Metodos de separación3 (2)

QUIMICA ANALITICA III
Edineldo Lans Ceballos. M.Sc.
Febrero 9 del 2015
2
E.Lans
Contenido
1 CROMATOGRAFIA
1.1 Clasificación de métodos cromatográficos . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.1 Cromatografı́a en columna . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.2 Cromatografı́a plana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2 Clasifición de métodos cromatográficos en columna . . . . . . . . .
1.2.1 Cromatografı́a de Gases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2.2 Cromatografı́a lı́quida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2.3 Cromatografı́a de fluı́dos supercrı́ticos . . . . . . . . . . . .
1.3 Terminos y ecuaciones en cromatografı́a . . . . . . . . . . . . . . .
1.3.1 Resolución . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.3.2 Difusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.4 Velocidades de separación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.5 Relación entre tiempo de retención y el coeficiente de partición . .
1.6 Relación tiempo de retención y constante de distribución . . . . . .
1.7 Asimetrı́a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.8 Tipos de fuerzas que están presentes en un sistema cromatográfico
1.8.1 Interacciones iónicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.8.2 Fuerzas de enlaces de hidrógeno . . . . . . . . . . . . . . .
1.8.3 Fuerzas de repulsión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.8.4 Fuerzas de Van Der Walls . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.9 Bases fı́sicas de la cromatografı́a . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.9.1 Eficiencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.9.2 Ecuación de Van Deemter . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.10 Ejercicios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2 CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
2.1 Ventajas de la cromatografı́a en capa fina
2.2 Adsorbentes . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2.1 Proceso de adsorción . . . . . . . .
2.2.2 Adsorbentes utilizados . . . . . . .
2.3 Preparación de placas . . . . . . . . . . .
2.4 Aplicación de las muestras . . . . . . . . .
2.5 Elección del eluyente . . . . . . . . . . . .
2.6 Desarrollo de la cromatografı́a . . . . . . .
2.6.1 Evaluación de un cromatograma de
2.7 Localización de sustancias . . . . . . . . .
2.7.1 Método quı́mico . . . . . . . . . .
2.7.2 Método fı́sico . . . . . . . . . . . .
2.8 Constante Rf . . . . . . . . . . . . . . . .
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ii
E.Lans
3 CROMATOGRAFIA DE GAS
3.1 Cromatografı́a gas lı́quido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2 Fase móvil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3 Columnas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4 Columnas tubulares abiertas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4.1 Columnas tubulares abiertas de pared cubierta (WCOT) .
3.4.2 Columnas tubulares abiertas de soporte (SCOT) . . . .
3.4.3 Columnas tubulares abiertas de capa porosa (PLOT) . . .
3.5 Ventajas de las open tubular column . . . . . . . . . . . . . . . .
3.6 Fases estacionarias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.7 Escogencia de la fase estacionaria . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.8 Columnas empacadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.9 Columnas Preparativas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.10 Indice de retención . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.11 Programación de temperatura y presión . . . . . . . . . . . . . .
3.12 Carrier gas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.13 Inyección de la muestra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.13.1 Inyeción split . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.13.2 Inyección splitless . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.13.3 Inyección on column . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.14 Detectores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.15 Preparación de la muestra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.16 Selección del método en cromatografı́a de gas . . . . . . . . . . .
3.17 Escogencia del modo de inyección . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.18 Ejercicios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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4 ANALISIS CUANTITATIVO Y CUALITATIVO
4.1 Análisis cualitativo . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1.1 Co-Cromatografı́a . . . . . . . . . . . . . .
4.2 Análisis cuantitativo . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2.1 Método de normalización de área . . . . . .
4.3 Ejercicios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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5 ESPECTROMETRÍA DE MASAS
5.1 Cualidades de la espectrometrı́a de masas . . . . . .
5.1.1 Cualidades de indentificación y cuantificación
5.1.2 Cuantifica e identifica . . . . . . . . . . . . .
5.1.3 Sensibilidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.4 Universal y especı́fica . . . . . . . . . . . . .
5.1.5 Información estructural . . . . . . . . . . . .
5.1.6 Rapidez . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2 Tecnicas de ionización . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.1 Ionización por impacto electrónico (EI) . . .
5.2.2 Ionización quı́mica . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.3 Ionización Quı́mica negativa . . . . . . . . . .
5.2.4 Ionización por campo . . . . . . . . . . . . .
5.2.5 Fuentes de desorción . . . . . . . . . . . . . .
5.2.6 Desorción por campo . . . . . . . . . . . . . .
5.2.7 Bombardeo por Átomos Rápidos (FAB) . . .
5.2.8 Ionización electrospray . . . . . . . . . . . . .
5.3 Instrumentación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.3.1 Cámara de ionización . . . . . . . . . . . . .
5.3.2 Analizadores de masas . . . . . . . . . . . . .
5.4 Detectores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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Grupo de Investigación en Aguas, Pesticidas y Metales Pesados “GIAMP”
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6 CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
6.1 Proceso cromatográfico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.1.1 Efectos del tamaño de las partı́culas en HPLC . . . . . . . . . .
6.1.2 Columnas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.1.3 Columnas analı́ticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.1.4 Fase estacionaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.1.5 Proceso de elución . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.2 Clasificación de la cromatografı́a lı́quida . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.2.1 Cromatografı́a lı́quido - lı́quido o de partición . . . . . . . . . .
6.2.2 Cromatografı́a lı́quido-sólido o de adsorción . . . . . . . . . . . .
6.3 Cromatografı́a en fase reversa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.4 Cromatografı́a en fase normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.5 Cromatografı́a de adsorción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.5.1 Elección del solvente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.6 Gradiente de dilusión isocrática . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.7 Selección del modo de separación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.8 Solventes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.9 Criterios para una buena separación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.9.1 Atributos de una buena separación . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.10 Optimización con un solvente orgánico . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.11 Optimización con dos o tres solventes orgánicos . . . . . . . . . . . . . .
6.12 Temperatura como una variable en separaciones isocrática . . . . . . . .
6.12.1 ¿Como se consigue una buena separación? . . . . . . . . . . . . .
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41
41
42
42
42
42
43
43
43
43
43
43
45
45
45
45
46
46
46
47
47
47
5.5
5.6
5.4.1 Channeltron . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.4.2 Copa de faraday . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Métodos acoplados a masas . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.5.1 GC-MS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.5.2 ICP-MS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.5.3 LC-MS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.5.4 Espectrometrı́a de masas en tandem MS/MS . . .
Identificación de compuestos por espectrometrı́a de masas
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7 CROMATOGRAFÍA DE FLUÍDOS SUPERCRÍTICOS
7.1 Carácterı́sticas de un fluı́do supercrı́tico . . . . . . . . . . .
7.2 Analitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.3 Fase Móvil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.4 Cosolventes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.4.1 Fluı́dos usados para extracción supercrı́tica . . . . .
7.5 Forma e inyección de la muestra . . . . . . . . . . . . . . .
7.6 Columnas y fases estacionarias . . . . . . . . . . . . . . . .
7.7 Detectores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.8 Areas donde se utilizan los fluı́dos supercrı́tico . . . . . . .
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48
49
49
49
50
50
50
50
50
51
8 ELECTROFORÉSIS
8.1 Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.2 Electroforésis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.2.1 Tipos de electroforésis . . . . . . . . . . . .
8.2.2 Electroforésis convencional . . . . . . . . .
8.2.3 Electroforésis capilar . . . . . . . . . . . . .
8.2.4 Cambio de sentido del flujo electroosmótico
8.3 Instrumentación . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.3.1 Introducción de la muestra . . . . . . . . .
8.4 Sistema de detección . . . . . . . . . . . . . . . . .
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52
52
52
53
53
53
55
55
55
57
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iv
E.Lans
8.5
8.6
8.7
8.4.1 Métodos de absorbancia . . . . . . . . . . . .
Modalidades de la electroforésis capilar . . . . . . . .
8.5.1 Electroforésis capilar por zona (CZE) . . . .
8.5.2 Electroforésis capilar en gel (CGE) . . . . . .
8.5.3 Isotacoforesis capilar . . . . . . . . . . . . . .
8.5.4 Cromatografı́a capilar electrocinética miscelar
Enfoque isoeléctrico capilar(CIEF ) . . . . . . . . . .
Aplicaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Bibliografı́a
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(MECC)
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57
57
58
58
58
58
59
59
60
Lista de tablas
4.1
Normalización de área con factor de respuesta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.1
Temperatura crı́tica, presión crı́tica y punto de ebullición de algunos compuestos comunes 49
v
30
Capı́tulo 1
CROMATOGRAFIA
Ciencia y arte de separar los componentes de una mezcla. Estos componentes son transportados a
través de una fase estacionaria, por el flujo de una fase móvil, donde la fase móvil puede ser un lı́quido
o un gas.
Aunque esta es una definición fácilmente entendible en principio, puede presentar algunas limitaciones,
estas limitaciones se deben básicamente al desarrollo de la cromatografı́a de fluı́dos supercrı́ticos en la
década de los sesenta, donde la fase móvil no es ni un gas ni un lı́quido sino un fluı́do surpercrı́tico.
Por ello es mas conveniente relacionar la cromatografı́a como un método separativo y aceptar más
bien la definición dada por Guiddings que la define como un método de migración en zonas; esto con
el fin de aceptar los cambios que se puedan dar con el avance de las ciencias.
La IUPAC define la cromatografı́a como un método fı́sico de separación en el cual los componentes a
ser separados son distribuı́dos entre dos especies, una de las cuales es la fase estacionaria, mientras
que la otra se mueve en una dirección definida.
Las separaciones se basan en las diferencias de velocidad de migración entre los distintos componentes de la mezcla. La cromatografı́a, fué originalmente descrita por Tswett en el 1906. Tswett ideó
un método para separar pigmentos de plantas utilizando un tubo de vidrio lleno con CaCO3 ,agregó
un extracto de planta a la columna no sin antes lavarla con un solvente orgánico y observó que se
separaban diferentes bandas coloreadas en el interior de la columna. A la separación de bandas coloreadas le dió el nombre de cromatografı́a, de la palabra griega Chromatos que significa color.
En la figura 2.1 se muestra una solución que contiene una mezcla la cual se coloca sobre una columna
empacada con partı́culas sólidas y llenado con solvente. Vemos como los solutos que conforman la
mezcla fluyen hacia abajo de la columna a medida que se le agrega solvente fresco. De los distintos
solutos que conforman la mezcla el primero que eluye es el menos adsorbido por la fase estacionaria y
el que eluye de último es el más adsorbido por ésta, completándose ası́ la separación.
En general podemos decir que en la cromatografı́a no se incluyen separaciones que emplean campos
eléctricos para impulsar las moléculas con cargas de modo que se separen. Este tipo de métodos se
clasifican como electroseparaciones.
1.1
Clasificación de métodos cromatográficos
Los métodos cromatográficos son de dos tipos
1.1.1
Cromatografı́a en columna
La fase estacionaria está contenida en un tubo estrecho y se fuerza el paso de la fase móvil a través
del tubo ya sea a presión o gravedad
1.1.2
Cromatografı́a plana
La fase estacionaria está sostenida sobre una placa plana, o en los poros de un papel. Aquı́ la fase
móvil se desplaza a través de la fase estacionaria por capilaridad, o por efectos de la gravedad.
1
2
E.Lans
Figura 1.1: Cromatografı́a en columna
1.2
Clasifición de métodos
cromatográficos en columna
Los métodos cromatográficos se clasifican según la fase móvil, si esta es un gas se denomina cromatografı́a de gas, si es un lı́quido toma el nombre de cromatografı́a lı́quida y si es un fluı́do supercrı́tico
se le da el nombre de cromatografı́a de fluı́dos supercrı́ticos.
1.2.1
Cromatografı́a de Gases
Gas-Lı́quido: La fase estacionaria es un lı́quido y la fase móvil un gas. Gas-Sólido: Donde la fase
estacionaria es un sólido y la fase móvil es un gas.
1.2.2
Cromatografı́a lı́quida
Lı́quido-Lı́quido o de reparto: La fase estacionaria es un lı́quido. Lı́quido - Sólido: La fase
estacionaria es un sólido.
Intercambio iónico: La fase estacionaria es una resina de intercambio iónico.
Exclusión por tamaño: La fase estacionaria es un lı́quido en los intersticios de un sólido polimérico.
También es llamada permeación por gel. La cromatografı́a de permeación por gel es llamado también
filtración por gel, se utilizan materiales con un control del tamaño de los poros de la fase estacionaria.
Esta cromatografı́a se usa para separaciones preparativas de polı́meros sintéticos de alto peso molecular.
Afinidad: La fase estacionaria es un lı́quido con grupos especı́ficos unidos a una superficie sólida. Es
especialmente utilizada para el análisis de muestras biológicas.
En cromatografı́a por afinidad la fase estacionaria es un péptido o proteı́na las cuales tienen una
afinidad especı́fica por un analito en particular, se enlaza covalentemente a un ligando como un ácido
nucléico a una enzima. Sólo los analitos con una afinidad especı́fica por el ligando serán retenidos y
separados. La cromatografı́a por afinidad tiene gran aplicación en bioquı́mica, ya que pueden separar
proteı́nas.
1.2.3
Cromatografı́a de fluı́dos supercrı́ticos
Fase móvil es un fluı́do supercrı́tico.
Como se puede notar las diferentes clases de cromatografı́a se clasifican de acuerdo a la fase móvil,
como se dijo anteriormente.
Grupo de Investigación en Aguas, Pesticidas y Metales Pesados “GIAMP”
1.3
3
Algunos términos y ecuaciones
utilizados en cromatografı́a
Para tener un entendimiento mas preciso, sobre los procesos cromatográficos, se hace necesario que el
lector tenga claro algunos conceptos utilizados en cromatografı́a.
1.3.1
Resolución
El movimiento del soluto a través de la columna cromatográfica, se propaga en forma gausiana con
una desviación estándar de . La resolución de una columna es la medida cuantitativa de su capacidad
para separar los analitos presentes en una mezcla. Figura 1.2.
Entre más tiempo gasta un soluto pasando a través de la columna, mas ancha es la banda. Medidas
comunes al ensanchamiento de la banda son la anchura media del pico W1/2 , medida a la mitad de la
altura del pico y la anchura de la lı́nea base W. Figura 1.2.
La resolución está dada por las siguientes ecuaciones:
Rs =
tr
Vr
=
Wav
Wav
tr y Vr son las diferencias de tiempo de retención y volumen respectivamente entre picos y Wav
es el promedio de la anchura base de ambos picos en sus unidades correspondientes.
(tr )B (tr )A
WA + WB
Para análisis cuantitativo una resolución >de 1.5 es altamente deseada.
Rs = 2
Factores que afectan la resolución
La resolución de una columna se ve afectada por el número de plato teórico N, la retención relativa
0
y el factor de capacidad K como se observa en la siguiente ecuación:
!
!
p
0
N ↵ 1
K2
Rs =
0
4
↵
1 + Kav
Donde N es el número de platos teóricos en la columna, ↵ es la retención relativa de los dos picos,
0
K2 es el factor de capacidad para el componente más retenido y Kav es el promedio de los factores de
0
Figura 1.2: Curva gausiana ideal muestra como w y w1/2 son medidos. El valor de w es obtenido extrapolando
las tangentes en el punto de inflección de la linea base
.
4
E.Lans
Figura 1.3: Resolución de un cromatograma
p
capacidad para ambos picos. De la ecuación anterior se deduce que la resolución es proporcional
a N,
p
de tal modo que si doblamos la longitud de la columna, se incrementa la resolución en 2. Igualmente
0
podemos decir que la resolución se incrementa cuando aumenta ↵ y el factor de capacidad K2 . La
manera de cambiar la retención relativa es cambiando en cromatografı́a de gas la fase estacionaria y
en HPLC cambiando la fase estacionaria o fase móvil.
1.3.2
Difusión
Una causa del ensanchamiento de una banda es la difusión. Una banda del soluto se ensancha a medida
que se va moviendo a través de la columna. Figura1.4. El coeficiente de difusión mide la velocidad a
la cual una substancia se mueve aleatoriamente de una región de alta concentración a otra región de
baja concentración.
El número de moles que cruzan en un metro cuadrado por segundo, se llama flujo y es proporcional
al gradiente de concentración.
F =
mol
⌘J
m2 S
J=
D
dc
dx
La constante de proporcionalidad D es el coeficiente de difusión, y el signo negativo se debe a que el
flujo neto va de una región de alta concentración a otra de baja concentración.
Figura 1.4: Ensanchamiento de banda debido a la difusión
Grupo de Investigación en Aguas, Pesticidas y Metales Pesados “GIAMP”
5
Retención relativa o factor de selectividad: Es la retención de un compuesto con respecto a
otro, también la podemos denominar como velocidad de migración diferencial.
t,r2
t,r1
↵=
Entre mas grande el tiempo de retención relativa, mas grande es la separación entre componentes. La
retención relativa es independiente de la velocidad de flujo por lo que puede ser usado para identificar
picos cuando la velocidad de flujo cambia.
KB
KA
↵=
La especie B es mas fuertemente retenida que la especie A, por tanto, ↵ siempre va a ser mayor que
la unidad.
↵=
(tr )B
(tr )A
0
↵=
KB
0
KA
=
tm
tm
KB
KA
Altura de plato H : Es una medida de la eficiencia de una columna y viene dado por la ecuación :
L
N
Fase estacionaria: Material sólido en cuya superficie se enlazan las moléculas.
H=
Eluyente: Disolvente que se usa para transportar los componentes de una mezcla a través de una
fase estacionaria.
Eluato: Fase móvil que sale de la columna.
Cromatograma: Es una gráfica de alguna señal de la concentración de un soluto en función del
tiempo de elución o el volumen de elución.
0
Factor de capacidad (K ): Es un parámetro importante que con frecuencia se utiliza para describir
las velocidades de migración de los analitos en las columnas. Para una especie A:
0
K =
K A VS
VM
(1.1)
KA = constante de distribución de la especie A
VS = volumen de la fase estacionaria(analito)
VM = volumen del analito en la fase móvil
0
De un cromatograma se puede calcular K teniendo en cuenta las ecuaciónes 1.1,1.3, 1.4 y 1.5 ası́:
L
L
1
=
⇥
0
tr
tm 1 + K A
Reordenando tenemos:
6
E.Lans
0
KA =
tr
tm
tm
(1.2)
0
Con esta ecuación se puede calcular KA para un compuesto A desde un cromatograma.
0
Cuando el factor de capacidad K de una especie dada es menor que la unidad, es porque la elusion
0
es tan rápida que es difı́cil determinar con exactitud los tiempos de retención. Cuando K es del
orden de 20 a 30 o mayores, es porque los tiempos de retención son demasiado largos. Idealmente las
separaciones se realizan en unas condiciones en las que los factores de capacidad oscilan entre 1-5
Tiempo de retención:Tiempo que
transcurre después de la inyección de la muestra para que el pico del analito alcance el detector,
el tiempo de retención para una especie B viene dada por la siguiente ecuación:
16Rs2 H
(tr )B =
µ
↵
↵
1
!2
0
(1 + KB )3
0
(KB )2
Tiempo muerto: Tiempo para que la especie no retenida alcance al detector; es decir la velocidad de
migración de la especie no retenida coincide con la velocidad promedio del movimiento de las moléculas
de la fase móvil.
0
Tiempo de retención ajustado (tr ): Es la diferencia entre el tiempo de retención del analito y el
tiempo muerto.
0
t r = tr
tm
Para dos sustancias que se desea separar:
0
tr =
(tr )B
(tr )A
tm
tm
Número de Plato ( N):
Lo podemos definir como la medida cuantitativa de la eficiencia de una columna.
El número de plato teórico de una columna con longitud L es:
L
L
LX
LX
L2
16L2
N=
= 2 = 2 , si hacemos x = L ) 2 =
=
2
H
W2
W
ya que
x
W
16L2
=
)N=
4
W2
16
Si expresamos L y W en unidades de tiempo, en vez de longitud N serı́a adimensional; ası́ obtenemos la expresión mas útil para N
N = 16
tr
W
!2
Si usamos la achura de la altura media en vez de la base (figura 1.3), entonces
N = 5, 545
W1/2 = Anchura de la altura media del pico.
tr
W1/2
!2
Grupo de Investigación en Aguas, Pesticidas y Metales Pesados “GIAMP”
1.4
7
Velocidades de separación
La efectividad de una columna cromatográfica para separar dos analitos depende en parte de las
velocidades relativas con la que eluyen las dos especies. Estas velocidades están determinadas por la
magnitud de las constantes de los equilibrios de distribución de las especies entre las fases estacionaria
y móvil.
Cs
Cm
K = Constante, razón, o coeficiente de distribución.
Cs = Concentración molar del analito en la fase estacionaria.
Cm = Concentración molar del analito en la fase móvil.
Idealmente K debe ser constante en un amplio intervalo de concentraciones,o sea que Cs u Cm
K=
V̄ =
L
tr
(1.3)
donde V̄ = velocidad lineal media de migración del analito
L = Longitud de la columna
L
tm
µ = velocidad lineal media de las moléculas de la fase móvil
µ=
(1.4)
Entre más rápido es la velocidad lineal media de migración del analito ( flujo lineal), menos tiempo
gasta en la columna y menos ensanchamiento de banda ocurre debido a lo difusión longitudinal. Las
velocidades lineales de flujo en cromatografı́a de lı́quidos son significativamente menores que las que
se utilizan en cromatografı́a de gas.
0
Cuando el factor de capacidad K de una especie dada es menor que la unidad, es por que la elución
0
es tan rápida que es difı́cil determinar con exactitud los tiempos de retención. Cuando el K es del
orden de 20 a 30 o mayores,es porque los tiempos de retención son demasiado largos; idealmente las
separaciones se realizan en unas condiciones en las que los factores de capacidad oscilan entre 1-5. El
factor de capacidad K , para cada uno de los picos en un cromatograma está definido como:
0
K =
tr
tm
tm
Para verificar la eficiencia de una columna es bueno monitorear perı́odicamente midiendo el factor de
capacidad de un estándar, el número de platos y la asimetrı́a de los picos. Cambios en estos factores
reflejan degradación de la columna.
V̄ = µ ⇥
moles de analito en la fase móvil
moles totales de analito
V̄ = µ ⇥
1.5
1
VS
1 + KA
VM
(1.5)
Relación entre tiempo de retención y el coeficiente de partición
La definición del factor de capacidad es equivalente a decir:
0
K =
tsgf e
tsgf m
8
E.Lans
Donde tsgfe, tsgfm = tiempo del soluto gastado en la fase estacionaria y tiempo soluto gastado en
fase móvil respectivamente.
Si tenemos en cuenta la ecuación(1.4), podemos afirmar que:
0
Si el soluto gasta todo el tiempo en la fase móvil, entonces el factor de capacidad K = 0 por que
el tiempo de retención serı́a igual a tm .
Si el soluto gasta igual tiempo en la fase móvil y la fase estacionaria, entonces el tr = 2tm , por lo que
0
K =1
Si el soluto gasta tres veces más tiempo en la fase estacionaria que en la fase móvil, entonces el
0
tr = 4tm , ası́, K = 3
De lo anterior podemos deducir que habrá tres veces más moles de soluto en la fase estacionaria.
C s Vs
C m Vm
0
K =
Donde Cs es la concentración de soluto en la fase estacionaria, Vs volumen de la fase estacionaria, Cm ,
concentración de soluto en la fase móvil y Vm volumen en la fase móvil.
0
como K =
C s Vs
Cs
yK=
entonces,
C m Vm
Cm
0
K =K
0
como K =
tr
tm
tm
Vs
Vm
0
tr
=
tm
0
0
K =K
Vs
tr
=
V m tm
0
tr
K =
tm
0
1.6
Relación entre el tiempo de retención y la constantes de distribución
V̄ = µ ⇥ fracción de tiempo que el analito reside en la fase móvil
V̄ = µ ⇥
C m Vm
=µ⇥
C m Vm + C s V s
V̄ = µ ⇥
1
1+
KVs
Vm
Como
0
KA =
K A Vs
Vm
entonces:
V̄ = µ ⇥
1
0
1 + KA
1
1+
C s Vs
C m Vm
Grupo de Investigación en Aguas, Pesticidas y Metales Pesados “GIAMP”
1.7
9
Asimetrı́a
La asimetrı́a de un pico puede tener distintas causas: Aplicación de un exceso de analito, error en la
técnica de inyección o columna degradada.
Picos no simétricos generalmente indican que interacciones no deseadas han ocurrido durante el proceso
cromatográfico.
Picos anchos son comunes en columnas empacadas,indicando que la cinética de la transferencia de
masas es demasiado lenta.
En algunas aplicaciones con columnas empacadas poco se puede hacer al respecto, sin embargo, el
objetivo del cromatografista es lograr unos picos estrechos tanto como sea posible, para lograr mejores
separaciones.
La simetrı́a de los picos se puede clasificar como Tailing o Fronting dependiendo de la localización de
la asimetrı́a. El alcance de la asimetrı́a es definido como Tailing Factor (TF).
b
(1.6)
a
Tanto a como b son medidos sobre el 10% de la altura del pico. Figura 1.5 en la página 9. De
acuerdo a la ecuación (1.6) un pico con tailing tendrı́a un TF mayor que la unidad, y un pico con
fronting su TF es menor que la unidad. Todos los picos que necesiten ser medidos deben ser simétricos
con un TF en el rango de 0,9 a 1,5.
TF =
1.8
Tipos de fuerzas que están presentes en un sistema cromatográfico
En un sistema cromatográfico existen varios tipos de interacciones, a saber:
1. Interacciones iónicas
2. Enlaces de hidrógeno
3. Repulsión
4. Van Der Walls
1.8.1
Interacciones iónicas
Ocurren entre el soluto y una fase o ambas, cuando tienen cargas permanentes. Este tipo de interacciones me da la cromatografı́a iónica, que resulta de la interacción entre los iónes de soluto y los iones
de la fase estacionaria.
Figura 1.5: Asimetrı́a de un pico cromatográfico
10
E.Lans
1.8.2
Fuerzas de enlaces de hidrógeno
Ocurren entre moléculas que tienen el hidrógeno unido a un pequeño átomo bastante electronegativo
como los alcoholes, aminas y agua los cuales pueden ser donores o aceptores de protones. Los ésteres,
aldehı́dos, cetonas y éteres solo pueden ser aceptores de protones y forman enlace de hidrógeno con
compuestos donores de protones
1.8.3
Fuerzas de repulsión
Las fuerzas de repulsión se dan entre cargas iguales, la energı́a de orientación aumenta con forme
aumenta el momento dipolar.
1.8.4
Fuerzas de Van Der Walls
Las fuerzas de Van Der Walls son de tres tipos:
1. Orientación o Keesom. Se dan entre moléculas con dipolo permanente.
2. Inducción o Debye. Dipolo inducido-dipolo
3. Dispersión o London. Dipolo inducido-dipolo inducido
Las fuerzas de London son débiles y se dan entre moléculas simétricas ej: SO3 , SO2 , O2 , N2 , Br2
etc. ocurren entre una fase y el soluto donde ambas son neutros o polarizables.
1.9
Bases fı́sicas de la cromatografı́a
Entre más grande la razón de los coeficientes de partición, mas grande es la separación entre los
componentes de una mezcla. La ecuacion(1.5) relaciona el tiempo de retención, coeficiente de partición
0
0
y factor de capacidad del sistema cromatográfico. Debido a que tr , ↵K ↵K la retención relativa (↵)
puede ser expresada como:
0
t,r2 Kr2 K2
↵= , = 0 =
tr1 Kr1 K1
1.9.1
Eficiencia
Existen dos factores que contribuyen a la eficiencia de una separación.
1-La diferencia del tiempo de elución entre picos, entre mas grande es esta diferencia mejor la separación.
2-El ancho de los picos. Entre mas ancho sean los picos mas pobre es la separación.
La eficiencia de una columna se mide por la altura de plato H. El nombre proviene de la teorı́a de la
destilación, en la cual la separación puede ser llevada a cabo en escalones discretos llamados Altura
equivalente o un plato teórico.
El ensanchamiento de banda (ancho de los picos)también se produce como consecuencia de la velocidad finita con la que ocurren los distintos procesos de transferencia de masa durante
p la migración de
una especie a lo largo de la columna. La desviación estándar de una banda = 2Dt.
De donde D = coeficiente de difusión
t = tiempo
m
Si un soluto viaja a una distancia x a una velocidad de flujo lineal
= µx el tiempo que gasta este
s
x
al viajar por una columna serı́a: t = , por lo tanto:
µx
Grupo de Investigación en Aguas, Pesticidas y Metales Pesados “GIAMP”
2
= 2D
x
2D
2D
=
x, si
=H)
µx
µx
µx
2
11
= Hx
2
H=
x
Del análisis anterior podemos concluir que la altura de plato es la constante de proporcionalidad entre
la varianza 2 de la banda y la distancia (x) que ha viajado. Fı́sicamente NO EXISTEN estos platos
en cromatografı́a, de tal manera que uno debe considerar la altura de plato como un término que
relaciona el ancho de una banda con la distancia recorrida en una columna. La altura de plato H es
proporcional a la varianza de una banda cromatográfica. Cuanto mas pequeño es la altura de plato
mas estrecho es el ancho de una banda.
La capacidad que tiene una columna para separar una mezcla de componentes es mejorada por la
disminución en la altura de plato.
Diferentes solutos que pasan a través de una misma columna, tienen diferentes alturas de plato,
por que ellos tienen diferentes coeficientes de difusión.
Las alturas de platos en cromatografı́a de gas son aproximadamente de 0,1 a 1mm, en HPLC
⇠ 10µm y < 1µm en electroforésis capilar.
La altura de plato; donde es la desviación estándar de la curva gausiana y x es la distancia que viaja
a través de la columna.
1.9.2
Ecuación de Van Deemter
La ecuación de Van Deemter nos dice como la columna y la velocidad de flujo afecta la altura de plato.
La eficacia de las columnas cromatográfica pueden evaluarse por la ecuación 1.7
B
+ Cux
(1.7)
µx
H= altura de plato en cm A= término de los múltiples pasos, factor de tortuosidad, o difusión de
Eddy. Cux = término de transferencia de masas, es decir tiempo finito requerido para que el soluto
alcance el equilibrio entre la fase móvil y la fase estacionaria.
cm
µx = velocidad lineal de la fase móvil
.
s
B = difusión longitudinal.
H ⇡A+
La altura de plato debido al término de transferencia de masa es:
0
K d2 ⇥ µx
H=
u Cux
(K 0 + 1)2 D
0
K = factor de capacidad
d = espesor de la fase estacionaria
D = coeficiente de difusión del soluto en la fase estacionaria.
La altura de plato es reducida con el término de transferencia de masas disminuyendo el espesor de
la fase estacionaria y aumentando la temperatura, ya que ası́ se aumenta el coeficiente de difusión del
soluto en la fase estacionaria. Las alturas de plato en cromatografı́a lı́quida son un orden de magnitud
menores que las que se encuentran en cromatografı́a de gas; sin embargo en cromatografı́a lı́quida el
largo de las columnas no son mayores de 25 a 50 cm, ya que no se puede mantener la alta presión a
longitudes mas grandes; cosa que no ocurre en cromatografı́a de gas. Ası́ vemos que ésta contraresta
la longitud de la columna en cromatografá de gas. Dado que en cromatogrfı́a de gas las columnas
pueden alcanzar hasta 50 m de longitud, la H es mayor con frecuencia en cromatografı́a de gas.
La expresión 1.7 es llamada ecuación de Van Deemter la cual se usa para tratar de explicar las
complejas interacciones fı́sicas y los efectos que conducen al ensanchamiento de banda.
12
E.Lans
Si cambiamos la columna y la fase estacionaria cambian tambien los valores de A, B y C. Según
la ecuación de Van Deemter hay mecanismos de ensanchamiento de la banda que son proporcional, e
inversamente proporcional e independiente a la velocidad de flujo. Figura 1.6
En las columnas empacadas todos los tres términos contribuyen al ensanchamiento de banda. Para
las columnas open tubular el término A es 0, de modo que el ancho de banda disminuye, aumentando
por tanto la resolución. Cuando la altura de plato es mas pequeña, más estrecha es la banda; ası́ que
la ecuación de Van Deemter nos dice como afecta la velocidad de flujo y la columna la altura de plato.
En electroforésis capilar tanto el término A como el C son 0 disminuyendo la altura de plato a
valores considerablemente bajos hasta niveles de micrómetros produciendo un poder extraordinario
de separación.
Una gráfica de Cs versus Cm (a una temperatura dada) es llamada isoterma. Figura 1.7
En la figura 1.7 la isoterma de la izquierda ocurre cuando ha sido agregado demasiado soluto a
la columna, sobrecargándola. Cuando la concentración del soluto se incrementa es porque el soluto
es mas soluble en la fase estacionaria ; hay tanto soluto en la fase estacionaria que ésta tiende a
parecerse al soluto.(semejante disuelve semejante). Una cola surge cuando algunos sitios de la fase
estacionaria retienen soluto mas fuertemente que otros. En cromatografı́a se pueden presentar a
menudo cromatogramas con picos no muy bien definidos, presentándose picos con cola, como se puede
ver en la parte inferior de la figura 1.7 La isoterma de abajo en la figura ocurre cuando pequeñas
cantidades de soluto son retenidas mas fuertemente que cantidades grandes.
Como se dijo anteriormente, sitios que retienen solutos fuertemente causan cola ; ası́ los grupos
hidróxilos que forman enlaces de hidrógenos con solutos polares producen colas muy marcadas. La
silanización reduce las colas porque bloquean a los grupos hidroxilos con otros grupos no polares, como
el trimetilsilil. Figura 1.8
Las columnas de vidrio o de sı́lice usadas en cromatografı́a de gas o lı́quida también se pueden
silanizar para minimizar la interacción del soluto con los puntos activos de la columna.
1.10
Ejercicios
1. Considere un experimento cromatográfico en la cual dos componentes con factores de capacidad
de 4,0 y 5,0 respectivamente, son inyectados en una columna con 1 ⇥ 103 platos teóricos. El
tiempo de retención para el compuesto menos retenido es tr1 = 10,0 min.
a)Calcular el tm y tr2
b) Encontrar W1/2 y W
c)Calcular la resolución de los dos picos.
Rta.
a)tm = 2 min.; tr2 = 12 min.
b)w2 = 1, 52 min. ;W1 = 1, 26;w1/2 pico 1 = 0, 74;w1/2 pico 2 = 0,89
c) Resolución = 1,44
2. La retención relativa de dos compuestos en cromatografı́a de gas es 1,068 en una columna con
una altura de pico de 0,520 mm. El factor de capacidad para el compuesto 1 es 5,16.
a)¿Cual serı́a la longitud de la columna requerida para separar los compuestos con una resolución
de 1?
b) El tiempo de retención para el aire en la columna(a) es de 2.0 min. Si el número de platos
es el mismo para ambos compuestos. Encontrar los tiempos de retención y la anchura de cada
uno de los picos.
c) Si la razón fase estacionaria fase móvil es 0,30, encontrar el coeficiente de partición para el
componente 1.
Grupo de Investigación en Aguas, Pesticidas y Metales Pesados “GIAMP”
Figura 1.6: Aplicación de la ecuación de Van Deemter en cromatografı́a de gas
Figura 1.7: Isotermas comunes y formas de las bandas
Figura 1.8: Silanización
13
14
E.Lans
Rta.
a) L = 2,71 m
b) tr1 = 12, 32 min. ; tr2 = 13, 02 min. ; W1 = 0, 68 min. ; W2 = 0, 72 min.
c) K = 17
3. Las áreas de picos obtenidas por cromatografı́a de gases para una mezcla de acetato de metilo,
propionato de metilo y n-butirato de metilo fueron 17.6, 44.7 y 31.1 respectivamente.Calcular
el porcentaje de cada compuesto si las respectivas respuestas de detección relativa fueron 0.65,
0.83 y 0.92
Capı́tulo 2
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
La cromatografı́a en capa fina se basa en la preparación de una capa uniforme de un adsorbente
mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos esenciales para la cromatografı́a
en capa fina son : un adsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante la
extensión, otro para aplicar el adsorbente y una cámara en la que se desarrolla la cromatografı́a. La
fase móvil es lı́quida y la fase estacionaria un sólido.
La fase estacionaria será un componente polar y el eluyente será por lo general menos polar que la
fase estacionaria, de modo que los solventes que se desplacen con mayor velocidad serán menos polares
figura 2.1. Durante décadas se ha perfeccionado esta técnica hasta tal punto que hoy dı́a existe la
cromatografı́a en capa fina de alta eficiencia ” HPTLC ” la cual se basa en la utilización de un
adsorbente con un tamaño de partı́culas mucho menor 5 a 17 µm que el que se utilizarı́a normalmente,
lo cual implica el uso de un volumen de muestra mas pequeño. El uso de silica gel refinada con
tamaño de partı́cula de 5 µm ha contribuido al desarrollo de la HPTLC. En los actuales momentos se
ha desarrollado buena instrumentación, hasta tal punto que se puede aplicar la muestra automática;
por ello es considerada una herramienta indispensable en el control de calidad y en laboratorios de
investigación. La técnica es fácil de aprender, rápida, versátil y en muchas ocasiones puede ser preferida
a las técnicas de GC y HPLC.
2.1
Ventajas de la cromatografı́a en capa fina
1. La instrumentación utilizada es mas simple.
2. El tiempo para conseguir las separaciones es mucho menor.
3. El método es simple y los resultados son reproducibles, lo que la hace un método adecuado para
fines analı́ticos.
Figura 2.1: Placa cromatográfica
15
16
E.Lans
2.2
Adsorbentes
Al elegir un adsorbente se debe tener en cuenta el tamaño de las partı́culas. Cuanto más finamente
dividido esté, mayor será su adhesión al soporte.
2.2.1
Proceso de adsorción
La muestra aplicada en la capa, es adsorbida en la superficie del material por la acción de fuerzas
electrostáticas (fuerzas de Van Der Waals). Luego cuando la placa es expuesta a un flujo por acción
capilar, se inicia una competencia de enlaces entre sitios activos del adsorbente y la sustancia con el
solvente. Es decir, la sustancia y el solvente compiten por lo sitios activos del adsorbente.
2.2.2
Adsorbentes utilizados
Los adsorbentes más utilizados son la celulosa, el almidón, los azucares, sı́lica gel, oxido de aluminio
(alúmina) entre otros.
Los tres primeros se utilizan para extraer componentes polifuncionales de plantas y animales.
2.3
Preparación de placas
Para la preparación de las placas se sigue el siguiente procedimiento:
• Mezclar en un erlenmeyer el agua y el adsorbente
• Agitar fuertemente
• Extender la muestra sobre el soporte de vidrio
• Hacer oscilar la mezcla de un lado para otro
El espesor de la placa suele ser de 0.1 a 0,2 mm para separaciones analı́ticas. La placa debe quedar
libre de grumos y rugosidades que afectarı́an el desarrollo del proceso cromatográfico. Las placas se
dejan en reposo un corto tiempo después de cubrirlas; luego se colocan en bandejas metálicas. En este
momento se puede activar el adsorbente, bien dejando las placas reposar toda la noche a temperatura
ambiente, o calentándola durante 30-60 minutos a 105-110 grados Celsius, para ası́ expulsar el aire.
2.4
Aplicación de las muestras
Los productos a examinar se disolverán, cuando sea posible en un disolvente orgánico no polar que
tenga un punto de ebullición lo suficientemente bajo para que se evapore después de su aplicación.
Para sembrar la muestra se utilizan micropipetas o un tubo capilar. El proceso de siembra se hace
tocando con la punta del capilar la placa preparada dejando una distancia al borde inferior de un
centı́metro aproximadamente. El punto de aplicación de la muestra se denomina toque. Una vez
colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente, de forma que en la placa sólo quedará la
muestra a analizar.
2.5
Elección del eluyente
La elección del eluyente dependerá lógicamente del componente que se va a separar y del material en
que la separación se llevará a cabo. Entre los principales eluyentes en orden creciente de polaridad
tenemos: Eter de petróleo, éter dietĺico, ciclohexano, acetato de etilo, tetracloruro de carbono, piridina,
benceno, etanol, cloroformo, metanol, diclorometano, agua y ácido acético.
Entre los factores para la elección del eluyente se encuentran: Precio, pureza, no utilizar mezclas de
eluyente,no utilizar compuestos muy volátiles, evitar que contengan trazas de metales (catalizadores)
La elección del eluyente se realiza de forma empı́rica. Hay que estudiar la polaridad del componente
y probar con eluyentes cada vez mas polares hasta dar con el más apropiado.
Grupo de Investigación “GIAMP”
17
Otra técnica para realizar consiste en sembrar varias muestras distanciadas suficientemente y
aplicar con un tubo capilar distintos eluyentes sobre el centro de cada muestra. Esto permite desarrollar
cada eluyente radialmente por capilaridad, de tal forma que se aprecie el eluyente con el cual la
separación se realiza de una manera eficaz. Figura 2.2
2.6
Desarrollo de la cromatografı́a
El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente por el método ascendente, esto
es, al permitir que un eluyente ascienda por una placa casi vertical, por la acción de la capilaridad.
Generalmente el eluyente se introduce en una cámara una hora antes del desarrollo para permitir
la saturación de la atmósfera. El tiempo de desarrollo, por lo general no llega a los 30 minutos.
Figura 2.3 Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado, o hasta que se alcance una
lı́nea dibujada a una distancia fija desde el origen. Esto se hace para estandarizar los valores de Rf.
Frecuentemente esta distancia es de 10 cms.
La mejor posición de desarrollo para un componente es el punto medio entre el origen y el frente
del eluyente ya que permite separar las impurezas que se desplazan con mayor o menor velocidad.
2.6.1
Evaluación de un cromatograma de capa fina
Para llevar a cabo una evaluación de un cromatograma en capa fina se puede realizar por análisis
cualitativo y análisis cuantitativo.
Análisis cualitativo:
• Medida de Rf
• Comparación visual de color/intensidad.
Análisis cuantitativo: Comparación visual del diámetro y la intensidad del color de la mancha
contra una serie de manchas patrones de concentración conocida.
2.7
Localización de sustancias
Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posición de dichos compuestos.
Para ello existen dos métodos: Método quı́mico y Método fı́sico.
2.7.1
Método quı́mico
Consisten en realizar una reacción quı́mica entre un reactivo revelador y los componentes separados.
Para ello se atomiza la placa con los reactivos reveladores con la ayuda de un atomizador. Si el
reactivo atomizador es muy corrosivo o peligroso, la atomización deberá hacerse en una vitrina de
gases. Como reactivo revelador generalmente se utiliza yodo, el cual forma complejos coloreados con
los componentes orgánicos (con tonos amarillo-marrón) pero las manchas desaparecen con el tiempo
por lo que es conveniente señalar las manchas aparecidas.
Otro reactivo revelador bastante utilizado es el ácido sulfúrico, que reacciona con los componentes
orgánicos produciendo manchas negras. El tamaño de las manchas no está relacionado con la cantidad
de componente separado.
2.7.2
Método fı́sico
El más común consiste en añadir al adsorbente un indicador fluorescente de tal manera que al colocar
la placa bajo una lámpara ultravioleta, y dependiendo del indicador y la longitud de onda aparecen
manchas fluorescentes en las zonas en las que hay componentes.
Los compuestos que poseen fluorescencia se pueden detectar directamente bajo la luz ultravioleta.
18
E.Lans
Figura 2.2: Siembra de la muestra en una placa cromatográfica
Figura 2.3: Placa cromatográfica
Grupo de Investigación “GIAMP”
2.8
19
Constante Rf
La constante Rf (ratio of front) es simplemente una manera de expresar la posición de un compuesto
sobre una placa como una fracción decimal, mide la retención de un componente. Se define como:
Rf =
X
f
⇥ = distancia recorrida desde el origen por el compuesto de interes.
f = distancia recorrida por el frente del solvente.
La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el toque hasta el centro de
la mancha. y la distancia recorrida por el frente del solvente se mide desde el toque hast el final del
proceso cromatografico(frente del solvente). Figura ( ) Para que los Rf sean reproducibles se deben
fijar una serie de condiciones tales como espesor de la pelı́cula, fase estacionaria, fase móvil y cantidad
de muestra.
Para averiguar si dos compuestos son iguales, se colocan ambos sobre la misma placa y se desarrolla
con varios eluyentes. Una vez desarrollados se calculan los Rf, y si son distintos puede decirse con
toda seguridad que no se trata del mismo compuesto.
Si se sospecha que dos compuestos son muy parecidos se eluyen sobre la misma placa con el mismo
eluyente, u otros de menor polaridad, hasta apreciar una separación mı́nima.
Capı́tulo 3
CROMATOGRAFIA DE GAS
En cromatografı́a de gas el analito es transportado a través de la columna por una fase móvil gaseosa
llamada Carrier gas o gas soporte.
3.1
Cromatografı́a gas lı́quido
Llamada también de partición, la fase estacionaria es un lı́quido no volátil que cubre la parte interna
de la columna, o está sobre un soporte sólido.
3.2
Fase móvil
En cromatografı́a de gas la fase móvil es un gas generalmente He, N2 , o H2 y la fase estacionaria es
generalmente un liquido no volátil y algunas veces un sólido. El analito debe estar en forma gaseosa
o como un lı́quido volátil
La columna debe estar lo suficientemente caliente para proveer presión de vapor del analito y
pueda ser eluı́do en un tiempo razonable. El detector es mantenido a una temperatura mas alta que
la columna ası́ que todos los analitos serán gaseosos.
3.3
Columnas
Existen tres tipos de columnas en cromatogrfı́a de gas, las tubulares abiertas llamadas también open
tubular column y las empacadas y preparativas. Aqui es necesario mantener la columna a elevadas
temperaturas durante la corrida para evitar la consdesación de los componentes. Las columnas en
cromatografia de gas pueden alcanzar longitudes desde 2 a 300 pies. La idea de columnas grandes es
que haya mas interacción entre los componentes de la mezcla, la fase estacionaria y fase movil, lo que
permite una mejor separacioón. Por ejemplo, una columna de 12 pies tiene mas poder de resolución
que una de 6 pies simplemente porque los compomentes de la mezcla tiene interacción con las dos
fases. (John.Kenkel 2014)
Figura 3.1: Diagrama esquemático de un cromatógrafo de gas
20
Grupo de Investigación “GIAMP”
3.4
21
Columnas tubulares abiertas
La mayorı́a de los análisis usan open tubular column, largas y estrechas hechas de sı́lica fundida (SiO2 )
y revestida con poliamida (un plástico capaz de resistir hasta 350 o C) para soporte y protección de
la humedad atmosférica. El diámetro interno de las columnas esta entre 0.10–0.53 mm y la longitud
de 15–100 m.
3.4.1
Columnas tubulares abiertas de pared cubierta (WCOT)
Caracterı́sticas:El espesor de la pelı́cula de la fase estacionaria en el interior de la columna está
entre 0.1–5µm. Disminuyendo el espesor de la pelı́cula de la fase estacionaria aumenta la resolución,
disminuye el tiempo de retención y disminuye la cantidad de muestra. La fase estacionaria esta
adherida a las paredes internas de la columna.
3.4.2
Columnas tubulares abiertas de soporte (SCOT)
Caracterı́sticas:Partı́culas sólidas con la fase estacionaria liquida están adheridas a las paredes internas de la columna.
3.4.3
Columnas tubulares abiertas de capa porosa (PLOT)
Caracterı́sticas:La fase estacionaria sólida está unida a las paredes internas de la columna. Para
aumentar el área de contacto se tratan las paredes de la columna con HF, luego se deposita allá la fase
estacionaria. La eficiencia de las SCOT es intermedia entre las WCOT y las columnas empacadas.
3.5
Ventajas de las open tubular column
Comparadas con las columnas empacadas las open tubular ofrecen:alta resolución,tiempo de análisis
mas cortos,gran sensibilidad y mas baja capacidad de muestra.
Las narrow open tubular column ofrecen mas alta resolución que las wider open tubular pero requieren
mas alta presión para operar y tienen menos capacidad de muestra.
3.6
Fases estacionarias
Clases de fases estacionarias
Hoy dia existen muchos clases de fases estacionarias, entre las cuales podemos mencionar:
• (Diphenyl)x(dimethyl)1-x polysiloxane.
• (Cyanopropylphenyl)0.14(dimethyl)0.86 polysiloxane: Polaridad intermedia.
• Carbowax (poly(ethyleneglycol) :Fuertemente polar.
• (biscyanopropyl)0.9((cyanopropylphenyl)0.1 polysiloxane: Fuerte polaridad.
3.7
Escogencia de la fase estacionaria
La escogencia de una fase estacionaria dada para un problema dado se basa en la regla: semejante
disuelve semejante. Columnas no polares son mejores para solutos no polares las de polaridad intermedia son mejores para solutos de polaridad intermedia. Advertencia:Las altas temperaturas y
la exposición al oxı́geno causan degradación de la columna y producen cola en los cromatogramas.
Entre sólidos usados para columnas PLOT tenemos alúmina Al2 O3 la cual es una fase estacionaria que
separa hidrocarburos en cromatografı́a de adsorción gas sólido. Para evitar daños a las columnas por
impurezas de los gases, éstos deben ser secados utilizando trampas que contienen Mallas Moleculares
22
E.Lans
ya que el agua es fuertemente retenida por éstas. Las mayas moleculares son materiales inorgánicos
o polı́meros orgánicos con grandes cavidades dentro de las cuales pequeñas moléculas entran y son
parcialmente retenidas. Moléculas, tales como H2 , O2 , CO2 , CH4 pueden ser separadas una de otras.
Las mallas inorgánicas pueden ser regeneradas calentando a 300o C al vacı́o o bajo flujo de N2 .
3.8
Columnas empacadas
Contienen un soporte sólido finamente dividio o un lı́quido no volátil como fase estacionaria o sólo
el soporte sólido puede actuar como fase estacionaria. Una limitación de estas columnas es que no
pueden alcanzar mas de 20 pies de longitud, lo que significa que su poder de resolucion se vé seriamente
afectado. La fuerza de la presión del cindro de gas no es suficiente para arrastrar la fase móvil a través
de la columna para longitudes superiores a 20 pies. Con esta longitud no se pueden llevar a cabo
separaciones mas complejas en la cromatografá de gas. Las columnas son generalmente hechas de
acero inoxidable, nı́kel o vidrio. El diámetro interno es de 3 - 6 mm y la longitud es de 5 y 20 cm, el
soporte sólido a menudo es de diatomea que es silanizado.
En las columnas empacadas el tamaño uniforme de las partı́culas disminuye el termino de múltiples
caminos (A) en la ecuación de VAN DEEMTER reduciendo ası́ la altura de plato y aumentando por
ende la resolución.
El pequeño tamaño de las partı́culas disminuye el tiempo requerido para que el soluto alcance el
equilibrio mejorando la eficiencia de la columna, sin embargo entre mas pequeño es el tamaño de las
partı́culas se requiere mas presión para que la fase móvil pase a través de la columna.
El tamaño de las partı́culas se expresa en micrómetros o tamaños MESH esto se refiere al tamaño
del tamiz a través del cual las partı́culas son pasadas o retenidas. Una partı́cula de 100/200 mesh pasa
a través de un tamiz de 100 mesh pero no a través de uno de 200. Es decir el mesh da la apertura por
pulgada lineal del tamiz.
3.9
Columnas Preparativas
Las columnas preparativas son usadas cuando el propósito del experimento es preparar una muestra
pura o una sustancia en particular por GC para usar en otro trabajo de laboratorio. Aunque las
columnas analiticas son útiles para esto, la cantidad de sustancia que se consigue es muy pequeña
debido a que la cantidad colectada proviene de volumenes extremadamente pequeños procedente de
la inyección. Para hacer trabajos preparativos se requieren columnas con diamentros mas grandes
para poder inyectar volumenes en el orden de los mililitros. El detector utilizado no debe destruir la
muestra, como el detector de ionización de llama lo hace. Para este tipo de trabajo el detector mas
usado es el de conductividad térmica.
3.10
Indice de retención
Los ı́ndices de retención de Kovats (I) para alcanos es igual a 100 veces el número de átomos de
carbono. Para el octano el (I) es de 800 para el nonano es de 900.
3.11
Programación de temperatura y presión
En la programación de la temperatura, la temperatura de la columna es subida durante la separación
para incrementar la presión de vapor de soluto y disminuir el tiempo de retención de los compuestos
eluı́dos.
A temperatura constante en una mezcla los compuestos más volátiles pueden emerger juntos y los
menos volátiles pueden aún no ser eluı́dos.
Si la temperatura es incrementada de 50 a 250 o C a una velocidad de 8 o C/min, todos los compuestos son eluı́dos y la separación de los picos son uniformes. Hay que evitar subir la temperatura
Grupo de Investigación “GIAMP”
23
demasiado para prevenir descomposición térmica del analito o la fase estacionaria.
La programación de la presión es útil para analitos lábiles que no puedan tolerar altas temperaturas.
3.12
Carrier gas
La eficiencia de la columna y el detector depende de la identidad del gas soporte.
El He, N2 , H2 dan alturas de plato óptimos a una velocidad de flujo diferente. (ver curva de van
deemter).xxxxxxx
Entre más rápidamente un soluto se difunde entre las fases, mas pequeños es la transferencia de
masa, termino Cu en la ecuación de van deempter. Ecuación 1.7.
Para la eficiencia de la columna y la velocidad de análisis el H2 es un buen gas soporte. El H2
puede reaccionar catalı́ticamente con compuestos insaturados sobre superficies metálicas.
Las impurezas en el carrier gas degradan la fase estacionaria.
Se deben usar gases de alta calidad y aún ası́ estos deben pasarse a través de filtros para remover
el oxı́geno , agua y trazas de compuestos orgánicos antes de que estos entren a la columna.
3.13
Inyección de la muestra
Los lı́quidos son inyectados con una jeringa a través de un serpentı́n de caucho pasando por el glass
liner silanizado donde. El gas soporte barre la muestra vaporizada desde el puerto de inyección hacia
la columna cromatográfica. El volumen de inyección es tı́picamente 0,1 - 2 µL de muestra.
La muestra descompuesta y componentes no volátiles lentamente se acumulan en el glass linner el
cual debe ser reemplazado periódicamente.
3.13.1
Inyeción split
Medio de introducir pequeños volúmenes de muestra en columnas open tubular. Este modo se utiliza
si el analito de interés constituye mas del 0.1% de la muestra . Para trabajos de alta resolución,
los mejores resultados son obtenidos con este modo de introducción de la muestra, preferiblemente
conteniendo menor o igual a 1.0 ng de cada uno de los componentes.
Una inyección split libera solamente 0,2 -2% de la muestra en la columna.
3.13.2
Inyección splitless
Modo de inyección preferido para análisis a nivel de trazas, el analito constituye menos del 0,01% en
la muestra.
La temperatura de inyección para el modo splitless es mas bajo que para el modo split, aprox 220
o C por que la muestra gasta mucho mas tiempo en el puerto de inyección y no queremos que ocurra
descomposición térrmica. El tiempo de residencia en el glass liner es aprox de 1 min por que el gas
soporte fluye a través del liner a la columna con una velocidad de flujo aprox 1 mil/min. En este modo
el 80% de la muestra entra a la columna. Es mejor a niveles de trazas para solutos de alta ebullición
en solventes de baja ebullición. Figura 3.2
3.13.3
Inyección on column
Se usa para solutos térmicamente inestables, y solventes con alto punto de ebullición. Es mejor para
análisis cuantitativos que la inyeción split/ splitless. La solución es inyectada directamente en la
columna. En este procedimiento la muestra es sometida a la mas baja temperatura posible para
evitar la perdida de soluto.
24
E.Lans
Figura 3.2: Inyección split/splitless
3.14
Detectores
Un detector no identifica que está eluyendo de la columna, sino que algo está emergiendo de ella.
Existen muchas clases de detectores, entre los mas comunes tenemos:
Detector de ionización por llama (FID)
Es un detector universal ya que responde a todos los compuestos organicos, entre sus caracterı́sticas se
encuentran: Sensibilidad, estabilidad, excelente rango lineal, fácil operación, mantenimiento y amplia
aplicabilidad. Todos estos detalles lo hacen el más popular de los detectores en cromatografı́a de gas.
Figura3.3. (McNair & Miller 1998)
Principios: Se aplica un voltaje a la boquilla de la llama y al colector. El carrier gas que sale de
la columna es mezclado con hidrógeno y quemado en la punta de la boquilla, luego se aplica oxı́geno
como una mezcla de aire en la cámara de combustión para asegurar la eficiencia de la ionización del
efluente de la columna. Esta combustión genera iones. El movimiento de estos iones desde la llama
al colector cargado positivamente produce una pequeña corriente, estando presente siempre una señal
de fondo. Al introducir un compuesto orgánico en la llama produce unos iones que incrementa la
corriente de base. FIGURA Esta señal es procesada por el registrador en un correspondiente pico
cromatográfico.
Detector captura de electrones (ECD)
Es un detector de ionización que es especı́fico para compuestos que capturan electrones. Es usado
para análisis de compuestos halogenados debido a la sensibilidad extrema para estos compuestos.
Principios:Una fuente de electrones de una fuente radiactiva Ni63 es usado para bombardear el
efluente de la columna pasando a través de la celda del detector. El make up gas es ionizado por los
electrones libres de la fuente, produciéndose un plasma que contiene entre otras especies electrones
térmicos. Se aplica una diferencia de potencial a la celda del detector, el cual permite la captura de
Figura 3.3: Detector de ionización por llama
Grupo de Investigación “GIAMP”
25
iones cargados negativamente y de electrones. Esto crea una corriente que es la base para todas las
medidas. Cuando llegan los compuestos afines a los electrones estos son capturados produciéndose
una diferencia de corriente que es registrada y transformada en una señal. La cantidad de corriente
reducida es una función de la cantidad de compuesto presente y su capacidad de capturar electrones.
Detector de conductividad térmica (TCD)
Es sensible a todos los compuestos, pero la sensibilidad y la naturaleza casi universal del FID ha
hecho el uso del TCD útil solamente en áreas de aplicaciónes limitadas. Principios: Consiste en
dos celdas cada una con un filamento calentado cuya resistencia al flujo de corriente es mantenida
eléctricamente. El carrier gas con el compuesto de interés pasar a través de una celda, mientras que la
otra celda (referencia) recibirá solamente el carrier gas que no ha pasado a través de la columna. Los
filamentos se calientan simultáneamente; cuando pasa la muestra con el carrier gas hay una absorción
de calor por la muestra, lo que origina una diferencia de temperatura entre los dos filamentos de
los dos compartimientos. Un cambio en la temperatura es medido por el correspondiente cambio en
la resistencia del filamento. El cambio resultante en la resistencia del filamento ( temperatura) es
comparado con el filamento de la celda de referencia. La diferencia entre las corrientes de las dos
celdas es la señal, que es enviada al registrador para procesarlo en un pico cromatográfico.
Detector nitrogeno fósforo (NPD)
Es un detector de ionización que es selectivo hacia compuestos que contienen átomos de nitrógeno o
fósforo.
Principios: Funciona casi similar al FID excepto que tiene una sal alcalina sobre la llama
en la cámara de combustión. Una bolita de silicato de aluminio (sulfato de rubidio) es calentada
eléctricamente a 600 - 800o C por aplicación de una corriente, produciéndose un plasma sostenida por
adición de hidrógeno y aire. Los iones del metal alcalino son emitidos desde aquı́ interactuando con
el efluente de la columna.Una pequeña corriente es producida por los movimientos de iones generados
desde el plasma al colector cargada positivamente. La introducción de nitrógeno o fósforo contenidos
en los compuestos causa un aumento en la corriente por encima de la corriente base. Esta señal es
procesada por el registrador en un pico cromatográfico.
Detector fotométrico de llama
Es un detector óptico y especı́fico para compuestos que contienen fósforo y sulfuros.
Principios: Se combina H2 y aire O2 para producir una llama, el compuesto azufrado que proviene
del efluente de la columna se quema en la llama y emite una longitud de onda caracterı́stica del S2 , lo
cual es seleccionado por un filtro, luego esta luz emitida es enviada a un tubo foto multiplicador que la
transforma en corriente, la cual es enviada al registrador para su procesamiento en el correspondiente
pico cromatográfico.
H2O2
Compuesto azufrado
! SO + producto
llama
SO + O3
SO2⇤
3.15
! SO2⇤ + O2
! SO2 + Energı́a
Preparación de la muestra
Es un proceso de transformar una muestra en una forma que sea adecuada para el análisis.
El proceso podrı́a evaluar: extracción del analito en una muestra compleja, preconcentración de
analito muy diluida para su medición, remover o enmascarar las especies interferentes, o transformar
quı́micamente el analito en una especie mas conveniente a una forma mas fácilmente detectable.
(derivatización.
26
E.Lans
Microextracción en fase sólida
Metodo por medio del cual se puede extraer compuestos de lı́quidos, aire o lodo sin usar ningún
solvente.
Purga y trampa
Es un método para remover analitos volátiles de lı́quidos o sólidos (tal como aguas subterránea o
suelos)concentrando el analito e introduciéndolo en el cromatógrafo. En contraste con la SPME el
cual remueve una porción del analito de la muestra , el objetivo de purga y trampa es remover el
100% del analito en la muestra. Se burbujea el gas de purga He en el recipiente donde se encuentra
la muestra, el cual es calentado para ayudar a la evaporación del analito, el gas de purga junto con
el analito salen y pasan a través de un tubo de adsorción que contiene tres capas de compuestos de
adsorbente con fuerzas adsorbentes diferentes ( bajo, moderado y alto) luego es retirado el tubo con
los analitos adsorbidos e inyectados en el cromatógrafo de gas, donde empieza la desorción.
3.16
Selección del método en cromatografı́a de gas
Para seleccionar un método en cromatografı́a de gas se debe tener en cuenta lo siguiente:Objetivo del
análisis,preparación de la muestra,detector, columna y modo de inyección.
Objetivo del análisis
Que se requiere del análisis? La identificación cualitativa de los componentes de una mezcla?. Requiere
la separación una alta resolución en todo el cromatograma? O una buena resolución en una porción de
éste?. Puede sacrificar resolución por tiempo de análisis cortos?. Necesita el análisis cuantitativo de
uno o mas componentes?.Necesita alta precisión? Se encuentra el analito en concentración adecuada
o necesita técnicas especiales para ultra análisis? (preconcentración y un detector muy sensible).
Preparación de la muestra
La clave para una cromatografı́a exitosa en una muestra compleja es limpiarla antes de entrar a la
columna, para ello se usa la técnica micro extracción en fase sólida (SPME) o purga y trampa. Otros
métodos incluyen extracción lı́quida, extracción con fluidos supercrı́ticos, extracción en fase sólida
(SPE), desorción térmica de volátiles de un material sólido. Estas técnicas aı́slan el analito deseado
de sustancias interferentes y pueden además concentrar analitos diluidos hasta niveles detectables. Si
la muestra no se limpia bien pueden aparecer un gran numero de picos no resueltos y sustancias no
volátiles pueden arruinar su costosa columna cromatográfica.
Escogencia del detector
Para ello se hace necesario si quiere un detector especı́fico para un elemento en particular, o para una
clase particular de compuesto ej: el FID requiere que la muestra contenga mayor o igual a 10 ppm de
cada analito para la inyección split. El de conductividad térmica detecta toda clase de compuestos pero
no es suficientemente sensible para análisis de alta resolución y columnas open tubular de diámetro
estrecho. El ECD es especı́fico para moléculas que contienen halógenos, carbonilos conjugados, nitrilos,
y compuestos nitro. La muestra debe contener concentración mayor o igual a 100 ppb de cada analito.
El detector de fotoionización es especı́fico para compuestos aromáticos. NPD para compuestos con
nitrógeno y fósforo, FPD para compuestos que contienen sulfuros.Fotométrico de llama para elementos
como S, P , Pb o Sn. Si lo que se quiere es identificar, se utilizan los detectores MS y IR.
Selección de la columna
Para ello hay que tener en cuenta: la fase estacionaria, el diámetro de la columna, la longitud y el
espesor de la fase estacionaria. Las columnas pueden ser de polaridad intermedia, no polar y altamente
Grupo de Investigación “GIAMP”
27
polar: por ejemplo: Para compuestos altamente polar se necesita una columna fuertemente POLAR.
Una columna con fase estacionaria intermedia hará las mayorı́as de las separaciones que la columnas
no polar no pueden hacer. La mas alta resolución es alcanzada con columnas estrechas y una fase
estacionaria con espesor muy delgado. Esta combinación minimiza la resistencia a la transferencia
de masa termino C en la ecuación de van deemter, la fase estacionaria y la móvil reducen la altura
de plato. Columnas de pelı́culas delgada, estrechas son especialmente buenas para separaciones de
mezclas de compuestos de alto punto de ebullición que son retenidos demasiado fuertemente sobre
columnas con pelı́culas gruesas. El tiempo de retención corto provee alta velocidad de análisis, sin
embargo columnas con espesor de pelı́culas delgado, diámetro estrecho tienen muy poca capacidad de
muestra y requieren un detector con alta sensibilidad (el FID no es adecuado) no retienen compuestos
con bajo punto de ebullición y podrı́a sufrir exposición de sitios activos sobre la superficie de la sı́lice.
Columnas con pelı́culas gruesa y estrecha dan una buena combinación entre resolución y capacidad
de muestra y pueden ser usada con la mayorı́a de los detectores (excepto los TCD y el IR) y con
compuestos de alta volatilidad. Los tiempos de retención son más largos que aquellos de columnas
con pelı́cula delgada.
Columnas con diámetro grande y pelı́culas gruesa son sugeridas para detectores de conductividad
térmica TCD e IR ya que tienen alta capacidad de muestra y pueden manejar compuestos volátiles,
pero dan baja resolución y tiempos de retención muy largos. Si una columna en particular satisface la
mayorı́a de sus requerimientos pero no provee suficiente resolución, entonces una columna mas larga
del mismo tipo podrı́a ser usada. Doblando la longitud de la columna dobla el número de platos y
aumenta la resolución en 21/2 , aunque esta no es la mejor manera de aumentar la resolución por que
dobla el tiempo de retención.
Al usar una columna mas estrecha o una fase estacionaria mas delgada incrementa la resolución sin
perjudicar el tiempo de retención. Cambiando completamente el tiempo de retención cambia tambión
la retención relativa de los componentes y podrı́a resolver los componentes de interés.
3.17
Escogencia del modo de inyección
Inyección split
Es útil para analitos altamente concentrados, con este modo de inyección se consigue alta resolución.
Inyección splitless
Es útil cuando las muestras están muy diluı́das, se consigue igualmente alta resolución.
Inyección on column
Es mejor para análisis cuantitativo y compuestos térmicamente sensibles. Es una técnica de baja
resolución y no puede ser usada con columnas cuyo diámetro interno sea menor de 0.25 mm. Puede
manejar soluciones diluidas o concentradas y volúmenes relativamente grandes o pequeños.
3.18
Ejercicios
1. Las áreas de los picos obtenidos por cromatografı́a de gas para una mezcla de cetato de metilo,
propionato de metilo y n-butirato de metilo fueron: de 17.6, 44.7, 31.1 respectivamente. Calcular
el porcentaje de cada compuesto si las respectivas respuestas de detección relativas fueron: 0.65,
0.83 y 0.92.
2. Cuando 1,06 mmol de 1-pentanol y 1,53 mmol de 1-hexanol fueron preparados por cromatografı́a
de gas, dieron un área de pico relativa de 922 y 1.570 unidades respectivamente. Cuando 0,57
mmol de pentanol fueron agregados a una muestra desconocida que contiene etanol, el área
de pico relativa fué de 843:816 (pentanol:hexanol). Cuanto de hexanol habı́a en la muestra
desconocida? (Rta. 0,47 mmol)
28
E.Lans
Reporte
Para este ejercicio el profesor le hará entrega de un material que puede ser una nota de aplicación de
un instrumento, un método de algún libro, un artı́culo de alguna revista especializada etc.
Escriba un reporte dando los detalles del método de acuerdo al siguiente esquema, respondiendo cada
uno de los ı́tems que se darán a continuación.(John.Kenkel 2014)
a) Tı́tulo del método: Describa más ampliamente el tı́tulo que el dado en el volante entregado.
b) Escriba el material examinado: es agua, suelo, alimento, alguna preparación farmacéutica?
c) Analito: Dar el nombre del analito y su fórmula.
d) Procedimiento de muestreo: Este se refiere a cómo obtener la muestra. Si no hay suficiente
información especı́fica, idéese algo. Si quiere ser más estricto investigue para conocer la forma
correcta de hacerlo. Sea breve.
e) Procedimiento de preparación de la muestra: Esto hace referencia a los pasos que se llevaran a
cabo para preparar la muestra para el análisis. No se refiere a la preparación de estándares o
alguna solución asociada.
f ) Se Utilizó un estándar interno? Cual es y cuál es su concentración?
g) Cuál es la fase estacionario y el soporte sólido? Si no hay soporte solido indicarlo en su respuesta
pero diga que fase estacionaria es.
h) Se usó programación de temperatura? Si es ası́ decir exactamente cuál es. Si no lo es, indicar la
temperatura de la columna.
i) Cuales fase móvil y cual su velocidad de flujo, utilizada en el experimento.
j) Cuál es el detector utilizado.
k) Curva de calibrado: Se sugiere una curva de calibrado para las determinaciones? Si es ası́, indicar
que va en los ejes X y Y con sus unidades.
l) Como se reúnen los datos? En otras palabras, usted dispone del blanco, del estándar y su muestra,
que sigue después? Sea breve.
m) Nivel de concentración de los estándares. Esto se refiere a cual es rango de concentraciones
utilizados para la curva de calibrado, asegúrese de incluir las unidades. Si no usa curva de
calibrado indicarlo.
n) Como se preparan los estándares? Diluyendo una solución patrón? Si no es ası́, indicar como son
preparados los estándares.
o) Problemas potenciales. En el documento se menciona si se podrı́a presentar algún problema? Sea
breve.
p) Manejo de datos y elaboración de informe. Una vez usted tiene los datos entonces qué? Asegúrese
de presentar cualquier cálculo que se pudiera requerir.
q) q. Referencias. Miro otras fuentes de referencia para ayudarlo a responder cualquiera de las
preguntas anteriores? Si es ası́, escrı́balas aquı́.
Capı́tulo 4
ANALISIS CUANTITATIVO Y
CUALITATIVO
4.1
Análisis cualitativo
Para identificar compuestos dos detectores son muy comunes. El espectrómetro de masas y el IR con
transformada de fourier. Un pico puede ser identificado comparando su espectro con una biblioteca
de espectros que tiene el computador.
4.1.1
Co-Cromatografı́a
Es una forma mas adecuada de comparar tiempos de retención. Una muestra autentica es agregada
a una desconocida. Si el componente agregado es idéntico a la desconocida, entonces el área relativa
del pico aumentará.
4.2
Análisis cuantitativo
En análisis quı́micos muchas veces se mide la respuesta que tiene el método analı́tico con respecto a
cantidades de analito (patrones o estándares) presentes en una muestra dada.
Los métodos de cuantificación conocidos mas ampliamente son: la curva de calibrado o estándar
externo, método de la adición estándar, método del estándar interno y el método de la normalización
de área.
4.2.1
Método de normalización de área
Como su nombre lo indica, la normalización de área realmente es un calculo de porcentaje del área,
el cual se asume como igual al porcentaje en peso.
Si x es su sustancia de interés, entonces:
Ax
%área x = P
⇥ 100
(Ai )
i
donde Ax es el área de x y el denominador es la suma de todas las áreas.
Para que este método séa exacto se deben tener en cuenta los siguientes criterios:
1. Todos los analitos deben ser eluı́dos
2. Todos los analitos deben se detectados
29
30
E.Lans
3. Todos los analitos deben tener la misma sensibilidad
Estas tres condiciones son raramente encontradas, pero este método es simple y muy útil si el análisis
semicuantitativo es suficiente o si alguno de los analitos no ha sido identificado o no están disponibles
en forma pura (para uso en la preparación de estándares ).
Normalización de área con factor de respuesta
Si hay estándares disponibles el tercer criterio no se tiene en cuenta, para ello se corre el estándar
para obtener un factor de respuesta relativo fx . Una sustancia ( puede ser un analito en la muestra)
es escogido como estándar y su factor de respuesta fs se le da un valor arbitrario como 1.0. Se hacen
mezclas en peso del estándar y otros analitos, y se realiza el proceso cromatográfico. Luego se miden
las áreas del estándar As y del analito Ax y se calcula el factor de respuesta del analito ( fx ).
As
Ax
fx = fs ⇥
!
⇥
Wx
Ws
!
donde Wx /Ws es la razón de peso del analito y estándar. Los factores de respuesta de algunos
compuestos han sido publicados para los detectores mas comunes en GC, pero para mayor exactitud
en los cálculos se debe determinar su propio factor de respuesta.
Cuando una muestra desconocida es corrida, cada área es medida y multiplicada por su factor. Luego
el porcentaje es calculado como se dijo anteriormente, veamos
(Ax fx )
%x = P
⇥ 100
(Ai fi )
i
Ejemplo:
Considere una mezcla de etanol, hexano, benzeno y acetato de etilo que se van a analizar utilizando
un detector TCD. Las áreas obtenidas se muestran en la tabla 4.2.1 Cada área es multiplicada por su
factor de respuesta.
Para calcular el área corregida se multiplica el área del analito respectivo dada directamente por
el instrumento, por el factor de respuesta. Hay que tener en cuenta que este factor es propio de cada
analito en un detector determinado; en el caso del etanol serı́a (5.0) ⇥ (0.64) = 3.2. Ahora cada área
debe ser normalizada para conseguir el porcentaje; para el caso del etanol serı́a:
%etanol =
3.2
⇥ 100 = 17.6
18.5
El área de cada analito es normalizada como en el procedimiento anterior
La tabla 4.2.1 en su última columna muestra los errores en que se incurre cuando no se usa el factor
de respuesta.
Tabla 4.1: Normalización de área con factor de respuesta
Compuesto
Etanol
Hexano
Benzeno
Actato de etilo
Total
Area
5.0
9.0
4.0
7.0
25
fx
0.64
0.70
0.78
0.79
Area corregida
3.20
6.30
3.12
5.53
18.15
% peso
17.6
34.7
17.2
30.5
100
% área
20.0
36.0
16.0
28.0
100
Error
+2.4
+1.3
1.2
2.5
Grupo de Investigación “GIAMP”
31
Método de la adición patrón
Consiste en añadir cantidades conocidas de analito al problema, cuyo contenido en analito se requiere
determinar.A partir del aumento de señal se deduce cuanto analito habÃa en la muestra problema.
Este método requiere una respuesta lineal frente al analito.
La adición de patrón es especialmente apropiada cuando la matrı́z de la muestra es compleja y afecta
a la señal analı́tica. Se define matrı́z como todo lo que hay en la muestra a demás del analito. Se
define como efecto de matr’iz el cambio que experimenta una señal analı́tica distinta a la del analito.
El método de la adición estándar obedece a la siguiente ecuación:
Ix
[X]i
=
Is+x [S]f + [X]f
Método del estándar interno
En cromatografı́a el análisis cuantitativo es llevado acabo agregando una cantidad conocida de un
estándar interno al desconocido. Después se mide el factor de respuesta del estándar según la ecuación:
Ax /[⇥] = F (As /[S])
Donde:
Ax = Area de la señal del analito
As = Area de la señal del estándar
[X] = Concentración del analito en la mezcla
[S] = Concentración del estándar en la mezcla
F = Factor de respuesta
Para usar un patron interno primero se debe conocer la respuesta relativa del detector a las dos especies
( patrón y analito). Para ello se prepara una mezcla de concentraciones conocidas tanto del estándar
como del analito. Normalmente el detector da una respuesta diferente de ambas especies aun cuando
sus concentraciones en la mezcla sean iguales, de allı́ la importancia del factor de respuesta. Si el
detector responde de igual manera al estándar que al analito entonces F = 1. Si el detector responde
con el doble de intensidad al analito que al estándar F = 2. Si el detector responde intensidad a la
mitad del analito con respecto al estándar, entonces F = 0.5.
Método del factor de respuesta
Este es el nombre que recibe el método de normalización de área en algunos textos y es otra forma de
cuantificarla.
Si vemos un cromatograma (figura xxx) serı́a fácil calcular el porcentaje de cada uno de los constituyentes, de una mezcla, en este caso A, B, C y D de la siguiente manera:
Area B
⇥ 100
(4.1)
Area A + Area B + Area C + Area D
El problema con esta forma es: 1- sin comparar con un estándar o un set de estándares no sabemos si el
resultado se da en porcentaje en peso o porcentaje en volumen. 2-el detector de conductividad térmica
no responde de igual manera a todos los compuestos con igual concentración debido precisamente a
que la conductividad de cada uno de los componentes es distinta.
Para solucionar este inconveniente se debe hallar el factor de respuesta del detector a cada componente.
Para ello se toma una cantidad conocida de un estándar (en uL o peso ), se corre el espectro y se mide
la altura del pico, luego se divide entre la cantidad de estándar inyectado.(John.Kenkel 2014)
%B =
FR =
tamaño del pico
cantidad de estandar inyectada
(4.2)
Para hallar la cantidad de analito se toma el tamaño del pico(en la mezcla) y se divide entre su
factor de respuesta hallado.
32
E.Lans
Cantidad de analito⇤ =
tamaño del pico
factor de respuesta
(4.3)
El porcentaje de analito puede ser luego calculado de la siguiente forma:
% de analito =
4.3
cantidad de analito⇤
cantidad total inyectada
(4.4)
Ejercicios
1. Una muestra desconocida de Ni2+ dió una corriente de 2,36 µA en un análisis electroquı́mico.
Cuando 0,500 mL de solución que contiene 0,0287 M de Ni2+ fué agregado a 25 mL de muestra, la
corriente se incrementó a 3.79 µuA. Econtrar la concentración de Ni2+ en la muestra desconocida.
Rta. 9, 00 ⇥ 10 4 M.
2. Una solución fué preparada mezclando 5,00 mL de una muestra desconocida con 2,00 mL de una
solución estándar de 4,13 µg por mililitro y diluı́da a 10,00 mL. La razón de la señal medida en
X
un experimento de Absorción atómica fue = 0, 808, donde X es la muestra desconocida y S el
S
estándar. En un experimento por separado se encontró que para igual concentración de X y S, la
señal debido a X fué 1,31 veces más intensa que la señal debido a S. Encontrar la concentración
de X en la muestra desconocida. Rta. 1, 02µg/L
3. Una muestra desconocida de Cu 2+ dió una absorbancia de 0,262 en un análisis de absorción
atómica. Luego 1,00 mL de una solución de 100 ppm (µg/mL) de Cu2+ fué mezclado con 95 mL
de una solución desconocida y la muestra fué diluı́da en un balón de 100 mL. La absorbancia de
la nueva solución fué de 0,500. Con la información anterior encontrar la concentración inicial de
cu2+ en la solución desconocida. Rta. 1.04 ppm
4. El cloroformo es un estándar interno en la determinación del pesticida DDT en una análisis
polarográfico en el cual cada compuesto es reducido en la superficie de un electrodo. Una mezcla
que contiene 0,500 mM de cloroformo y 0,800 mM de DDT dió una señal de 15,3 µA para el
cloroformo y 10,1 µA para el DDT. Una solución desconocida (10,0 mL)que contiene DDT fué
colocada en un balón de 100,0 mL y 10,2 µL de cloroformo (MW= 119,39 y d = 1,484 g/mL)fué
agregado. Después de diluı́r a la marca con solvente una señal polagrográfica de 29,4 y 8,7 fueron
observadas para el cloroformo y el DDT respectivamente. Encontrar la concentración del DDT
en la solución desconocida.
Capı́tulo 5
ESPECTROMETRÍA DE MASAS
La espectrometrı́a de masas da el nombre a un conjunto de técnicas utilizadas para la medida de las
masas de los iones y su abundancia en la fase gaseosa.
El conjunto de técnicas llamadas espectrometrı́a de masas es una de las mas versátiles e importantes instrumentos de análisis quı́micos
5.1
5.1.1
Cualidades de la espectrometrı́a de masas
Cualidades de indentificación y cuantificación
Puede identificar cualitativamente de forma inequı́voca casi cualquier tipo de sustancia.
5.1.2
Cuantifica e identifica
Puede identificar y cuantificar la concentración de la sustancia bajo estudio.
5.1.3
Sensibilidad
Detecta en el orden de partes por cuatrillon (ppq) (ICP-MS) y tiene capacidad de separar mezclas
complejas.
5.1.4
Universal y especı́fica
Analiza sustancias o mezclas de sustancias sólidas, lı́quidas y gaseosas. Es capaz de detectar y separar
una sustancia en presencia de una matriz compleja.
5.1.5
Información estructural
Suministra información estructural de la molécula.
5.1.6
Rapidez
Puede realizar un espectro en décimas de segundos.
5.2
Tecnicas de ionización
Dependiendo de la naturaleza del compuesto a analizar o del interés del investigador se utilizan varias
tćnicas de ionización. Ente ellas tenemos: Ionización por impacto electrónico(EI), ionización quı́mica(CI), ionización por campo(FI), desorción por campo(FD), bombeo con átomos rápidos(FAB),
electrospray ( ESI), ionización a presión atrmosférica. Las tres primeras fuentes requieren la volatilización
de la muestra antes de la ionización;a ellas se les llama fuentes de fase gas; por tanto sólo se pueden
33
34
E.Lans
usar para compuestos térmicamente estables que tengan puntos de ebullición menores de 500 o C.
Mayoritariamente las fuentes de gas están limitadas a compuestos con PM menores de 103 daltons.
5.2.1
Ionización por impacto electrónico (EI)
Es el mas utilizado. Cuando las moléculas se encuentran en la cámara de ionización son sometidas a
un bombardeo con una corriente de electrones provenientes de un filamento. El número de electrones
es controlado por la temperatura del filamento, mientras que su energı́a lo es por el potencial a que
se mantiene el filamento. El potencial del filamento se puede variar. 70 eV es el mas usual.Figura 5.1
! M+ + 2 e
M+e
5.2.2
Ionización quı́mica
En las fuentes de ionización quı́mica se utiliza un gas reactivo ( metano, amonı́aco, argón, isobutano
etc) para suavizar las condiciones de ionización de la muestra . Por tal razón hay menos energı́a en
exceso y por ende menos fragmentación que el EI ( por encima de la que se necesita para la ionización).
Se introduce el gas en la cámara de ionización a una presión de 10 3 torr, su concentración es mucho
más alta que la de la muestra. Se ioniza el gas con un haz de electrones y a través de su subsiguientes
reacciones acepta protones para formar iones moleculares.
Si se usa metano el ión primario formado es el CH5+ , este, transfiere un protón a las moléculas de
analito que tienen mayor afinidad por el protón, mediante la reacción:
CH5 + + M
5.2.3
! MH+ + CH4
Ionización Quı́mica negativa
La reacción más frecuente es la abstracción protónica.
MH + R
! M + RH + Energı́a
El exceso de energı́a producido en la reacción suele quedar en forma de energı́a vibracional asociada
al enlace R H de la especie neutra formada, lo que hace que la especie M formada sea muy estable
y halla una ausencia casi total de fragmentación.
5.2.4
Ionización por campo
Aquı́ los iones se forman bajo la influencia de un campo eléctrico elevado al aplicar altos voltajes
(10 a 20 kV) a emisores que contienen numerosas puntas finas de diámetros menores de 1µm. Estos
emisores adquieren la forma de un fino hilo de tungsteno en la cual se han hecho crecer centenares de
agujas microscópicas de carbón por pirolisis de benzonitrilo que emergen desde la superficie del hilo.
La muestra gaseosa se difunde en el área del campo elevado alrededor de las micropuntas donde se
concentra éste. En las micropuntas es donde tiene lugar la ionización donde los electrones del analito
son extraı́dos. En este caso el analito adquiere poca energı́a vibracional y rotacional por lo que se
produce poca fragmentación.
5.2.5
Fuentes de desorción
Son aquellas donde no es posible la ionización de analitos térmicamente inestables y no volátiles.
Los métodos de desorción prescinden de la volatilización y la posterior ionización. En su lugar se
suministra energı́a a la muestra lı́quida o sólida de modo que se provoca la formación directa de iones
gaseosos. Como consecuencia los espectros aparecen muy simplificados y a menudo consisten sólo en
el ión molecular o el ión molecular protonado. Con esta técnica se puede obtener información sobre
espectros de masas de especies bioquı́micas y especies con PM por encima de 10.000 daltons.
Grupo de Investigación “GIAMP ”
35
Figura 5.1: Ionización por impacto electronico
5.2.6
Desorción por campo
Se utiliza un emisor con multiples puntas como se describió anteriormente. En este caso el electrodo
se monta sobre una sonda que puede separarse del compartimiento de la muestra y mojarse con una
solución de la muestra. Después la sonda se reinserta en el compartimiento de la muestra, la ionización
tiene lugar por la aplicación de un potencial elevado a este electrodo.
5.2.7
Bombardeo por Átomos Rápidos (FAB)
Es importante para el estudio por espectrometrı́a de masas para compuestos de elevado peso molecular.
La muestra condensada (a menudo en glicerol) se ionizan por bombardeo con átomos de elevada energı́a de xenón o argón. Tanto los iones negativos y positivos del analito son expulsados de la superficie
de la muestra por un proceso de desorción. Este procedimiento permite un calentamiento rápido de
la muestra reduciendo su fragmentación.
5.2.8
Ionización electrospray
En el método de ionización electrospray, el efluente de la columna es dirigido a través de un capilar
metálico que tiene una carga eléctrica alta. Gotas de solventes que contien iones de analito emergen del
capilar y se rompen debido a la fuerza de repulsión electrostatica. Como ellas continuan moviendose
hacia el electrodo de carga opuesta, las gotas se convierten en gotitas cada vez mas pequeñas debido
a la evaporación del solvente. Los iones de analitos luego entran al analizador de masas libre de
solventes.(John.Kenkel 2014)
5.3
Instrumentación
El instrumento utilizado para llevar a cabo la identificación de los analitos es el espectrómetro de
masas, el cual consta de :
1. Una fuente de ionización.
2. Un analizador.
3. Transductor(dectector).
36
E.Lans
Figura 5.2: Partes de un espectrómetro de masas
5.3.1
Cámara de ionización
Zona donde se introducen la moléculas ( pueden ser gaseosas, lı́quidas o sólidas), se evapora se ioniza
y se aceleran (las muestras gaseosas se ionizan entre dos placas cargadas). Los iones formados son de
masas diferentes.
5.3.2
Analizadores de masas
Las separaciones se llevan a cabo en el analizador de masas, teniendo en cuenta su relación tamaño
carga.
Analizador de quadrupolo
Probablemente el mas utilizado es el analizador de quadrupolo. Este consiste en cuatro rodillos
metalicos alineados en paralelo a los cuales se les aplica un voltaje y una radiofrecuencia, de tal modo
que dos rodillos tengan el mismo voltaje mientras que los otros dos adjacentes tengan voltajes con
signos opuestos. Asi es creado un campo electromágnetico. La magnitud del votaje puede ser cambiado
a voluntad y la fuerza del campo puede ser escaneada. Cuando los iones procedentes de la camara de
ionización entran al campo electromagnetico, ellos se pueden dirigir hacia el detector o deflectar de
acuerdo a su interacción con el campo magnético. Este proceso es repetido muchas veces, siempre y
cuando la muestra esté presente, ası́ es generada una señal de acuerdo a su razón tamaño/carga. De
este modo el espectro de masas puede ser graficado.
Analizador de tiempo de vuelo (TOF)
Este diseño separa los iones basados en la rapidez con que ellos se mueven a través del tubo, en el cual
un fuerte campo electrico está presente debido al alto votaje aplicado. Los fragmentos más ligeros
viajan más rápidos que los más pesados a través del tubo, ası́ las diferentes masas son detectadas a
diferentes tiempos, dependiendo de su tiempo de vuelo ”Time of flight” a través del tubo. La señal
es medida vs tiempo y trasladado al tradicional espectro de masas.
Analizador de trampas de iones
En este instrumento, los iones se generan a partir de la muestra eluı́da, por impacto electrónico o
ionización quı́mica y luego se almacenan en un campo de radiofrecuencia. A continuación los iones
atrapados se expulsan del área de almacenamiento hacia un detector multiplicador de electrones. La
expulsión se lleva a cabo de tal forma que es posible un barrido en función del cociente/masa carga.
Después de ser acelerados los iones pasan al analizador de masas que son de varios tipos, donde se
separan de acuerdo a su masa. Figura 5.3. En general en el analizador se necesita un vacı́o del orden
10 7 torr o mejor. Para lograrlo se debe utilizar un sistema eficiente de bombeo.
Grupo de Investigación “GIAMP ”
37
Figura 5.3: Esquema interno de un espectrómetro de masas
5.4
Detectores
Como ya lo habı́amos dicho un detector es aquel que convierte una propiedad quı́mica de un analito en
una señal susceptible de ser medida. En masas el detector más utilizado es el channeltron.El efecto es
muy parecido al fotomultiplicador. Es un tubo de vidrio abierto con un cono en una terminación. Para
la detección de iones positivos, el cono es sometido a un alto potencial negativo (aproximadamente
3kV ).
5.4.1
Channeltron
Cuando los iones salen del analizador de masas, son atraı́dos por el potencial negativo del cono.
Cuando los iones chocan con su superficie,ası́ se originan uno o más electrones secundarios. El potencial dentro del tubo varı́a continuamente con la posición, tal que los electrones secundarios se mueven
hasta llegar a otra zona donde se originan otros electrones secundarios, y ası́ sucesivamente. Figura
5.4
El tubo está cubierto por un material semiconductor. La vida media del multiplicador está determinada por la carga total acumulada.
Figura 5.4: Detector channeltron
38
E.Lans
Figura 5.5: Copa de faraday
5.4.2
Copa de faraday
El analizador del gas consiste en una fuente del Ion, un espectrómetro total, y una sección de la
medida. Se ioniza el gas residual cuando choca con los filamentos termoelectrónicos cargados de alta
temperatura, y los iones que se crean, se aceleran y convergen sobre el espectrómetro total. En el
espectrómetro total, los voltajes de la corriente alterna se aplican a los cuatro electrodos cilı́ndricos
(quadrupolo), que permite que los iones sean separados de acuerdo a su realción masa/carga. Los
iones separados son detectados como corriente eléctrica por la Copa de Faraday. La corriente del ón
es proporcional a la masa (presión parcial) del gas. Figura 5.5
5.5
Métodos acoplados a masas
Aunque la espectrometrı́a de masas es una poderosa herramienta para la identificación de compuestos
puros es insuficiente para el análisis de incluso mezclas simples ya que la identificación está limitada
por el inmenso número de fragmentos de diferentes valores m/z producidos.
5.5.1
GC-MS
Un instrumento GC-MS conciste en un cromatografo de gas, una interface entre la columna de GC y
el MS, una fuente de impacto electrónico, un sistema de vacı́o para reducir la presión en el MS hasta
10 5 torr, un analizador másico, un detector donde la señal es generada y un sistema de recolección de
datos.Las unidades modernas de GC-MS son más pequeñas que los modelos originales y nos referimos
a ellos como unidades benchtop- GC.MS.
La interfase debe transferir la muestra (fase móvil) de una presión positiva dentro de la columna GC
a una presión baja dentro del MS.
La mayorı́a de las aplicaciones GC-MS utiliza columna capilar a través de la cual la fase móvil fluye
a una velocidad menor de 5 mL/min. En este caso hay una transferencia directa de la columna a la
fuente de ionización. FIG GC MS
5.5.2
ICP-MS
El atomizador de plasma acoplado inductivamete constituye una fuente de ionización para la espectrometrı́a de masas. Asi que la técnica de plasma acoplada inductivamente (ICP) ha sido acoplado
a la espectrometrı́a de masas (ICP-MS). La muestra procedente del ICP llega hasta un dispositivo
como el de la muestra que tiene un orificio de 1 mm de diametro, seguido de un cono Skimmer con
un orificio menor de 0, 4mm de diámetro. FIGURA (ICP MS). El vacio arrastra lo iones desde el
ICP a través de estos huecos y entra al analizador másico, el cual es generalmente un cuadrupolo. La
intensidad de la señal es porporcional a la concentración del analito en la muestra. En la mayorı́a de
los casos habrá más de un ión del elemento dado (isótopo) y por tanto más de una señal para cada
Grupo de Investigación “GIAMP ”
39
elemento. Casi todos los elementos tienen al menos un isótopo que otro elemento no tiene. Ası́ una
señal con esta interferencia espectral es ignorado en favor del elemento que la produce.
Los lı́mite de detección para los elementos analizados por ICP-MS son significativamente más bajos
en la mayorı́a de los casos, más que en los lı́mites de detección de otras técnicas de espectroscopı́a
atómica.
5.5.3
LC-MS
Conectar un instrumento de HLC a un espectrometro de masas es complicado. Esto se debe a que
hay que tratar con grandes cantidades de lı́quido de la fase móvil que es incompatible con las bajas
presiones utilizadas en esectrometrı́a de masas. Para manejar esta situación y lograr la ionización
se han ideado dos esquemas de interfases: Ionización Quı́mica a Presión Atmosferica (APCI) y la
Ionización Electrospray (ESI)
En APCI los iones son generados por reacción quı́mica a presión atmosférica. Aunque un aerosol es
creado cuando la fase móvil emerge de la columna al nebulizador a través de la cual el gas nitrogreno
tambien fluye. Las moléculas de interés se ionizan cuando el aerosol es sometido a una especie de
descarga electrica. Como este procedimiento se lleva a cabo a altas temperaturas es condición necesaria
que las moleculas de interés sean estables a estas temperaturas.
En el método de ionización electrospray el efluente de la columna se hace fluir junto con el gas nitrogeno
a través de un capilar metálico que tiene una carga electrica alta. Las gotas de solventes que contienen
iones del analito, emergen del capilar y se parten debido a las fuerzas de repulsión electrostáticas a
medida que ellos continuan moviendose hacia el electrodo de carga opuesta cada vez más pequeña
debido a la evaporación del solvente.Los iones del analito luego entran al analizador másico libre de
moléculas de solventes.
5.5.4
Espectrometrı́a de masas en tandem MS/MS
Consiste en acoplar un espectrómetro de masas a otro. El primer espectrómetro sirve para aislar los
iones moleculares de varios componentes de una mezcla. Estos iones se introducen uno tras otro en un
segundo espectrómetro de masas. En un instrumento en tandem el primer espectrómetro está equipado
con un método de ionización suave( ionización quı́mica) para que la salida sea mayoritariamente de
iones moleculares o iones moleculares protonados.Estos iones pasan entonces a la fuente de ionización
del segundo espectrómetro. Esta fuente de iones consiste en una cámara de colisiones sin campo en
la que se bombea helio. Las colisiones entre los iones progenitores y los átomos de helio producen
fragmentaciones de iones progenitores dando numerosos iones hijos. El espectro de estos iones hijos
se efectúa por un segundo espectrómetro. El primer espectrómetro tienen la misma función que
la columna en GC/MS o GC/LC.La espectrometrı́a de masas en tandem parece ofrecer las mismas
ventajas que GC/MS y LC/MS pero es más rápida. La espectrometrı́a de masas en tandem es
potencialmente más sensible que las dos técnicas cromatográficas acopladas vistas anteriormente, ya
que el ruido asociado a su uso es menor.
Aplicaciones
Se ha utilizado en la determinación cualitativa y cuantitativa de los componentes de una amplia
variedad de materiales complejos encontrados en la naturaleza y la industria.Ejemplos
1. Identificación y determinación de metabolı́tos de drogas.
2. Feromonas de insectos.
3. Alcaloides en las plantas.
4. Trazas de contaminantes en el aire.
5. Secuencia de polı́meros.
6. Compuestos petroquı́micos.
40
E.Lans
7. Bifenilos policlorados.
8. Gases de escape de automotores.
9. Olores en aire.
Desventajas
Una desventaja de la cromatografı́a de masas en tandem con respecto a los otros procedimientos
cromatográficos es el alto costo del equipo requerido.
5.6
Identificación de compuestos por espectrometrı́a de masas
El espectro de masas de un compuesto puro nos da información a cerca de:
1. Peso molecular del compuesto.
2. De su formula quı́mica.
3. Sobre la presencia de varios grupos funcionales, estudiando el modelo de fragmentación y comparando el espectro del compuesto con uno conocido hasta su total coincidencia.
4. Relación con los picos debido a impurezas. Cuando existen dudas se deben utilizar los espectros
de ionización quı́mica o ionización por campo.
Capı́tulo 6
CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
La cromatografı́a lı́quida es muy importante porque la mayorı́a de los compuestos no son lo suficientemente volátiles para analizarse por cromatografı́a de gas.
En HPLC se usa alta presión para forzar el solvente a pasar a través de una columna que contiene
unas partı́culas muy finas que dan alta resolución a las separaciones. El sistema HPLC involucra:
1. Un sistema de entrega de solventes.
2. Una válvula de inyección de la muestra.
3. Una columna que resiste alta presión.
4. Un detector.
5. Un computador para el control del sistema. Modernamente se usa un sistema para el control de
la temperatura.
6.1
Proceso cromatográfico
En cromatografı́a de gas para incrementar la eficiencia se incrementarı́a la velocidad de transferencia
de masas entre la fase estacionaria y el analito. Para una columna open tubular esto es adecuado
ya que disminuyendo el espesor de la pelı́cula de la fase estacionaria y reduciendo el diámetro de la
columna las moléculas pueden difundirse rápidamente.
La difusión de los lı́quidos es 100 veces mas lento que la difusión de los gases. Por tanto en
cromatografı́a lı́quida no es generalmente factible usar columnas open tubular, por que el diámetro de
los canales del solvente es demasiado grande para ser atravesado por una molécula de soluto en corto
tiempo. De modo que la cromatografı́a lı́quida es llevada a cabo en columnas empacadas.
6.1.1
Efectos del tamaño de las partı́culas en HPLC
La eficiencia de una columna empacada se incrementa cuando el tamaño de las partı́culas de la fase
estacionaria decrece ya que disminuye la altura de plato. En condiciones óptimas el número de platos
teóricos en una columna de longitud L (cm) es:
N = 3.500L(cm)/dp(µm)
dp = tamaño de las partı́culas en micrómetro.
Una razón de porque las partı́culas pequeñas dan mejor resolución es que ellas proveen un flujo
mas uniforme a través de la columna, por tanto reducen el termino de múltiples pasos A en la ecuación
de Van Deempter. Una segunda razón es que la distancia a través de la cual el soluto debe difundirse
en la fase móvil entre partı́culas se debe al tamaño de éstas. Cuando las partı́culas son pequeñas, hay
41
42
E.Lans
menos distancia entre ellas, para que el soluto se difunda mejor en la fase móvil. Este efecto disminuye
el término C en la ecuación de Van Deemter, dando un tiempo finito entre equilibrio.
El inconveniente del pequeño tamaño de las partı́culas es la resistencia al flujo del solvente, es por
ello que requiere alta presión ( 70-400 atm).
6.1.2
Columnas
Las columnas en HPLC pueden ser de plástico, vidrio o acero inoxidable con longitudes entre 5 y 30
cm, con un diámetro interno de 1-5 mm. Las columnas son costosas, fácilmente degradables debido al
polvo o partı́culas que se encuentran en la muestra o el solvente, por lo que se requiere de un guarda
columna. Un guarda columna es una columna corta que contiene la misma fase estacionaria que la
columna principal. Las partı́culas finas e impurezas son retenidas por el guarda columna, la cual es
periódicamente reemplazado.
Si se calienta la columna generalmente disminuye la viscosidad del solvente, aumentando su velocidad
de flujo y reduciendo la presión requerida.
Igualmente, incrementando la temperatura disminuye el tiempo de retención mejorando la resolución, ya que aumenta la difusión del soluto; no obstante este aumento de temperatura puede
degradar la fase estacionaria disminuyendo la vida útil de la columna.Si calentamos la columna unos
pocos grados sobre la temperatura ambiente, mejora , la precisión (reproducibilidad y repetibilidad)
del análisis cuantitativo y el tiempo de retención. Mientras en GC se necesitan muchas columnas para
abarcar el rango de separaciones posibles, en HPLC con una sóla columna podemos separar sustancias
polares, ionizables y no polares simplemente modificando la composición de la fase móvil.
6.1.3
Columnas analı́ticas
El tamaño de las partı́culas de relleno en estas columnas son de 3-10 µm.
La columna más utilizada es la de 25 cm con tamaño de partı́culas de 5 µmy diámetro interno de
4.6 mm.
Estas columnas alcanzan unas alturas de platos teóricos de 40.000 a 60.000.
6.1.4
Fase estacionaria
Existen dos tipos básicos: De relleno pelicular y de partı́cula porosa. La mas común son partı́culas
microporosas esféricas de sı́lica que son permeables al solvente y tienen un área de superficie bastante
grande. Las esferas son de vidrio o polı́meros con diámetro de 30 a 40 µm. En la superficie de estas
bolas se deposita una capa delgada y porosa de sı́lice, alúmina o resina de intercambio iónico.Estas
esferas también se pueden tratar quı́micamente para obtener una capa superficial orgánica.
Los tı́picos rellenos de partı́culas porosas en cromatografı́a de lı́quidos están formados por micro
partı́culas porosas con diámetros de 3 a 10 µm.
6.1.5
Proceso de elución
En la cromatografı́a de adsorción las moléculas de solvente compiten con las moléculas de solutos por
los sitios activos de la fase estacionaria.
Las capacidades relativas de los diferentes solventes para eluir un soluto dado del adsorbente son
casi independiente de la naturaleza del soluto.
La elusion se puede describir como un desplazamiento de soluto a través la fase estacionaria por
el solvente.
Fuerza del eluente "0
Es una medida de la energı́a de adsorción del solvente, la cual es cero (0) para el pentano para
adsorción sobre sı́lica. Entre más polar es el solvente más fuerza de elusión tiene sobre la sı́lica. Entre
mas grande sea la fuerza del eluente mas rápidamente será eluı́do de la columna.
Grupo de Investigación “GIAMP”
43
La cromatografı́a de adsorción sobre sı́lica bare es un ejemplo de cromatografı́a en fase normal en
la cual usamos una fase estacionaria polar y un solvente menos polar. Un solvente mas polar tiene
una fuerza de eluente mas alta.
6.2
Clasificación de la cromatografı́a lı́quida
La cromatografı́a lı́quida la podemos clasificar en cromatografı́a lı́quido - sólido o de adsorción, cromatografı́a lı́quido-lı́quido o de partición, cromatografı́a de intercambio iónico, y cromatografá de
exclusión por tamño.
6.2.1
Cromatografı́a lı́quido - lı́quido o de partición
Aquı́ las moléculas de soluto se distribuyen entre los dos lı́quidos, uno de ellos hace las veces de fase
estacionaria y el otro de fase móvil. Esta última se encuentra distribuı́da homogéneamente sobre
un soporte sólido. Este tipo de cromatografı́a presentó inconvenientes mayores debido a que: 1-Se
requerı́a presurizar la fase móvil con la fase estacionaria.
2- Era necesario disolver la muestra en la fáse móvil presaturada con fase estacionaria.
3-No se podia llevar acabo gradiente de elución.
6.2.2
Cromatografı́a lı́quido-sólido o de adsorción
En este tipo de cromatografı́a se emplea un fase estacionaria polar como la sı́lica gel y una fase móvil
no polar como el hexano.
6.3
Cromatografı́a en fase reversa
Es la mas común donde el solvente es polar y la fase estacionaria es apolar o ligeramente polar. Aquı́ un
solvente menos polar tiene una fuerza de elución mayor. Generalmente el solvente es un hidrocarburo.
En la cromatografı́a en fase reversa se eliminan picos con cola (tailing) por que la fase estacionaria
tiene pocos sitios que puedan adsorber fuertemente al soluto como para producir el tailing. La cromatografı́a en fase reversa es menos sensible a las impurezas polares (como agua) en el eluente. En
esta cromatografı́a los componentes mas polares aparecen primero y un aumento en la polaridad de
la fase móvil disminuye el tiempo de elución.
6.4
Cromatografı́a en fase normal
Aquı́ la fase estacionaria es polar y la fase movil apolar. En cromatografı́a en fase normal el soluto
menos polar se eluye primero debido a que es más soluble en la fase móvil y un aumento en la polaridad
en la fase móvil aumenta el tiempo de elución.
Ejemplos
El siguiente ejemplo muestra el comportamiento de elución de los distintos componentes teniendo en
cuenta su polaridad y la clase de polarografı́a utilizada. Figuras 6.4, 6.4, 6.4, 6.4
6.5
Cromatografı́a de adsorción
Llamada cromatografı́a liquido-sólido. Las únicas fases que se utilizan en HPLC lı́quido-sólido son
la sı́lice y la alúmina, siendo la sı́lice la que más es utilizada, se usa para casi todas las aplicaciones
debido a su mayor capacidad de carga y mayor diversidad de presentaciones.
En cromatografı́a lı́quido-sólido la única variable que se puede utilizar para optimizar K y ↵ es la
composición de la fase móvil.
44
E.Lans
Figura 6.1: Cromatografı́a fase inversa.(Fase móvil de baja polaridad)
Polaridad de los componentes: A>B>C
Figura 6.2: Cromatografı́a fase normal.(Fase móvil de polaridad media)
Figura 6.3: Cromatografı́a en fase normal.(Fase móvil de polaridad media)
Polaridad de los componentes: A>B>C
Figura 6.4: Cromatografı́a en fase inversa.(Fase móvil de alta polaridad )
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45
La cromatografı́a de adsorción es más adecuada para compuestos no polares con masas moleculares
inferiores a 5000.
Esta cromatografı́a es mas adecuada para muestras que son solubles en disolventes no polares, por
lo que tiene una solubilidad limitada en los disolventes acuosos, utilizados en cromatografı́a de fase
inversa. Una caracterı́stica particular de la cromatografı́a de adsorción es su capacidad de diferenciar
isómeros.
6.5.1
Elección del solvente
Para elegir el solvente adecuado se varı́a la relación entre los disolventes y se obtiene ası́ un valor
0
adecuado de k . Se ha encontrado que un aumento de 0,05 unidades en el valor de "o por lo general
0
disminuye 3 o 4 veces el valor de k .
Con estas combinaciones se pueden encontrar la relación que favorezcan los tiempos de retención
para cualquier mezcla, pero por desgracia la relación de volumen no es lineal con "o .
6.6
Gradiente de dilusión isocrática
La elución isocrática es llevada a cabo con un solo solvente (o mezcla constante de solvente). Cuando
un solvente no es capaz de dar una elución rápida de todos los componentes, entonces se usa el
gradiente de elución, que no es mas que hacer cambios continuos en la composición del
solvente para aumentar su fuerza.
El gradiente de elución en HPLC es análogo a la programación de temperatura en cromatografı́a
de gas.Aumentando la fuerza del solvente se eluye más rápidamente el soluto retenido.
6.7
Selección del modo de separación
Hay varias formas de separar un componente de una mezcla dada. En cualquier caso la primera
pregunta que se debe hacer es si es soluble en agua o en un solvente orgánico.
Si el soluto se disuelve en un solvente no polar o débilmente polar, usaremos la cromatografı́a en
fase reversa. Si el peso molecular del soluto es mayor de 2000 y son solubles en solventes orgánicos
con diámetro molecular menor de 30 nm escogemos cromatografı́a fase reversa (C18 , C8 , C4 ). Si el peso
molecular es mayor de 2000 y es soluble en solvente orgánico y el tamaño molecular está entre 30-400
nm la cromatografı́a a escoger es la exclusión por tamaño.
Si el peso molecular del soluto es menor de 2000 y es soluble en agua y es iónico la cromatografı́a
a escoger es la iónica.
6.8
Solventes
Se requieren solventes grados HPLC muy puros para evitar la degradación de la columna debido a las
impurezas y minimizar la señal de fondo del detector debido a contaminantes.
Para evitar esto se utilizan filtros para retener las partı́culas con tamaños de las micra.
La muestra y el solvente son pasados a través de un guarda columna. Aún contando con un guarda
columna se recomienda el lavado periódico de la columna analı́tica para prolongar su vida útil.
Antes del uso del solvente estos son purgados con He para remover el aire disuelto, ya que las
burbujas de aire les causan problemas a las bombas,a las columnas y detectores. Las separaciones en
fase normal son muy sensibles al agua en el solvente.
Una buena cromatografı́a con fases móviles interactivas, requiere un equilibrio adecuado entre las
fuerzas intermoleculares entre los tres participantes activos en el proceso de separación soluto, fase
móvil y fase estacionaria. Estas fuerzas intermoleculares se describen en términos de polaridad
relativa de cada uno de los reactivos.
Para una separación cromatográfica de reparto la polaridad de la fase estacionaria ha de ser similar a
la del analito y para la elusión se requiere entonces una fase móvil de una polaridad considerablemente
distinta. La polaridad de los grupos funcionales viene dada:
46
E.Lans
hidrocarburos<eteres < esteres <cetona<aldehı́dos<amidas <aminas <alcoholes. En conclusión podemos decir que para que ocurra una buena separación las polaridades del soluto, fase móvil y la fase
estacionaria deben armonizarse, por que si el soluto tiene mucha mas afinidad con la fase móvil, los
tiempos de retención serán demasiado cortos para fines prácticos, y si tiene demasiada afinidad con la
fase estacionaria los tiempos de retención se hacen demasiado largos.
6.9
Criterios para una buena separación
El factor de capacidad es una medida del tiempo de retención (tr ) en unidades de tiempo.
Separaciones razonables demandan que el factor de capacidad para todos los picos deben estar en
el rango 0,5-20. Si el factor de capacidad es demasiado pequeño el primer pico es distorcionado por
el frente del solvente. Si el factor de capacidad es demasiado grande el tiempo de análisis es muy
prolongado.
Cuando no se observa perturbación en la lı́nea base de un cromatograma el tiempo muerto se puede
estimar con la ecuación :
tm =
Ldc
2F
Donde L = longitud de la columna
dc = diámetro interno de la columna
F = velocidad de flujo
En cromatografı́a en fase reversa el tm puede ser medido pasando un soluto no retenido (por ej.
uracil detectado a 260 nm) a través de la columna.
Para la cuantificación una resolución mı́nima entre dos picos vecinos de 1.5 es deseada. Para mayor
robustez una resolución de 2 es mucho mejor.
Otro criterio para una adecuada separación cromatográfica es no exceder la presión de operación por
encima de 15 MPa (150 atm) esto prolonga la vida de la bomba, válvulas, sellos y el automuestreador.
Todos los picos que necesiten ser medidos deben ser simétricos con un factor de asimetrı́a A/B en
el rango de 0.9-1.5
6.9.1
Atributos de una buena separación
Para que se produzca una buena separación, se deben cumplir las siguientes condiciones:
0
1. 0,5 6 K 6 20
2. Resolución
2
3. 0.96 factor asimetrı́a 6 1.5
4. Presión de operación 6 15 MPa ( 150 atm)
6.10
Optimización con un solvente orgánico
Combinaciones con acetonitrilo, metanol y tetrahidrofurano con agua ( o un bu↵er acuoso)provee
suficiente rango de interacción con los solutos para separar un vasto número de compuestos en cromatografı́a fase reversa. La primera mezcla a realizar es acetonitrilo-agua. El acetonitrilo tiene baja
viscosidad lo que permite operar a bajas presiones y deteccion en el Ultravioleta (uv) a 190 nm. A
esta longitud de onda un gran número de analitos presentan absorción.
El metanol es el segundo solvente escogido por que tiene una alta viscosidad y un cut-o↵ en el UV
mas grande.
El THF es la tercera mezcla escogida por que tiene un rango menor utilizable en el UV, es lentamente degradado por oxidación y se equilibra mas lentamente con la fase estacionaria. De a cuerdo a lo
Grupo de Investigación “GIAMP”
47
anterior entonces podemos afirmar que el orden de escogencia de un solvente organico es: acetonitrilo1 ,
metanol y tetrahidrofurano (THF).
6.11
Optimización con dos o tres solventes orgánicos
Cuando se requieren dos o tres solventes orgánicos, se requiere primeramente una optimización, para
ello se deben seguir los siguientes pasos:
Paso 1: Se optimiza la separación con acetonitrilo/bu↵er para generar un cromatograma A.
Paso 2: Se optimiza la separación con metanol/bu↵er para generar un cromatograma B.
Paso 3: Se optimiza la separación con THF/bu↵er, para generar un cromatograma C. Paso 4:
Se mezclan los solventes, de los pasos 1,2 y 3 en proporciones 1:1 para generar los cromatogramas D,
E y F.
Paso 5: hacer una mezcla de acetonitrilo, metanol y THF en proporción 1:1:1 para generar un
cromatograma G.
Paso 6: si alguno de los resultados mostrados en los cromatogramas de A a G, es adecuado,
selecciónelo.
Si la separación no se consigue con ninguno de los pasos anteriores es necesario que usted pruebe una
columna diferente u otra forma de cromatografı́a.
6.12
Temperatura como una variable en separaciones isocrática
Cambiando la temperatura de la columna puede afectar la retención relativa de los diferentes compuestos en una mezcla, la temperatura tiene mucha influencia en compuestos iónicos( cationes amonio,
cationes carboxilatos)y moléculas con múltiples sustituyentes polares.
Para elevadas temperaturas de operación, el pH debe estar por debajo de 6 para retardar la
disolución de la fase estacionaria de sı́lica.
6.12.1
¿Como se consigue una buena separación?
Para hacer una buena separación se debe aumentar la resolución, para ello usted debe:
1. Disminuir la velocidad del flujo
2. Incrementar la longitud de la columna.
3. Disminuir el tamaño de las partı́culas en la columna.
1
El acetonitrilo es un reactivo peligroso por lo que sus desechos deben ser hidrolizados con acetato de sodio y vertidos
al drenaje.
Capı́tulo 7
CROMATOGRAFÍA DE FLUÍDOS
SUPERCRÍTICOS
La cromatografı́a de fluı́dos supercrı́ticos es una técnica de separación llamada también estracción
supercrı́tica. La cromatografı́a de fluı́dos supercrı́ticos tiene importancia por que permite la separación y la determinación de un grupo de compuestos que no se pueden analizar adecuadamente ni
por cromatografı́a de gas ni por cromatografı́a lı́quida
Los fluı́dos supercrı́ticos combinan caracterı́sticas de gases y lı́quidos Ej.: los coeficientes de difusión
y viscosidad de los FSC son semejantes a la de los gases de arrastre en cromatografı́a de gas, mientras
que sus densidades se aproximan a la de los lı́quidos.
Estos compuestos son los no volátiles o térmicamente lábiles a los que no se pueden aplicar los procedimientos de cromatografı́a de gas y aquellos que no contienen grupos funcionales que hagan posible su
detección por las técnicas espectroscópicas o electroquı́micas que se utilizan en cromatografı́a lı́quida
En CFS es posible hacer variar tres condiciones que son similares a los que se hacen variar en
HPLC: Temperatura, composición del eluyente y la velocidad de la fase móvil
• Fluı́do supercrı́tico (FSC): Cuando un sustancia se encuentra a valores superiores a los de
su punto critico se le conoce como fluidos supercrı́ticos. En estas condiciones no se lı́cua por
mas que se aumente la presión, ni se vaporiza por mas que se eleve la temperatura, por tanto la
fase lı́quida no se puede distinguir de la fase de vapor. Un fluido supercrı́tico se comporta como
un gas y como un lı́quido, es decir se difunde como un gas y puede disolver sustancias como un
lı́quido. Los FSC se carácterizan por el amplio rango de densidades que pueden adoptar.
Por encima de las condiciones crı́ticas pequeños cambios en la presión y la temperatura generan
grandes cambios en la densidad.
• Temperatura crı́tica: Temperatura por encima de la cual un gas miscible no puede ser licuado
independientemente de la presión. Los gases no se pueden licuar por encima de la temperatura
crı́tica, porque en este punto las caracterı́sticas de los gases y los lı́quidos son las mismas, no
habiendo bases sobre la cual distinguirlos.
• Presión crı́tica: La presión de vapor que adquiere una sustancia a temperatura crı́tica se denomina presión crı́tica. La presión de vapor de una sustancia nunca es superior a su temperatura
critica.
• Punto crı́tico: Temperatura y presión superiores próximas a la presión y temperatura crı́tica.
La tabla 7 muestra la temperatura, presión critica y punto de ebullición de algunos compuestos
Los valores experimentales de temperatura critica y presión crı́tica de una sustancia se pueden
calcular utilizando las constantes a y b en la ecuación de Van Der Walls 7.1
(p + an2 )
(v
v2
nb) = nRT
(7.1)
las constantes a y b sse pueden calcular a partir de su presión y temperatra crı́tica, de a cuerdo a la
siguiente ecuación:
48
Grupo de Investigación “GIAMP”
49
Tabla 7.1: Temperatura crı́tica, presión crı́tica y punto de ebullición de algunos compuestos comunes
Gas
He
H2
N2
CO
CO2
NH3
O2
Tc
267.96
240.17
146.89
140.23
31.04
132.4
118.38
Pc(atm)
2.61
12.77
33.54
34.53
72.85
111.3
50.14
a=
7.1
P. Ebullición
268.94
252.76
195.81
191.49
78.44
33.42
182.96
27R2 T c2
64P c
Carácterı́sticas de un fluı́do supercrı́tico
• Gran poder disolvente junto con una enorme capacidad de penetración en sólidos, lo que permite
el agotamiento rápido y prácticamente total de los sólidos extraı́bles.
• A diferencia en HPLC y GC en los FSC el aumento de presión a una temperatura dada incrementa la densidad la cual aumenta la solubilidad de la mayorı́a de los analitos.
Otra caracterı́stica de los FSC es que un aumento de temperatura a determinada presión produce una
menor densidad del fluı́do, lo que conduce a una menor solubilidad. Como resultado, incluso cuando
la temperatura y la composición del eluyente son constantes, la caı́da de presión desde la entrada
hasta la salida de la columna significa que las solubilidades de los analitos disminuye conforme estos
avanzan por la columna. Para resumir podemos decir que el método es menos sencillo que en GC y
HPLC.
7.2
Analitos
En la actualidad la CFS no es tan popular como GC o HPLC. Es una técnica casi ideal para realizar
separaciones de algunos surfactantes y polı́meros. Se prefiere la CFS para estos compuestos por que no
es necesario la volatilización para obtener un gas, y la transferencia de masas es un orden de magnitud
mayor que en las fases móviles de HPLC. Esto implica una reducción significativa del tiempo de
análisis, pues logra un equilibrio más rápido entre la fase móvil y la estacionaria. También se ha
demostrado que CFS es útil para separar algunos compuestos quirales. El orden de retención suele
ser el mismo que para HPLC quiral, pero las separaciones son mas rápidas.
7.3
Fase Móvil
La fase móvil en CFS se inicia en un cilindro de gas a alta presión, pero el fluı́do permanece comprimido y se calienta por encima de su temperatura critica, para ası́ obtener condiciones supercrı́ticas. El
dióxido de carbono es la fase móvil que se emplea con mayor frecuencia, debido a su bajo costo, no es
inflamable ni tóxico. Como no es polar se le agregan modificadores polares para permitir el análisis
de compuestos polares.
Los modificadores que se agregan con frecuencia incluyen metanol y etanol, para sustancias básicas
se usan aminas.
Los gradientes en CFS se obtienen cambiando las condiciones que modifican la solubilidad del
analito en la fase móvil supercrı́tica.
50
7.4
E.Lans
Cosolventes
Sustancia que se le agrega al sistema para aumentar la selectividad y el poder disolvente del fluı́do,
con caracterı́sticas similares a las del soluto. Se agrega en una concentración mayor que la del soluto
pero menor que la del disolvente.
Las diferencias de solubilidad de distintas sustancias en fluı́dos supercrı́tico se deben a las caracterı́sticas de los solutos sólidos tales como presión de vapor y a las interacciones particulares que se
establecen entre un soluto dado con el disolvente supercrı́tco. Como consecuencia de esto, moléculas
muy parecidas pueden tener solubilidades muy diferentes ej: La extraccón con CO2 supercrı́tico la
cafeı́na de los granos del café y de la teobromina de las hojas del té. Para la extracción de la
cafeı́na el proceso es excelente y no lo es ası́ para la extracción de la teobromina del té a pesar de que
la única diferencia entre ambas moléculas es que donde tiene la teobromina un átomo de hidrógeno, la
cafeı́na tiene un grupo CH3 . La extracción de cafeı́na es uno de los procesos más exitosos de extraccón
supercrı́tica, mientras que la baja solubilidad de la teobromina en CO2 supercrı́tico impide el uso de
este proceso para extraerla. Cerca de 100, 000 toneladas de café son tratadas anualmente con CO2
supercrı́tico para extraerlo totalmente.
7.4.1
Fluı́dos usados para extracción supercrı́tica
Para la extracción en fluı́dos supercrı́ticos se utilizan las siguientes fases móviles: CO2 , H2 O, C2 H6 ,
C2 H4 , C3 H8 , Xe, N2 O.
El CO2 cuya temperatura crı́tica de 31, 2o C cercana a la ambiente, se convierte en el disolvente apropiado para manejar sustancias lábiles a pesar de que sus propiedades como disolvente son mucho más
modesta que las del agua. Por ejemplo son insolubles en CO2 , incluso a altas densidades, las sustancias
polares y muchas no polares. La solubilidad de una sustancia en un disolvente supercı́tico es en general
menor que en los lı́quidos convencionales., esto se compensa por que cuando se emplean FSC la separación de soluto y disolvente le logra eficientemente mediante un simple proceso de expansión. Esto
evita tener que aumentar la temperatura para eliminar el disolvente por evaporación, como sucede
con los disolventes adicionales.
Los procesos que emplean FSC son, en general, más caros que los convencionales debido a costo de la
etapa de compresión y del confinamiento de los fluı́dos.
7.5
Forma e inyección de la muestra
La introducción de la muestra en CFS es similar a la inyección en HPLC. Las muestras en fase gaseosa
no son adecuadas para CFS. Los sólidos se extraen con los FSC y se concentra el extracto. El tipo de
muestra que se emplea en CFS con mayor frecuencia es una solución.
7.6
Columnas y fases estacionarias
Las columnas para CFS son prácticamente iguales a las de HPLC y algunas columnas en GC. Son de
acero inoxidable, y se empacan con partı́culas de 5 µm; los calibres pequeños de 250 y 530 µm son
los mas comunes. Las fases estacionarias pueden ser del tipo que se emplean en HPLC normal o fase
reversa: sı́lica porosa, alúmina y sı́lica con grupos orgánicos enlazados.
7.7
Detectores
Los detectores de gases FID y UV en HPLC deben estar construidos para funcionar con el volumen
relativamente grande de gas que se produce al despresurizar el fluı́do supercrı́tico.
Los detectores similares a los que se utilizan en HPLC se modifican para tolerar las presiones
necesarias para mantener a los fluı́dos supercrı́ticos.
Grupo de Investigación “GIAMP”
7.8
51
Areas donde se utilizan los fluı́dos supercrı́tico
Un área de reciente interés en la aplicación de los FSC es la de los procesos de descontaminación o
desctrucción de residuos tox́icos. Suelos o sedimentos fluviales contaminados con pesticidas, como
DDT y otros contaminantes orgánicos han sido tratados exitosamente con CO2 , mientras que fenoles
y productos relacionados han sido extraı́dos eficientemente de disoluciones acuosas. En lo relativo a
los desechos tóxicos, el agua supercrı́tica presenta una ventaja respecto a la incineración, ya que esta
última requiere temperaturas hasta de 1, 200o C, provocando la emisión de sustancias que contaminan el ambiente, entre ellos las dioxinas producidas por la incineración incompleta especialmente las
aromáticas policloradas.. Utilizando agua supercrı́tica a unos 500o C y en presencia de un oxidante
es posible quemar sustancias orgánicas completamente en una reacción térmicamente autosostenida,
produciendo sólo nitrógeno, dióxido de carbono y otras sustancias inorgánicas. El inconveniente radica
en la alta corrosividad del agua supercrı́tica sobre los materiales utilizados, lo que obliga a utilizar
aleaciones especiales encareciendo el proceso.
Otras áreas de utilización de FSC son los métodos analı́ticos separativos en cromatografı́a, utilizando fluı́dos supercrı́tico. Obtención de productos naturales y alimenticios(extracción de
aceites vegetales y grasa de semillas, drogas de plantas, aromas, sabores, perfumes y especias, eliminación de nicotina del tabaco). Separación de hidrocarburos pesados(desasfaltado de las fracciones pesadas del petróleo, recuperación y purificación de lubricantes, licuefación del carbón etc).
Regeneración(carbón activado, adsorbentes, filtros y catalizadores). Agua potable a partir de
agua de mar(oxidación de corrientes acuosas que contienen productos orgánicos).
Capı́tulo 8
ELECTROFORÉSIS
8.1
Introducción
Una separación electroforética se lleva a cabo inyectando una pequeña parte de la muestra a una
disolución tampón que está alojada en un tubo estrecho o en un medio de soporte poroso y plano,
como un tubo estrecho, papel o un gel semisólido. Seguidamente se aplica un elevado potencial de
corriente continua a través del tampón mediante dos electrodos situados en los extremos del tampón.
El potencial impulsa los iones de la muestra a migrar hacia uno u otro extremo de los electrodos. La
velocidad de migración de un especie dada depende de su carga y su tamaño.
Las separaciones en consecuencia se basan en las diferencias de la relación tamaño-carga entre
los diferentes analitos presentes en la muestra.Cuanto mayor es esta relación más rápido migra un
ión en el seno del campo eléctrico. La separación se lleva a cabo en un medio tamponado que actúa
simultáneamente como conductor de la corriente eléctrica y controlando o fijando la carga eléctrica de
las sustancias a analizar
8.2
Electroforésis
El término electroforésis se emplea para describir aquellas técnicas de separación que se basan en la
diferente movilidad que tienen las partı́culas cargadas en el interior de un campo eléctrico. Es un
método de separación que se basa en la diferente velocidad de migración de las especies cargadas, en
el seno de una disolución amortiguadora, a través de la cual se aplica un campo eléctrico constante.
El parámetro más importante de esta técnica es el campo eléctrico,(E) definido como el voltaje
aplicado por unidad de longitud del medio de separación, de acuerdo a esto, prodrı́amos decir que
cuanto mayor sea el campo eléctrico aplicado mayor serı́a la resolución que se podrı́a obtener, ya que
mayor será la velocidad de migración de los diferentes componentes de la muestra; no obstante, a
campos eléctricos elevados, la corriente eléctrica que circula por el medio de separación va a ser alta
y como consecuencia se va a generar una cantidad de calor. Este calor es un inconveniente por varias
razones a la hora de llevar a cabo una separación por que puede generar gradientes de temperaturas,
flujos de convección del tampón que dificultarı́a la separación, desnaturalización de proteı́nas o pérdidas
de actividades enzimáticas etc.
Para solucionar estos problemas generados por el calor se han utilizado varios procedimientos, entre
ellos trabajar a campos eléctricos bajos, pero podrı́amos obtener tiempos de separación muy grandes
y mala resolución. trabajar con medios anticonvectivos, como los geles de poliacrilamida o garosa que
de acuerdo a su naturaleza microporosa son resistentes a la circulación del tampón. trabajar a campos
eléctricos altos pero la separación se da dentro de un capilar relleno de tampón esto último dió origen
a la electroforésis capilar
52
Grupo de Investigación “GIAMP”
8.2.1
53
Tipos de electroforésis
Existen dos tipos de electroforésis, electroforésis capilar y la electroforésis convencional.
8.2.2
Electroforésis convencional
Es utilizada para separar especies complejas, de elevado peso molecular, de interés biológico y bioquı́mico.
En la electroforésis convencional, las separaciones se llevan a cabo sobre una capa delgada y plana
o placa de un gel semisólido y poroso que contiene un tampón acuoso en el interior de sus poros.
En estas placas se pueden separar varias muestras simultáneamente como en cromatografı́a en capa
fina. Las muestras se disponen como manchas o bandas sobre la placa y se aplica el potencial de
corriente continua, a través de la placa, durante un perı́odo de tiempo fijo. Cuando creemos que las
separaciones se ha completado se interrumpe el paso de la corriente, y las especies separadas se tiñen
para visualizarse.
La velocidad de migración de un ión en centı́metros por segundo, en el seno de un campo eléctrico es
igual al producto de la intensidad del campo eléctrico por la movilidad electroforética.
⌫ = µe E
⌫ = velocidad de migración
E = campo eléctrico en (V cm 1 )
µe = movilidad electroforética en (cm2 V 1 S 1 )
La movilidad electroforética es directamente proporcional a la carga del analito e inversamente proporcional a los factores de retardo por rozamiento. El potencial eléctrico actúa sobre los iones por lo
que se moverán a través del tampón.
Para iones del mismo tamaño la fuerza impulsora será mayor en el de mayor carga, y tendrá una
movilidad de migración mas rápida. Para iones que tengan igual carga la velocidad de migración será
más rápida en el ión más pequeño. La relación tamaño-carga de los iones cambiarán estos efectos.
La electroforésis convencional es lenta y laboriosa y además no proporciona resultados cuantitativos
precisos.
Finalmente podemos decir que la velocidad a la cual un soluto se mueve en respuesta a un campo
eléctrico aplicado se llama velocidad electroforética.
8.2.3
Electroforésis capilar
Los principios teóricos de la electroforésis capilar son bastante parecidos a la electroforésis convencional.
La electroforésis capilar da lugar a separaciones con volúmenes de muestra de 0.1 a 10 nL, contrario
a la convencional que usa volumen de uL.
Aquı́ en vez de colorear, para identificar la sustancia se utilizan detectores cuantitativos como los
empleados en HPLC.
Velocidad de migración
La velocidad de migración depende de la intensidad del campo eléctrico aplicado. El campo eléctrico
(E) se determina por la magnitud del potencial aplicado (V en voltios) y la longitud sobre la que se
aplica.
V
L
Bajo ciertas condiciones el ión se moverá a velocidad constante, siendo balanceado por la fuerza de
fricción.
qE = 6⇡⌘r⌫
⌫ = µe
54
E.Lans
donde q = carga
⌘ = viscosidad de la solución
r= radio hidrodinámico
⌫ = velocidad
La movilidad electroforética viene dada por:
µe =
q
6⌘⇡r
lo que indica que a mayor carga mayor movilidad y viceversa.
Factores que determinan la resolución en electroforésis capilar
• Número de platos:
En cromatografı́a tanto la difusión longitudinal como la transferencia de masas contribuyen al ensanchamiento de la banda. Como en electroforésis está implicada una sola fase, solo se considera la
difusión longitudinal. Para electroforésis el número de platos (N ) viene dado por la siguiente expresión
N = µe
V
2D
D = Coeficiente de difusión del soluto en cm 2 S 1
Como la resolución se incrementa al aumentar el número de platos, se debe aplicar un elevado potencial
para obtener mayores separaciones. Obsérvese que aquı́ el número de plato no se incrementa con la
longitud de la columna.
La electroforésis capilar genera normalmente un número de platos comprendido entre 100.000 y
200.000 comparados con los 5.000 y 20.000 obtenidos en HPLC.
• Flujo electroomóstico
Cuando se aplica un potencial elevado a través de un capilar que contiene un tampón, se origina un
flujo llamado, flujo electroosmótico, gracias al cual el solvente migra hacı́a el ánodo o el cátodo.
La causa del flujo electroosmótico es la doble capa eléctrica que se forma en la interfase sı́lice/disolución.
Figura 8.1
A valores de pH por encima de 3 la pared interna de un capilar de sı́lice presenta carga negativa
debido a la ionización de los grupos silanoles (Si OH) de la superficie. Los cationes del tampón se
agrupan sobre la superficie negativa de capilar de sı́lice para formar la doble capa eléctrica.
Los cationes que están en la capa exterior de la doble capa, son atraı́dos hacı́a el cátodo, y dado
que los cationes están solvatados arrastran el resto de la disolución con ellos a lo largo del capilar. La
electroósmosis conduce un flujo en la disolución que tiene un perfil plano, perpendicular al capilar,
contrario del perfil parabólico del flujo en cromatografı́a lı́quida, cuyo origen es la presión. Debido a este
Figura 8.1: Flujo electroosmotico
Grupo de Investigación “GIAMP”
55
perfil plano el flujo electrosmótico no contribuye al ensanchamiento de banda de manera significativa,
como sı́ ocurre con el flujo producido por la presión en HPLC. Figura 8.2.
Aunque los analitos migran según su carga dentro del capilar, la velocidad del flujo electrosmótico
es normalmente suficiente como para arrastrar todas las especies cargadas positivamente, los neutros
y los cargados negativamente hacia el mismo extremo del capilar, de tal forma que todos ellos pueden
detectarse al pasar por un punto común. El electroforegrama es similar a un cromatograma. La
velocidad de flujo electrosmótico viene dada por una ecuación similar a la anteriormente vista, esto
es:
⌫eof = µeo E
Ası́ podemos definir la velocidad del flujo electros’mótico Veof como la velocidad con el cual el soluto
se mueve a través del capilar debido al flujo electrosmótico.
La velocidad con el cual un soluto se mueve respecto al campo eléctrico aplicado se llama velocidad
electroforética.
En presencia de la electroósmosis la velocidad de un ión es la suma de su velocidad de migración y de
la velocidad del flujo electrosmótico ası́:
V = (µeo + µe )E
(8.1)
µe = En caso de un anión tendrá signo negativo
Como consecuencia de la electroósmosis, el orden de elución en una separación por electroforésis capilar tı́pica es:
Primero los cationes más rápidos, seguido de los más lentos, segundo las especies neutras en una
zona y finalmente los aniones. Figura 8.3
En algunos casos la velocidad de flujo electrosmótico no es lo bastante grande como para superar la
velocidad a la cual se mueven algunos aniones hacia el ánodo, en cuyo caso estas especies se desplazan
hacia el ańodo.
8.2.4
Cambio de sentido del flujo electroosmótico
Se logra agregando un tensoactivo catiónico al tampón. El tensoactivo se adsorbe sobre la pared del
capilar y hace que esta quede cargada positivamente. Ahora los aniones del tampón se agrupan en las
proximidades de la pared y son arrastrados hacia el ánodo (electrodo positivo).
Esta estratagema se usa a menudo para acelerar la separación de los aniones.
El flujo electrosmótico puede ser eliminado recubriendo la pared interna del capilar con un reactivo
como el trimetilclorsilano para eliminar los grupos silanoles de la superficie.
8.3
Instrumentación
Consta de un capilar de sı́lice fundida de 10-100 µm de diámetro interno y de 40 a 100 cm. de longitud.
Está lleno de un tampón conectado entre si por dos recipientes que contienen el mismo tampón, y dos
(2) electrodos de platino.
La introducción de la muestra se lleva a cabo por uno de los extremos y la detección por el otro.
Figura 8.4
8.3.1
Introducción de la muestra
Inyección electrocinética
Un de los recipientes del capilar se retira con su respectivo electrodo. Luego este extremo es sumergido
en el recipiente donde se encuentra la muestra y se le aplica un potencial determinado hasta que la
muestra penetre en el capilar debido a la actuación conjunta de los fenómenos de migración iónico y
flujo electrosmótico. Luego el extremo retirado se coloca nuevamente en la solución tampón original
donde se mantiene durante el proceso de separación.Figura. 8.5
56
E.Lans
Figura 8.2: Perfil del flujo electro osmótico
Figura 8.3: Dirección del flujo electroosmótico
Figura 8.4: Componentes básicos de un sistema de electroforésis capilar
Grupo de Investigación “GIAMP”
57
Figura 8.5: Métodos de introducción de muestra
Inyección por presión
Se retira un extremo del capilar y se introduce en el recipiente de la muestra, a la cual se le aplica una
diferencia de presión. Esta diferencia de presión proviene de aplicar vacı́o en el extremo del detector o
de la aplicación de presión en el recipiente que contiene la muestra, o bien por elevación del extremo
que contiene la muestra. En ambos casos el volumen inyectado se controla por la duración de la
inyección. 5-50 nL son los mas comunes.
8.4
Sistema de detección
Los detectores son similares en diseño y función a los utilizados en HPLC. La diferencia está en
el comportamiento de éstos; en electroforésis capilar cada ión migra a una velocidad determinada
debido a su movilidad electroforética. Por tanto las bandas del analito llegan al detector a diferentes
velocidades, lo que hace que las áreas de los picos sean dependientes del tiempo de retención. En
cambio en HPLC todas las especies pasan a través del detector a la misma velocidad de la fase móvil,
ası́ que las áreas de los picos son independientes de los tiempos de retención.
8.4.1
Métodos de absorbancia
El camino óptico para las medidas de absorbancia es muy pequeño, y para mejorar estas medidas se
han propuestos varios métodos.
1. Celda tipo Z de 3 mm: Se dobla el capilar en forma de Z para aumentar el camino óptico.
2. Celda de tipo burbuja de 150 µm: Se forma una burbuja en el extremo del capilar
3. Celda de reflexiones múltiples: En el extremo del capilar se deposita un recubrimiento de
plata reflectante , y la radiación experimenta numerosas reflexiones antes de salir del capilar.
Figura.8.6
8.5
Modalidades de la electroforésis capilar
La electroforésis capilar es el nombre genérico para una familia de técnicas relacionadas que tiene su
origen en la electroforésis capilar por zona (CZE) y son: electroforésis capilar por gel(CGE), enfoque
isoeléctrico capilar(CIEF), cromatografı́a capilar miscelar electrocinética (MECC) y la isotacoforésis
capilar(CITP). Aunque las técnicas difieren significativamente una de otras, se pueden llevar a cabo
con la misma instrumentación básica.(Braithwaite & Smith 1999)
58
E.Lans
Figura 8.6: Diseños de celda para mejorar la sensibilidad de detección por medida de absorbancia aumentando
el camino óptico
8.5.1
Electroforésis capilar por zona (CZE)
La composición del tampón es constante en toda la zona de separación. El potencial aplicado hace
que los diferentes componentes iónicos de la mezcla migren cada uno según su propia movilidad y
se separen en zonas. El capilar es llenado solamente con el bu↵er y las separaciones de los analı́tos
ocurren basándose en la razón masa/carga.
8.5.2
Electroforésis capilar en gel (CGE)
Se lleva a cabo en una matriz polimérica con estructura de gel poroso, cuyos poros contienen una
mezcla tampón en la que se lleva a cabo la separación.
8.5.3
Isotacoforesis capilar
Las bandas de todos los analitos migran finalmente a la misma velocidad, por eso recibe el nombre
de ISO, igual y TACO velocidad. La razón por la cual todas las bandas se mueven a la misma velocidad es que el potencial se hace mas reducido para las bandas más móviles, y se hace mas intensa
para las bandas mas lentas, de tal forma que la corriente es la misma en todas las zonas del tampón.
(Braithwaite & Smith 1999)
En isotacoforésis un campo eléctrico es aplicado a un sistema electrolı́tico que comprende un electrolı́to principal y un electrolı́to de arrastre, y una alı́cuota de muestra, la cual es colocada entre los
dos. El electrólito principal es escogido de tal manera que su movilidad sea mayor que algunos de los
analitos, y el electrólito de arrastre sea el de menor movilidad. Tanto aniones como cationes pueden
ser analizados pero no en la misma corrida. El capilar primero se llena con el electrólito principal
seguido de la muestra, un voltaje es aplicado y la separación de las especies ocurren en los espacios
entre el electrolito principal y el electrolito de arrastre, de acuerdo con su movilidad electroforética.
8.5.4
Cromatografı́a capilar electrocinética miscelar (MECC)
Se logra la resolución de los aniones, neutrones y cationes combinando los efectos de la migración
electroforética y la partición miscelar. Las miscelas son agregados afipáticos moleculares llamados
surfactantes los cuales tienen una cadena molecular larga caracterizado por tener una parte hidrofı́lica
y la otra hidrofóbica (cabeza y cola). Las miscelas son formadas en soluciones acuosas con una cola
hidrofóbica orientado hacia adentro y una cabeza hidrofı́lica orientada hacia afuera. Las miscelas
aunque cargadas negativamente migran hacia el cátodo bajo la influencia del flujo electrosmótico
Grupo de Investigación “GIAMP”
59
(EOF).
Durante la migración las especies de interés pueden interactuar con las miscelas a través de los procesos hidrofóbicos y electrostáticos. Ası́ las moléculas se partirán dentro y fuera de la miscela basándose
en su hidrofobocidad. Cuando el analito mas hidrofóbico se asocia con la miscela y su velocidad de
migración es desacelerada.
Los surfactantes mas comunes usados en MECC son anionicos y catiónicos.
8.6
Enfoque isoeléctrico capilar(CIEF )
Se usa para separar compuestos como aminoácidos, péptidos, proteı́nas y compuestos que pueden
existir como zwitterion1 sobre la base de su punto isoelectrico(PI).
La columna capilar es llenada con una solución de anfolito soporte sobre la base de su punto isoeléctrico
y la muestra; cuando se aplica un voltaje al analito, éste es cargado y unos migrarán hacı́a el cátodo
(el cual está en contacto con una solución básica) y otros migrarán hacı́a el ánodo (el cual estará en
contacto con una solución ácida).
La migración se detiene cuando el anfolito alcanza su punto isoeléctrico y ya no es cargado más.
El anfolito mantiene un pH local que corresponde a este PI, debido a su fuerte capacidad bu↵er.
Aquellos solutos como las proteı́nas también migran hacia el ánodo dependiendo de su carga, hasta
encontrar un pH donde su carga neta sea cero. En este punto la migración se detiene y el soluto se
dice que está enfocado, luego las bandas de solutos son movilizadas y migran hacia el detector. La
movilización puede ir hacia el ánodo o hacia el cátodo agregando una sal en el compartimiento del
electrodo apropiado o usando un flujo presurizado.
El EOF es eliminado en CIEF cubriendo las paredes del capilar, esta técnica ha sido exitosa para la
separación de inmunoglobina y hemoglobinas.
8.7
Aplicaciones
Podrı́a decirse que las aplicaciones de la electroforésis capilar son enormes. Las eficiencias alcanzadas
son bastante asombrosas, 2 ⇥ 105 platos teóricos son generados en menos de 10 minutos de análisis.
Las separaciones se pueden lograr basándose en las diferencias de carga, movilidad, tamaño, hidrofobocidad y clases de compuestos, lográndose separaciones de nucleótidos, péptidos bioactivos, proteı́nas,
vitaminas y un gran número de productos farmacéuticos o incluso, iones orgánicos.
1
Ión dipolar quı́micamente neutro
Bibliografia
Braithwaite, A. & Smith, F. (1999), Chromatographic Methods, fifth edn, Kluwer Academic Publishers.
John.Kenkel (2014), Analytical Chemistry for technicians, 4 edn, CRC. Press.
McNair, H. M. & Miller, J. M. (1998), Basic Gas Chromatographic, 1 edn, John Wiley and Sons, INC.
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Índice Alfabético
Adsorbentes, 16
Aplicaciones, 39
Asimetrı́a, 9
Co-cromatografı́a, 29
Coeficiente de difusión, 4
Coeficiente de partición, 8
Columnas, 42
empacadas, 22
tubulares abierta, 21
Columnas analı́ticas, 42
Constante de distribución, 8
Constante RF, 19
Cosolventes, 50
Cromatografı́a, 1
capa fina, 15
de fluı́dos supercrı́ticos, 2
de gases, 2
fase reversa
fase normal, 43
lı́quida, 2
plana, 1
Cromatografı́a de adsorción, 43
Cromatograma, 5
Desorción, 34
Detector, 37
FID
ECD, 24
Fotométrico de llamas, 25
TCD
NPD, 25
Difusión, 54
Dioxinas, 51
Eficiencia, 10, 41
Electroforéris
capilar por zona
en gel, 58
Electroforésis
capilar, 53
convencional, 52
Eluato, 5
Elución, 42
Eluyente, 5, 16
Factor de capacidad, 5
Factor failing, 9
Fluı́do supercrı́tico, 48
Flujo electrosmótico, 55
Fuerzas
iónicas
enlaces de hidrógeno, 9
repulsión
Van Der Walls, 10
Gradiente, 45
Inyección
on column, 27
por presión
electrocinética, 55
split
splitless, 27
Ionización
por bombardeo de átomos rápidos
electrospray, 35
quı́mica
quimı́ca negativa, 34
ionización, 36
EI, 33
Ionización por campo, 34
Isotacoforésis, 58
Isoterma, 12
Lábil, 50
Métodos
quı́micos
fı́sicos , 17
Masas, 33
Número de plato, 54
Placas, 16
Plato teórico, 6
Presión crı́tica, 48
Punto crı́tico, 48
Resolución, 3, 46, 54
Retención relativa, 5
Separación, 1, 47
Solventes, 45, 46
Supercrı́tico, 50
61
62
supercrı́tico, 51
Tailing, 9, 43
Tandem, 39
Temperatura crı́tica, 48
Tiempo
muerto
retención ajustado, 6
Van Deemter, 11
E.Lans
Bibliografia
Braithwaite, A. & Smith, F. (1999), Chromatographic Methods, fifth edn, Kluwer Academic Publishers.
John.Kenkel (2014), Analytical Chemistry for technicians, 4 edn, CRC. Press.
McNair, H. M. & Miller, J. M. (1998), Basic Gas Chromatographic, 1 edn, John Wiley and Sons, INC.
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