Definición de las características y la duración de las respuestas de anticuerpos covid19

ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN
Citar como: K. Röltgen et al., Sci. Immunol.
10.1126 / sciimmunol.abe0240 (2020).
CORONAVIRUS
Definición de las características y la duración de las respuestas de anticuerpos a la
infección por SARS-CoV-2 asociada con la gravedad y el resultado de la enfermedad
Katharina Röltgen 1 †, Abigail E. Powell 2 †, Oliver F.Wirz 1 †, BryanA. Stevens 1 †, Catherine A. Hogan 1, Javaria Najeeb 3, MollyHunter 4, HannahWang 1, Malaya K.
Descargado de http://immunology.sciencemag.org/ por invitado el 8 de diciembre de 2020
Sahoo 1, ChunHongHuang 1, Fumiko Yamamoto 1, Monali Manohar 5,6, JustinManalac 1, Ana R. Otrelo-Cardoso 3, ThoD. Pham 1,7, Arjun Rustagi 8, Angela J. Rogers 5, Nigam
H. Shah 9, Catherine A. Blish 8,10, Jennifer R. Cochran 11, Theodore S. Jardetzky 3, James L. Zehnder 1, Taia T. Wang 8,10,12, BalasubramanianNarasimhan 13,14, SaurabhGombar
1, Robert
Tibshirani 13,14, Kari C. Nadeau 5,6, Pedro
S. Kim 2,10 ‡, BenjaminA. Pinsky 1,8 ‡, Scott D. Boyd 1,6 ‡ *
1
Departamento de Patología, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU. 2 Stanford ChEM-H y Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU. 3 Departamento
de Biología Estructural, Universidad de Stanford, Stanford, Estados Unidos. 4 ATUM, Newark, CA, EE. UU. 5 Departamento de Medicina, División de Medicina Pulmonar, Alergia y Cuidados Críticos, Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU. 6 Sean
N. Parker Center for Allergy and Asthma Research, Stanford, CA, EE. UU.
7 Stanford Blood Center, Palo Alto, CA, EE. UU. 8 Departamento de Medicina, División de Enfermedades Infecciosas y Medicina Geográfica, Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.
9
Centro de Stanford para la Investigación en Informática Biomédica, Universidad de Stanford, Stanford, California, EE. UU. 10 Chan Zuckerberg Biohub, San Francisco, CA, Estados Unidos. 11 Departamento de Bioingeniería, Universidad de Stanford,
Stanford, CA, EE. UU. 12 Departamento de Microbiología e Inmunología, Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU. 13 Departamento de Estadística, Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU. 14 Departamento de Ciencias de Datos
Biomédicos, Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.
†Estos autores contribuyeron igualmente a este trabajo.
‡Estos autores contribuyeron igualmente a este trabajo.
* Autor correspondiente. Email: [email protected]
Los anticuerpos específicos del SARS-CoV-2, en particular los que evitan la interacción del dominio de unión del receptor de pico viral (RBD) con el receptor de la enzima
convertidora de angiotensina 2 (ACE2) del huésped, pueden neutralizar el virus. Sin embargo, se desconocen qué características de la respuesta serológica pueden afectar
los resultados clínicos de los pacientes con COVID-19. Analizamos 983 muestras de plasma longitudinales de 79 pacientes hospitalizados con COVID-19 y 175 pacientes
ambulatorios e individuos asintomáticos infectados con SARS-CoV-2. Dentro de esta cohorte, 25 pacientes murieron a causa de su enfermedad. Se observaron proporciones
más altas de anticuerpos IgG dirigidos a los dominios de pico S1 o RBD en comparación con el antígeno de la nucleocápsida en pacientes ambulatorios que tenían una
enfermedad leve frente a pacientes gravemente enfermos. Los aumentos de anticuerpos plasmáticos se correlacionan con la disminución de la ARNemia viral, pero las
respuestas de anticuerpos en la enfermedad aguda fueron insuficientes para predecir los resultados de los pacientes hospitalizados. Los ensayos de neutralización de
pseudovirus y un ELISA escalable que mide los anticuerpos que bloquean la interacción RBD-ACE2 se correlacionaron bien con los títulos de IgG del paciente a RBD. Los
anticuerpos del SARS-CoV-2 de pacientes ambulatorios y asintomáticos, incluida la IgG, disminuyeron progresivamente durante la observación hasta cinco meses después
de la infección.
INTRODUCCIÓN
y el resultado, pero esto queda por establecer.
Un nuevo coronavirus descrito por primera vez en Wuhan, China, en diciembre de 2019 ( 1)
El virus que causa COVID-19 pertenece a la Sarbecovirus
ha llevado a una enfermedad por coronavirus (COVID-
subgénero (género Betacoronavirus) junto con el coronavirus del síndrome
19) pandemia y un cierre económico mundial en medio de medidas de distanciamiento
respiratorio agudo severo (SARS-CoV) y ha sido designado SARS-CoV-2 ( 9). Los
social sin precedentes. El espectro clínico de COVID-19 varía desde una infección
coronavirus contienen cuatro proteínas estructurales, incluidas las proteínas de pico,
asintomática y una enfermedad leve del tracto respiratorio superior en la mayoría de los
envoltura, membrana y nucleocápside (N). La glicoproteína de la superficie de la
pacientes, hasta una neumonía viral grave con insuficiencia respiratoria, insuficiencia
espiga contiene el dominio de unión al receptor (RBD), que se une fuertemente a los
multiorgánica y muerte ( 2 - 4). Los adultos mayores y las personas con problemas de salud
receptores ACE2 humanos ( 1, 10), y juega un papel importante en la unión viral, la
subyacentes graves corren mayor riesgo de sufrir una enfermedad grave y la muerte ( 5 - 8). Lasfusión de las membranas viral y del huésped y la entrada del virus en las células del
respuestas inmunitarias del huésped pueden ser uno de los determinantes más importantes
huésped ( 11). La mayoría de las personas infectadas con SARS-CoV-2 desarrollan
para la progresión de la enfermedad.
anticuerpos contra el
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proteínas pico y N, que por lo tanto se utilizan como antígenos en ensayos de serología
individuos asintomáticos o pacientes ambulatorios), o después de que informaron a los
clínica. La proteína de pico es un objetivo importante para neutralizar los anticuerpos, ya
sitios clínicos asociados a Stanford Health Care con síntomas de COVID-19. Esto incluyó a
que pueden prevenir la entrada del virus en las células huésped ( 12, 13). La información
24 pacientes ambulatorios, 35 pacientes hospitalizados que no fueron ingresados en la
actual sobre el papel de los anticuerpos en la eliminación viral y la modulación de la
unidad de cuidados intensivos (UCI) y 20 pacientes hospitalizados en la UCI que
gravedad de la enfermedad, así como la durabilidad de estas respuestas después de una
sobrevivieron a su enfermedad. Para evaluar las respuestas serológicas asociadas con la
infección primaria, es limitada o controvertida. Se necesita una mejor comprensión de la
mortalidad de los pacientes, también analizamos muestras de 25 pacientes que murieron de
inmunidad humoral al SARS-CoV-2 para informar las estrategias de vacunación y el uso
COVID-19 (un paciente ambulatorio, siete ingresados fuera de la UCI y diecisiete
de terapias en forma de anticuerpos neutralizantes o plasma de convalecencia. Los
pacientes ingresados en la UCI). De los pacientes que fueron tratados en la UCI, 26 de 37
informes sobre la longevidad de los títulos de anticuerpos contra el SARS-CoV-2 no
(70%) requirieron ventilación mecánica, incluidos 15 pacientes que fallecieron.
coinciden plenamente, y algunos encuentran una disminución rápida de los anticuerpos
IgG específicos del virus aproximadamente 3 meses después de la infección ( 14, 15), y
Las características demográficas y clínicas de los pacientes estratificados por estado de la enfermedad
Las respuestas de anticuerpos específicos contra virus parecen estar elevadas en los
se presentan en la Tabla 1. El porcentaje de hombres y aquellos con comorbilidades de hipertensión o
pacientes con COVID19 con enfermedad grave en comparación con los individuos
diabetes mellitus aumentó con la gravedad de la enfermedad del paciente. Los pacientes ambulatorios y los
asintomáticos o levemente enfermos, lo que genera preocupaciones sobre la eficacia de
individuos asintomáticos eran más jóvenes y tenían los niveles más bajos de obesidad en comparación con
las respuestas de anticuerpos al SARS-CoV-2. Un informe reciente que aplica un panel
los pacientes más graves. En particular, los niveles de ARN viral medidos por rRT-PCR de hisopos
de ensayos serológicos a pacientes con COVID-19 que convalecieron o murieron ()
nasofaríngeos en el momento del diagnóstico mostraron un aumento progresivo (menor umbral del ciclo de
sugiere que la calidad más que la cantidad de anticuerpos puede predecir el resultado de
rRT-PCR, Ct) con la gravedad de la enfermedad; los pacientes que fallecieron tuvieron las cargas virales más
la infección ( 19). Los primates no humanos expuestos al SARS-CoV-2 después de la
altas (fig. S2). Se dispuso de muestras de plasma para pruebas serológicas en profundidad de todos los
vacunación con vacunas de ADN basadas en picos desarrollaron anticuerpos
pacientes hospitalizados y 86 de los 160 supervivientes ambulatorios. Las características demográficas y
neutralizantes y correlatos inmunitarios de protección, lo que sugiere que las respuestas
clínicas de pacientes ambulatorios e individuos asintomáticos con y sin disponibilidad de plasma se presentan
de anticuerpos pueden ser más efectivas para prevenir que para resolver la enfermedad ( 20).en la tabla S1. Se analizaron un total de 828 muestras con ELISA que midieron IgM, IgG e IgA específicas
para SARS-CoV-2 RBD, S1 o N, así como el ensayo de bloqueo RBD-ACE2 (Fig. 1A-C). También se
analizaron muestras representativas para determinar la reactividad cruzada de anticuerpos con el SARS-CoV
RBD, el ARN viral en la sangre (ARNemia) y la neutralización de lentivirus pseudotipados con púas (Fig. 1D).
También probamos 45 muestras de plasma de una cohorte de validación de 14 individuos asintomáticos y
ambulatorios con SARSCoV-2 rRT-PCR positivos con recolección mensual prospectiva de muestras hasta
Realizamos un análisis exhaustivo de los anticuerpos específicos de las
cuatro meses después de la inscripción. así como el ensayo de bloqueo RBD-ACE2 (Fig. 1A-C). También se
proteínas RBD, S1 y N del SARS-CoV-2, y los anticuerpos bloqueadores de
analizaron muestras representativas para determinar la reactividad cruzada de anticuerpos con el SARS-CoV
RBD-ACE2, la neutralización del virus pseudotipado con picos y las mediciones de
RBD, el ARN viral en la sangre (ARNemia) y la neutralización de lentivirus pseudotipados con púas (Fig. 1D).
ARN viral en muestras de frotis nasofaríngeo y de plasma de individuos infectados
También probamos 45 muestras de plasma de una cohorte de validación de 14 individuos asintomáticos y
con el SARS-CoV -2. Se estudiaron un total de 254 individuos (79 pacientes
ambulatorios con SARSCoV-2 rRT-PCR positivos con recolección mensual prospectiva de muestras hasta
hospitalizados y 175 pacientes ambulatorios o asintomáticos). Los anticuerpos
cuatro meses después de la inscripción. así como el ensayo de bloqueo RBD-ACE2 (Fig. 1A-C). También se
bloqueadores de RBD-ACE2 y la neutralización de lentivirus pseudotipados con
analizaron muestras representativas para determinar la reactividad cruzada de anticuerpos con el SARS-CoV
picos estaban bien correlacionados con IgG específica para RBD. En particular, las
proporciones más altas de anticuerpos IgG dirigidos a S1 o RBD en comparación
con N se asociaron fuertemente con una infección clínicamente más leve. La
ARNemia viral disminuyó rápidamente a niveles indetectables una vez que
aparecieron los anticuerpos plasmáticos y la actividad bloqueante de RBD-ACE2.
RBD, el ARN viral en la sangre (ARNemia) y la neutralización de lentivirus pseudotipados con púas (Fig. 1D). También probam
Las respuestas de anticuerpos anti-RBD, S1 y N y la duración están asociadas con la
gravedad de la enfermedad.
Se han informado respuestas de anticuerpos más bajas en pacientes con síntomas leves
en comparación con aquellos con una enfermedad más grave para otras infecciones por
coronavirus, como MERS-CoV ( 21 - 23) así como para el SARS-CoV-2 ( 15, 24). La tasa de
detección de anticuerpos de unión a RBD a intervalos de una semana después del inicio de los
síntomas se muestra en la tabla S2; la mayoría de los individuos se seroconvirtieron en la
semana 2 después del inicio de los síntomas (Fig. 2A, B). Las tasas de positividad para RBD
IgM, IgG e IgA alcanzaron su máximo en las semanas 4, 6 y 5, respectivamente, con la mayoría
RESULTADOS
de los pacientes negativos para IgM e IgA después de 12 semanas, mientras que los niveles de
Diseño del estudio y datos demográficos del paciente
En el estudio se incluyeron un total de 254 personas con una prueba de frotis
nasofaríngea en tiempo real de RT-PCR (rRT-PCR) positiva para el SARS-CoV-2 (fig.
S1). Los sujetos del estudio se identificaron después de pruebas serológicas de rutina
o de exámenes de salud ocupacional en los laboratorios clínicos de Stanford Health
Care para detectar anticuerpos IgM e IgG anti-SARS-CoV-2 RBD (136
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otros enfatizando títulos estables detectados durante varias semanas o meses ( dieciséis - 18).
RBD IgG mostraron una disminución más lenta, pero progresiva, o un negativo continuo. dan
como resultado aquellos que no pudieron generar IgG en puntos de tiempo anteriores (Fig. 2A,
Fig. S3 y tabla S2). Los pacientes ambulatorios tenían títulos más bajos de RBD IgM, IgG e IgA
en comparación con los pacientes hospitalizados, y una disminución más rápida de los títulos
(Fig. 2B, Fig. S4). Pacientes que
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requirieron cuidados en la UCI, y aquellos que murieron, desarrollaron y mantuvieron Validación de la disminución de las respuestas de los anticuerpos en un niño enfermo
mantuvo los niveles más altos de IgM, IgG e IgA, así como de anticuerpos
bloqueadores de RBDACE2, a lo largo del tiempo (Fig. 2C).
e individuos asintomáticos
La mayoría de las personas que se infectan con la infección por SARS-CoV-2 no
necesitan hospitalización para recuperarse de su enfermedad, y una fracción
Las IgM, IgG e IgA específicas de S1 mostraron una cinética de anticuerpos muy
considerable (aproximadamente 40-45%) ( 29)
permanecer asintomático. Realizamos análisis adicionales de las respuestas de
IgG específicas de N mostraron altas tasas de positividad con cinéticas de anticuerpos
anticuerpos en un conjunto más amplio de muestras de 136 pacientes ambulatorios e
similares a las de RBD y S1, las respuestas de anticuerpos IgM a N fueron
individuos asintomáticos que dieron positivo por rRT-PCR para ARN del SARS-CoV-2 en
sorprendentemente bajas en la mayoría de los pacientes (figs. S4 y S6 y tabla S2). No hubo
hisopos nasofaríngeos y se realizaron pruebas serológicas en el Laboratorio Clínico de
diferencias consistentes en los títulos de anticuerpos RBD, S1 y N o en los anticuerpos
Stanford Health Care. También probamos un conjunto de validación independiente de 45
bloqueantes RBD-ACE2 entre los pacientes de la UCI que sobrevivieron en comparación
muestras de plasma de otros 14 individuos asintomáticos o levemente enfermos. Como
con los pacientes que murieron (fig. S7).
se observa para los pacientes ambulatorios en la Fig. 2B, los individuos asintomáticos y
ambulatorios mostraron títulos relativamente bajos y una rápida disminución de RBD IgM
Además, evaluamos la amplitud de las respuestas de anticuerpos en diferentes
e IgG (Fig. 4A, tabla S3). El momento de la infección en individuos asintomáticos es
categorías de gravedad de la enfermedad mediante la prueba de unión a SARSCoV RBD.
menos seguro que en individuos sintomáticos, cuyos síntomas generalmente se
La mayoría de los anticuerpos monoclonales que se dirigen al SARS-CoV RBD no logran
desarrollan dentro de 2 a 14 días después de la exposición al virus ( 30). No obstante, la
unirse al SARS-CoV-2 RBD, lo que indica una antigenicidad distinta a pesar de la
representación gráfica de las respuestas serológicas de pacientes ambulatorios e
secuencia y similitud estructural de las dos proteínas ( 25, 26). Nueve de los 13 pacientes
individuos asintomáticos en relación con la fecha de su primera prueba de rRT-PCR
de la UCI, tres de los 25 pacientes ingresados fuera de la UCI (fig. S8A) y cinco de los 82
positiva para infección mostró un curso de tiempo similar al observado para pacientes
pacientes ambulatorios (fig. S8B), desarrollaron títulos de IgG de SARS-CoV RBD durante
ambulatorios representados como días posteriores al inicio de los síntomas (Fig. 2B). En
el curso de su infección. El curso temporal de la positividad de RBD anti-SARSCoV en
particular, la cantidad de ARN viral detectado en hisopos nasofaríngeos de diagnóstico se
muestras seriadas de pacientes individuales no siempre reflejó las respuestas de IgG
correlacionó con los títulos de anticuerpos medidos en estos individuos (Fig. 4B).
anti-SARS-CoV-2 RBD, lo que sugiere respuestas limitadas de células B clonales u
oligoclonales con esta reactividad más amplia dentro del antiSARS-CoV policlonal general.
2 respuesta serológica (figs. S8C, D).
Las muestras de plasma de la cohorte de validación independiente de
Los anticuerpos neutralizantes aumentan en los pacientes hospitalizados en comparación con los
pacientes ambulatorios y se correlacionan con el RBD-ACE2.
individuos asintomáticos o ambulatorios se recogieron prospectivamente durante
visitas mensuales hasta cuatro meses después del reclutamiento (Fig. 4C, D, Fig.
S9). Los ensayos de bloqueo y neutralización de RBD IgM, IgG e IgA, RBD-ACE2
Títulos de IgG de bloqueo y RBD
La neutralización de anticuerpos del SARS-CoV-2 vivo, o de virus pseudotipados como
los lentivirus que expresan el pico del SARS-CoV-2 pueden representar los sustitutos
fisiológicamente más relevantes para la inmunidad humoral in vivo, pero son poco escalables
debido a los requisitos restrictivos de bioseguridad para el SARS- CoV-2 y componentes y
mostraron una disminución progresiva durante los meses muestreados. Los
anticuerpos neutralizantes se correlacionaron mejor con los títulos de IgG de RBD,
y algo menos con ELISA de bloqueo de RBD-ACE2 en estos individuos (R 2 = 0,751
y 0,5221, respectivamente) (Fig. 4E).
protocolos de ensayo menos fáciles de estandarizar, en comparación con las pruebas que
utilizan proteínas purificadas. Probamos la neutralización de lentivirus con pseudotipado de
pico de SARSCoV-2 ( 27) en células HeLa que sobreexpresan ACE2 ( 28) por muestras de
Los pacientes ambulatorios y no ingresados en la UCI muestran un direccionamiento preferencial
pacientes hospitalizados y ambulatorios, y evaluaron las correlaciones con los ELISA más
de anticuerpos de RBD y S1 en comparación con N
escalables para el bloqueo de RBD, S1 y RBD-ACE2 (Fig. 3A, B). Al igual que con el bloqueo
Es una pregunta abierta si las respuestas de anticuerpos en las primeras semanas de la
de RBD-ACE2, la actividad de los anticuerpos neutralizantes fue mayor en los pacientes
infección por SARS-CoV-2 tienen un papel en la modulación de la gravedad de la
hospitalizados en comparación con los pacientes ambulatorios, y comenzó a disminuir
enfermedad. Habiendo descubierto que los pacientes con una enfermedad más leve o una
aproximadamente un mes después del inicio de los síntomas. La neutralización estuvo bien
infección asintomática tenían niveles más bajos de anticuerpos del SARSCoV-2 contra RBD,
correlacionada con los títulos de IgG de RBD y el bloqueo de RBDACE2 (coeficiente de
S1 y N en comparación con los pacientes gravemente enfermos, planteamos la hipótesis de
regresión lineal de determinación R 2 de 0,6995 y 0,6824 para pacientes hospitalizados; 0,7338
que la focalización relativa de la respuesta de anticuerpos entre los antígenos podría estar
y 0,6839 para pacientes ambulatorios). El ensayo de bloqueo RBD-ACE2 fue menos sensible
asociada con una gravedad diferente de la enfermedad. En un estudio reciente, el análisis
que la neutralización o el ELISA RBD IgG. Los resultados de RBD IgM e IgA ELISA fueron
serológico de muestras de pacientes que murieron de COVID-19 en comparación con
mucho más variables y no se correlacionaron tan bien con la neutralización o el bloqueo de
individuos que convalecieron sugirió un enriquecimiento de una medida agregada de
RBD-ACE2 en comparación con RBD IgG.
anticuerpos pico o actividades funcionales de anticuerpos en los convalecientes ( 19). Calculamos
las proporciones de RBD a N (Fig.5A) y S1 a N (Fig.5B) resultados de ELISA para IgM, IgG e
IgA para todas las muestras que tenían
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similar a la observada para RBD (figs. S3 a S5 y tabla S2). Mientras que las respuestas de
anticuerpos detectables. En particular, en las semanas 1 y 2 posteriores al inicio de los síntomas, las
0,47 para IgM, -0,43 para IgG y -0,44 para IgA, p <0,001 para cada uno) (Figs. 6, 7,
proporciones de IgG RBD / N y S1 / N de pacientes ambulatorios fueron más altas que las de los pacientes
8; Figs. S10, S11).
ingresados que no ingresaron en la UCI y los pacientes que murieron a causa de su enfermedad; los
pacientes ingresados y en la UCI también tuvieron mayores proporciones de RBD / N en comparación con
los pacientes que murieron. En las semanas 3 y 4, y después de 4 semanas, los pacientes ambulatorios y
los pacientes ingresados tenían relaciones IgG S1 / N más altas en comparación con los pacientes de la
UCI y los que fallecieron. Las respuestas de IgA mostraron un patrón similar al de IgG en las semanas 3 y 4,
y después de la semana 4 después de la aparición de los síntomas. Las proporciones de IgM a estos
antígenos fueron más variables y no mostraron una relación consistente con la gravedad de la enfermedad.
DISCUSIÓN
Las preguntas clínicas clave en la pandemia de COVID-19 en curso son el
papel de los anticuerpos en la modulación de la gravedad de la enfermedad
durante la infección, la duración de las respuestas serológicas de los individuos y
el grado en que las respuestas de anticuerpos del paciente pueden proteger contra
la reinfección. A medida que los candidatos a la vacuna del SARS-CoV-2 avancen
a través de los ensayos clínicos, la comparación de las respuestas inmunitarias
inducidas por la vacuna con las estimuladas por la infección viral y las de las
se asocian con disminuciones en la ARNemia, pero no con trastornos.
personas que se reinfectan ayudará a aclarar los correlatos inmunológicos de
protección. Una comprensión más completa del papel de los anticuerpos en la
enfermedad aguda por COVID-19 guiará el uso eficaz de productos plasmáticos de
facilitar el resultado
Planteamos la hipótesis de que un examen detallado del curso temporal de las
respuestas de anticuerpos del SARS-CoV-2 podría identificar patrones distintos
asociados con los pacientes ingresados que no ingresan en la UCI (Fig.6, Fig.
convalecencia terapéuticos y anticuerpos recombinantes dirigidos contra el
SARS-CoV-2. Suponiendo que las vacunas dirigidas a picos sean seguras y
eficaces y se utilicen ampliamente,
S10), pacientes en la UCI que se recuperaron de su enfermedad (Fig.7, fig. S11A),
o los que murieron (Fig. 8, fig. S11B). Identificamos tres patrones principales de
respuesta: en el momento más cercano a su alta hospitalaria o muerte, los
individuos del Grupo 1 tenían respuestas de anticuerpos contra el SARS-CoV-2 sin
actividad de bloqueo de RBD IgG o RBD-ACE2; Los individuos del grupo 2 tenían
hasta un 25% de actividad bloqueante de RBD-ACE2; y los individuos del Grupo 3
desarrollaron altos niveles de anticuerpos y más del 25% de actividad bloqueante
de RBDACE2. Estos patrones de respuesta no se asociaron fuertemente con la
gravedad de la enfermedad, sino que se compartieron entre las categorías de
enfermedades. Los pacientes del grupo 1 incluyeron pacientes ingresados que se
recuperaron rápidamente de su enfermedad y fueron dados de alta antes de que
hubieran desarrollado respuestas de anticuerpos detectables, pero también
incluyeron pacientes que se recuperaron de su enfermedad sin producción de
anticuerpos después de estadías prolongadas en la UCI y pacientes que murieron
de COVID-19 antes de desarrollo de anticuerpos. De manera similar, los patrones
Aquí, hemos analizado las respuestas serológicas al SARSCoV-2 en 254 individuos
que van desde individuos asintomáticos hasta pacientes de la UCI, con un análisis
detallado de las respuestas de anticuerpos a los antígenos RBD, S1 y N del
SARS-CoV-2, y ensayos funcionales que prueban el bloqueo de anticuerpos del RBDUnión de ACE2 o neutralización del virus pseudotipado con púas. En los puntos
temporales tempranos posteriores al inicio de los síntomas, no vimos evidencia de
anticuerpos preexistentes que reconozcan el SARS-CoV-2, lo que sugiere que existe una
mínima reactividad cruzada de los antígenos del SARS-CoV-2 con los coronavirus de la
comunidad. Estos hallazgos no excluyen la posibilidad de que las células B de memoria
estimuladas por la exposición previa al coronavirus puedan tener una reacción cruzada y
formar parte de la respuesta al SARS-CoV-2.
del Grupo 2 con niveles bajos de bloqueo de RBD-ACE2 se compartieron en las
tres categorías de pacientes. En el Grupo 3 (altos niveles de producción de
anticuerpos y> 25% de actividad de bloqueo de RBD-ACE2), los pacientes
admitidos que no ingresaron en la UCI se diferenciaron de los pacientes en la UCI
o fallecidos en que desarrollaron sus respuestas sólidas de anticuerpos durante
estancias cortas en el hospital antes del alta, mientras que en la UCI o fallecidos
los pacientes normalmente tenían cursos hospitalarios prolongados.
Los anticuerpos IgM, IgG e IgA específicos para los antígenos del SARS-CoV-2
generalmente se vuelven detectables en la sangre de los pacientes en tiempos medios similares
de aproximadamente 2 semanas después del inicio de los síntomas (este estudio y ( 32, 33)), aunque
la sincronización de la IgA es la más variable. Como hemos informado recientemente, aparecen
en la circulación grandes proliferaciones policlonales de células B recientemente cambiadas de
clase que expresan subtipos IgG e IgA con bajas frecuencias de mutación somática de
anticuerpos en la circulación alrededor del momento de la seroconversión, probablemente
incluyendo plasmablastos que contribuyen a las respuestas serológicas observadas 29).
¿Qué características de las respuestas de anticuerpos del paciente se asociaron con la gravedad
La ARNemia viral se detecta en hasta un tercio de los pacientes con COVID-19, con
mayor frecuencia en pacientes con enfermedad grave ( 3, 31).
Se evaluó la ARNemia en un subconjunto de pacientes y se detectó en 15 de 25
pacientes ingresados, 13 de 15 pacientes de UCI que se recuperaron y 2 de 2 pacientes
que murieron a causa de su enfermedad. La reducción de la ARNemia se correlacionó
fuertemente con la aparición de anticuerpos plasmáticos (coeficientes de correlación de
de la enfermedad? Para nuestra sorpresa, encontramos que los pacientes ambulatorios con la
enfermedad más leve mostraban proporciones más altas de dominios RBD y S1 de pico en
comparación con el antígeno N, comenzando en las primeras dos semanas después de la aparición de
los síntomas. Estos hallazgos podrían sugerir que las respuestas inmunes humorales tempranas
centradas en los antígenos de pico ayudan a limitar la infección viral, quizás incluso en momentos en
que los títulos aún no son lo suficientemente altos como para ser
Spearman de -
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Los patrones de evolución temporal de los anticuerpos del SARS-CoV-2 en pacientes hospitalizados
Existe una necesidad urgente de comprender cuánto tiempo
medido en la sangre. Los pacientes ambulatorios y los pacientes admitidos fuera de la
UCI tenían las cargas virales más bajas en sus hisopos nasofaríngeos, pero este estudio
Los títulos contra el virus persisten después de la infección, ahora que la pandemia ha
observacional no puede determinar si esto se debe a sus respuestas de anticuerpos. En
estado en curso durante más de medio año en muchos países, y han comenzado a
otros estudios también se han encontrado asociaciones de mortalidad en pacientes con
aparecer informes de casos iniciales de reinfección comprobada por SARS-CoV-2 ( 37,
COVID-19 con carga viral de SARS-CoV-2 evaluada mediante rRT-PCR aplicada a
38). Los estudios que difieren en las poblaciones de pacientes, la gravedad de la
muestras de hisopos nasofaríngeos ( 34, 35). Nuestros datos son consistentes con los
enfermedad y los ensayos serológicos no han estado de acuerdo con la duración de las
resultados informados de un panel de ensayos de anticuerpos aplicados a muestras
respuestas de anticuerpos del SARS-CoV-2 ( 14, 16, 32). Nuestros datos derivados de
puntuales de pacientes con COVID-19 que se recuperaron o murieron de su enfermedad,
pacientes hospitalizados, pacientes ambulatorios e individuos asintomáticos, con una
que encontraron valores más altos de respuestas dirigidas a picos en los convalecientes ( 19).cohorte de validación asintomática adicional, muestran claramente que no solo IgM e
IgA, sino también títulos de IgG para antígenos RBD, S1 y N, actividad de bloqueo
títulos de anticuerpos más altos que aquellos con una enfermedad más leve, de acuerdo
RBD-ACE2 y títulos de neutralización viral pseudotipados todos comienzan a disminuir
con publicaciones anteriores ( 32, 36)
en los pacientes aproximadamente después del primer mes después de la aparición de
los síntomas. La disminución en los títulos de anticuerpos es más evidente en
individuos que tenían una infección asintomática o una enfermedad leve, que producen
e informes de otras infecciones por coronavirus ( 21 - 23). Los pacientes con una
niveles más bajos de anticuerpos en el pico de sus respuestas. Observamos que los
enfermedad más grave también tenían cargas virales algo más altas que los pacientes
resultados informados que no lograron encontrar una disminución en los anticuerpos
con una enfermedad más leve, lo que sugiere que cantidades iniciales más grandes de
contra el SARSCoV-2 después de varios meses después de la infección se han basado
antígeno viral pueden contribuir a sus mayores respuestas serológicas. El bloqueo
en ensayos "pan-Ig" que no pueden evaluar cada isotipo por separado ( dieciséis). Nuestros
funcional de la interacción RBDACE2 y la neutralización del virus pseudotipado con
datos no nos permiten predecir qué fracción de la población será susceptible de
picos por los anticuerpos del paciente aparecieron con un curso de tiempo similar al de
reinfección en un momento dado después de su enfermedad inicial, o si los individuos
IgM, IgG e IgA, pero se correlacionaron más estrechamente en magnitud con los títulos
mantendrán mesetas sostenidas de niveles más bajos de anticuerpos después de una
de IgG. La neutralización, el bloqueo de RBD-ACE2 y la IgG específica de RBD
disminución inicial; Se requerirá tiempo adicional y seguimiento para obtener esta
estaban altamente correlacionados en pacientes con niveles altos de anticuerpos, pero
información. Una limitación de nuestro estudio es que, además de la cohorte de
el bloqueo de RBD-ACE2 fue menos sensible que el ensayo de neutralización,
validación prospectiva, los puntos de tiempo de muestreo para cada paciente se
potencialmente debido a los anticuerpos que pueden neutralizar al unirse a regiones no
determinaron en función de la duración de la estancia hospitalaria y las visitas
RBD de la espiga, o anticuerpos de menor afinidad que pueden neutralizar en el ensayo
sanitarias posteriores, lo que permitió un análisis más detallado de las respuestas
de cultivo celular pero que no compiten tan bien con la unión de ACE2 en las
serológicas en pacientes con enfermedades más graves. Es importante señalar que la
condiciones del ensayo de bloqueo. Sin embargo, actualmente no está claro cuál de
disminución de los niveles de anticuerpos no indica necesariamente que se perderá
estos ensayos será el mejor predictor de la protección inmunológica in vivo contra la
toda la inmunidad. 39). Incluso si los anticuerpos séricos disminuyen a niveles
infección o reinfección por SARS-CoV-2 en individuos vacunados o previamente
indetectables, las células B y T de memoria estimuladas por la infección podrían
infectados.
proporcionar una respuesta más rápida o eficaz después de una exposición futura. Los
informes iniciales de reinfección ofrecen alguna esperanza de que el SARS-CoV-2
pueda comportarse de manera similar a otros coronavirus comunitarios, y que la
reinfección generalmente produce una enfermedad más leve que la infección inicial ( 40,
En los cursos de tiempo serológicos detallados de los pacientes
41).
hospitalizados en este estudio, fue evidente que los patrones de respuestas de
anticuerpos no podían explicar completamente los resultados del paciente, incluida
la muerte. Un número considerable de pacientes se recuperaron de su enfermedad
y fueron dados de alta del hospital antes de que hubieran formado respuestas de
anticuerpos detectables, pero también se observaron respuestas serológicas
mínimas en pacientes que murieron de COVID-19 en momentos tempranos
después de la aparición de los síntomas. De manera similar, se observaron
Una implicación de nuestro hallazgo de niveles decrecientes de anticuerpos es
individuos con producción moderada de anticuerpos en todo el espectro de
que los estudios de seroprevalencia pueden, con el tiempo, subestimar la
gravedad de la enfermedad hospitalaria, y muchos pacientes que murieron a
proporción de la población investigada que ha sido previamente infectada con
causa de su enfermedad generaron niveles altos de anticuerpos, actividad
SARS-CoV-2. La disminución de anticuerpos después de la infección también
bloqueadora de RBD-ACE2 y títulos neutralizantes. Diferencias entre individuos en
plantea la cuestión de cuánto durarán los anticuerpos provocados por la
otros aspectos de la respuesta inmune o el curso de la enfermedad,
vacunación y si será necesario un refuerzo frecuente para mantener la protección,
suponiendo que se identifiquen vacunas seguras y eficaces. Las estrategias de
vacunación actuales que se someten a ensayos clínicos difieren de la infección
natural en una variedad de formas, incluido el método para generar o introducir
antígenos virales en el
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Los pacientes con una enfermedad más grave en nuestro estudio finalmente elevaron
cuerpo, el sitio de exposición y la presencia de adyuvantes ( 42 -
ACE2-mFc
45). Es posible que algunos de los enfoques de la vacuna puedan generar anticuerpos
Las proteínas SARS-CoV y SARS-CoV-2 RBD se expresaron en células
más potentes y duraderos que la infección natural, en la que el virus puede tener
Expi293F y se purificaron usando resina de níquel-NTA y cromatografía de
mecanismos actualmente desconocidos para subvertir las respuestas inmunes
exclusión por tamaño. La construcción de SARS-CoV (RBD-His_pTT5, GenBank
humorales. Un estudio más detallado de la generación de poblaciones de células B de
AAP13441.1) fue sintetizada comercialmente por Twist Bioscience (San Francisco,
memoria, células plasmáticas de vida corta o larga y memoria de células T para el
CA); la construcción de SARS-CoV-2 (RBD-His_pCAGGS, GenBank MN908947.3)
SARS-CoV-2, así como otros coronavirus, debería comenzar a aclarar algunos de
fue amablemente proporcionada por el Dr. Florian Krammer ( 48). SARS-CoV-2 S1
estos puntos mecánicos clave.
(residuos de pico 1-682) y ACE2-mFc, expresados en células HEK293, y la
proteína N, expresada en E. coli fueron producidos por la organización de
investigación por contrato ATUM. La ACE2 humana soluble fusionada a una
MATERIALES Y MÉTODOS
etiqueta Fc de ratón se construyó sintetizando un gen que codifica ACE2 (residuos
Diseño del estudio y participantes
respuestas inmunes humorales al SARS-CoV-2, incluidos los anticuerpos que
615) unido por un (G 4 S) x2 enlazador a IgG2a Fc de ratón, y se colocó bajo el control de
bloquean la unión de RBD al receptor ACE2 humano o la neutralización del
un promotor de CMV mediante clonación en un plásmido de expresión de mamífero.
pseudovirus pico, y las cargas de ARN viral en la nasofaringe y la sangre en
diferentes COVID-19. grupos de pacientes y pacientes individuales. El 4 de marzo
de 2020, el Laboratorio de Virología Clínica de Stanford Health Care comenzó las
pruebas de rRT-PCR en muestras nasofaríngeas de pacientes con sospecha de
COVID-19 utilizando un ensayo de rRT-PCR de SARS-CoV-2 desarrollado en
laboratorio ( 46, 47). Para este estudio, incluimos muestras de pacientes con
infección por SARS-CoV-2 confirmada por rRT-PCR que reportaron síntomas de
COVID-19 en sitios clínicos asociados a Stanford Healthcare entre marzo de 2020
y agosto de 2020; y muestras de pacientes ambulatorios positivos para rRT-PCR e
individuos asintomáticos identificados entre abril de 2020 y mayo de 2020
mediante exámenes de salud ocupacional que incluyen rRT-PCR y pruebas
serológicas para RBD IgM / G en Stanford Clinical Laboratories. El programa de
detección que detectó individuos infectados con SARS-CoV-2 asintomáticos se
ofreció a todos los empleados de Stanford Healthcare de forma voluntaria y se
evaluó a los empleados con pruebas de rRT-PCR con hisopo nasofaríngeo y
serología. Además, incluimos una cohorte de validación de 14 individuos
asintomáticos y con enfermedades leves con una recolección prospectiva de
muestras hasta cuatro meses después de la inscripción.
ELISA para detectar anticuerpos anti-SARS-CoV-2 Spike RBD en muestras de
plasma
El procedimiento ELISA en este estudio fue modificado de un protocolo
publicado por Stadlbauer ( 48).
Placas de alta unión Corning Costar de 96 pocillos (catálogo no.
9018, Thermo Fisher) se recubrieron con proteína SARS-CoV RBD, SARS-CoV-2 RBD,
S1 o N en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración de 0,1 μ g
por pocillo (0.025 μ g por pocillo para el ensayo de IgG de nucleocápsida) durante la
noche a 4 ° C. Al día siguiente, los pocillos se lavaron 3 veces con PBS-Tween 20 al
0,1% (PBS-T) y se bloquearon con PBS-T que contenía leche en polvo desnatada al 3%
durante 1 hora a temperatura ambiente (TA). A continuación, se incubaron los pocillos
con muestras de plasma de pacientes con COVID-19 a una dilución de 1: 100 en PBS-T
que contenía leche desnatada al 1% durante 1 hora a 37 ° C. En cada placa se
incluyeron dos pocillos de combinación de plasma negativos y dos positivos y dos
pocillos en blanco incubados con PBS-T que contenía leche en polvo desnatada al 1%.
Después de lavar 3 veces con PBS-T, anti-IgG humana de cabra conjugada con
peroxidasa de rábano picante ( γ- específico de la cadena, catálogo no. 62-8420, Thermo
Fisher, dilución 1: 6000), IgM ( μ- específico de la cadena, catálogo no. A6907, Sigma,
dilución 1: 6000) o IgA ( α- específico de la cadena, catálogo no. P0216, Agilent, dilución
1: 5.000) en PBS-T que contenía leche desnatada al 1% y se incubó durante 1 hora a
TA. Los pocillos se lavaron 3 veces con PBS-T y se secaron golpeando vigorosamente
las placas sobre toallas de papel. 3,3 ′, 5,5 ′ - Se añadió una solución de sustrato de
tetrametilbencidina (TMB) y la reacción se detuvo después de 12 min mediante la
Recolección de muestras y datos
adición de ácido sulfúrico 0,16 M. La densidad óptica (DO) a 450 nanómetros se midió
Muestras de sangre por punción venosa recogidas en heparina sódica
con un lector de microplacas EMax Plus (Molecular Devices, San José, CA); los valores
o K 2 Se utilizaron vacutainers recubiertos con EDTA para las pruebas serológicas y la detección de
de los pocillos en blanco se restaron de los valores obtenidos para las muestras de
ARNemia por rRT-PCR, respectivamente. Después de cen-
plasma. El valor de corte para la seroconversión se calculó agregando 3 desviaciones
trifugación para la recolección de plasma, las muestras se almacenaron a 80 ° C.
estándar a las DO de ELISA promedio de 94 muestras históricas de control negativo de
donantes de sangre sanos (recolectadas antes de la pandemia para un estudio de
Se realizó una revisión retrospectiva de las historias clínicas de todos los participantes
del estudio. Los datos recopilados incluyeron edad, sexo, fecha de inicio de los síntomas,
seroprevalencia no relacionado) obtenidas al analizar las muestras en todos los
ensayos de proteína / isotipo (tabla S4).
duración de la estancia hospitalaria, tiempo de internación en la UCI, fecha y valor de Ct
para el resultado de la prueba de diagnóstico por torunda nasofaríngea rRT-PCR, la
presencia de comorbilidades subyacentes, síntomas clínicos y mortalidad.
Producción de proteínas SARS-CoV y SARS-CoV-2 y
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1-
El objetivo de este estudio fue investigar las correlaciones entre las
En las figs. Se proporcionan detalles adicionales para la configuración del ensayo ELISA del
las series de diluciones mostradas en la Figura S9 se realizaron por duplicado técnico;
instrumento de laboratorio clínico y manual. S12 y S13.
Los valores de% de infectividad normalizados se ajustaron con una curva inhibidora de
Competición ELISA para detectar anticuerpos que bloquean la unión.
regresión no lineal de tres parámetros en GraphPad Prism 8.4.1 y los ajustes se
ing de ACE2 toRBD
restringieron para tener un valor de 0% en la parte inferior del ajuste.
Se recubrieron placas de alta unión Corning Costar de 96 pocillos (Thermo
Fisher: cat. 9018) con proteína RBD de pico de SARS-CoV-2 en PBS a una
PCR en tiempo real para detectar ARN del SARS-CoV-2 en plasma
Un volumen de 400 μ Se extrajo L de plasma anticoagulado con EDTA mediante
concentración de 0,1 μ g por pocillo durante la noche a 4 ° C. Todos los pasos de
ELISA de competición se llevaron a cabo al día siguiente a TA. Los pocillos se lavaron
Qiagen EZ1 Virus Mini Kit v2.0 (Qiagen Germantown, MD). Se realizaron pruebas
3 veces con PBS-T y se bloquearon con PBS-T que contenía leche en polvo
moleculares para detectar la presencia de ARN del SARS-CoV2 en plasma con una
desnatada al 3% durante 1 hora. Luego, los pocillos se incubaron con muestras de
modificación de un ensayo de rRT-PCR publicado dirigido a la envoltura ( MI) gen 46,
47).
leche desnatada al 1% durante 1 hora. En cada placa se incluyeron dos controles de
Los valores estándar de Ct de las pruebas positivas con este ensayo oscilan entre Ct
calidad (Access SARS-CoV-2 IgG QC, QC1-QC2, 2 niveles, número de catálogo
<20 a 45 ciclos. Se repitió la prueba de muestras de plasma con un valor Ct de 40 o
C58964, Beckman Coulter) y dos pocillos en blanco incubados con PBS-T que
más para asegurar la reproducibilidad del resultado positivo. Como el cultivo viral no
contiene leche desnatada al 1%. ACE2-mFc diluido a 0,5 μ Se añadieron g / ml en
se realizó como parte de este estudio, la presencia de SARS-CoV-2 en el plasma
leche en polvo desnatada al 1% sin etapas de lavado y se incubó durante 45 min más.
analizado se definió como ARNemia.
Después de lavar 3 veces con PBS-T, se añadió IgG anti-ratón de cabra conjugada
con peroxidasa de rábano picante (Fc específico, catálogo n. ° 31439, Invitrogen,
dilución 1: 10'000) en PBS-T que contenía leche desnatada al 1% y se incubó durante
45 min. Los pocillos se lavaron 3 veces con PBS-T y se secaron golpeando
vigorosamente las placas sobre toallas de papel. Se añadió una solución de sustrato
TMB y la reacción se detuvo después de 12 min mediante la adición de ácido sulfúrico
0,16 M. La DO a 450 nanómetros se midió con un lector de microplacas EMax Plus
(Molecular Devices, San Jose, CA). Los valores de DO se convirtieron en porcentaje
de bloqueo utilizando la siguiente fórmula: 100 * (1- (OD de la muestra -
Estadísticas
Se utilizó el software GraphPad Prism versión 8.0 (GraphPad Software, San Diego,
California, EE. UU.) Para visualizar los datos de ELISA, analizar las diferencias en las
respuestas de anticuerpos entre las categorías de enfermedades mediante la prueba de
suma de rangos de Wilcoxon y llevar a cabo la regresión lineal de la neutralización de
virus pseudotipados, RBD- Resultados de ELISA de anticuerpos y bloqueo de ACE2. La
bondad de ajuste para los análisis de regresión lineal se informó como el coeficiente de
determinación, R 2. El suavizado de la gráfica de dispersión estimada localmente para el
desarrollo y la disminución de las respuestas de anticuerpos a lo largo del tiempo se
realizó utilizando el método loess en el paquete estadístico R versión 3.6.1 ( 50). Correlación
entre la DO del anticuerpo 450 valores, ARNemia y ensayo de bloqueo de ACE2-RBD OD 450
0,2) / (QC1 OD - 0,2)), teniendo en cuenta el ruido de fondo del ensayo de 0,2
Los valores se calcularon como correlaciones de Spearman con la función R cor.
determinado después de analizar muestras de plasma de control prepandémicas. En
las figs. Se proporcionan detalles adicionales para la configuración y optimización del
ensayo ELISA de competición. S14 y S15.
MATERIALES COMPLEMENTARIOS
immunology.sciencemag.org/cgi/content/full/5/54/eabe0240/DC1
PAGS ensayo de neutralización lentiviral seudotipado
Figura S1. Diseño del estudio y descripción general de los participantes.
Se realizaron ensayos de lentivirus pseudotipados de SARS-CoV-2 como se describió
anteriormente. Brevemente, se produjo lentivirus pseudotipado en espiga en células
Figura S2. Valores de umbral de ciclo (Ct) de SARS-CoV-2 rRT-PCR para diagnóstico
hisopos nasofaríngeos (NP).
Figura S3. Distribución y trayectorias de las respuestas de anticuerpos al SARS-CoV-2 en
HEK293T como se describe en ( 49) utilizando un sistema de 5 plásmidos descrito en ( 27). Para
los ensayos de neutralización viral, las células ACE2 / HeLa ( 28) se sembraron en placas
de cultivo de tejido de 96 pocillos un día antes de la infección. Antes de los ensayos de
neutralización, las muestras de plasma de los pacientes se inactivaron por calor durante 1
pacientes hospitalizados a lo largo del tiempo.
Figura S4. Distribución y trayectorias de las respuestas de anticuerpos al SARS-CoV-2 en
pacientes ambulatorios a lo largo del tiempo.
Figura S5. Desarrollo de respuestas de anticuerpos S1 de pico anti-SARS-CoV-2 en COVID-19
pacientes.
hora a 56 ° C. Las muestras de plasma y el virus se incubaron con las células a 37 ° C
Figura S6. Desarrollo de respuestas de anticuerpos anti-SARS-CoV-2N en pacientes con COVID-19. Figura S7.
durante ~ 48 horas. Después de la incubación, las células se lisaron con la solución de
Comparación de respuestas de anticuerpos contra antígenos del SARS-CoV-2 entre UCI
lectura del ensayo BriteLite (Perkin Elmer) y se obtuvieron los valores de luminiscencia con
un lector de placas BioTek. Los ensayos de neutralización de un solo punto de dilución se
realizaron por duplicado técnico en dos réplicas experimentales diferentes. El porcentaje
de neutralización se determinó normalizando los valores de luciferasa bruta a un 0% de
infectividad (promedio de pocillos de células solamente) y un 100% de infectividad
(promedio de pocillos de virus solamente) en GraphPad Prism 8.4.1. Plasma
pacientes que sobrevivieron o murieron.
Figura S8. Los pacientes hospitalizados con COVID-19 desarrollan un cruce de RBD de pico anti-SARS-CoV / SARS-CoV-2
respuestas reactivas de IgG.
Figura S9. Actividad de neutralización pseudoviral en muestras longitudinales de la validación
grupo.
Figura S10. Correlaciones entre las respuestas de anticuerpos RBD de pico anti-SARS-CoV-2,
actividad de neutralización pseudoviral y ARN viral en pacientes individuales hospitalizados.
Figura S11. Correlaciones entre las respuestas de anticuerpos RBD de pico anti-SARS-CoV-2,
actividad de neutralización pseudoviral y ARN viral en UCI individuales y pacientes fallecidos.
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plasma de pacientes con COVID-19 a una dilución de 1:10 en PBS-T que contenía
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Figura S12. Titulación de tablero de ajedrez para RBD ELISA serológico.
Figura S13. Validación del laboratorio clínico de Stanford Health Care anti-RBD IgM / G
12. B. Ju, Q. Zhang, J. Ge, R. Wang, J. Sun, X. Ge, J. Yu, S. Shan, B. Zhou, S. Song, X. Tang, J. Yu, J. Lan, J.
ELISA.
Yuan, H. Wang, J. Zhao, S. Zhang, Y. Wang, X. Shi, L. Liu, J. Zhao, X. Wang, Z. Zhang, L. Zhang,
Figura S14. Titulación de tablero de ajedrez para ELISA de bloqueo de receptores.
neutralización humana anticuerpos provocados por la infección por SARS-CoV-2. Naturaleza 584, 115-119
Figura S15. Optimización de ELISA de bloqueo de RBD-ACE2.
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2380-z Medline
Cuadro S1. Características demográficas y clínicas de pacientes ambulatorios y asintomáticos
13. M. Ho, Perspectivas sobre el desarrollo de anticuerpos neutralizantes contra el SARSCoV-2. Anticuerpo Ther
individuos con y sin disponibilidad de plasma. Cuadro S2.
3, 109-114 (2020). doi: 10.1093 / abt / tbaa009 Medline
Seropositividad hospitalaria.
14. FJ Ibarrondo, JA Fulcher, D. Goodman-Meza, J. Elliott, C. Hofmann, MA Hausner, KG Ferbas,
Cuadro S3. Seropositividad de pacientes ambulatorios y asintomáticos.
Cuadro S4. Determinación de los valores de corte y la especificidad del ensayo SARS-CoV-2. Cuadro S5.
NH Tobin, GM Aldrovandi, OO Yang, Rapid Decay of Anti-SARS-CoV-2 Antibodies in Persons
Archivo de datos brutos (hoja de cálculo de Excel)
con leve Covid-19. N. Engl. J. Med. 383,
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Materiales complementarios. Este trabajo tiene una licencia Creative Commons Attribution 4.0 International
PA Piedra, C. Desai, K. Callahan, M. Lewis, P . Price-Abbott,
(CC BY 4.0), que permite el uso, distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre
N. Formica, V. Shinde, L. Fries, JD Lickliter, P. Griffin, B. Wilkinson, GM Glenn, Ensayo de fase 1-2 de una
que el trabajo original se cite correctamente. Para ver una copia de esta licencia, visite
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arte u otro contenido incluido en el artículo que se acredite a un tercero; obtener la autorización del titular
de los derechos antes de utilizar dicho material.
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Recibido el 27 de julio de 2020 Reenviado
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el 5 de octubre de 2020 Aceptado el 3 de
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Computación Estadística, Viena, Austria. URL: http: //www.R-
project.org/ .
Expresiones de gratitud: Los autores agradecen a Dana Anderson por sus útiles consejos sobre
producción de proteínas, y el equipo ATUMBio para la optimización y producción de antígenos. Agradecemos al
Dr. Jesse Bloom, Kate Crawford, el Dr. Dennis Burton y la Dra. Deli Huang por compartir los plásmidos, las
células y los valiosos consejos para la implementación del ensayo de neutralización lentiviral pseudotipado con
espigas.
Fondos: Este trabajo fue apoyado por NIH / NIAID R01AI127877 (SDB), NIH / NIAID
R01AI130398 (SDB), NIH 1U54CA260517 (SDB), NIH / NIAID T32AI007502-23 (AR), NIH / NIAID
U19AI111825 (TT003142), UL1 BN), una donación a SDB de la Crown Family Foundation, una
beca postdoctoral para AEP del Stanford Maternal and Child Health Research Institute, un
estipendio de beca de movilidad para postdoctorado temprano para
OFW de la Swiss National Science Foundation (SNSF) y un premio de respuesta rápida COVID-19 de
Coulter al JRC y SDB Contribuciones de autor: KR,
AEP, OFW, BAS, BAP, SDB conceptualizaron y diseñaron el estudio. KR,
AEP, OFW, CAH, MKS, CHH, FY, JM realizaron los experimentos.
BAS, JN, MH, HW, MKS, MM, ARO, TDP, AR, AJR, CAB, JRC,
KCN, BAP, SG, NHS recopilaron datos y / o aportaron muestras / reactivos o métodos de
procesamiento de EHR. CAH, JM, TSJ, JLZ, TTW, KCN, PSK proporcionaron contribuciones
intelectuales a lo largo del estudio. KR, BN, RT, realizaron análisis estadísticos. KR, AEP, OFW,
BAP, CAH, SG, RT,
SDB analizó los datos. KR, SDB escribió el manuscrito. Todos los autores editaron y aprobaron el manuscrito. Conflicto
de intereses: MH es un empleado de ATUM. SDB ha sido consultor de Regeneron, Sanofi y Novartis sobre
temas no relacionados con este estudio. SDB, KR, PSK y AEP han presentado solicitudes de patente
provisionales relacionadas con las pruebas serológicas para anticuerpos contra el SARS-CoV-2.
KCN informa subvenciones del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID),
Investigación y Educación sobre Alergias Alimentarias (FARE), End Allergies Together (EAT); Instituto
Nacional del Corazón, Pulmones y Sangre (NHLBI) e Instituto Nacional de Ciencias de la Salud
Ambiental (NIEHS). KCN es Director del Centro de Excelencia de FARE y la Organización Mundial de
Alergias (WAO) en la Universidad de Stanford; Asesor de Cour Pharmaceuticals; Cofundador de Before
Brands, Alladapt, Latitude e IgGenix; Miembro del Comité Científico Nacional de la Red de Tolerancia
Inmunológica (ITN) del NIAID; receptor de un patrocinio de investigación de Nestlé; Consultor y
miembro del consejo asesor de Before Brands, Alladapt, IgGenix, NHLBI y ProBio; y miembro de la
Junta de Monitoreo de Datos y Seguridad en NHLBI. CAB está en la junta de Catamaran Bio. Disponibilidad
de datos y materiales: Todos los datos necesarios para evaluar las conclusiones del artículo están
presentes en el artículo o en el
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Fig. 1. Prueba serológica de plasma de individuos con SARS-CoV-2 rRT-PCR +. Muestras de plasma de individuos positivos para SARS-CoV-2
rRT-PCR ( UN) se analizaron para determinar la presencia de anticuerpos que se unen al pico RBD del SARS-CoV-2 ( SEGUNDO). * También se analizó
el plasma para detectar anticuerpos específicos para las proteínas S1 y N del SARS-CoV-2, y el RBD del SARS-CoV. Además, se analizaron muestras
para detectar anticuerpos que bloquean la interacción de ACE2 y RBD en un ELISA de competición ACE2 ( C). Se realizaron ensayos de neutralización
lentiviral pseudotipada de SARS-CoV-2 en muestras de plasma seleccionadas ( RE). Se midió la entrada de virus mediada por picos en las células HeLa
que sobreexpresan el receptor ACE2 mediante la actividad informadora de luciferasa.
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pacientes hospitalizados y fallecidos por COVID-19 (714 muestras) ( UN) y 86 pacientes ambulatorios (114 muestras) ( SEGUNDO) se analizaron mediante ELISA a una
dilución de 1: 100 para la presencia de anticuerpos IgM, IgG e IgA específicos de SARS-CoV-2 RBD y para anticuerpos que bloquean la unión de ACE2 a RBD. Datos
de ELISA estratificados por los 86 pacientes ambulatorios (Outpt), 35 pacientes hospitalizados que no requirieron atención en UCI (Admit) y los 20 pacientes de UCI y
25 pacientes que fallecieron, desde la semana 1 hasta ≥ 7 semanas después del inicio de los síntomas ( C). Los recuadros indican el rango intercuartílico y los bigotes
muestran los valores mínimo y máximo para cada grupo. Las líneas punteadas indican el límite del ensayo. Se muestran los valores medios para mediciones
duplicadas. Las comparaciones de las pruebas estadísticas son P1 = Outpt vs Admit / UCI / Fallecido, P2 = Admitir vs UCI / Fallecido, por la prueba de suma de rango
de Wilcoxon bilateral. * P <0,05, ** P <0,01,
* * * P <0,001, **** P <0,0001. Datos de 14 muestras de 2 pacientes (uno ingresado fuera de UCI y uno fallecido
paciente) no se trazan porque se desconocía el momento de inicio de los síntomas. OD ELISA media 450 Los valores de las mediciones duplicadas se muestran
para cada muestra.
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Fig. 2. Desarrollo de respuestas de anticuerpos anti-SARS-CoV-2 RBD en pacientes con COVID-19. 828 muestras de plasma longitudinales recolectadas de 80
de plasma de pacientes hospitalizados (n = 188) ( UN) y ambulatorios (n = 96) ( SEGUNDO) recolectados en diferentes puntos de tiempo después del inicio de los
síntomas, se probaron a una dilución de 1: 1250 para determinar su actividad de neutralización de pseudovirus. Las correlaciones con los datos de RBD IgM, IgG, IgA
(muestras de plasma diluido 1: 100) y ELISA de bloqueo RBD-ACE2 (muestras de plasma diluido 1:10) se evaluaron con regresión lineal simple y bandas de
confianza del 95% (sombreado gris) de la mejor -línea de ajuste. Las correlaciones entre los datos de RBD IgM, IgG e IgA y los resultados de ELISA de bloqueo de
RBD-ACE2 se realizaron en el conjunto de muestras completo de pacientes hospitalizados (n = 714) y pacientes ambulatorios (n = 114). Los gráficos muestran la DO
de ELISA media 450 valores de mediciones duplicadas y neutralización porcentual promedio de pruebas duplicadas en cada uno de los dos experimentos repetidos.
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Fig. 3. Correlación de la neutralización viral pseudotipada con espigas, el bloqueo de RBD-ACE2 y los resultados de la serología específica de RBD. Muestras
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Fig. 4. Desarrollo de respuestas de anticuerpos RBD de pico anti-SARS-CoV-2 en individuos asintomáticos con rRT-PCR + de SARS-CoV-2 y pacientes
ambulatorios a lo largo del tiempo. Se analizaron 176 muestras de plasma de 136 individuos con SARS-CoV-2 rRT-PCR + para detectar RBD IgM e IgG. El eje x
indica el tiempo que sigue a la primera prueba de rRT-PCR positiva ( UN). Las líneas punteadas indican el límite del ensayo para resultados positivos. RBD IgM e IgG
se muestran para el último punto de tiempo disponible para sujetos con Ct bajo (Ct> 12-25), medio (Ct> 25-35) y alto (Ct> 35-40) SARS-CoV-2 rRT-PCR en
diagnóstico ( SEGUNDO). Se analizaron 45 muestras de plasma de 14 rRT-PCR + individuos asintomáticos y pacientes ambulatorios muestreados a intervalos
mensuales (V1 = inscripción, V2 a V5 = meses 1 a 4 posteriores a la inscripción) para detectar RBD IgM, IgG, IgA a una dilución de 1: 100, así como los anticuerpos
bloqueadores RBD-ACE2 a una dilución de 1:10 ( C). Las 45 muestras de plasma
se analizaron adicionalmente para la neutralización pseudoviral a una dilución de 1: 1250 ( RE). ELISA de caja-bigotes 450 y las gráficas de porcentaje de bloqueo /
neutralización muestran el rango intercuartílico como el cuadro y el mínimo y máximo
valores como los extremos de los bigotes. Las correlaciones entre la neutralización del virus y el bloqueo de RBD IgM, IgG, IgA y RBDACE2 se muestran con
regresión lineal simple superpuesta y bandas de confianza del 95% (sombreado gris)
de la línea de mejor ajuste MI). Los gráficos muestran la DO de ELISA media 450 valores de mediciones duplicadas y neutralización porcentual promedio de pruebas
duplicadas en cada uno de los dos experimentos repetidos.
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( UN) y anti-S1 / N ( SEGUNDO) ELISA OD de IgM, IgG e IgA 450 Los valores se muestran para pacientes ambulatorios (Outpt), pacientes hospitalizados que no (Admitieron) o
requirieron (UCI) atención en UCI y pacientes fallecidos (Muerte) a lo largo del tiempo. Bigotes de caja
ELISA OD 450 Las gráficas de razón ilustran el rango intercuartil como la caja y los valores mínimo y máximo como los extremos de los bigotes. Las comparaciones
entre grupos se realizaron mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon bilateral. * P <0,05, **
P <0,01, *** P <0,001, **** P <0,0001. La línea de puntos denota una proporción igual de anticuerpos específicos de antígeno.
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Fig. 5. Relaciones de respuesta de anticuerpos RBD / N y S1 / N en pacientes con diferente gravedad de la enfermedad. Relaciones de RBD / N
ARN viral en pacientes individuales hospitalizados que no requirieron atención en la UCI.
Los gráficos de pacientes individuales muestran el desarrollo de respuestas de anticuerpos RBD IgM, IgG e IgA (paneles superiores para cada paciente) y
anticuerpos bloqueadores RBD-ACE2 (paneles inferiores para cada paciente) para todos los puntos de tiempo de muestra de plasma disponibles. El sombreado
naranja indica el tiempo de internación en el hospital. Se muestran gráficos representativos para individuos sin (Grupo 1), hasta un 25% (Grupo 2) y más del 25%
(Grupo 3) de actividad bloqueante de RBD-ACE2. Los gráficos de los pacientes admitidos restantes se muestran en higo. S10. La ARNemia viral y la actividad de
neutralización de pseudovirus se muestran en los paneles inferiores de pacientes en los que se midieron. El punto de tiempo y el valor Ct para el diagnóstico de PCR
con hisopo de NP SARS-CoV-2 rRT se muestran como un triángulo turquesa en el panel inferior.
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Fig. 6. Correlaciones entre las respuestas de anticuerpos de RBD de pico anti-SARS-CoV-2, la actividad de neutralización de pseudovirus de pico y el
pacientes individuales de UCI. Los gráficos de pacientes individuales muestran el desarrollo de respuestas de anticuerpos RBD IgM, IgG e IgA (paneles superiores para cada
paciente) y anticuerpos bloqueadores RBD-ACE2 (paneles inferiores para cada paciente) para todos los puntos de tiempo de muestra de plasma disponibles. El sombreado
naranja indica el tiempo de internación en el hospital, el sombreado rojo representa el período de tiempo que los pacientes fueron tratados en la UCI. Aquí se muestran los
gráficos representativos para individuos sin (Grupo 1), hasta un 25% (Grupo 2) y más del 25% (Grupo 3) de actividad de bloqueo de RBD-ACE2 en el momento más cercano al
alta hospitalaria. Los gráficos para los pacientes restantes de la UCI se muestran en higo. S11A. El punto de tiempo y el valor Ct para el diagnóstico de PCR con hisopo de NP
SARS-CoV-2 rRT se muestran como un triángulo turquesa en el panel inferior.
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Fig. 7. Correlaciones entre las respuestas de anticuerpos RBD de pico anti-SARS-CoV-2, la actividad de neutralización de pseudovirus de pico y el ARN viral en
pacientes fallecidos individuales. Los gráficos de pacientes individuales muestran el desarrollo de respuestas de anticuerpos RBD IgM, IgG e IgA (paneles superiores
para cada paciente) y anticuerpos bloqueadores RBD-ACE2 (paneles inferiores para cada paciente) para todos los puntos de tiempo de muestra de plasma disponibles. El
sombreado naranja indica el tiempo de ingreso en el hospital, mientras que el sombreado rojo representa el período de tiempo que los pacientes fueron tratados en la UCI.
La hora de la muerte se indica en cada parcela con una estrella. Aquí se muestran gráficos representativos para individuos sin (Grupo 1), hasta un 25% (Grupo 2) y más
del 25% (Grupo 3) de actividad de bloqueo de RBD-ACE2. Los gráficos de los pacientes fallecidos restantes se muestran en higo. S11B. El punto de tiempo y el valor Ct
para el diagnóstico de PCR con hisopo de NP SARS-CoV-2 rRT se muestran como un triángulo turquesa en el panel inferior.
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Fig. 8. Correlaciones entre las respuestas de anticuerpos RBD de pico anti-SARS-CoV-2, la actividad de neutralización de pseudovirus de pico y el ARN viral en
Tabla 1. Características demográficas y clínicas de los pacientes.
Pacientes ambulatorios y
Caracteristicas
indicio asintomático
Hembra
Aceptado,
UCI
Fallecido*
(n = 25)
(n = 35)
(n = 20)
41 (32-56)
55 (40-71)
44 (37-63)
76 (64-85)
101 (63)
20 (57)
10 (50)
10 (40)
59 (37)
15 (43)
10 (50)
15 (60)
particulares (n = 160)
Edad, mediana (IQR)
Admitido, no
UCI
Sexo (%)
Masculino
29,7
Diagnóstico de rRT-PCR Ct, mediana (IQR)
(21,8-37,3)
Hipertensión
25,2
20,4
(22,5-29,9)
(16,5-28,8)
15 (1 NA) (43)
11 (55)
10 (40)
30 (19)
8 (23)
7 (35)
19 (76)
16 (10)
7 (20)
7 (35)
14 (56)
Tos
93 (58)
27 (77)
17 (85)
15 (60)
Fiebre
72 (45)
23 (66)
15 (75)
11 (44)
30 (19)
25 (71)
15 (75)
18 (72)
60 (38)
15 (43)
11 (55)
3 (12)
29 (18)
19 (54)
10 (50)
5 (20)
56 (35)
17 (49)
6 (30)
7 (28)
Resfriado
29 (18)
10 (29)
8 (40)
3 (12)
Dolor de cabeza
37 (23)
6 (17)
5 (25)
1 (4)
11 (55)
15 (60)
presentes)
DM
SOLLOZO
Síntomas en la presentación,
Mialgia
N de individuos
soldado americano
(% presente)
Fatiga
Ventilacion mecanica (%)
Duración de la estancia hospitalaria, mediana de días (IQR)
Número de muestras de plasma por paciente, mediana (IQR)
0
0
N/A
5 (2-8)
17 (9-49)
15 (5-29)
1 (1-2)
5 (4-8)
13 (8-21)
8 (3-11)
Unidad de cuidados intensivos; IQR, rango intercuartil; rRT-PCR Ct, umbral del ciclo de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa en tiempo real; NA, no
disponible; DM, diabetes mellitus; SOB, dificultad para respirar; GI, gastrointestinal. * De los 25 pacientes fallecidos, uno, siete y diecisiete fueron clasificados como pacientes
ambulatorios, ingresados fuera de UCI y admitidos en UCI, respectivamente. Los catorce individuos que formaron parte de la cohorte de validación no se incluyeron en esta
tabla.
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número de individuos (%
43 (27 NA) (32)
Obesidad
Comorbilidades
30,6
(21,1-35,4)
Definición de las características y la duración de las respuestas de anticuerpos a la infección por SARS-CoV-2 asociada con la gravedad y el resultado de
la enfermedad
Katharina Röltgen, Abigail E. Powell, Oliver F. Wirz, Bryan A. Stevens, Catherine A. Hogan, Javaria Najeeb, Molly Hunter, Hannah Wang, Malaya K. Sahoo,
ChunHong Huang, Fumiko Yamamoto, Monali Manohar, Justin Manalac, Ana R. Otrelo-Cardoso, Tho D. Pham, Arjun Rustagi, Angela J. Rogers, Nigam H. Shah,
Catherine A. Blish, Jennifer R. Cochran, Theodore S. Jardetzky, James L. Zehnder, Taia T. Wang, Balasubramanian Narasimhan, Saurabh Gombar, Robert
Tibshirani, Kari C. Nadeau, Peter S. Kim, Benjamin A. Pinsky y Scott D. Boyd
Sci. Immunol. 5, eabe0240.
DOI: 10.1126 / sciimmunol.abe0240
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SUPLEMENTARIO
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