TEMA 7: SIEMBRA DE UNA MUESTRA BIOLÓGICA INTRODUCCIÓN: Sembrar consiste en depositar un inóculo o muestra en un medio de cultivo apropiado para su crecimiento y desarrollo. Para poder llegar a la identificación de una bacteria, es preciso separarla de otras que puedan coexistir con ella. Para ello se efectúan siembras para aislamiento. Se aislarán así los microorganismos, para obtener después cultivos puros (donde sólo hay un tipo de microorganismo), A partir de estos cultivos puros realizaremos diferentes pruebas para identificar al microorganismo. Cuando una bacteria se desarrolla en un medio de cultivo sólido, da lugar a una colonia de elementos derivados de la misma. Por lo tanto podemos definir colonia como un conjunto de microorganismos idénticos entre sí porque proceden todos de un solo microorganismo viable o unidad formadora de colonia. Resembrar consiste en pasar un microorganismo de un medio de cultivo a otro. Inóculo es una cantidad suficiente y representativa del microorganismo problema. Es necesario preparar un inóculo de siembra para obtener resultados fiables, cuando las muestras sean muy viscosas o concentradas y para técnicas en las que se pretenda el aislamiento del germen o la realización de un análisis cuantitativo. TÉCNICA GENERAL DE PREPARACIÓN DE INÓCULOS: Se obtienen a partir de un cultivo joven (fase exponencial del crecimiento) y puro, o de una muestra. Técnica: 1.- Se toma con el asa estéril varias colonias de un cultivo o una porción de la muestra biológica, y se suspende en unos 5 ml de solución diluyente, tras lo cual se homogeniza. Como diluyente se pueden utilizar: o Caldo de cultivo: se usará un medio base líquido. Normalmente el que se vaya a utilizar después pero sin agar. o Solución salina estéril: suele ser lo más adecuado. o Agua destilada estéril: si no disponemos en el momento de ninguno de los dos anteriores. 2.- También se puede preparar un inóculo tomando con el asa estéril varias colonias de un cultivo o una porción de la muestra biológica, y sembrándolas por estría en superficie en un tubo que contenga un medio base sólido inclinado. Con frecuencia necesitamos para ciertas técnicas una concentración determinada de microorganismos. Esto se consigue estandarizando el inóculo. ESTANDARIZACIÓN DE UN INÓCULO: TÉCNICA DE KIRBY-BAUER: Se basa en utilizar un gradiente de turbidez. Cada tubo de la escala va numerado y sirve como patrón de referencia, según la concentración de microorganismo que se requiera. Cuanta más turbidez más microorganismos habrá. El inóculo se puede ajustar al patrón de referencia de dos formas: o Por comparación visual aproximada: comparando la turbidez de la muestra con la de los patrones de la escala. Es menos exacta y es útil sobre todo para operadores con cierta experiencia. o Por espectrofotometría: haciendo coincidir la absorbancia (la turbidez) del problema con la del patrón requerido. Una escala universalmente aceptada es la escala de Mc Farland, constituida por una serie de tubos en los que se origina un precipitado blanco de sulfato bárico, por reacción de ácido sulfúrico con cloruro bárico. Número del tubo Cl2Ba.2H2O al 1,175% P/V (ml) SO4H2 al 1% V/V (ml) Densidad celular aproximada (x 108/ml) 0,5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 9,9 5 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 1,5 3 6 9 12 15 18 21 24 10 1 9 27 3 30 Preparación de los patrones turbidimétricos de la escala de Mc Farland CONSIDERACIONES GENERALES SOBRE LA SIEMBRA: Antes de comenzar la siembra se colocan ordenadamente y a mano todos los medios y utensilios que van a necesitarse sobre una mesa limpia y protegida con papel de filtro. También es necesario disponer de recipientes con solución desinfectante para ir depositando el material contaminado. Los medios de cultivo que van a inocularse deben estar atemperados y libres de agua de condensación. Las placas no deben estar fuera del frigorífico más de dos horas, para evitar la desecación del medio. Todos los procedimientos de inoculación deben efectuarse en condiciones de asepsia y con utensilios perfectamente estériles. Trabajar siempre cerca de la llama del mechero para prevenir riesgos. Identificar las placas, tubos, portaobjetos y cualquier recipiente de la muestra para su reconocimiento posterior. Antes se solía emplear un número de orden, la fecha del día y las iniciales de nombre y apellidos del paciente (por ej., 24/18-5-CMF), hoy se usan los códigos de barras. Las placas se rotulan en la parte inferior que contiene el medio, por si la tapadera pudiera cambiarse o extraviarse. Flamear el asa, hilo o instrumento utilizado para la siembra, si no es de material desechable, inmediatamente antes y después de su empleo. Evitar introducirlos calientes dentro de la muestra, porque se pueden formar aerosoles que originan contaminación ambiental y porque ocasionaría la destrucción de los microorganismos por el intenso calor. Evitar el golpeo brusco del asa sobre los medios de cultivo o las paredes de los recipientes, así como la expulsión intensa de los contenidos de pipetas y jeringas, que provocan la formación de aerosoles. Las pipetas para tomar muestras deben estar taponadas con algodón graso y se emplearán dispositivos de pipeteo por razones de seguridad. El inóculo no debe soplarse en los tubos o placas para evitar contaminación. Flamear la boca de los recipientes después de abrirlos y antes de cerrarlos, con el fin de crear una atmósfera caliente que prevenga la contaminación; los tapones se toman con el dedo meñique de la mano derecha y nunca se dejan sobre la mesa. Mantener las placas cerca de la llama del mechero siempre que se abran, para asegurar una atmósfera estéril. Igual se procederá con tubos, matraces, frascos, etc. Las placas sembradas se incubarán de forma invertida y siempre se mantendrán en esta posición salvo para la técnica del antibiograma por difusión. INSTRUMENTOS USADOS PARA LA SIEMBRA: Asa de siembra: su principal aplicación es la estriación de placas y la siembra en medios líquidos. Antes se usaban de platino, pero actualmente se usan más las asas de nicron, un material mucho más barato y resistente, o las asas de plástico desechables y calibradas; estas últimas han conquistado el mercado por su comodidad de manejo. Hilo o aguja de siembra: se utilizan fundamentalmente para realizar siembras en picadura. También han sido reemplazados los de platino por los de nicron o los de material plástico, desechables. Escobillón o hisopo: se trata de una varilla de madera, plástico o alambre, que en uno de sus extremos lleva enrollada una porción de algodón. Son muy útiles para efectuar la primera parte de la siembra (descarga) a partir de los productos patológicos, para la transferencia de cultivos líquidos a placa y de cultivos líquidos a medios líquidos y para la siembra masiva. Varilla, asa o espátula de Drigalsky: se usa para la siembra masiva en superficie. Pueden ser de vidrio o de plástico (desechables). Pipeta Pasteur: se utiliza para la inoculación de muestras líquidas fundamentalmente. Hoy día se emplean con preferencia las pipetas estériles de plástico, desechables. Jeringas: son adecuadas para la inoculación de las muestras tomadas mediante punción y transportadas dentro de ellas. Además se utilizan para subcultivos en placa a partir de frascos de hemocultivo y para transferir cultivos líquidos. TÉCNICAS DE SIEMBRA: 1. - SIEMBRA EN TUBO: 1.A.- EN MEDIO LÍQUIDO: Cuando la muestra es líquida se toma con el asa previamente flameada, (o con la jeringa, el hisopo, etc.) lo más vertical posible y se introduce en el medio de cultivo cerca de la superficie, depositando el contenido del asa en el seno de éste, moviendo ligeramente el asa. Cuando la muestra es sólida se hace igual pero golpeando ligeramente la pared del tubo cerca de la superficie del medio. Inoculación con asa: Técnica: - Sujetar ambos tubos con la mano izquierda. El tubo donde está el microorganismo entre los dedos índice y corazón y el tubo que vamos a inocular entre el corazón y el anular *, usando el dedo pulgar para sujetar ambos tubos. - Mantener los tubos lo más horizontal posible siempre cerca del mechero y con la boca dirigida a la llama. - Con la mano derecha flamear el asa hasta ponerla al rojo en toda su extensión, después se flamea la parte metálica del mango de Kölle y por último se pone otra vez al rojo el asa. - Esperar a que se enfríe manteniéndola en la zona aséptica. - Quitar mientras los tapones de los dos tubos y sujetarlos entre los dedos corazón y anular el del tubo estéril, y entre anular y meñique el tubo que contiene la muestra *, cuidando que no nos rocen ni se rocen entre sí. Si el tapón es de algodón graso, la parte que se sostiene es siempre la que sobresale del tubo, la parte que penetra en el tubo nunca debe tocarse con los dedos, no debe rozarse con la mano ni con el algodón del otro tubo, y por supuesto no debe caerse a la mesa o al suelo, con el objeto de no contaminar el interior del tubo. - Flamear la boca de los tubos a la llama. - Inclinar los tubos unos 30º, tomar la muestra del tubo más lejano y hacer una descarga del inóculo frotando suavemente el asa contra la pared del tubo más cercano por debajo del menisco formado. - Flamear las bocas del tubo, taparlos y flamear el asa. - Soltar el asa y el tubo que contenía la muestra. - Mover suavemente el tubo que acabamos de sembrar, mediante movimientos de rotación. El tapón nunca debe mojarse. - Llevar a incubación. * El coger los tubos y los tapones con uno u otro dedo es para no confundir jamás los tubos y los tapones entre sí. Es una sugerencia que puede modificarse, pero en cualquier caso cada operador siempre debe seguir la misma norma. Cuando se trata de microorganismos anaerobios hay que procesarlas en cámaras de anaerobiosis. Si no se dispone de ellas, se deben procesar lo más rápidamente posible. Además el tubo a inocular se hervirá unos diez minutos a 100ºC, a fin de expulsar el oxígeno disuelto (si el medio lleva un indicador rédox incorporado, se hervirá hasta que desaparezca el color del indicador). Después se enfría al chorro de agua fría hasta 45-50ºC y se añade el inóculo masivamente, tratando de no agitar enérgicamente para evitar la entrada de burbujas de aire. Finalmente se le añade de 0,5 a 1 cm 3 de vaselina líquida o parafina estéril a fin de crear una barrera al medio para evitar la penetración de aire. Inoculación con pipeta Pasteur o jeringa: Técnica: - Tomar el problema con una pipeta o jeringa estéril. - Destapar el tubo y flamear la boca del mismo. - Depositar en el interior del tubo el volumen de muestra deseado. - Flamear la boca del tubo y cerrarlo. Homogeneizar su contenido. - Dejar la pipeta o jeringa en el recipiente adecuado. - Llevar a incubación. Inoculación con escobillón o hisopo estéril: Técnica: - Tomar la muestra con el escobillón o hisopo estéril. - Destapar el tubo y flamear la boca del mismo. - Introducir el escobillón en el medio, agitándolo con movimientos de rotación. También se puede romper el escobillón por la parte contaminada del extremo superior y se deja el resto dentro del medio. - Flamear la boca del tubo y taparlo. - Si es necesario, depositar el escobillón en el recipiente adecuado o introducirlo en su funda y llevarlo a esterilizar. - Llevar a incubación. 1.B.- EN MEDIO SÓLIDO: Siembra por estría en superficie en agar inclinado: Técnica: - Flamear el asa (o el hilo) y esperar a que se enfríe. - Tomar el problema con el asa (o el hilo). - Quitar el tapón del tubo con el dedo meñique de la mano derecha (si se es diestro) y flamear ligeramente la boca del mismo. - Introducir el asa (o el hilo) y hacer una suspensión del inóculo en el agua de condensación del fondo del tubo; a continuación sembrar en estrías desde abajo hacia arriba con un movimiento en “S” procurando que las estrías queden bastante juntas. - Flamear la boca del tubo y taparlo. - Flamear el asa. - Llevar a incubación. Si la muestra se encuentra en un tubo, deberán tomarse los dos tubos a la vez y seguir los seis primeros pasos de la técnica de siembra en medio líquido con asa, después continuar con el punto cuarto de esta técnica. Este tipo de siembra se hace en tubos con agar inclinado o en pico de flauta y se suele utilizar para la obtención de cultivo puro en cantidad suficiente para a partir de él, realizar las pruebas necesarias. Siembra en profundidad o picadura: Técnica: - Introducir el hilo de siembra con el inóculo hasta aproximadamente la mitad del medio, por su eje central con un movimiento recto y vertical. - Retirar el hilo por el mismo sitio, sin hacer desgarros en el medio. - Llevar a incubación. Este tipo de siembra se hace en tubos con el medio no inclinado y se utiliza sobre todo para microorganismos anaerobios o facultativos y para ver la movilidad de los microorganismos si el medio es semisólido. Se emplea el hilo para evitar que el asa desgarre al medio. Otro tipo de cultivo en profundidad consiste en fundir el medio e inocular el microorganismo como si fuera en medio líquido, rotarlo entre las manos, esperar a que se solidifique e incubarlo (siembra en masa). Si el microorganismo es anaerobio se sigue un proceso semejante al descrito para la siembra en medio líquido de este tipo de microorganismo. La única diferencia es que el medio debe enfriarse hasta que esté sólido Los medios para anaerobios suelen llevar un indicador redox y un agente reductor como el tioglicolato sódico. Siembra en profundidad y estría: Consiste en combinar los dos métodos anteriores. Se debe hacer siempre con hilo para no desgarrar el medio. Técnica: - Igual que la técnica anterior, sólo que antes de sacar el hilo del tubo donde se ha hecho la picadura, se lleva hasta la zona más profunda del pico de flauta y se hace una estría como en el primer método, teniendo más cuidado porque con el hilo se desgarra más el agar. Este tipo de siembra se utiliza para microorganismos facultativos, para ver la movilidad de los microorganismos, para determinadas pruebas bioquímicas y para conservar los microorganismos vivos en el laboratorio (en este caso hay que refrigerar). Siembra en masa: Técnica: - Fundir el medio e inocular el microorganismo. - Rotar el tubo entre las manos. - Esperar a que se solidifique. - Llevar a incubación. 2.- SIEMBRA EN PLACA: 2.A.- SIEMBRA PARA AISLAMIENTO: Inoculación por estrías o en zig-zag: Se realiza este tipo de siembra para obtener colonias perfectamente aisladas a partir de la muestra o de suspensiones concentradas de microorganismos. Como ya hemos dicho, cuando se trata de microorganismos anaerobios hay que procesar las muestras en cámaras de anaerobiosis. Si no se dispone de ellas, se deben procesar lo más rápidamente posible. Para la siembra se pueden usar las placas de Petri normales, pero incubándolas en condiciones anaerobias, o bien usar las placas con tapaderas de Brewer, que están especialmente ideadas para eliminar el oxígeno y permitir al mismo tiempo el cultivo en superficie de colonias anaerobias Se puede usar agar de Brewer que contiene tioglicolato sódico como agente reductor. Consiste en diseminar la muestra en la placa hasta agotarla. Donde depositamos la muestra y al principio de la siembra, los microorganismos forman colonias que se desarrollan juntas, pero a medida que la extensión continúa, la suspensión o la masa de microorganismos contenida en el asa se va agotando y se originan colonias bien separadas, cada una de las cuales procede de un microorganismo o de una unidad viable. Esto se consigue siguiendo alguno de estos esquemas: Técnica de la estría en placa completa: - Dividir mentalmente la placa en dos mitades. - Flamear el asa y mantenerla en la zona aséptica hasta que se enfríe. - Tomar la muestra. - Abrir la placa lo menos posible pero lo suficiente para no rozar los bordes al sembrar. - Colocar el asa con la muestra en el borde más alejado del operador y diseminar el inóculo extendiendo la muestra de borde a borde de la placa, en estrías paralelas muy próximas en dirección al operador. - Cuando se alcance el centro de la placa, levantar el asa del agar y sin sacarla girar la placa unos 180º. - Continuar la extensión diseminando el resto del inóculo en estrías algo más separadas, ahora alejándonos del operador. Esto evita el obstáculo del borde de la placa. - Flamear el asa antes de soltarla. Técnica de los cuatro cuadrantes: - Dividir mentalmente la placa en cuatro cuadrantes. - Flamear el asa y mantenerla en la zona aséptica hasta que se enfríe. - Tomar la muestra. - Abrir la placa lo menos posible pero lo suficiente para no rozar los bordes al sembrar. - Colocar el asa con la muestra en el borde más alejado del operador y descargar el asa en el primer cuadrante, realizando estrías. - Levantar el asa del medio y sin sacarla girar la placa 90º - Repetir lo anterior en cada uno de los otros cuatro cuadrantes. Técnica de la descarga masiva: - Flamear el asa y mantenerla en la zona aséptica hasta que se enfríe. - Tomar la muestra. - Levantar la placa cerrada a la altura de la llama del mechero y abrirla a esa altura, lo menos posible pero lo suficiente para no rozar los bordes al sembrar. - Sosteniendo la placa a la altura de la llama, depositar la muestra en el borde de la placa más alejado y sembrar mediante estrías muy juntas, hasta superponerse. - Flamear el asa, rotar la placa (puede hacerse a la altura a la que tenemos la placa o bajándola sobre la mesa pero, en este caso, cerrándola y abriéndola a la altura del mechero) y tocar con el asa fría la muestra depositada anteriormente, arrastrándola hacia otra zona de estrías en ángulo con las primeras y tocando éstas, de forma que la carga de inóculo se haga en la estriación anterior. Es muy importante que esta segunda zona de estrías toque a la primera, ya que de no ser así, al haber esterilizado el asa, no habría aquí crecimiento. - Repetir el proceso siempre flameando el asa y arrastrando la muestra anterior, hasta conseguir 4 ó 5 zonas de estría. En este punto es fundamental que la última estría no toque la primera. - Por último, y ya sin esterilizar el asa hacer una última estría pequeña, para que no vaya a rozar ninguna de las zonas, para terminar de descargar el asa si hubiese quedado algo de muestra en ella. Técnica de la descarga en línea: - Colocar la placa invertida cerca del mechero. - Flamear el asa y mantenerla en la zona aséptica hasta que se enfríe. - Tomar la muestra. Coger la parte de la placa que contiene el medio y ponerla paralela a la llama del mechero. - Descargar el asa haciendo una estría vertical de un extremo a otro de la placa. - Flamear el asa, colocarla en el principio de la estría anterior y hacer una serie de estrías de lado a lado de la placa, pasando por la estría de descarga. - Colocar la placa sobre la tapa que manteníamos en la mesa, cerrándola. - Girar la placa unos 90º. - Flamear el asa y esperar que se enfríe. - Arrastrar la muestra haciendo otra serie de estrías perpendiculares a las anteriores, con cuidado de no tocar la descarga inicial. - Sin flamear terminar de descargar el asa en la zona libre de estrías. - Cerrar la placa y flamear el asa antes de soltarla. Hay muchas otras técnicas de siembra por estrías en placa, de forma que cada laboratorio y cada microbiólogo tiene la suya preferida. Tan sólo hemos visto una muestra de ellas. Siembra en masa o siembra en placa por vertido: Difiere de la siembra en estría en que el medio está aún líquido aunque no caliente ( a unos 45-50ºC) cuando se inocula, de forma que las colonias se desarrollan en todo el medio, no sólo en la superficie. Así se obtiene una mejor distribución de las colonias cuando las placas están bien preparadas. Para obtener colonias aisladas, ya que normalmente no puede predecirse el número de células viables de una muestra, debe prepararse siempre varias diluciones de la muestra y prepararse varias placas. Las placas que resulten demasiado concentradas o demasiado diluidas deben eliminarse. Para preparar estas placas con distintas concentraciones se puede hacer por el método de dilución, la técnica es la siguiente: Técnica de dilución: - Fundir tres tubos de medio de cultivo, previamente rotulados con los números 1, 2 y 3, y mantenerlos a baño María a 45-50ºC. - Tomar con el asa, previamente esterilizada, la muestra y sembrarla en el tubo nº 1. - Homogeneizar por rotación entre las palmas de las manos y tomar un asa del mismo resembrándola en el tubo de agar nº2, dejando el primer tubo en el baño a 45-50ºC. - Homogeneizar el tubo nº2, tomar un asa y pasarla al tubo nº3. - Dejar los dos tubos en el baño. - Verter el contenido de cada uno de los tres tubos, homogeneizándolos de nuevo, en tres placas estériles marcadas respectivamente con los números 1, 2 y 3. Girarlas suavemente para repartir uniformemente el agar. - Esperar que se solidifique el medio. - Incubar en estufa a temperatura adecuada durante 24 horas, colocando las placas en posición invertidas. - Elegir las placa donde estén las colonias más aisladas. Estos métodos de siembra en placa para aislamiento proporcionan cultivos puros a partir de mezcla de microorganismos, ya que una vez que las colonias crezcan separadas, se toman con el asa por separado las colonias crecidas en las placas de agar que presenten aspecto diferente, se siembran en tubos con caldo nutritivo o agar común inclinado y se llevan a la estufa para obtener masa de cultivos puros y poder proceder a la identificación y al antibiograma. 2.B.- SIEMBRA PARA CRECIMIENTO MASIVO: Siembra masiva en superficie o siembra en placa por extensión: Consiste en distribuir la muestra por la superficie del medio de cultivo contenido en la placa, de una manera uniforme. Se utiliza para ello la espátula de Driglasky, el escobillón o el asa. Es el método idóneo para el recuento de colonias (utilizando asas calibradas) y para la realización del antibiograma por el método de difusión. En este caso también se llama siembra en césped ya que los microorganismos deben crecer de forma que cubran totalmente la placa pareciendo una alfombra o césped. Técnica: - Efectuar la descarga sobre la parte central de la placa. - Estriar toda la placa. - Girar 90º y volver a estriar toda la placa. - Estriar la placa en las dos diagonales restantes. - Realizar todas las estrías que sean oportunas, girando una y otra vez la placa para que quede uniformemente repartida la muestra CULTIVO DE MICROORGANISMOS: Tras la preparación de un inóculo y posterior siembra del mismo o de la muestra problema en el medio de cultivo adecuado, se requerirán unas condiciones para que lo que hemos sembrado pueda desarrollarse, y poder realizar posteriormente los oportunos estudios cualitativos o cuantitativos del microorganismo problema. Para esto se pondrán los tubos y placas inoculados a incubar en una estufa, es lo que llamamos cultivo de una muestra o de un inóculo. Las placas siempre se deben incubar invertidas, pues debido a la elevada concentración de agua en el agar, durante la incubación se forma agua de condensación que resbalaría desde la tapa a la superficie del agar, extendiéndose y provocando una masa de crecimiento confluente, impidiéndose la formación de colonias aisladas. Para que el cultivo sea el correcto se requieren unas condiciones adecuadas: 1.- Temperatura: La temperatura óptima de incubación para la mayoría de los microorganismos, especialmente los patógenos, está próxima a la corporal (3537ºC), pero existen variaciones. Algunos no pueden soportar esta temperatura, y otros tienen un margen más amplio. Determinados hongos y levaduras dermatofitos, crecen mejor a temperatura ambiente, próxima a los 30ºC. Estas temperaturas constantes se consiguen fácilmente gracias a las estufas de cultivo. Es muy importante que la T de incubación se mantenga en los límites establecidos durante todo el proceso. Para evitar oscilaciones incontroladas, aparte del termómetro externo que llevan las estufas es aconsejable dotarlas de un termómetro interno que pueda registrar las posibles variaciones. 2.- Tiempo de incubación: Será de 18-24 horas, en términos generales. Algunas bacterias necesitan una incubación adicional para desarrollarse bien y han de mantener hasta 48-72 horas. A veces será necesario más tiempo, como por ejemplo las que crecen a temperatura 17º (psicrófilas) se mantienen 5 días a 17ºC; 15 días para los hongos dermatofitos. Los microorganismos anaerobios se suelen cultivar de 72 a 96 horas y con frecuencia necesitan incubarse durante 7 días antes de dar como negativos los resultados. 3.- Condiciones de esterilidad: Para evitar el crecimiento de otros microorganismos que pudieran interferir cualquier determinación del germen problema es necesario trabajar en condiciones de esterilidad. De ahí que se requieran recipientes cerrados, como tubos con tapones de algodón, tapones de cierre hermético o tapones metálicos no herméticos si requieren de la presencia de oxígeno, placas de Petri, etc. 4.- Concentración adecuada de oxígeno u otros gases: Si el microorganismo problema es aerobio, necesitará la cantidad suficiente de oxígeno. Si es anaerobio facultativo puede necesitar según los casos, un ambiente microaerófilo o la cantidad adecuada de CO2, estas condiciones serán variables en cada caso dependiendo del tipo de metabolismo: oxidativo y/o fermentativo del microorganismo problema. Si la bacteria es anaerobia habrá que crear una atmósfera carente de oxígeno. En resumen: para mantener todas estas condiciones en los medios de cultivo, de forma que permita un normal y adecuado crecimiento de los microorganismos, será importante tener en cuenta las siguientes precauciones: Evitar la apertura de los medios de cultivo, sobre todo en el periodo de incubación. Sólo se abrirán cuando sea estrictamente necesario. Controlar la temperatura de las estufas. Verificar las condiciones de oxígeno y/o dióxido de carbono. Rotular adecuadamente los medios y añadir el día y hora en que se efectuó la siembra. ESTUFAS DE CULTIVO: Las hay de varios tipos según el microorganismo a cultivar: ESTUFAS CONVENCIONALES: son las más utilizadas, en ellas se incuban medios de cultivo con microorganismos aerobios y anaerobios facultativos. Controlan la temperatura y la protección ambiental. ESTUFAS O INCUBADORAS DE CO2: son aquellas que, además, controlan el contenido de CO2. En ellas se incuban microorganismos cuyo aislamiento se ve favorecido por la presencia de un 5-10% de CO 2, como es el caso de Brucella, Neisseria... Cuando no se dispone de estufa de CO 2, el método más sencillo y más frecuentemente utilizado es el uso del “frasco bujía” que consiste en un recipiente en el que se colocan las placas de Petri junto con una bujía que no produzca humo; se enciende la misma y se cierra la tapa herméticamente. La llama arderá hasta que el nivel de oxígeno descienda lo suficiente como para impedir la combustión, al apagarse la bujía, la atmósfera contiene aproximadamente del 3 al 5 % de CO2, incubándose el conjunto en una estufa convencional. Este sistema de la bujía se puede sustituir por un sobre generador de CO 2. También puede sustituirse el aire por CO 2 mediante un sistema de válvulas de tal forma que por una sale aire y, al mismo tiempo, por la otra entra el dióxido de carbono. SISTEMAS HERMÉTICOS DE INCUBACIÓN DE ANAEROBIOS: BOLSA ANAERÓBICA: consiste en una bolsa de plástico que cierra herméticamente y dentro de la cual se introducen las placas o los tubos y un generador de anaerobiosis. La placa se puede ver en cualquier momento de la incubación sin exponerla al aire. JARRA DE ANAEROBIOS O JARRA DE GASPAK: es un sistema sencillo para la obtención de una atmósfera anaerobia. Pueden ser metálicas pero con más frecuencia son de plástico transparente para poder ver lo que ocurre en su interior. Tienen una tapadera hermética sujeta con una abrazadera para evitar pérdidas. Hay de dos tipos dependiendo de la forma de conseguir la anaerobiosis: Jarras con un sistema de reemplazamiento del aire de su interior por una mezcla de gases: H2 (10%), CO2 (5%), N2 (85%). En la tapa de la jarra hay dos válvulas una de entrada y otra de salida y un manómetro que nos marca la presión interior. Jarras que generan en su interior la anaerobiosis mediante una reacción química. a.- ROSCA b.- TAPA HERMÉTICA c.- CATALIZADOR d.- ESPITA H2 /CO2 e.- INDICADOR f.- PLACAS PETRI Las más utilizadas son las del segundo tipo. Contienen en su interior un sobre que viene preparado comercialmente y que genera anaerobiosis mediante una mezcla química que al contacto con el aire genera H 2 y CO2. Así el O2 del aire es reducido a agua, mediante la siguiente reacción: 2 H 2 + O2 2 H2 O Y por otra parte, el CO2 es empleado por ciertos anaerobios para su crecimiento. Este sobre se activa mediante el simple agregado de 10 ml de agua. Para que ocurra la reacción anterior, es necesaria la presencia de un catalizador que suele ser gránulos de alúmina recubiertos con paladio. Estos catalizadores se inactivan por exceso de humedad, por lo que debe colocarse en el interior de la jarra una sustancia que absorba la humedad, debiendo cambiarse cada vez que se utilice la jarra. Estas jarras también deben contener en su interior indicadores de anaerobiosis. Los hay de tipo bacteriológico y de tipo químico. Los bacteriológicos consisten en introducir en la jarra un cultivo de un aerobio estricto; si éste crece, indica un fallo en el establecimiento de la atmósfera de anaerobiosis. El inconveniente de estos indicadores es que los resultados no son conocidos hasta el final de la incubación. Por ello se usan más los indicadores químicos, que son unos indicadores rédox que se decoloran cuando están reducidos. Los más utilizados son las tiras de azul de metileno que son azules cuando están oxidadas y las de resazurina que son rosas. Pueden estar incorporados al medio de cultivo. Técnica: 1. Se colocan los medios sembrados en la jarra. 2. Se coloca también en el interior de la jarra una sustancia desecante tipo sílicagel, cloruro cálcico o papel de filtro, para absorber la humedad producida. 3. Se introduce un indicador de anaerobiosis y un sobre generador de H 2 y CO2 abierto. 4. Se agrega agua sobre el sobre generador de CO 2 e H2. 5. Se cierra la tapa inmediatamente. La tapa lleva unas perlas de alúmina recubierta de paladio que actúan como catalizador de la reacción entre el oxígeno del interior de la jarra y el hidrógeno producido por el generador de anaerobiosis. Las perlas de paladio antes de volver a utilizarse deben regenerarse introduciéndolas en el horno Pasteur durante 90 minutos a 180º ó 2 horas a 160-170º ya que se inactivan por exceso de humedad y deben ser reactivadas después de cada uso. A los 30 minutos aparecerán gotas de condensación en la superficie interna de la jarra y la tapadera se notará caliente al tacto, lo que indica que el catalizador y el sobre generador funcionan adecuadamente. CABINA DE ANAEROBIOSIS: es una cámara en cuyo interior se genera la anaerobiosis mediante un catalizador (paladio) e hidrógeno. El material se incorpora y se retira a través de unos guantes de plástico que acceden a su interior. En ella se procesa un gran volumen de muestras de anaerobios. OBSERVACIÓN E IDENTIFICACIÓN DEL CRECIMIENTO: TIPACIÓN DE COLONIAS: 1.- Crecimiento en medios líquidos: En los medios líquidos las bacterias poseen una gran libertad de movimiento y se disponen con arreglo a sus necesidades nutritivas y requerimientos de oxígeno. El crecimiento en medio líquido puede manifestarse de diferentes formas: Formación de una espacie de velo o telilla en la superficie, formada por una pequeña masa de células que flota en la parte superior del cultivo. Así suelen crecer las bacterias aerobias estrictas. Formación de un sedimento, es decir un depósito de células que permanece en la parte inferior del cultivo, pero que se puede poner en suspensión sacudiendo suavemente el tubo. Así suelen crecer los anaerobios estrictos. Enturbiamiento del medio con una opacidad más o menos intensa. Así suelen crecer las bacterias anaerobias facultativas. a.- microorganismo aerobio b.- microorganismo anaerobio c.- microorganismo facultativo a b c 2.- Crecimiento en medios sólidos (placas): En estos medios las bacterias crecen formando colonias. Cada colonia procede de una sola bacteria (una unidad viable), de su crecimiento y reproducción. El tiempo que tarda en formarse una colonia es variable y depende de cada especie; en la mayoría de los casos es de 18-24 horas. El aspecto macroscópico de una colonia es de gran ayuda para la identificación del germen en cuestión, por cuanto difieren en tamaño, forma , elevación, borde, color, olor, … Hay que tener en cuenta que una misma bacteria puede dar colonias muy distintas en función del medio donde se cultiven. Por otra parte, el estudio de la morfología colonial debe ser sólo orientativo, puesto que en determinados medios, especies distintas pueden dar colonias muy similares. Vamos a tener en cuenta varios aspectos: a . - Tamaño: las colonias se pueden clasificar según su tamaño en: pequeñísimas o puntiformes, pequeñas, medianas y grandes. b.- Forma: en ocasiones, el aspecto de una colonia recuerda o se asemeja a algún objeto conocido, en este caso la forma hace referencia a esta similitud. Se suelen clasificar en: puntiforme, circular, filamentosa, irregular o ameboide, naviculada o fusiforme, rizoide, espinular, melena de león, etc. c.- Elevación de la colonia: las hay planas, levantadas o elevadas, convexas, abombadas o pulvinadas, umbreladas o umbonada, umbilicadas... d.- Bordes: las hay con los bordes lisos o enteros y deformados (ondulado, lobulado, erosionados o crenado, filamentoso, enrollado, ondeado o rizado, etc.). e.- Consistencia: unas tienen consistencia mantecosa, otras son frágiles o quebradizas, etc. f . - Superficie: puede ser lisa, rugosa, erizada, brillante, seca, pulverulenta,... g.- Color: es generalmente blanquecino, color crema o grisáceo, pero pueden presentar una amplia gama de tonalidades (amarillas, rosas, negras, verdes, … ). Depende mucho del medio de cultivo empleado. h . - Olor: algunos microorganismos presentan, en determinados medios de cultivo, un aroma característico que facilita su identificación. Puede ser pútrido, desagradable, ácido,… y va a depender mucho del medio de cultivo empleado. En el siguiente esquema se describen los más significativos: BACTERIA Pseudomonas spp Escherichia coli Klebsiella spp Salmonella spp Citrobacter spp Proteus spp Haemophilus spp MEDIO DE CULTIVO Mc Conkey Mc Conkey Mc Conkey S. S. S. S. Mc Conkey Agar chocolate AROMA Jabón Levadura de pan Levadura de pan Harina de pescado Fétido Amoniaco Semen Aromas característicos de algunos cultivos i.- Entorno colonial: la modificación del entorno colonial más significativa es la hemólisis producida en agar sangre. Este dato resulta muy útil en la identificación inicial de ciertas bacterias, sobre todo estreptococos. (Ver temas 6 y 9). 3.- Crecimiento en medio sólido (tubos): Si bien en tubos de agar inclinado los microorganismos crecen sin formar colonias aisladas normalmente, el crecimiento que se desarrolla en la superficie de la cuña si es característico de cada microorganismo para un medio determinado. Puede ser: ELIMINACIÓN DE UN CULTIVO: El cul tivo hay que descontaminarl o ante s de desecharlo. La descontaminación se puede hacer de tres formas: A. Inundación del cultivo con solución desinfectante (lejía): hay que dejarlo actuar 6 horas como mínimo. No es recomendable salvo que no se pueda hacer por otro método. B. Esterilización en el autoclave (ver tema 3). C. Incineración: se usa para microorganismos muy patógenos o en grandes centros hospitalarios donde hay mucho material contaminado. Después de la descontaminación se procede a la limpieza del recipiente cuando éste sea recuperable (tubos fundamentalmente) o se tira a la basura si es desechable. RECUENTO DE BACTERIAS: El recuento de bacterias tiene como objeto conocer el número de microorganismos/ml presentes en una muestra, aunque no nos sirva para saber que tipo de microorganismos son. Se podría hacer un informe orientativo rápido haciendo una tinción de Gram con la muestra no diluida. Hay dos tipos de métodos para el recuento: 1.- MÉTODOS DIRECTOS: miden directamente el número de gérmenes. 1. a. - Mediante el microscopio: Se usa el citómetro o cámara de recuento, que es una cámara del tipo de las de recuento globular. Conociendo el volumen que se ha depositado y una vez contadas las células, se puede hallar la concentración. Este método es una forma rápida de estimar la cantidad de células microbianas/ml de muestra. Sin embargo tiene algunas limitaciones: No se distinguen las células muertas de las células vivas. Las células pequeñas son difíciles de ver con el microscopio y, posiblemente se omitan algunas de ellas. Los cálculos a realizar para dar una cifra de microorganismos/ml de muestra, se detallan en la figura siguiente: 1. b. – Electrónicos: Consiste en utilizar para el contaje un contador electrónico de partículas semejante a otros empleados en el laboratorio, como por ejemplo los que se usan para el recuento de hematíes. Se basan en la diferencia de conductividad que se produce al paso de una bacteria u otra partícula, y que se traduce en una señal que se va registrando y contabilizando. Su mayor inconveniente reside en que no distingue los microorganismos de cualquier otra partícula. 1. c. – Recuento de microorganismos tras siembra e incubación: En los métodos anteriores de recuento, se cuentan tanto células vivas como células muertas, en cambio en este caso se utiliza un medio sólido en placa, en la cual cada germen vivo va a dar lugar a una colonia que es lo que verdaderamente contamos. Hay dos formas de realizar un recuento en placa: 1. c. 1.- Método de siembra masiva en superficie o siembra en placa por extensión: Consiste en extender un volumen no mayor de 0,1 ml de una muestra adecuadamente diluida, sobre la superficie de una placa de agar nutritivo o cualquier otro medio de tipo general, incubar la placa y contar el número de colonias. La muestra se tomará con pipeta o asa calibrada para que el volumen sea conocido exactamente y se puedan hacer los cálculos correspondientes. Es importante que la superficie de la placa esté seca, de forma que el líquido que se extienda se embeba. Nunca se deben usar volúmenes mayores de 0,1 ml, ya que un exceso de líquido no se embebería y puede ser causa de que las colonias se unan al formarse, dificultándose el recuento. 1. c. 2.- Método de siembra en masa o siembra en placa por vertido: Consiste en tomar un volumen conocido (normalmente 0,1 ó 0,01 ml) de muestra con pipeta estéril y depositarla sobre una placa de Petri vacía y estéril. Se funde el agar común o cualquier otro medio de tipo general, se deja enfriar a 40-50ºC y se deposita en la placa. También se puede hacer, sembrando el microorganismo en tubo con el medio líquido, y verterlo luego en la placa, como se indica en las pág. 12-13. Se homogeniza por rotación y se deja enfriar. Después se pone a incubar de 24 a 48 horas a 37ºC. Las colonias crecerán repartidas por la superficie y por dentro del agar y tendremos que contarlas todas. Como la muestra se mezcla con el medio de agar fundido, se puede utilizar un volumen mayor que con el método anterior; sin embargo para realizar este método se debe tener en cuenta que el microorganismo resista perfectamente, aunque sea por un periodo breve de tiempo, la temperatura de fusión del agar. También hay que considerar la relativa dificultad que entraña el contar colonias en el interior del agar. Métodos para realizar un recuento en placa Con ambos métodos es importante que el número de colonias que se desarrollan no sea demasiado grande, ya que en placas con demasiados microorganismos las colonias pueden no llegar a formar colonias aisladas y el recuento sería erróneo. Igualmente debemos evitar hacer el contaje en placas con muy pocas colonias pues en este caso la significación estadística sería muy baja, es decir que, el contaje no tendría significado estadístico y el recuento podría ser igualmente erróneo. La práctica común, la que tiene mayor significado estadístico, es la de contar solamente aquellas placas que tengan entre 30 y 300 colonias. Para obtener el número apropiado de colonias, se debe diluir la muestra que vamos a contar, y como normalmente no podemos intuir si el número de colonias que van a aparecer va a ser contable o no para una dilución determinada, suele ser necesario hacer más de una dilución. Lo común es hacer diluciones decimales seriadas, para lograr así la dilución final deseada. Procedimiento para contar viables utilizando diluciones seriadas de la muestra Cuando se hacen diluciones es importante que se utilice una pipeta diferente para cada dilución, aún cuando sea de la misma muestra. Esto es porque al vaciar el contenido de la pipeta con la muestra inicial, que contiene la mayor concentración de microorganismos, o con cualquier otra, pueden no haberse expulsado todos los organismos y que se queden adheridos a las paredes de la pipeta por lo que podrían ser arrastrados fuera en diluciones posteriores y ocasionar un error en el contaje final. El recuento de viables puede estar sujeto a grandes errores: No todos los microorganismos forman colonias a la misma velocidad. Si las colonias son pequeñas se pueden omitir en el recuento, etc. Para evitarlo, como siempre, hay que estandarizar al máximo estableciendo las condiciones de incubación (medio de cultivo, temperatura y tiempo). También se aconseja preparar las placas por duplicado o triplicado para cada dilución y posteriormente hacer la media. Para establecer más claramente el resultado, este recuento se expresa como el número de unidades formadoras de colonias (u. f. c.)/ ml, ya que una unidad formadora de colonia puede contener una o más células de partida. 2.- MÉTODOS INDIRECTOS: Los más utilizados se basan en medir la turbidez de un medio. Una suspensión de células se ve turbia porque cada célula dispersa la luz. Cuanto más células haya más dispersará la luz y será más turbia. La turbidez se puede medir de varias formar como ya vimos al principio del tema: Comparando la turbidez del medio con la de una escala formada por una solución de sulfato de bario a diferentes concentraciones (escala de Mc Farland). Preparando una curva estándar para cada microorganismo estudiado, en la que se relacione el número de células con la absorbancia. Comparando la absorbancia del tubo problema con la curva patrón (llevando la absorbancia a la curva) podremos saber el número de células/ml del problema.
