Prácticas de Toxicología. Departamento de Farmacología, Farmacognosia y Botánica. Facultad de Farmacia UCM. 2018/2019 PRÁCTICA 2: DETECCIÓN DE CANNABINOIDES Introducción y Objetivo: Dentro de la función reguladora de la toxicología, se encuentra la detección e identificación, de sustancias ilegales. La Marihuana y el Hachís (Hashish) son las principales formas en las que se comercializan diferentes variedades de la planta Cannabis sativa L. La marihuana, está constituida por las flores femeninas sin fecundar. Estás flores presentan pequeños pelos, que contienen una resina con una sustancia oleosa rica en cannabinoides, como el Tetrahidrocannabinol (THC), Cannabinol (CBN) o Cannabidiol (CBD), que son los componentes activos. El hachís, se obtiene de la separación mecánica de estos pelos y su prensamiento en tabletas o pastillas, que se suelen encontrar envueltas en papel plata o plástico. Los cannabinoides presentan un indudable interés farmacológico actualmente, http://www.mayoclinic.org/drugssupplements/marijuana/background/hrb-20059701, pero su uso como sustancia recreativa está prohibido por ley, en España. Ello ha conducido a desarrollar diferentes métodos de identificación, esto es, ensayos presuntivos, diseñados para facilitar una indicación de la presencia o ausencia de droga en las muestras. No obstante, estos ensayos, no se consideran suficientes para la identificación de drogas, resultando ser necesario confirmar los resultados positivos, con otro tipo de ensayos de laboratorio, ensayos confirmatorios. El objetivo de esta práctica, es adquirir destreza en la metodología, para la detección e identificación de sustancias ilegales, para ello, se llevara a cabo, mediante ensayos presuntivos, la determinación de la presencia de cannabis o/y sus componentes, en diferentes muestras problema. Para el desarrollo de la práctica, se llevara a cabo la extracción de la sustancia, a través de un método adecuado, y a continuación varios métodos de identificación colorimétrica, uno de ellos desarrollado a través de una cromatografía en capa fina, que supone la separación y posterior identificación, de los principales principios activos, que la componen. Una vez realizadas y concluidas las pruebas presuntivas, se resolverán unas preguntas y se elaborara y entregará, un informe pericial de análisis químico de sustancias, tal y como se realiza en la vida real, para un laboratorio de química forense. Reactivos: • • • • • • • • Éter de petróleo Reactivo de Duquenois: Acetaldehido 1 mL, Vainillina 1 g y Alcohol Etílico 100 mL Azul sólido B (Fast blue B): 0,25 g de azul solido B (dicloruro de 3,3’-dimetoxibifenil-4,4’-bis (diazonium)) en 50 mL de agua destilada. NaOH 0,2 M en agua destilada HCl concentrado Hexano/éter dietílico (80:20) 10 mL Diclorometano Extracto estandarizado de Cannabis sativa L. Material: • • • • • • • • • • • Placas de gel de sílice de 0,2 mm de espesor 6 tubos de ensayo, tapones 3 embudos Papel de filtro y algodón Baño de agua en caliente Probetas Pipetas 5 mL Cámaras de cromatografía Pulverizador Secador Capilares Normas de seguridad: En esta práctica se emplean agentes corrosivos, irritantes, cancerígenos e inflamables. Es obligatorio utilizar bata, guantes y la cabina de extracción de gases cuando esté especificado. 1 Prácticas de Toxicología. Departamento de Farmacología, Farmacognosia y Botánica. Facultad de Farmacia UCM. 2018/2019 Procedimiento: 1. Extracción: Las muestras, ya pesadas (0,1 g) y dispuestas en frascos, se extraen con 5 mL de éter de petróleo. Cerramos y agitamos vigorosamente evitando la caída del líquido y filtramos por decantación cada muestra sobre un tubo de ensayo sobre una torunda de algodón ligeramente humedecida con éter de petróleo. El residuo vegetal remanente en el frasco se lava con otros 5 mL de éter de petróleo y juntamos los líquidos filtrados de cada muestra. Separamos el filtrado en dos partes, 1/3 para el ensayo en cromatografía en capa fina (tubo pequeño) y 2/3 para el ensayo de coloración (tubo grande). Procedemos a evaporar los líquidos orgánicos, en Baño María, dentro de una campana de extracción hasta sequedad. 2. Análisis cualitativo: Pruebas presuntivas a. Reacciones coloreadas: Reacción de Duquenois: Está reacción se realiza obligatoriamente en cabina de extracción. Añadimos al tubo de 2/3 seco primero 2 mL del reactivo de Duquenois y a continuación 2 mL de HCl concentrado. Se produce una sucesión de colores que termina en violeta azulado. Para confirmarlo añadimos 4 mL de diclorometano y se agita con cuidado dentro de la cabina de extracción: La capa inferior (diclorometánica) se colorea también de violeta si la muestra correspondiera a Cannabis sativa. b. Cromatografía en capa fina (CCF): Disolvemos las muestras (A, B y C) añadiendo 2 gotas de etanol al tubo de 1/3. En un trozo de placa de aproximadamente 5 x 10 cm se deposita a una distancia de al menos 1 cm de la base el contenido de un capilar de las muestras y el extracto estandarizado. Una vez seco el deposito, procedemos al desarrollo cromatográfico en una cámara saturada con el solvente Hexano/éter dietílico 80:20. Para ello, introducimos la placa de cromatografía y dejamos correr hasta que el frente llegue a 2 cm del borde superior. Retiramos la placa y dejamos secar, en campana de extracción. Si es necesario ayudamos con un secador. Una vez seca, se revela en la vitrina de gases con el reactivo Azul sólido B. Dejamos secar y pulverizamos de nuevo con NaOH 0,2 M. Si es positiva, aparecerán las manchas correspondientes al tetrahidrocannabinol (THC), Cannabidiol (CBD) y Cannabinol (CBN) con coloraciones diferentes que varían desde el rojo, naranja hasta el violeta. Contesta a las preguntas siguientes: 1. ¿Qué resultado se obtiene en la reacción coloreada para cada muestra? 2. ¿Puedes explicar el fundamento de la reacción coloreada? ¿Por qué se añade diclorometano? 3. Dibuja la placa de cromatografía obtenida. 4. Calcula los valores de Rf de las muestras. 5. ¿Hay presencia de cannabis en las muestras? 6. Determina aproximadamente cuál es el cannabinoide mayoritario en cada muestra ¿Cuál presentaría efectos psicótropos? 2 Prácticas de Toxicología. Departamento de Farmacología, Farmacognosia y Botánica. Facultad de Farmacia UCM. 2018/2019 INFORME PERICIAL DE ANÁLISIS QUÍMICO DE SUSTANCIAS E INSUMOS SUJETOS A FISCALIZACIÓN, PARA LABORATORIO DE QUÍMICA FORENSE Lugar y Fecha: INFORME DE ENSAYO N°:………….. Solicitado por Nº de Oficio Fecha del Oficio Nombre del Procesado Caso policial Instrucción Fiscal 1.- OBJETIVO DE LA PERICIA: 2.- ELEMENTOS RECIBIDOS: Lugar, Fecha y Hora Entregado por Nº de muestras Cantidad Recibida(Peso Neto) Descripción detallada del elemento recibido: 3.- FUNDAMENTOS TECNICOS (METODOLOGÍA EMPLEADA): 3 1.2.3.4.- Prácticas de Toxicología. Departamento de Farmacología, Farmacognosia y Botánica. Facultad de Farmacia UCM. 2018/2019 4.- OPERACIONES REALIZADAS: ENSAYOS PRESUNTIVOS: ENSAYOS RESULTADOS 1.- 1.- 2.- 2.- 3.- 3.- ENSAYOS CONFIRMATORIOS: ENSAYOS RESULTADOS 5.-CONCLUSIONES: 6.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 7.- OBSERVACIONES: Nº de Muestra Muestra para Análisis Pericial (Peso/volumen, g/mL) Muestra Remanente (Peso/volumen, g/mL) Nota: Culminado el estudio, se embalará la evidencia con los respectivos sellos de seguridad y número de pericia química, este remanente permanecerá en el laboratorio con un tiempo máximo de 2 años. 8.- PERITOS INTERVINIENTES: 4 Prácticas de Toxicología. Departamento de Farmacología, Farmacognosia y Botánica. Facultad de Farmacia UCM. 2018/2019 ANEXOS Tomado de Montana Biotech Tomado de Izzo AA et al., TIPS 2009 Tomados de Izzo AA et al., TIPS 2009 5
