electroforesis

ELECTROFORESIS DE PROTEINAS EN GEL DE
POLIACRILAMIDA
A. Padilla y H. Gray
INTRODUCCION
Cualquier ion o grupo cargado migrará cuando sometido a un campo
eléctrico. Las proteínas llevan una carga neta a cualquier pH que sea
diferente al de su punto isoeléctrico, por lo tanto estas migrarán y su tasa
de migración dependerá de la densidad de carga (la razón de carga a
masa). Mientras más alta sea la razón de carga a masa, más rápida
será la migración de la molécula. La aplicación de un campo eléctrico a
una mezcla de proteínas en solución, resultará en diferentes migraciones
para diferentes proteínas hacia uno de los electrodos. Sin embargo, ya
que todas las proteínas estuvieron originalmente presentes en toda la
solución, la separación obtenida es mínima. La electroforesis zonal es
una modificación de este procedimiento en donde, la mezcla de
moléculas a ser separadas se coloca como una zona o banda delgada a
una distancia apropiada de los electrodos de tal manera que las proteínas
con diferentes movilidades migren como zonas discretas, que
gradualmente se separan una de otras en el transcurso de la
electroforesis. En la práctica, existen desventajas asociadas a la
electroforesis zonal en solución libre. Primeramente, cualquier efecto de
calentamiento que se de, resulta en una disturbación convectiva de la
columna líquida e interferencia de las zonas protéicas que se estan
separando. Segundo, el efecto de difusión constantemente ensancha
las zonas protéicas y esto continúa hasta después de que ha terminado la
electroforesis. Para minimizar estos efectos, la electroforesis zonal
raramente se lleva a cabo en solución libre, si no que, se ejecuta en una
solución estabilizada con un medio de soporte. Además de reducir los
efectos de convección y difusión durante la electroforesis, el medido de
soporte hace posible que el investigador pueda fijar las posiciones finales
de las proteínas inmediatamente después de la electroforesis, asi
obviando la pérdida de resolución que resulta de la difusión
post-electroforética. El proceso de difusión empleado depende del
medio de soporte que se escoja.
Muchos medios de soporte son de uso común, siendo los más populares
el papel o el acetato de celulosa, materiales tales como gel de sílica,
alumina, o celulosa, que son esparcidos como capas finas en vidrio o
plástico, y geles de agarosa, almidón, o poliacrilamida. Estos medios
estan divididos en dos clases. Papel, acetato de celulosa, y materiales
en capa fina, son relativamente inertes y sirven primordialmente como
soporte y para minimizar convección. Por lo tanto la separación de
proteínas utilizando estos materiales se basa mayormente en la densidad
de carga de las proteínas a un pH escogido, como con electroforesis en
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solución libre. Al contrario, los diferentes geles no solamente preveen
convección y minimizan difusión, sino que en algunos casos estos
activamente participan en el proceso de separación interaccionando con
las partículas migrantes. Estos geles pueden ser considerados como
medios porosos en que el tamaño de poros esta en el orden de los
tamaños de las moléculas de proteínas de tal manera que ocurra un
efecto de tamiz molecular y que la separación dependa de la densidad de
carga y de tamaño. Así, dos proteínas de diferente tamaño pero con
densidad de carga idéntica a lo mejor no sean separadas efectivamente
con electroforesis de papel, mientras que, suponiendo que la diferencia
en tamaño sea lo suficientemente grande, entre ambas especies
protéicas, estas pueden ser separadas por electroforesis en
poliacrilamida ya que, el efecto de tamiz molecular disminuirá la tasa de
migración de la proteína más grande.
El grado de tamiz molecular depende de cuan cercano sea el tamaño de
poro del gel a la de la partícula migrante. El tamaño de poro de agarosa
es lo suficientemente grande para que el tamiz molecular de la mayoría
de las proteínas sea mínimo y la separación se basa mayormente en la
densidad de carga. Por otro lado, los geles de almidón y poliacrilamida
tienen poros en el mismo orden de tamaño como las proteínas y por ende
estos sí contribuyen a un efecto de tamiz molecular. Sin embargo, el
éxito de la electroforesis en almidón depende críticamente en la calidad
misma del gel de almidón, el cual al ser preparado desde un producto
biológico, no es altamente reproducible y puede contener contaminantes
que pueden afectar adversariamente la calidad de los resultados
obtenidos. Por otro lado, el gel de poliacrilamida es un polímero sintético
de un monómero de acrilamida y puede siempre ser producido a partir de
reactivos altamente purificados de manera muy reproducible asumiendo
que las condiciones de polimerización estan estandarizadas.
Los
componentes básicos para la reacción de polimerización pueden ser
adquiridos comercialmente con un grado de pureza muy alta, aunque,
algunas veces se puede requerir extra purificación.
Además, la
poliacrilamida tiene la ventaja de ser químicamente inerte, estable a un
amplio rango de pH, temperatura y fuerza iónica, y es transparente.
Finalmente, la poliacrilamida es mejor para el fraccionamiento proteico ya
que geles con un amplio rango de tamaño de poros pueden ser
preparados fácilmente, mientras que el rango de tamaños de poros a
prepararse con gel de almidón son estrictamente limitados. Por estas y
otras razones, electroforesis en geles de poliacrilamida ha sido la técnica
más escogida para la ejecución de electroforesis zonal de proteínas,
aunque, electroforesis en geles de almidón ha sido extensamente
utilizada para análisis de isoenzimas. Geles de agarosa son utilizados
para el fraccionamiento de moléculas o complejos más grandes de lo que
pueden ser fraccionados por poliacrilamida, especialmente ciertos ácidos
nucleicos y nucleoproteínas. Además, agarosa es ampliamente utilizada
en inmunoelectroforesis, en donde la electroforesis zonal de proteínas
está acoplada a la detección y cuantificación inmunológica.
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Estructura Química
Los geles de poliacrilamada resultan de la polimerización de monómeros
de acrilamida en largas cadenas y uniones entrecruzadas de estas por
compuestos bifuncionales como N,N'metilen bisacrilamida (
generalmente abreviado como bisacrilamida) que reaccionan con grupos
funcionales libres al término de la cadena. La estructura de los
monómeros y la estructura final del gel se da abajo.
CH2
CH2 = CH
I
I
C
C=O
I
I
NH2
NH
=
CH
=
O
I
CH2
I
NH
I
C=O
I
CH2 = CH
ACRILAMIDA
BISACRILAMIDA
N,N'- METILEN
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I
-CH2-CH-[CH2-CH]n CH2-CH-[CH2CH-]nCH2I
I
CO
CO
I
I
NH2
I
CO
I
NH
NH2
I
CH2
I
NH
I
CO
I
-CH2-CH-[CH2CH-]n CH2-CH-[CH2-CH]n CH2I
I
CO
I
CO
CO
I
NH
I
I
NH2
NH2
I
CH2
I
NH
I
CO
I
-CH2-CH-[CH2-CH]n CH2-CH-[CH2-CH-]n CH2I
I
CO
I
CO
CO
I
NH2
I
I
NH
NH2
I
ESTRUCRURA
DE
UN
GEL
DE
POLIACRILAMIDA
Catalizadores de la Polimerización
La polimerización de la acrilamida se inicia por la adición de persulfato de
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amonio o riboflavina. En este tipo de polimerización se requiere de un
acelerador del proceso que generalmente es el
N,N,N',N'tetrametiletilendiamida (TEMED). Otro acelerador, pero menos común,
de la polimerización es el 3-dimetilamino-propionitrilo (DMAPN).
En el sistema persulfato de amonio-TEMED, el TEMED cataliza la
formación de radicales libres del persulfato y estos a su vez inician la
polimerización. Debido a que la base libre del TEMED es requerida, la
polimerización puede retrasarse o no darse en absoluto pH bajo.
Incrementos en, ya sea, la concentración de TEMED o persulfato de
amonio aumenta la tasa de polimerización.
En contraste con la polimerización química con persulfato, el uso del
sistema riboflavina - TEMED requiere de luz para iniciar la polimerización.
Esto causa fotodescomposición de la riboflavina y la producción de los
radicales libres necesarios.
Aunque la gelación ocurre cuando
soluciones contienen únicamente acrilamida y riboflavina, el TEMED por
lo general también se lo incluye, debido a que la polimerización ocurre de
manera más confiable en su presencia.
El oxígeno inhibe la polimerización de la acrilamida y por lo tanto las
mezclas son degasadas antes de su utilización.
Tamaño Efectivo de Poro
El tamaño efectivo de poro en los geles de poliacrilamida, es altamente
influenciado por la concentración total de poliacrilamida en la mezcla de
polimerización. El tamaño efectivo de poro es inversamente proporcional
a la concentración de acrilamida utilizada (disminuye con el incremento
en la concentración de acrilamida). Geles con concentraciones de
acrilamida menores al 2.5%, que son necesarios para tamizar moléculas
con pesos moleculares mayores a 106, son casi líquidos, pero pueden ser
remediados con la adición de agarosa al 0.5%. Por el otro lado, geles a
concentraciones de 30% acrilamida pueden formarse, a esta
concentración polipéptidos con pesos moleculares tan bajos como 2000
pueden ser fácilmente tamizados. Como se puede esperar, el escoger la
concentración adecuada de acrilamida es crítico para una separación
óptima de proteínas.
Para cualquier concentración total de monómero dada, el tamaño efectivo
de poro, rigidez, fragilidad, disperción de luz, y propiedades de
hidratación del gel de poliacrilamida, varía con la proporción de la
sustancia entrecruzadora para la unión ("cross-linker") utilizada. La
polimerización en ausencia de la sustancia entrecruzadora de unión,
llevaría a la formación, al azar, de cadenas de polímeros, resultando
solamente en una solución viscosa. Cuando biacrilamida se incluye en
la mezcla de polimerización, la gelación ocurre en cadenas de polímeros
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al azar entrecruzadas a intervalos para formar una malla con uniones
covalentes. Al incrementar la concentración de la sustancia
entrecruzadora de unión, el tamaño de poro disminuye, alcanzando el
mínimo cuando la bisacrilamida representa el 5% del total del monómero.
Con mayores proporciones de bisacrilamida, las cadenas de polímeros se
entrecruzan en grandes bultos crecientes con grandes espacios entre
ellos y por lo tanto el tamaño efectivo de poro incrementa otra vez. Esta
dependencia del tamaño de poro sobre la proporción de la sustancia
entrecruzadora de unión ocurre independientemente de la concentración
de monónmero utilizado, así, un gel que contiene una concentración de
monómero total, mayor, puede tener un tamaño efectivo de poro más
grande que un gel de menor concentración, si la proporción de
bisacrilamida está por encima o por debajo del valor óptimo del 5%.
Sistema de Tampón Disociante y No -disociante
La gran mayoría de los estudios que emplean electroforesis zonal de
proteínas en geles de poliacrilamida, utilizan un sistema de tampón
diseñado para disociar todas las proteínas en sus subunidades
polipeptídicas. El agente disociante más común es un detergente iónico,
dodecil sulfato sódico (SDS). La mezcla protéica se desnaturaliza al ser
hervida a 100°C en presencia de un exceso de SDS y un reactivo tiol
(para romper los enlaces disulfuro). Bajo éstas condiciones, la mayoría
de los péptidos unen el SDS a una tasa de peso constante (1.4g SDS por
gramo de polipéptido). Las cargas intrínsicas del polipéptido son
insignificantes en relación con las cargas negativas que provee el
detergente iónico al unirse;
de tal manera que el complejo
SDS-polipéptido tienen esencialmente densidades de carga idénticas y
migran en los geles de poliacrilamida, de la porosidad correcta,
estrictamente de acuerdo al tamaño del polipéptido. De ésta manera,
además de analizar la composición polipeptídica de una muestra, el
investigador puede determinar el peso molecular de los péptidos que
están siendo estudiados, en referencia a la movilidad de péptidos de
pesos moleculares conocidos, bajo las mismas condiciones
electroforéticas. La simplicidad y velocidad de éste método, más el
hecho de que sólamente se requieran microgramos de proteínas, hacen
que el método electroforético SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE), sea el
más utilizado para determinar la complejidad y el peso molecular de las
proteínas constituyentes de una mezcla. Proteínas de casi cualquier
fuente son rápidamente solubilizadas por el SDS, de tal manera que el
método es muy aplicable.
La urea también ha sido utilizada como agente de disociación y actúa
interrumpiendo enlaces de hidrógeno. Concentracioneas altas de urea
(~ 8 M) y un agente tiol son requeridos para la desnaturalización completa
de proteínas que contienen enlaces disulfuro. La urea debe estar
presente durante la electroforesis para mantener el estado de
desnaturalización. La ventaja de utilizar urea en algunas aplicaciones,
Padilla, A. y Gray, H. SDS-PAGE - Página 7
está en que no afecta la carga intrínsica de las proteínas y de esta
manera las separación de los péptidos constituyentes será en base a
masa y carga, en contraste con el SDS. Sin embargo la gran desventaja
existente en el fraccionamiento por carga y tamaño está en el hecho de
que impide determinaciones exactas de los pesos moleculares.
Además, la urea no es tan buen agente para disociar proteínas, como lo
es el SDS; hasta el 50% de una mezcla compleja de proteínas fracasará
en penetrar el gel cuando con urea, mientras que con SDS como agente
disociante por lo menos el 90% de las proteínas entrarán en el gel. Sin
embargo, algunas proteínas necesitan la presencia de ambos agentes,
para que la mayoría del material penetre el gel.
Al contrario de los sistemas mencionados anteriormente, la
electroforesis zonal de proteínas nativas bajo condiciones con tampón
no-disociante, está diseñada para fraccionar una mezcla de proteínas
de tal manera que la interacción entre las subunidades, la conformación
original y la actividad biológica se conserven. La separación de las
proteínas ocurren en base a carga y tamaño.
Sistema de Tampón Contínuo o Discontínuo (Multifásico)
Sistemas de electroforesis zonal en el que los mismo iones del tampón
están presentes por toda la muestra, el gel y los recipientes elctródicos
del tampón (aunque a diferentes concentraciones en cada uno), a un pH
constante, se refieren como sistemas de tampón contínuo. En estos
sistemas, la muestra de proteína se aplica directamente en el gel que
ocurrirá la separación, el gel de resolución, que contiene poros lo
suficientemente pequeños como para causar el fraccionamiento de los
componentes de la muestra durante la electroforesis. Por el otro lado,
sistemas de tampones discontínuos (o multifásicos), emplean diferentes
iones en el gel, comparados a aquellos presentes en el tampón de
corrida. La mayoría de los sistemas de tampón discontínuo tienen
discontinuidades en la composición del tampón y el pH. En estos
sistemas, la muestra se aplica en un gel de apilamiento con poros
grandes, que se polimeriza sobre el gel de resolución con poros
pequeños (Figura 1).
Padilla, A. y Gray, H. SDS-PAGE - Página 8
CANALES PARA COLOCACION DE MUESTRAS
GEL DE APILAMIENTO
GEL DE RESOLUCION
FIGURA 1. Ilustración de un gel de poliacrilamida a ser utilizado con un
sistema de tampón discontínuo. Nótese el gel superior (de apilamiento)
y el inferior (de resolución). Las muestras se colocan en el gel de
apilamiento.
La mayor ventaja de los sistemas de tampón discontínuo sobre los
sistemas de tampón contínuo es el que relativamente grandes volúmenes
de proteína diluída pueden ser aplicados en el gel y se obtiene gran
resolución. La razón de esto es que las proteínas se encuentran
concentradas en zonas extremadamente estrechas (o apiladas) durante
la migración por los poros grandes del gel de apilamiento, antes de su
separación electroforética en el gel de resolución que contiene poros
pequeños.
Debido a la gran resolución que se puede obtener con los sistemas de
tampón discontínuo, el sistema SDS-discontínuo (un sistema de tampón
discontínuo con SDS añadido a todos los tampones), es generalmente el
sistema más adecuado para el fraccionamiento de mezclas protéicas de
alta resolución.
El sistema de tampón SDS-discontínuo más
comunmente utilizado es aquel originalmente descrito por Laemmli, que
consiste en glicina y Tris-HCl. Desafortunadamente no existe un tampón
universal para electroforesis de proteínas nativas. La selección se debe
basar en las condiciones requeridas para mantener la actividad de las
proteínas de interés, mientras se adquiere a la vez, resolución suficiente
de los componentes protéicos en questión.
Algunas
proteínas
nativas
se
abultan
y
pueden
precipitar
a
Padilla, A. y Gray, H. SDS-PAGE - Página 9
concentraciones protéicas muy altas con los sitemas de tampón
discontínuo, así fracasando en penetrar el gel de resolución o causando
una mancha a lo largo del gel. Este fenómeno ocurre cuando las
proteínas se abultan en la superficie del gel y lentamente se disuelven
durante la electroforesis, causando manchas que corren paralelamente
en la dirección de la migración. El problema puede, algunas veces, ser
superado utilizando un sistema de tampón contínuo, ya que éste evita
que se concentren las muestras protéicas y que logren precipitarse.
Afortunadamente, el uso de sistemas de tampón contínuo puede todavía
dar buena resolución con la condición de que se reunan ciertas
condiciones. Primeramente, la muestra debe aplicarse en el volumen
más pequeño posible para dar una zona fina de comienzo. Dependiendo
del método utilizado para detectar las zonas de separación después de la
electroforesis, esto generalmente requiere la disponibilidad de una
solución concentrada de proteínas (~ 1 mg/ml). Agudización adicional de
la zona ocurre cuando las proteínas penetran el gel de resolución, en el
cual la movilidad de las proteínas en questión son consideradas menores
que aquellas en solución libre. Segundo, agudización adicional de las
zonas puede obtenerse aplicando la muestra a un tampón que tenga
menor fuerza iónica (1/5 a 1/10) que la del gel o el tampón de corrida.
Las proteínas inicialmente estarán en una zona de menor fuerza iónica
(menor conductividad) y por lo tanto mayor voltaje, lo que hace posible
que las proteínas se muevan más rápido en solución libre, disminuyendo
su velocidad una vez que comiencen a penetrar el gel, debido al efecto
de tamiz que proveerá el gel y la caída del gradiente de voltaje cuando
éstas entran en el tampón del gel, el cual es más concentrado.
Virtualmente cualquier tampón puede ser utilizado para electroforesis de
proteínas nativas en un sistema de tampón contínuo, y por lo tanto, para
la mayoría de proteínas es un hecho de experimentación para determinar
que tampón es el más adecuado.
Selección del pH
La electroforesis en geles de poliacrilamida puede ser, teóricamente,
llevada a cabo a pH's entre 2.5 y 11 aunque, en la práctica, los límites
son pH 3 y 10, debido a que ciertas reacciones hidrolíticas (como
deaminaciones) ocurren a extremos de pH.
En la SDS-PAGE, los complejos SDS-polipéptido están cargados
negativamente en un amplio rango de pH, de tal forma que el pH del
sistema contínuo SDS-tampón fosfato no es crítico. El pH del sistema
SDS-tampón discontínuo es importante únicamente para permitir la
concentración de la muestra protéica por medio del efecto de apilamiento.
En contraste, el pH es crítico en las electroforesis de proteínas en geles
de poliacrilamida que tienen un sistema de tampón no-disociante, en
donde las proteínas nativas se separan en base a su tamaño y densidad
de carga. En éste último caso, cambios en pH alteran la carga neta de
los componentes protéicos y por lo tanto afecta la separación que se
Padilla, A. y Gray, H. SDS-PAGE - Página 10
debe obtener.
Para escoger el pH de un tampón a ser utilizado en un sitema de tampón
contínuo, la consideración inicial debe ser el rango de pH al cual las
proteínas de interés son estables. Este rango debe ser más estrecho si
la intención es la de retener la actividad biológica de las proteínas. Entre
este rango de pH, la selección del pH es un compromiso entre dos
consideraciones opuestas. Mientras más alejado se encuentre el pH del
tampón de corrida del punto isoeléctrico de las proteínas, más alta será la
carga de las proteínas. Esto hace posible que el tiempo de corrida que
se requiere para la electroforesis, se acorte y por ende se reduce la
difusión de las bandas. Por el otro lado, mientras más cercano se
encuentre el pH del tampón de corrida al ppunto isoeléctrico de las
proteínas, más grande será la diferencia en carga entre las proteínas
mismas, por lo tanto aumentendo la separación entre ellas. Muchas
proteínas tienen puntos isoeléctricos entre pH 4-7, entonces una idea
general es utilizar tampones en el rango de pH 8.0 y 9.5. Lo ideal es
llevar a cabo un estudio sistemático durante el cual, se hagan ajustes
progresivos cercanos al punto isoeléctrico de las proteínas hasta que se
encuentre una resolución y separación óptima de la mezcla protéica. Un
estudio similar se puede hacer con proteínas básicas las cuales necesitan
ser separadas a pH ácido.
Selección de la Concentración del Gel
La separación de bandas protéicas vía electroforesis zonal en
poliacrilamida, se refiere a la distancia entre bandas, sin tomar en
consideración el ancho de las bandas.
La resolución entre dos
componentes es influenciado por todos los factores que afectan la
agudización de las bandas; por lo tanto, el uso de pequeñas cantidades
de muestra poteica, el uso de sistemas de tampónes dicontínuos, y el
remover las altas concentraciones de iones en una mezcla harán posible
la obtención de una óptima resolución. Los factores más críticos que
afectan la separación son el pH del gel (en electroforesis de
poliacrilamida de proteínas nativas pero no en SDS-PAGE, tal como se
mencionó anteriormente) y la concentración del gel. Tomando en
consideración parámetros extremos de comparación, la elección
incorrecta de la concentración de un gel llevaría a la exclusión total de las
proteínas que no pueden penetrar el gel, o al contrario, falta de
fraccionamiento de las proteínas que corren con el frente del tampón.
Se debe tomar en cuenta que así exista una concentración ideal para la
resolución de dos proteínas cualquiera, puede ser que no exista una
concentración ideal para la separación al máximo de todos los
componentes, el uno del otro, de una mezcla compleja de proteínas.
Así, la concentración de gel que se elije para el fraccionamiento de una
mezcla heterogenea, es generalmente una que exhiba adecuadamente
todos los componentes de interés. Un modo razonable para iniciar el
análisis de una mezcla protéica con un sitema de tampón no-disociante
Padilla, A. y Gray, H. SDS-PAGE - Página 11
sería el empezar con un gel de acrilamida a una concentración de 7.5% y
luego tratar una serie de concentraciones entre 5% y 15%, para
determinar la concentración más adecuada. Una estrategia del mismo
tipo puede ser utilizada para SDS-PAGE, cuando no se conoce el rango
de pesos moleculares de la mezcla protéica.
PROCEDIMIENTOS
Acrilamida y bisacrilamida son agentes neurotóxicos.
Tome las
precauciones del caso y no pipetee éstas sustancias directamente con la
boca. La corrida electroforética en este experimento será del tipo
vertical, discontínuo y con un sistema de tampón disociante.
1.
El instructor demostrará el ensamblaje del molde para la
preparación un gel de poliacrilamida al12.5%, con espesor de 0.75
mm.
2. Preparación del gel inferior o de resolución:
a) En un Erlenmeyer de 100 cc, mezcle 12.5 ml de la solución
madre de acrilamida-bisacrilamida (30:0.8), 3.75 ml del
tampón para el gel de resolución, y 11.95 ml de agua
destilada. Degase la mezcla en una bomba de vacío por 3
minutos.
b) Añada, a la solución degasada, 300µl de SDS al 10%, 1.5 ml de
la solución (recién preparada) de persulfato de amonio al 1.5%,
y 15 µl de TEMED. Agite gentilmente la solución para mezclar
sus contenídos.
c) Pipetee toda la solución del Erlenmeyer en el molde ensamblado
por el instructor. Inmediatamente cubra la superficie de la
solución de poliacrilamida con una capa de agua, de
aproximadamente un cm, (tenga cuidado de no mezclar la capa
de agua con la poliacrilamida). Deje polimerizar (~ 20 minutos)
3. Preparación del gel superior o de apilamiento
a) En un Erlenmeyer de 50 cc, mezcle 2.5 ml de la solución madre
de acrilamida-bisacrilamida (30:0.8), 5.0 ml del tampón para el
gel de apilamiento, y 11.3 ml de agua destilada. Degase la
mezcla en una bomba de vacío por 3 minutos.
b) Añada a la solución degasada, 200µl de SDS al 10%, 1.0 ml de la
solución (recién preparada) de persulfato de amonio al 15%, y
15µl de TEMED. Agite gentilmente la solución para mezclar sus
contenidos.
Padilla, A. y Gray, H. SDS-PAGE - Página 12
c) Decante el agua que se encuentra sobre la superficie del gel
inferior de poliacrilamida, que se dejó polimerizar en el
segundo paso, y añada la mezcla para la polimerización del gel
superior.
d) Ponga la peinilla del ancho adecuado, para la formación de los
canales de muestra, y deje polimerizar el gel de apilamiento.
4. Preparación de la muestra protéica a ser analizada
Prepare las muestras, proporcionadas por el instructor para la
corrida electroforética, haciéndolas hervir a ~70 °C
por tres
minutos en tampón de muestra .
Generalmente 0.25 µg de
proteína pueden ser visualizados como una sóla banda.
5. Con una micropipeta, coloque 10 µl de cada muestra en los canales
del gel superior.
El glicerol en el tampón de la muestra permite
que la mezcla se coloque directamente sobre el gel y bajo el
tampón de corrida, sin que ésta llegue a desbordarse. En el canal
del centro coloque 10 µl de los estándares de pesos moleculares
para, posteriormente, poder calcular los pesos moleculares de los
péptidos desconocidos. El tampón de la muestra contiene azul de
bromofenol como marcador de frente.
6.
Ensamble la celda electroforética vertical y llene los tanques de
los electrodos con la cantidad suficiente de tampón de corrida.
7. Coloque la tapa de la celda y conecte el aparato a una fuente de
poder a 120 V. Deje correr la electroforesis hasta que el marcador
de frente llegue a 2 cm de distancia del borde inferior.
8.
Una vez terminada la electroforesis, remueva el gel de entre los
vidrios y póngalo a teñir en la solución de coomassie azul hasta el
siguiente día.
9. Destiña el exceso de colorante en el gel, colocando éste en el
destiñidor automático. Al cabo de cuatro horas, observe las bandas
protéicas en el gel.
10. Remueva el gel del destiñidor y póngalo a secar al vacío en un
secador de geles, como lo demostrará el instructor.
11. Una vez seco el gel, el instructor demostrará una densitometría
para el cálculo de las concentraciones de cada una de las bandas
protéicas en la mezcla y también se procederá al cálculo de los
pesos moleculares de cada polipéptido.
Padilla, A. y Gray, H. SDS-PAGE - Página 13
BIBLIOGRAFIA
Hames, BD. and Rickwood, D. (1986) Gel Electrophoresis of Proteins: a
Practical Approach (IRL Press, Oxford), pp. 1-28
APENDICE
Solución Stock de Acrilamida-bisacrilamida
La solución stock de acrilamida-poliacrilamida (30:0.8), se prepara
disolviendo 30g de acrilamida y 0.8g de bisacrilamida en un volumen total
de 100ml de agua destilada. A continuación, la solución se debe filtrar a
través de papel filtro Whatman No.1 y ser guardada en un frasco obscuro
a 4°C. La solución no se debe utilizar después de un mes de
almacenada.
Solución de Persulfato de Amonio (1.5% p/v)
La cantidad de 0.15g de persulfato de amonio se disuelve en 10 ml de
agua destilada. Esta solución es inestable y se debe preparar justo
antes de ser utilizada.
SDS (10% p/v)
Disuelva 2.5g de SDS en 25 ml de agua destilada. La solución debe ser
tanto clara como incolora. La solución es estable a temperatura
ambiente por algunas semanas, pero se precipita en el frío.
Tampón Stock Para el Gel Superior o de Apilamiento: 0.5M
Tris-HCl (pH 6.8)
Disuelva 6.0g de Tris en 40 ml de agua destilada, titúle a pH 6.8 con HCl
1.0M (~ 48 ml) y afore a 100ml con agua destilada. Filtre la solución a
través de papel filtro Whatman No. 1 y almacene la solución a 4°C.
Tampón Stock Para el Gel Inferior o de Resolución:
Tris-HCl (pH 8.8)
3.0M
Mezcle 36.3g de Tris y 48.0 ml de HCl 1.0M. Afore a un volumen total de
100 ml con agua destilada. Filtre la solución a través de papel filtro
Whatman No.1 y almacene la solución a 4°C.
Padilla, A. y Gray, H. SDS-PAGE - Página 14
Tampón de Corrida: 0.25M Tris, 1.92M Glicina, 1 % SDS (pH
8.3)
Disuelva 30.3g de Tris, 144.0g de glicina y 10.0g de SDS en 1.0L de agua
destilada. Almacene la solución a 4°C.
Tampón de Muestra
Mezcle 0.075g de Tris, 0.2g de SDS, 0.5 ml de mercaptoetanol (98%), 1.0
ml de glicerol, 3.5 ml de agua destilada y 0.01g de azul de bromofenol.
Haga alícuotas de 100 µl y almacene a -20°C.