Mitosis en meristemo radicular de Alium cepa

Mitosis en meristemo
radicular de Alium cepa
por: Nicolás Fernández Villacorta
Grupo 5, 27 de enero de 2001
Nicolás Fdez. Villacorta
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Mitosis en meristemo radicular de A. cepa
Material y métodos
Alium cepa
Para la observación de mitosis en meristemo radicular de Alium cepa es necesario conseguir las cebollas.
Para su germinación se cogen varias cebollas y se limpian las zonas radiculares eliminando las capas secas, se coloca la zona radicular en contacto con
agua, si es posible, bien aireada. Cambiar el agua al menos dos veces al dı́a.
Para la fijación de las raı́ces, se cortan varias de una longitud de 2-4 cm y se
sumergen en etanol -acético 3:1 recién hecho durante un mı́nimo de 20 minutos.
Para su conservación a medio plazo, se introducen en el congelador, si es
posible a −18o C.
Preparación de las muestras
Tinción
Se colocan 3 ó 4 raı́ces en un vidrio de reloj con orceı́na clorhı́drica al 2%. Se
calienta sobre un mechero (brevemente) hasta la emisión de vapores blanquecinos y se deja enfriar durante 5 minutos.
Repetir la operación. Calentar igual por tercera vez y dejar enfriar 10 minutos. Añadir orceı́na clorhı́drica al 2% siempre que se corra el riesgo de que
se sequen las raı́ces.
Otro método de tinción, más simple; usando carmı́n acético como tinte, consiste en sumergir las raı́ces en un vidrio de reloj con carmı́n acético, se calienta
un poco y tras dejar enfriar 2 minutos se pueden realizar las preparaciones.
Realización de preparaciones
Se toma una de las raicillas teñidas y se deposita sobre un porta limpio. Se
separan 1,5 ó 2 mm del extremo apical de la raı́z (es el más redondeado) y el
resto se tira, si no se distingue con claridad el extremo apical, se puede usar el
microscopio para que no haya errores. Se añade una gota de orceı́na clorhı́drica
al 1% o de acético al 45% (éste último fue el material usado) sobre el meristemo
seccionado y con cuidado se deposita un cubre y se golpea suavemente con el
mango de una lanceta para lograr la extensión de las células. Con un trozo de
papel de filtro se elimina el resto de colorante sujetando con el papel porta y
cubre para que éste último no se desplace lateralmente, se aprieta ası́ un poco
con el dedo para extender un poco más las células. A partir de este momento
pueden realizarse las observaciones al microscopio.
Preparaciones permanentes
Se enfrı́a la preparación con un chorro de nieve carbónica o por inmersión en
nitrógeno lı́quido. Cuando esté congelada la zona de material biológico se separa
con una cuchilla el cubre y se introduce el porta, al que habrá quedado pegado
el material, en etanol al 100% durante un mı́nimo de 15 minutos. Se saca el
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Mitosis en meristemo radicular de A. cepa
porta del alcohol, se seca y se coloca un cubre limpio con una gota de Entellan
o similar.
Tratamiento con colchicina
Preparar colchicina al 0,1% (0,1 g de colchicina en 100 c.c. de agua), agitar sin
formar espuma.
Sumergir las raı́ces en la solución durante 20, 40, 60, 90 y 120 minutos,
extraerlas de la solución transcurrido ese tiempo y luego fijarlas en alcohol acético 3:1 recién hecho, para conservarlas se pueden poner en el congelador a
−18o C. A las 15 horas pasar a agua durante 24-36 horas.
Para observar las distintas fases de la mitosis, seguir el protocolo especificado
en Preparación de las muestras.
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Etapas de la mitosis
Para la diferenciación de las fases, se van a tener en cuenta los siguientes criterios
para normalizar la toma de datos por parte de todos los grupos:
Profase:
Los cromosomas se ven espiralizados, como la
membrana nuclear todavı́a no se ha roto,
éstos forman un contorno redondeado.
Prometafase:
Los cromosomas ya no forman el cı́rculo
limitado por la membrana nuclear, ya que
ésta se ha disgregado por lo que algunos
brazos salen de la zona nuclear.
Metafase:
Los centrómeros están colocados en la placa
ecuatorial. Se distingue por una tinción más
intensa.
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Anafase:
Los centrómeros se escinden en dos, todavı́a
no les separa mucha distancia por lo que no
se ve muy bien, según transcurre la anafase
se van separando hasta llegar cerca del
polo celular.
Telofase:
Alguno de los brazos de los cromosomas se
salen del trapecio virtual formado por la
tensión del avance; ya han llegado al polo.
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Índice mitótico
El cálculo del ı́ndice de mitosis o de división se hace usando la siguiente fórmula:
ID =
no de cels. en div.
no de cels. en div. + no de cels. en interfase
Usando entonces los datos de la tabla 1 queda:
ID =
174
= 0, 24
174 + 550
Grupo
Interfase
División
1
2
3
4
5
6
7
8
68
62
—
76
90
72
90
92
28
43
—
25
10
45
15
8
Total
550
174
%
76
24
Tabla 1: Relación del número de células en división y en interfase. El porcentaje total
indica lo mismo que el ID. Los datos personales son los del grupo 5.
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Mitosis en meristemo radicular de A. cepa
Con lo que se puede decir que el 24% de las células del meristemo están en
división. Relacionando este ı́ndice con la duración de la mitosis en el ciclo celular; ya que, cuanto más dure una fase, mayor número de células se observarán
en esa determinada fase; se puede decir que la mitosis dura aproximadamente
un cuarto del tiempo total del ciclo celular.
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Índices de fase
Para calcular los ı́ndices de fases se hace de la misma manera que para el ı́ndice
de división:
IF =
no de cels. en la fase F
no total de cels. en div.
Utilizando los datos de la tabla 2 (página 7) con tiempo 0 de tratamiento
con colchicina:
IP =
191
38
= 0, 475 IP m =
= 0, 094
402
402
IM =
54
= 0, 134
402
66
53
= 0, 164 IT =
= 0, 132
402
402
Por lo que cada fase durará más cuantas más células estén en esa fase
concreta, en la siguiente tabla se puede ver la relación de duración relativa
tomando como referencia el tiempo total de mitosis.
IA =
5
Fase
Duración (%)
P
Pm
M
A
T
47,51
9,45
13,44
16,42
13,18
Tratamiento con colchicina
La colchicina actúa impidiendo la formación del huso acromático lo que impide
la migración de los cromosomas y por tanto la parada de la mitosis antes de la
metafase acumulándose células en prometafase.
Empezando con el comentario de las gráficas (página 6), a simple vista se
puede observar que no se parecen mucho, excepto en los datos para prometafase
y profase donde en ésta última incluso se puede apreciar el repunte del número
de células en profase (figura 2) debido a la no rotura nuclear para luego descender ya que aunque relativamente haya más células que entren en división, cada
vez quedarán menos en profase acumulándose éstas en prometafase. La tasa de
prometafase aumenta como se espera en la figura 1.
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Mitosis en meristemo radicular de A. cepa
Los casos de metafase, anafase y telofase, no están tan claros en la figura 2
ya que los datos con que han sido utilizados no se diferencian mucho por lo que
se anastomosan las lı́neas. Lo que si está claro es que la aparición de células en
metafase a los 60 y 90 minutos puede deberse a confundirlas con prometafases
o a que la colchicina haya actuado más tarde siendo un tratamiento retardado.
El error de muestreo mencionado antes (confundir prometafase con metafase)
puede deberse a que en determinadas células que están en prometafase, los cromosomas están más o menos ordenados lo que induce a pensar que forman la
placa metafásica, una forma de no caer en el equı́voco es fijarse bien en el centro
de la masa de cromosomas ya que tiene que estar más intensamente teñida al
estar ahı́ los centrómeros.
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Mitosis en meristemo radicular de A. cepa
Figura 1: Gráfica teórica esperada.
Figura 2: Gráfica obtenida con los datos globales.
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Mitosis en meristemo radicular de A. cepa
0 minutos
20 minutos
Grupo
P
Pm
M
A
T
P
Pm
M
A
T
1
2
3
4
5
6
7
8
32
34
—
26
31
33
19
16
2
14
—
8
9
1
2
2
8
7
—
2
7
7
14
9
12
14
—
6
10
6
11
7
6
6
—
3
12
6
4
16
14
19
24
20
—
25
23
35
7
10
8
8
—
11
7
6
16
4
7
10
—
5
4
2
4
6
11
4
—
8
11
5
10
12
6
8
—
4
6
2
Total
191
38
54
66
53
160
57
48
49
48
%
47,51
9,45
13,44
16,42
13,18
44,2
15,75
13,26
13,54
13,20
40 minutos
60 minutos
Grupo
P
Pm
M
A
T
P
Pm
M
A
T
1
2
3
4
5
6
7
8
20
19
32
33
—
12
23
30
12
14
8
4
—
19
19
6
3
7
3
8
—
3
0
0
7
5
1
3
—
4
7
5
8
7
10
3
—
4
2
9
20
12
11
18
—
16
11
37
20
25
31
26
—
34
34
13
2
9
2
5
—
0
1
0
3
3
5
1
—
1
4
0
4
1
8
0
—
2
0
0
Total
169
82
24
32
43
125
183
19
17
15
%
48,29
23,43
6,86
9,14
12,29
34,82
50,9
5,29
4,74
4,25
90 minutos
120 minutos
Grupo
P
Pm
M
A
T
P
Pm
M
A
T
1
2
3
4
5
6
7
8
22
23
16
26
—
17
25
23
21
21
34
27
—
37
28
27
1
2
1
0
—
1
0
0
4
3
1
0
—
0
0
0
2
1
1
0
—
0
0
0
10
15
15
17
—
22
18
12
40
26
41
31
—
31
27
38
0
1
0
0
—
0
0
0
0
1
0
0
—
0
0
0
0
0
0
1
—
0
0
0
Total
152
195
5
8
4
111
234
1
1
1
%
37,35
47,91
1,23
1,96
0,98
31,89
67,24
0,29
0,29
0,29
Tabla 2: Relación de células en división (especificando su fase) a 0, 20, 40, 60, 90 y
120 minutos de tratamiento con colchicina. Los datos personales son los del grupo 5 a
tiempo 0 y grupo 3 para el resto de los tiempos.
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