GUÍA PARA LAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO, TALLER O CAMPO DEPARTAMENTO: ASIGNATURA: DOCENTE: CIENCIAS DE LA VIDA Y LA AGRICULTURA TALLER DE AGROBIOTECNOLOGÍA DR. DARWIN RUEDA LABORATORIO DONDE SE DESARROLLARÁ LA PRÁCTICA CÓDIGO DE DOCUMENTO: DCIV-GUI-2019-V1-008 CARRERA: ☒ Ing. Agropecuaria ☐ Ing. Biotecnología PERíODO LECTIVO: SII-2020 (NOV2020 – ABR 2021) NRC: NIVEL: 8 PRÁCTICA N°: 3 LAB. AGROBIOTECNOLOGÍA (PRÁCTICAS EN CASA) TEMA DE LA AISLAMIENTO Y MULTIPLICACIÓN MASIVA DE HONGOS BÉNEFICOS. PRÁCTICA: INTRODUCCIÓN: Los organismos que conforman la fracción viva del suelo, principalmente hongos, sufren cambios en cantidad y diversidad de acuerdo al manejo del suelo y de los cultivos que se utilicen a través del tiempo (rotaciones, fertilizació0n, fumigaciones, etc.). La presencia y cantidad de hongos encontrados actúan como un indicador biológico del estado de calidad / salud del suelo dentro del funcionamiento del ecosistema. En la naturaleza existe una gran diversidad de microorganismos entomopatógenos, que afectan a una serie de insectos plaga reduciendo sus poblaciones. Entre estos microorganismos se encuentran hongos, bacterias, virus y nematodos, muchos de los cuales son manipulados y reproducidos masivamente para ser utilizados comercialmente en el control de plagas agrícolas, desarrollándose así el concepto de control microbial. La aplicación de métodos biológicos para el control de insectos plaga que afectan a diversos cultivos, implica la búsqueda de microorganismos entomopatógenos eficaces, así como el desarrollo de metodologías para su multiplicación masiva, con el fin de producir biopreparados a bajo costo, los cuales puedan ser accesibles a la mayoría de los agricultores. Uno de los componentes del control microbial, es el uso de hongos entomopatógenos, los cuales causan enfermedades en los insectos, siendo muchos de ellos utilizados exitosamente en programas de manejo de plagas. La utilización de microorganismos benéficos como hongos entomopatógenos, involucra una serie de procesos para su producción masiva, desde la preparación del materiales y medios de cultivo, así como técnicas de asepsia para evitar contaminantes, cuyo objetivo principal es la obtención de material que, una vez aplicado en campo, actúe directamente como el estado más infectivo del microorganismo o posibilite la formación de ese estado en el campo. OBJETIVOS: - Aislar microorganismos eficientes (EM) benéficos para el suelo capturado mediante una trampa casera de arroz. - Multiplicar de forma masiva los microorganismos eficientes (EM) benéficos para el suelo. MATERIALES: REACTIVOS: INSUMOS: - Alcohol antiséptico (etanol 70%) - Cernidor de cocina - PDA (Agar Papa Dextrosa) o Papa, azúcar y - Fundas transparentes gelatina sin sabor - Cuchara o pinza - Arroz precocido - Agua EQUIPOS: Olla, microondas, olla de presión, base o rejilla de metal. MUESTRA: Hongos capturados en trampa de arroz INSTRUCCIONES: 1. Verificar normas de bioseguridad y adaptarlas a la realidad en casa: - Mantener el lugar de trabajo donde preparará el material en condiciones higiénicas y aseadas (evite lugares con corrientes de aire). - Utilizar ropa de protección: guantes, mascarilla, cabello recogido, zapatos cerrados. - Lavarse con cuidado las manos antes y después de cada procedimiento. - Desinfectar todo el material con alcohol antiséptico (etanol 70%) antes de su uso. - Trabajar cerca de una llama para generar una zona de trabajo estéril (por ejemplo, cerca de una hornilla de cocina, velas/cirios grande) CODIGO: FRM 6.3 REV. UPDI: 2019-nov-21 GUÍA PARA LAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO, TALLER O CAMPO CÓDIGO DE DOCUMENTO: DCIV-GUI-2019-V1-008 ACTIVIDADES POR DESARROLLAR: Preparación del medio PDA: 1. Para preparar 1 L de medio: colocar 200 g de papas sin pelar y picadas en una olla con 500 mL de agua y dejar hervir durante 30 minutos a fuego medio. 2. Retirar la olla del fuego y se deja enfriar el líquido hasta que pueda ser manejado cómodamente a una temperatura aproximada de 45°C (~ 10 minutos). 3. Tamizar el contenido con un cernidor sobre un recipiente limpio (se obtiene aproximadamente 4 g de líquido que constituye el extracto de papa) 4. Añadir al extracto de papa 20 g de azúcar y 15 g de agar (reemplazar con 100 g de gelatina sin sabor) y completar hasta un volumen de 1 L con agua. Nota: En caso de realizar otro volumen de medio de cultivo PDA, realizar los cálculos pertinentes. 5. Homogeneizar mientras aún está caliente, si es necesario calentar en microondas, sin dejar que llegue a la ebullición la preparación para que se mezclen los componentes. Esterilización del material: 6. Preparar el material: a. Medio de cultivo: Colocar el medio de cultivo en un recipiente de plástico o vidrio (resistente al calor) con tapa. Tener en cuenta que los recipientes no deben estar completamente cerrados y llenar máximo hasta los dos tercios del recipiente) b. Recipientes de cultivo: Empacados dentro de fundas de papel 7. Colocar el material a esterilizar (evitando que toque las paredes de la olla), simular un baño María dentro de una olla de presión. Para lo cual se debe colocar alguna base o rejilla de metal y llenar de agua. Se debe evitar que el material a esterilizar se encuentre con el agua. 8. Dejar calentar la olla, hasta que pite por primera vez; a partir de ese momento se baja la temperatura y se toma el tiempo por 20 minutos. 9. Apagar la olla y dejar que se enfríe hasta que los frascos puedan ser manipulados, para dispensar en los recipientes de cultivo (se recomienda que también sean esterilizados) en una cantidad de 20 mL en cada caja y dejar enfriar. Aislamiento de hongos benéficos 10. Recuperar las trampas de arroz colocadas en campo hace una semana. 11. Realizar la inoculación en recipientes con medio PDA: a. Opción 1: Con una cucharita o pinza previamente flameada con etanol absoluto, seleccionar los granos de arroz con las coloraciones típicas de los hongos benéficos y colocarlos en cada recipiente con medio de cultivo (dos granos de arroz del mismo color por recipiente). Etiquetar y sellar los recipientes con plástico para envolver. b. Opción 2: Realizar un raspado sobre las colonias que presentaron características de hongos benéficos, posteriormente el raspado fue colocado en el medio de cultivo de cultivo. Etiquetar y sellar los recipientes con plástico para envolver. 12. Reservar un recipiente sin inocular nada, éste recipiente nos servirá como control negativo, éste deberá permanecer cubierto con el plástico para envolver, en el mejor de los casos este debería permanecer limpio sin ningún tipo de crecimiento microbiano en él. 13. Incubar en oscuridad a temperatura de 20 – 30°C (óptimo 28°C), durante un período de 3 a 8 días observándose su comportamiento todos los días. 14. En caso de contaminación o crecimiento heterogéneo, reaislar el hongo de interés cortando un segmento del medio de cultivo donde se encuentre micelio libre de contaminación e inocularlo sobre un recipiente con medio de cultivo nuevo. Dejar incubar en las mismas condiciones. 15. Finalmente observar detenidamente y determine las características del crecimiento de colonias fúngicas formadas. Producción masiva de hongos benéficos 1. Preparar tubos con agua estéril o con medio líquido PD (procedimiento igual que PDA pero sin gelatina). Una vez frío, inocular el hongo colocando granos de arroz con los colores de los hongos benéficos y homogeneizar. 2. Colocar 100 g de sustrato de arroz precocido dentro de fundas plásticas (procedimiento de cocción igual que para las trampas de arroz). Sellar las fundas y esterilizar en olla de presión. CODIGO: FRM 6.3 REV. UPDI: 2019-nov-21 GUÍA PARA LAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO, TALLER O CAMPO CÓDIGO DE DOCUMENTO: DCIV-GUI-2019-V1-008 3. Dejar reposando las bolsas con sustrato por 12 horas. 4. Tomar 10 mL de medio líquido más hongo con una jeringuilla e inyectar en la funda (desinfectar la zona de punción) posteriormente sellar el orificio creado con cinta. 5. Remover hasta obtener una homogeneidad dentro de la funda. 6. Incubar las bolsas durante 3 días en oscuridad y al cuarto día sacarlas a la luz entre una a dos semanas. Revisar las bolsas diariamente. Esperar al menos una semana, tiempo en el cual el hongo cubrirá el sustrato 7. Hacer un orificio en las bolsas por el centro o colocar el contenido de cada funda en fundas de papel periódico o en bandejas desinfectadas por separado y dejar secar al ambiente en un lugar caliente o al sol durante 3 días. 8. Verter el contenido en fundas plásticas y sellar. RESULTADOS OBTENIDOS: Anotar sus observaciones del crecimiento microbiano de cada muestra, poniendo énfasis en el color observado de cada hongo. Realice el informe para entrega en formato digital por grupo de trabajo. CONCLUSIONES: Se puede aislar microorganismos eficientes (EM) benéficos para el suelo capturado mediante una trampa casera de arroz, utilizando medios de cultivo sólidos. La preparación de fundas con sustrato permite multiplicar de forma masiva los microorganismos eficientes (EM) benéficos para el suelo, sin embargo, es recomendable realizar la multiplicación a partir de los cultivos de hongos previamente aislados e identificados. RECOMENDACIONES: Tener en cuenta normas de bioseguridad mencionadas. Para eliminar el material generado al colocar los cultivos obtenidos en un recipiente con cloro al 2% durante unas 5 horas y luego si verterlo el lavabo. FIRMAS F: ……………………………………………. Nombre: Dr. Darwin Rueda Docente CODIGO: FRM 6.3 F: ………………………………………………. F: …………………………………………………… Nombre: Coordinador de Área de Conocimiento Nombre: Dr. Darwin Rueda Jefe de Laboratorio REV. UPDI: 2019-nov-21
