas Rhizobium que presentan un tamaño que varía de
1 a 3 cm. En los suelos donde hay presencia de estas bacterias, la
formación de los nódulos comienza pocos días después de la
germinación, al cortarlos presentan una coloración rojiza.
9
2.2.3.2. Tallo y ramificaciones
Según (Camarena, 2012), la planta de tarwi posee un tallo que alcanza
entre los 0.5 a 2 metros de altura, siendo su valor promedio aproximado
de 1 metro, por lo general este es grueso, de forma cilíndrica, leñoso y
ramificado (de acuerdo al eco tipo presente, este puede ser ramificado
o no ramificado) y dependiendo del grado de leñosidad que la planta
presente, su color variará de verde a gris castaño.
2.2.3.3. Hojas
(Rodriguez, 2009) y (Araujo, 2015), mencionan que, mencionan que,
la hoja del Tarwi es de forma digitada, generalmente conformada por 8
- 9 foliolos que varía entre ovalados a lanceolados. En la base de los
peciolos existe pequeñas hojas estipuladas, muchas veces
rudimentarias y estas se diferencias de las otras especies de Tarwi en
las que las hojas tienen menos vellosidades. Las coloraciones de las
hojas pueden variar de amarillo verdoso a verde oscuro, y esto depende
del contenido de antocianina en la planta. Estas se diferencian de otras
hojas de la especie Lupinus porque sus hojas tienen menos
vellosidades.
2.2.3.4. Flores e inflorescencia
El tarwi pertenece a la subfamilia Papilionoideas por lo cual presenta
una corola grande de 1 a 2 cm, con cinco pétalos y compuesta por un
estandarte, dos quillas y dos alas. Según el tipo de ramificación que
presente la planta, puede tener hasta tres floraciones sucesivas. Se
menciona que en una sola planta pueden existir hasta 1000 flores
(Tapia, 2007).
(Araujo, 2015), nos dice que la coloración de la flor varía entre el inicio
de su formación hasta la maduración de un azul claro hasta uno muy
intenso y de allí se origina su nombre científico, mutabilis, es decir que
cambia. Los colores más comunes son los diferentes tonos de azul e
incluso púrpura; menos frecuentes son los colores blanco, crema,
rosado y amarillo.
10
2.2.3.5. Fruto
(Marmolejo, 2010), mencionan que el fruto es una vaina de forma
elíptica u oblonga, el tamaño varía de acuerdo a la variedad entre 6 a
12 cm de longitud y de 1,5 a 2,3 cm de ancho, con sus extremos agudos
la cubierta es pubescente. Cada vaina puede obtener de 1 a 8 semillas
que son elipsoidales a lenticulares de 4 a 15 mm.
2.2.3.6. Semilla
(Gross, 1997), Citado por (callisaya, 2012), reporta que las semillas de
tarwi están incluidas en número variable en la vaina y varían de forma
(redonda, ovalada a casi cuadrangular), miden entre 0,5 a 1,5 cm. Un
kilogramo tiene 3500 a 5000 semillas. La variación en tamaño depende
tanto de las condiciones de crecimiento como del eco tipo o variedad.
La semilla está recubierta por un tegumento endurecido que puede
constituir hasta el 10% del peso total. Los colores del grano incluyen
blanco, amarillo, gris, ocre, pardo, castaño, marrón y colores
combinados como marmoleado, media luna, ceja y salpicado.
2.2.3.7. El Tarwi como abono verde
El (lupinos mutabilis), son especialmente adecuadas para cobertura o
abono verde porque proporcionan gran cantidad de material verde de
calidad. Este material enriquece el suelo con principios nutritivos y
minerales, además de devolver el nitrógeno que extrae de la planta
durante su crecimiento. Sumado a ello, el nitrógeno proporcionado por
las leguminosas queda retenido en el suelo durante largos períodos y
es difícil que sean arrastrados por agua de lluvia.
Es por ello que, agricultores de todo el mundo han incluido a las
leguminosas en sus rotaciones de cultivo debido a esta capacidad
fijadora en simbiosis con bacterias presentes en los nódulos. Esta
práctica tradicional está basada en la observación empírica de que las
leguminosas recuperan, mantienen o aumentan la fertilidad del suelo. Si
un terreno se cultiva año tras año con una gramínea, la productividad irá
disminuyendo y para restaurarla será preciso romper ese ciclo anual
11
cultivando alguna leguminosa. La mayoría de las plantas ven limitado su
crecimiento por la cantidad de nitrógeno combinado del suelo, pero no
así las leguminosas. Además, el análisis de nitrógeno total demuestra
que cuando las leguminosas crecen sobre suelos pobres en nitrógeno
aumentan la cantidad de nitrógeno fijado en el suelo. Como la única
fuente posible de este nitrógeno adicional es la atmósfera, científicos
Demostraron que las legumbres a diferencia de otras plantas pueden
fijar nitrógeno atmosférico, siendo esta la base química para la práctica
tradicional de rotación de cultivos (Lucero, 2018).
Las leguminosas se emplean como abono verde con la finalidad de
restablecer o mantener la fertilidad de los suelos, los géneros más
destacados y con mayor potencial son Vigna, Lablab, Lupinus y
Melilotus (Hernández, 1996).
2.2.3.8. El Tarwi como biocombustible
Los tallos secos del Lupinus mutabilis sean cultivadas o silvestres se
emplean como leña desde tiempos antiguos. Las familias campesinas
trasladan estos tallos de la chacra a la vivienda y lo emplean como leña.
El tallo seco, posee gran cantidad de celulosa y alto poder calorífico, por
lo que se emplea como biocombustible, Asimismo, las cenizas producto
del quemado de los tallos secos de tarwi constituyen un excelente
repelente de insectos chupadores, rapadores, perforadores y cortadores
de plantas tiernas en los cultivos andinos (Jacobsen, 2006).
2.2.3.9. El tarwi como uso medicinal.
Farmacología. - Se han realizado estudios verificando las propiedades
hipoglucemiantes en la sangre de las semillas de Lupinus mutabilis tanto
cruda como cocinadas. Se han encontrados los siguientes metabolitos
secundarios: alfa-tocoferol, γ-Tocoferol, esparteína, lupinina, lupanidina
y ácidos grasos. (Peralta, 2019)
El tarwi como uso sanidad.
12
La planta de tarwi se utilizan mayormente las personas que viven en
campo como medicinal tanto para ello y para sus ganados, controlan
diferentes enfermedades como: diabetes, males renales, resaca, etc.
(Jacobsen, 2006). También se usan sus propiedades curativas para
eliminar infestación de parásitos externos en el ganado vacuno
(garrapatas), al mezclar el agua hervida amarga de tarwi con agua
hervida de ajenjo y hollín de cocina. Con el producto de esta infusión, se
baña al animal afectado y se repite hasta que quede libre de parásitos.
(Galvez, 2008), citado por (Chirinos- Arias, 2015), menciona que es
importante el recalcar que el tarwi es la única especie del género
Lupinus que posee isoflavonas (un tipo de flavonoides) en sus semillas
que son conocidas por sus propiedades antioxidantes. porque presenta
compuestos Fito estrógenos no esteroídicos como las isoflavonas, las
cuales poseen anillos fenólicos que se unen a los receptores de
estrógeno. (Galvez, 2008). Como tamoxifen, usado para el tratamiento
de cáncer de mama. (Davies, 2013). Por lo que ayudaría a la prevención
de cáncer.
2.2.4. La simbiosis rizobio-leguminosa y su aporte en las chacras
La fijación biológica del Nitrógeno (FBN) es el proceso responsable para la
reducción del N2 a amonio (NH3). (France, 2009) y es llevado a cabo por
microorganismos diazótrofos, particularmente por bacteria y arquea (Dixon,
2004). La enzima clave de la fijación de N2 es la nitrogenasa que consta,
típicamente, de un ferro proteína (Fe-proteína, nitrogenasa reductasa) y de una
molibdoferroproteína (MoFe-proteína, nitrogenasa). Cuando en el medio no hay
disponibilidad de molibdeno, algunas bacterias como Azotobacter vinelandii o
Rhodobacter capsulatus inducen la síntesis de nitrogenasas alternativas que
contienen vanadio o hierro en lugar de molibdeno (Dixon, 2004).
Se estima que la cantidad total de N que se adiciona al suelo es de unos 275
millones de toneladas métricas al año, de los que 30 se deben a causas
naturales, como descargas eléctricas o erupciones volcánicas, 70 proceden de
13
la síntesis industrial debida a la producción de fertilizantes nitrogenados
mediante el proceso Haber-Bosch, y 175 se producen mediante la fijación
biológica del N2. (Felipe, 2006). La fijación biológica de N2 es, por tanto, un
proceso de enorme interés en el ciclo biogeoquímico del N en la naturaleza ya
que repone el contenido total de N en la biosfera y compensa las pérdidas que
ocurren por des nitrificación (Philippot, 2007).Como ejemplo, baste decir que el
empleo de alfalfa como cultivo en rotación incorpora al suelo entre 127 y 500 kg
de N/ha/año (Altieri, 2005).La utilización de leguminosas constituye, por tanto,
una alternativa para disminuir la aplicación de fertilizantes nitrogenados, lo que
redunda en una disminución significativa tanto en términos económicos como de
contaminación medioambiental.
Las bacterias del orden Rhizobiales, conocidas genéricamente como rizobios,
son α-Proteo bacterias, Gram-negativas, que pertenecen a los géneros
Rhizobium,
Ensifer
(Sinorhizobium),
Mesorhizobium,
Bradyrhizobium,
Allorhizobium, Azorhizobium, Blastobacter, Methylobacterium, Devosia,
Phyllobacteriumy Ochrobactrum (Sawada, 2003). Estos rizobios inducen en las
raíces de sus plantas hospedadoras la formación de nódulos, que son los
órganos donde tiene lugar el proceso de fijación de N2. La mayoría de los
rizobios forman nódulos en las raíces, aunque Azorhizobium los ocasiona tanto
en las raíces como en los tallos de Sesbaniarostrata, y Phyllobacteriumlos forma
en las hojas de las plantas de las familias Myrsinaceae y Rubiaceae. Además
de los rizobios, existen otras bacterias capaces de fijar nitrógeno en simbiosis
con leguminosas, como son las la β-proteobacterias de los géneros Burkholderia
y Ralstonia (Velazquez, 2006). En el interior de los nódulos, los rizobios se
transforman en células especializadas, los bacteroides, que se caracterizan por
sintetizar la enzima nitrogenasa que es la que reduce el N2 a amonio (NH 4+).
Estudios de campo han demostrado que L. mutabilis es capaz de fijar alrededor
de 200 kg de nitrógeno por hectárea.
2.2.5. Bacterias endófitas
14
Tomada literalmente, la palabra endófito significa "dentro de la planta" (endon,
en griego, dentro de; phyton, planta), (Bacon C. y., 2000). Los endófitos son
microorganismos que colonizan tejidos internos vivos de las plantas, sin causar
ningún efecto negativo inmediato o daño aparente a la planta. De este modo, las
bacterias endófitas se consideran aquellas aisladas de tejidos de plantas vivas
desinfectadas superficialmente, o extraído de tejido interno de la planta, y que
no causan síntomas visibles de enfermedad en la planta. (Hallmann, 1997).
Estas bacterias se encuentran principalmente en los espacios intercelulares de
los tejidos y, con menor frecuencia, intracelularmente y en tejidos vasculares,
sin causar síntomas de enfermedad.
2.3. HIPÓTESIS
Los rizobios nativos aislados de la raíz del cultivo de tarwi (Lupinus mutabilis) de la
comunidad Palmira baja-Acoria-Huancavelica y caracterizadas morfológicamente son
simbiontes que nodulan.
2.4. DEFINICIÓN DE TÉRMINOS
Rhizobium. Es un género de bacterias gran-negativas del suelo que fijan nitrógeno
atmosférico. Pertenece a un grupo de bacterias fijadoras de nitrógeno que se
denominan colectivamente rizobios.
Los nódulos radicales. Como en la mayoría de las leguminosas, la simbiosis entre la
planta de lupino y las bacterias noduladoras, que viven en las raíces, tienen gran
importancia. Los Rhizobium fijan el nitrógeno del aire y proporcionan a la planta sales
nutrientes nitrogenadas. La formación de estos nódulos comienza a partir del quinto
día después de la germinación.
Los nódulos pueden alcanzar un diámetro de hasta 3 cm; y se encuentran de
preferencia en la raíz primaria, por encima de la ramificación, así como en las raíces
secundarias. Cada planta puede producir hasta 50g de nódulos en sus raíces.
15
Simbiosis. Viven con determinadas plantas (como por ejemplo las leguminosas) en su
raíz, después de un proceso de infección inducido por la propia planta mediante la
secreción de lectina, a las que aportan el nitrógeno necesario para que la planta viva y
está a cambio le da cobijo.
Rizosfera. Se encuentra en el suelo inmediata a las raíces vivas y cumplen una
fijación N y le ayuda absorber los minerales de la planta.
Comunidad microbiana. Suma de todos los microorganismos y los factores abióticos
de un ambiente particular. Poblaciones de microorganismos: por crecimiento celular.
Endófita. Son microorganismos unicelulares que viven sin causar daño en el interior
de células o tejidos de plantas. Se le conoce como bacterias endófitas.
Simbionte. - Es un organismo que tiene una relación de ayuda con otro organismo.
Simbionte: Especie animal o vegetal que vive en simbiosis con otra especie diferente.
Organismo que vive habitualmente en el espacio corporal de otro, pero sin perjudicarlo.
2.5. IDENTIFICACIÓN DE VARIABLES
2.5.1. VARIABLE INDEPENDIENTE
Rizobios de los nódulos del cultivo de tarwi (Lupinus mutabilis) de la comunidad
campesina de Palmira baja del distrito de Acoria-Huancavelica.
2.5.2. VARIABLE DEPENDIENTE
Diversidad de bacterias localizadas en los nódulos de (Lupinus mutabilis).
2.5.3. VARIABLE INTERVINIENTE

Clima

Propiedades del suelo

Sanidad de las plantas de tarwi (Lupinus mutabilis).

Medio de cultivo
2.5.4. VARIABLES A EVALUAR
16

Aislar los rizobios de nódulos radicales de tarwi (Lupinus mutabilis).

Caracterizar morfológicamente las bacterias de tarwi (Lupinus mutabilis) en
la comunidad campesina de Palmira baja del distrito de AcoriaHuancavelica.
2.6. DEFINICIÓN OPERATIVA DE VARIABLES.
Variable
Definición conceptual
Definición
operacional
Indicador
Escala
Variable
Los nódulos de Lupinus son de
Nódulos se
Presencia de
Tamaño y
independiente:
crecimiento indeterminado, y
obtendrá de las
nódulos
sanidad de
Nódulos de
por tanto mantienen un
raíces de las
Lupinus
meristemo activo. Sin embargo,
plantas de
mutabilis
no muestran las características
Lupinus Mutabilis,
típicas de los nódulos
en la etapa de
indeterminados:
floración.
nódulos
Forma cilíndrica, meristemo
apical, y en la zona infectada,
un gradiente de diferenciación
desde el meristemo hasta la
base del nódulo. Se clasifican
como un subtipo especial y
único denominado nódulo
lupinoide.
Variable
La diversidad de los microbios
Los nódulos son
Aislados
Característi
dependiente:
endofíticos es la base para
nichos del
bacterianos
cas
Diversidad de
entender sus diversas
endosimbionte, a
morfológica
bacterias
capacidades de producir
partir de la cual se
s de las
localizadas en
compuestos, vivir en diversos
aíslan los
colonias
los nódulos de
ambientes, asociarse a
simbiontes de
aisladas de
Lupinus
diferentes plantas, etc.
Lupinus mutabilis,
los nódulos.
mutabilis.
17
CAPITULO III: METODOLOGÍA DE INVESTIGACIÓN
3.1. ÁMBITO DE ESTUDIO
3.1.1. Ubicación política
Departamento
: Huancavelica.
Provincia
: Huancavelica.
Distrito
: Acoria.
Lugar
: Palmira Alta.
3.1.2. Ubicación geográfica
Latitud sur
: 12°38´34.00´´
Longitud Oeste
: 74°51´42.00´´
Altitud
: 3898 msnm
3.1.3. Factores climáticos
Temperatura promedio
: 6.0 °C.
Humedad relativa
: 50% hasta 73%
Precipitación promedio anual
:
766 mm al año.
3.1.4. Duración
Inicio
: Octubre, 2019
Culminación
: Mayo, 2020
3.2. TIPO DE INVESTIGACIÓN
El presente trabajo de investigación es aplicada porque el propósito fundamental es
dar soluciones a problemas prácticos la fertilidad natural de las chacras y dar
soluciones a las personas que sufren como cáncer, colesterol, diabitis etc en la
comunidad Palmira baja, por lo tanto, contribuirá en el ahorro de energía fósil
(petróleo), así como también en la reducción de la contaminación del medio ambiente.
3.3. NIVEL DE INVESTIGACIÓN
18
El presente trabajo de investigación corresponde a la investigación descriptiva,
orientada a la caracterización de los rizobios endosimbiontes en nódulos de (Lupinus
mutabilis), crecidas en la comunidad Palmira baja-Acoria-Huancavelica.
3.4. MÉTODO DE INVESTIGACIÓN
Se fundamenta en el Método Científico y utiliza como procesos lógicos la inducción y
la deducción.
3.5. DISEÑO DE INVESTIGACIÓN
El diseño de investigación es transversal descriptivo, porque los datos o información
son recolectados en un solo momento; y corresponde a la investigación no
experimental, cuyo flujo es el siguiente:
Investigación no
experimental
Diseño
transversal
Descriptivo
Diagrama del proceso de aislamiento e identificación del rizobios de Lupinus
mutabilis.
Recolección de nódulos
Esterilización de nódulos
Siembra y aislación de bacterias
Purificación de bacterias
Caracterización Morfológica
Prueba Biológica
19
3.6. POBLACIÓN, MUESTRA Y MUESTREO
3.6.1. Población:
La población estará conformada por 300 nódulos procedentes de 30 plantas de
Lupinus mutabilis crecidas en la comunidad Palmira baja-Acoria-Huancavelica.
3.6.2. Muestra:
Se tomarán 10 nódulos por cada planta
3.6.3. Muestreo:
El tipo de muestreo a utilizar será el simple – aleatorio
3.7. TÉCNICAS E INSTRUMENTOS DE RECOLECCIÓN DE DATOS
Técnicas de recolección de datos. Para la recolección de datos en el trabajo de
investigación se utilizará la técnica de observación y medición, según la variable a
evaluar, según la metodología antes ya descrita.
Instrumentos de recolección de datos. Los instrumentos a utilizar en la recolección
de datos, serán entre según el protocolo que se emplea en la caracterización de las
bacterias y las pruebas biológicas.
3.8. PROCEDIMIENTO DE RECOLECCIÓN DE DATOS
a) Recolección de Nódulos
Para la recolección de los nódulos que servirán para el aislamiento de Rizobios se
seleccionaran de 10 plantas vigorosas con hojas verdes y sanas, de las cuales se
toman alrededor de 20 nódulos vivos e intactos, preservándolos en frascos de vidrio
con material desecante (gel de sílica) hasta su siembra, aislamiento e identificación
en el Laboratorio
b) Esterilización de nódulos y aislamiento de sus endosimbiontes
Los nódulos de cada planta se mezclarán y 12 de ellos se esterilizarán con HgCl 2
al 0.25% durante 5 minutos. Posteriormente, se lavarán abundantemente con agua
destilada estéril. Cada uno de los nódulos se deposita en una placa Petri, se le
20
adicionará 2 gotas de agua estéril y se machacará con una varilla de vidrio también
estéril. El extracto resultante se utilizará para inocular placas Petri que contengan
medio YEM (Vincent, 1970). Para comprobar la eficacia de la esterilización, 3
nódulos sin machacar se harán rodar sobre placas rellenas con medio YEM. Todos
los cultivos se incubarán a 30 ºC durante 8 d. Las unidades formadoras de colonias
(UFCs) con diferente morfología que aparecen en las placas se seleccionarán
mediante inspección con una lupa de aumento 10X y cada una de ellas se resiembra
en placas Petri con medio YEM hasta la obtención de colonias morfológicamente
uniformes.
c) Cultivo Bacteriano
Cada una de las cepas obtenidas se siémbrala en tubos de vidrio de 3 ml de medio
liquido YEM y se incuba a 30 °C, en agitación a 120 r.p.m. durante 34 a 72 horas,
tiempo necesario para que la densidad celular de las diferentes cepas bacterianas,
determinada espectrofotométricamente a 600 mm de longitud de onda, fuera – 0,6.
Posteriormente las células se recogen mediante centrifugación de los cultivos en
una micro fuga a 12.000 r.p.m durante 3 minutos, a temperatura ambiente. Cuando
de las cepas produce abundante polisacárido, las células se lavarán con sarkosil al
0.1 % en solución tampón TE (10 mM Tris-HCL, 1 Mm EDTA, pH 8.0).
d) Esterilización de semillas, germinación e inoculación de las plántulas.
Esterilización de semillas y germinación
Las semillas de tarwi (Lupinus mutabilis), se esterilizarán de la siguiente manera:
1) Sumergir las semillas en una solución de HgCl2 al 2,5% durante 10 minutos
en agitación.
2) Lavar con abundante agua destilada estéril.
3) Embeber en agua destilada estéril durante 1-2 horas a temperatura
ambiente, en agitación.
4) Lavar abundantemente con agua estéril y colocar sobre placas Petri con
agar al 1%.
21
5) Germinar en oscuridad a 30 º C hasta que las radículas alcancen 1-2 cm
de longitud
Solución nutritiva para el cultivo de plantas
Se empleará la solución mineral descrita por (Rigaud y Puppo, 1975), cuya
composición se describe a continuación:
Macro elementos (por litro de agua)
• KH2PO4
68 mg
• K2HPO4
44 mg
• SO4Mg x 7H2O
123 mg
• K2SO4
174 mg
• SO4Ca
173 mg
• EDTA férrico (forma comercial Secuestrene)
25 mg.
Micro elementos (por litro de agua):
• MoO4Na2 x 2H2O
0,11 mg
• BO3H3
2,85 mg
• SO4Mn x 4H2O
3, 07 mg
• SO4Zn x 7H2O
0, 55 mg
• SO4Cu x 5H2O
0,2 mg
La solución se esterilizará en autoclave a 120 ºC durante 20 minutos.
Preparación de inóculos bacterianos
Todos los inóculos bacterianos se obtendrán a partir de cultivos frescos en los
correspondientes medios líquido, hasta obtener una suspensión bacteriana de,
aproximadamente, 108 células viables por ml. La cantidad de células viables se estima
calculando el número de UFCs. Cada semilla se inoculará con 1 ml de la
correspondiente suspensión bacteriana.
Cultivo de plantas

Cultivo en jarra Leonard
El cultivo se llevará a cabo utilizando Jarras Leonard (Leonard, 1943). Este
sistema consta de dos recipientes independientes, de manera que el superior se
22
rellena con vermiculita y el inferior con solución nutritiva (Regaud, 1975). El
conjunto se esterilizará mediante autoclave a 120 º C durante 20 minutos. En cada
jarra se sembrará las semillas pre germinadas y se inoculará con 1 ml de la
suspensión bacteriana en estudio. La capa superficial de vermiculita se cubrirá
con una capa de perlita estéril, que evita la posible contaminación ambiental y
refleja la luz por lo que previene el calentamiento excesivo de las semillas. Cada
jarra se envuelve en papel opaco a la luz para evitar que ésta alcance las raíces.
Las jarras se trasladarán a un invernadero funcionando en condiciones
controladas (500 µeinstein x m-2 x s-1 de longitud de onda de onda, 400-700 nm
de intensidad luminosa, fotoperiodo de 16/8 horas luz/oscuridad, 23/17 ºC de
temperatura día/noche y 50% de humedad relativa).
3.9. TÉCNICA Y PROCESAMIENTO DE ANÁLISIS DE DATOS
Para el análisis de datos se utilizará diversos softwares de bioinformática y estadística
descriptiva, siguiendo la metodología (Talbi, 2011).
Estadística descriptiva: tablas y gráficos de frecuencias.
Estadística inferencia: Prueba de relación específico: Chi cuadrado de
independencia.
23
CAPITULO IV: ASPECTO ADMINISTRATIVO
4.1. POTENCIAL HUMANOS.
4.1.1. Tesista
: CHILQUILLO QUISPE, Luz Marina
: MACHUCA GALA, Roxana
Ciclo
: X Ciclo
Condición
: Regular
Escuela
: EP Agronomía - Acobamba
Facultad
: Ciencias Agrarias.
4.1.2. Asesor
: Mtro. Jesús Antonio Jaime Piñas
Condición
: Nombrado - Asociado
Escuela
: Agronomía - Acobamba
Facultad
: Ciencias Agrarias
4.2. RECURSOS MATERIALES
Unidad de
Medida
Cantidad
Insumos y reactivos
Manitol
g
500
350
350.00
MgSO4 x 7H2O
g
250
52
52.00
Extracto de levadura
Agua destilada
Agar bacteriológico
g
l
kg
500
100
1
25
4
550
25.00
400.00
550.00
HgCl2
g
100
160
160.00
SO4Ca
g
250
106
106.00
Perlita
kg
1
45
45.00
Materiales Generales
24
Precio
Sub Total, S/.
Unit. S/.
Vermiculita
Placas Petri
Papel platina
Algodón
Botellas de tapa azul 1000 ml
Jarras Leonard
Materiales de escritorio
Cuaderno
Lapiceros
Impresiones
Copias
USB
kg
Unidad
Unidad
Paquete
Unidad
Unidad
24
50
30
4
5
30
Unidad
Unidad
Unidad
Unidad
Unidad
Sub total
2
21
1000
500
1
125
250.00
4
200.00
12
230.00
25
100.00
30
150.00
10
300.00
Sub total S/. 2,918.00
4
0.5
0.1
0.1
30
8.00
10.5.00
100.00
50.00
24.00
S/. 192.50
4.3. PRESUPUESTO
Presupuesto del proyecto
Insumos y reactivos
Materiales de escritorio
Movilidad y transporte
Publicación
Capacitación
Costo total S/.
Monto S/.
2918.00
192.50
150.00
350.00
500.00
4110.50
4.4. FINANCIAMIENTO.
El presente trabajo será subvencionado por programa 066 de proyectos de
investigación para estudiantes de pregrado.
4.5. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
Meses
ACTIVIDADES
Presentación del proyecto
N
X
25
D
E
F M A M
Compra de materiales
X
Muestreo de nódulos del cultivo de
X
tarwi.
Aislamiento del rizobios
X
Pruebas de inoculación
X
X
Identificación de rizobios
X
Análisis e interpretación de datos
X
X
Redacción de informe final
X
Presentación del informe
X
26
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29
ANEXO
MATRIZ DE CONSISTENCIA
CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA DE RIZOBIOS NATIVOS AISLADOS DE NÓDULOS DE TARWI (Lupinus
mutabilis) EN LA COMUNIDAD CAMPESINA DE PALMIRA BAJA DEL DISTRITO DE ACORIA-HUANCAVELICA
PROBLEMA
General
El cultivo de tarwi en una leguminosa
andina cuyo cultivo y consumo
necesitan ser revalorados por su
adaptación a los suelos marginales, su
tolerancia al estrés hídrico y su
capacidad
de
fijar
nitrógeno
atmosférico en el suelo, que es ideal
para
sistemas
de
cultivos
agroecológicos u orgánicos.
Específicos
¿Qué especie de rizobios nodulan en la
raíz del cultivo de tarwi (Lupinus
mutabilis) en la comunidad Palmira
baja - Acoria - Huancavelica?
OBJETIVOS
HIPÓTESIS
General
Los rizobios nativos
Evaluar las bacterias endosimbióticas de aislados de la raíz del
los nódulos radicales de lupinus mutabilis cultivo de tarwi
crecidas en la comunidad Palmira baja- (Lupinus mutabilis)
Acoria -Huancavelica.
de la comunidad
Palmira baja-AcoriaHuancavelica
y
caracterizadas
morfológicamente
son simbiontes que
nodulan.
Específicos
 Aislar los Rizobium de nódulos
radicales de Lupinus mutabilis.
 Caracterizar morfológicamente
las bacterias de tarwi (Lupinus
mutabilis) en la comunidad
campesina de Palmira baja del
distrito de Acoria-Huancavelica.
 Seleccionar los Rizobium que
forman nódulos en la raíz del
cultivo de tarwi (Lupinus
mutabilis).
30
VARIABLES
Independiente
Rizobios de los nódulos
del cultivo de tarwi
(Lupinus mutabilis) de la
comunidad campesina de
Palmira baja del distrito de
Acoria-Huancavelica.
Dependiente
Diversidad de bacterias
localizadas en los
nódulos de Lupinus
mutabilis.
METODOLOGÍA
Se fundamenta en el
Método Científico y utiliza
como procesos lógicos la
inducción y la deducción,
empleando metodologías
Lezama. 2010; Arone et
al. 2013.
31
32